CN101785852A - 一种真皮层微量介入美容抗衰除皱制剂与方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于美容修复皮肤皱纹与凹陷缺陷的方法,通过真皮微量介入术将含有生物活性成分具有真皮层修复机能的重组人血小板衍生生长因子(recombinant human Platelet-Derived Growth Factor,简称rhPDGF)、转化生长因子(Transforming Growth Factor,简称TGF)、透明质酸(Hyaluronic Acid,简称HA)复合制剂导入真皮层,刺激真皮层内成纤维细胞的生长与有丝***、胶原蛋白与透明质酸的合成与分泌、胶原纤维与弹性纤维的生成与修复,从而长久修复诸如皮肤凹陷、深皱纹、真皮纤维组织断裂等皮肤缺陷,达到美化肌肤抗衰老的效果。
Description
技术领域
本发明公开了一种重组人转化生长因子和重组人血小板衍生生长因子的美容新用途,专利涉及的技术领域为介入医学与生物制药技术在皮肤美容与抗衰老领域的应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官,总重量占体重的5%~15%,总面积为1.5~2平方米。皮肤具有保持人体内环境稳定的功能,防止体内水分、电解质和其他营养物质的丢失和阻止外界有害物质的侵入的屏障作用,在生理上起着重要的保护功能,同时皮肤也是人体健康与衰老的重要体征与标志,具有重要的美容功用。皮肤的损伤时有发生,而皮肤衰老不可避免。
皮肤衰老开始表现为皮肤松弛下垂,由于循环能力减弱,眼部、额部、颈部周围开始出现膨胀,真皮***失去正常功能,皮肤失去柔软润泽的外观,溶性胶原消退使皮肤粗糙;皮肤逐渐流失弹性胶原蛋白,皮丘结构不能***与保持形状;皮脂分泌降低等原因引起皮肤干燥,皮肤保留液体能力减退;皮肤弹性纤维变质,皮肤皱纹开始出现并逐年加深。解剖学研究表明,20岁以后真皮成纤维母细胞数量逐渐减少,胶原蛋白总含量每年减少1%,胶原纤维***,密度增大,且变为不可溶性,不易被胶原酶所分解,胶原稳定性增加。有关胶原基因表达研究揭示,I型胶原基因表达降低,I型胶原合成减少,而III型胶原基因表达增加。由于胶原纤维的这些改变,使胶原应力传导减弱,一旦受过分拉伸就容易发生撕裂伤。真皮网状层弹性纤维排列改变,电镜下纤维边界模糊,偶见纤维断裂,这些变化在50岁后多见。弹性纤维所含微丝减少,弹性纤维的内含物增多,弹性纤维形态变异复杂,导致皮肤拉伸后弹性回复力减弱。真皮***层弹性纤维也发生改变,正常升至真皮***最高位置紧贴基底膜下的弹性纤维网消失了。电镜检查显示,非正常弹性纤维由大量微纤维沉淀构成,这种弹性纤维的退化导致皮肤松弛,形成细小皱纹。由于胶原和弹性纤维的结构改变,导致皮肤生物力学的改变。运用机械装置测定皮肤伸展能力和弹性回复力发现,皮肤伸展能力70岁后才明显下降,而弹性回复力从很早就开始下降。故皮肤弹性可作为衡量皮肤老化程度的一个参数。35岁以后皮肤张力明显下降。
老化、过度干燥的环境、不当地拉扯皮肤等因素,都会破坏胶原蛋白的结构,造成细小纹路甚至皱纹的出现。胶原蛋白在肌肤真皮层结构的转变如下,由新生组织的「单束连结(intrastrand links)」、变成「束与束连结(interstrand links)」、最后变成「分子间连结(intermolecular links)」的方式存在。因此胶原蛋白的整体结构就变得较为紧密、但是支撑力相对减弱,导致真皮层的张力随之而降低,就会使得真皮层弹力蛋白逐渐丧失弹性,使得肌肤呈现出松垮的外观。而胶原蛋白的物化性质同样也会有所改变,新生组织的胶原蛋白呈水溶性,老化组织的胶原蛋白则呈水不溶性。比较胶原蛋白在体内的含量则会发现,存活年龄越长的动物其体内胶原蛋白的总含量会越少,水不溶性胶原蛋白的比例也会随之增加。
目前解决皮肤皱纹与衰老的方式主要包括1、口服抗衰老与补充流失成分的营养物质,包括维生素C、维生素E、胶原蛋白、透明质酸(玻尿酸)等,或者2、采用注射肉毒素、奥美定、玻尿酸、胶原蛋白等补充或抑制流失成分的药物或营养制剂。口服方式通过消化***与代谢作用到达真皮层的过程十分复杂与不可控,只能从营养学的角度具有广义的营养作用,缺乏临床数据的支持,特别是对特定的皮肤缺损与深皱纹无法做到针对性修复。注射方式靶向性强,效果显著,但代价不菲,或如肉毒素、奥美定等具有不同程度的副作用,或如玻尿酸、胶原蛋白等因被周边组织吸收或随细胞间质流失而保持期较短。
细胞生长因子是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合,调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质。存在于血小板和各种成体与胚胎组织及大多数培养细胞中,对不同种类细胞具有一定的专一性。在分泌特点上,生长因子主要属于自分泌(autocrine)和旁分泌(paracrine)。许多生长因子已被提纯和确定了其结构组成。各类生长因子都有其相应的受体,是普遍存在于细胞膜上的跨膜蛋白,不少受体具有激酶活性,特别是酪氨酸激酶活性(如PDGF受体、EGF受体等)。由于生长因子是由正常细胞分泌,既无药物类毒性,也无免疫反应,因此在研究其生理作用机制同时,有的已试用于临床治疗。生长因子有多种,如血小板类生长因子(血小板来源生长因子,PDGF;骨肉瘤来源生长因子ODGF)、表皮生长因子类(表皮生长因子,EGF、转化生长因子,TGFα和TGFβ)、成纤维细胞生长因子(αFGF、βFGF)、类胰岛素生长因子(IGF-I、IGF-II)、神经生长因子(NGF)、白细胞介素类生长因子(IL-1、IL-1、IL-3等)、红细胞生长素(EPO)、集落刺激因子(CSF)等。
PDGF是人体内源的具有双链结构的蛋白质多肽,由109个氨基酸组成,分子结构中有8对二硫键,分子量为24~30KDa,以α颗粒的形式储存于血小板中,正常人血浆中存在的PDGF浓度约为17.5+/-3.1(SD)ng/mL,随血液循环而行。组织受损时,巨噬细胞、血小板、浸润的炎细胞、受损的内皮细胞及激活的肝星形细胞均可以分泌PDGF,以自分泌、旁分泌的方式发挥作用。PDGF是血小板分泌释放的主要有丝***源,是一个极为重要的作用于间充质细胞的生长因子,直接促进正常细胞的增殖和分化,逆转分化老化细胞为年轻的干细胞,能恢复细胞活力。极微量的PDGF即能强烈引发细胞周期阶段的变化,刺激细胞的DNA合成,导致RNA合成及有丝***,延缓正常细胞衰老进程,延长细胞的生命周期,加速变异细胞的凋亡进程,促进细胞的更新与再生,具有良好的促进细胞增殖作用,使新生细胞逐渐增多,同时PDGF能诱发其他细胞生长因子(hEGF、hbFGF、hNGF、aFGF、TGF-β)的形成,全面促进各类细胞生长。
皮肤医学研究表明,rhPDGF能有效增强细胞活力,促进皮肤组织的新陈代谢,使皮肤组织逐渐增厚,正常皮肤结构逐渐恢复。对于表皮细胞的增殖、再生和受损皮肤组织的修复具有极强功效,促进纤维母细胞、表皮细胞、神经细胞等多种皮肤细胞的***和新皮肤组织的再生,促进胶原纤维、网状纤维、弹性纤维的形成。经过一段时间使用,能有效修复受损皮肤组织,明显恢复、增强皮肤弹性,舒展皱纹,延缓衰老,使皮肤回复到紧致而富有弹性的年轻状态。rhPDGF可以诱导皮肤毛细血管的形成、发育和分化,改善微循环,有效提供肌肤所需营养,增强皮肤细胞对营养物质的吸收和对代谢废物的***,提升皮肤活力,延缓皮肤衰老,增强对环境侵袭、紫外线、污染物、刺激物、敏化剂、炎性细胞的抵抗力,预防痤疮、暗疮发生,淡化面部色斑,改善面部晦暗色泽,滋养肌肤***,年轻健美。rhPDGF能刺激细胞外大分子的合成与分泌(如透明质酸、糖蛋白等),促进人体自身胶原蛋白、透明质酸和纤维蛋白的合成与胶原纤维、网状纤维、弹性纤维的发育,调节胶原蛋白和粘多糖的分泌,维持皮肤组织中水分含量和电解质代谢,改善萎缩皮肤的缺水状态,使皮肤细胞更加饱满,细胞间质更加充盈,消除或减少皱纹,调理肌肤幼嫩光滑,润泽丰满。
rhPDGF对皮肤细胞的修复与美容作用:
rhPDGF采用基因工程技术表达并经现代层析高度纯化,对人类皮肤细胞没有任何毒副作用,是众多细胞生长因子中唯一通过美国FDA批准上市的基因工程产品,目前在国外广泛应用于糖尿病溃疡愈合、组织再生、运动关节整形矫治等方面的治疗。尚未有见其在皮肤美容修复与抗衰老方面的研究和应用。rhPDGF是真皮层组织缺损与衰老良好的修复成分,在细胞层面对成纤维细胞、角元细胞等皮肤组织的微观结构进行调节与再造,在美容抗衰与美容整形领域中具有广阔的应用前景。
TGF-β是一种亲多种组织、多种效应和多功能性的细胞因子。它由间充质细胞产生,也可由浸润的淋巴细胞、单核巨噬细胞及血小板产生。TGF-β是由两个结构相同或相近的、分子量的12.5kDa亚单位借二硫键连接的双体,其cDNA序列研究表明,单体的TGF-β112氨基酸残基是由含400氨基酸残基的前体分子(per-pro-TGF-β)从羧基端裂解而来。pre-pro-TGF-βN端含有一个信号肽,在分泌前被裂解掉,成为非活性状态的多肽链前体(pro-TGF-β),通过改变离子强度、酸化或蛋白酶水解切除N端部分氨基酸残基,所剩余的羧基端部分形成有活性的TGF-β。起初对TGF-β的生物学功能研究主要在炎症、组织修复和胚胎发育等方面,近年来发现TGF-β对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用。TGF-β1、β2和β3功能相似,一般来说,TGF-β对间充质起源的细胞超刺激作用,而对上皮或神经外胚层来源的细胞起抑制作用:促进成纤维细胞、成骨细胞和雪旺氏细胞的生长。TGF-β1、TGF-β2促进人成纤维细胞IL-6的产生,其机理可能是通过对IL-6基因转录的调节;抑制上皮细胞、破骨细胞、内皮细胞生长和脂肪、心肌、骨骼肌的形成。TGF-β可拮抗EGF的某些生物学功能;促进细胞外基质(ECM)如胶原蛋白、纤粘连蛋白的表达和抑制ECM的降解,对细胞的形态发生、增殖和分化过程起着重要作用,有利于胚胎发育和细胞修复。动物体内实验表明,局部注射TGF-β可以促进伤口愈合和典型肉芽组织形成。过多的TGF-β可使组织纤维化,可引起纤维母细胞迁移,抑制胶原酶和其它金属蛋白酶的活性,增加胶原产生,降低胶原降解,促进基质沉积。
本发明通过rhPDGF与TGF-β联合应用,可以刺激rhPDGF成倍发挥功效。
由于健康皮肤存在表皮屏障,使水份、油脂、电解质、蛋白质大分子无法自由进出表皮的角质层,使rhPDGF等调理修复成分只能透过毛囊和汗腺等通道进入真皮层极微量的部分,影响限制了这些活性成分发挥作用。本发明通过真皮层微介术(压力导入、微针导入、磨砂去死皮导入、微波导入、射频导入、电泳导入、喷射导入、皮内注射导入、像素激光导入及其组合应用),可以使细胞生长因子的透皮吸收效率提高10-1000倍,满足不同皮肤美容抗衰修复调理的需要。
发明内容
本发明公开了一种用于美容修复皮肤皱纹与凹陷缺陷的制剂与方法,通过真皮层微量介入术-运用导入手法或介入医学手段,克服或穿透表皮屏障将微量(微克级单位)含有生物活性成分具有真皮组织修复机能的重组人血小板衍生生长因子(recombinant human Platelet-Derived Growth Factor,简称rhPDGF)、转化生长因子(Transforming Growth Factor,简称TGF)、透明质酸(HA)复合制剂导入真皮层目标位置的靶细胞,刺激真皮层内成纤维细胞的生长与有丝***、胶原蛋白与透明质酸的合成与分泌、胶原纤维与弹性纤维的生成与修复,从而持久修复诸如皮肤凹陷、深皱纹、真皮纤维组织断裂等皮肤缺陷,达到美化肌肤抗衰老的效果。
真皮层微量介入术可以提高真皮层对细胞生长因子复合制剂的吸收效率,实现皮肤美容修复深层皱纹与皮肤缺陷的目的,具体包括但不限于压力导入、微针导入、磨砂去角质导入、微波射频导入、超声波导入、电泳导入、喷射导入、皮内注射导入、激光导入及其组合应用。压力导入是指通过包括按摩、拍打、充气压盘等施加在皮肤外部的压力将涂敷在皮肤表面的细胞生长因子复合制剂通过毛囊和汗腺和角质层缝隙加速透过表皮屏障的方法。微针导入是指利用纹绣单针、纹绣排针、微针辊轮在目标部位的表皮表面制造细小的微孔,形成短时的导入通道,促进涂敷在皮肤表面的细胞生长因子复合制剂通过表皮屏障的方法。磨砂去角质导入是指利用磨砂材料在皮肤表面适当打磨,清除角质层外部的死皮和减少角质层的厚度,促进涂敷在皮肤表面的细胞生长因子复合制剂通过表皮屏障的方法。微波射频导入是指利用微波/射频导入仪器,以10KHz-100GHz的高频电磁波提高皮肤内部温度,加大角质层细胞间的间隙,以增强细胞生长因子制剂的角质层通透性的方法。超声波导入是指利用超声波机械振动的原理,以10KHz-1MHz的高速振波加大皮肤角质层细胞间的间隙,以增强细胞生长因子制剂的角质层通透性的方法。电泳导入是指通过电泳仪导入设备产生的静电的场力,导致细胞膜水通道蛋白(Aquaporins)开通,通过这个通道有效地将生物活性的物质渗入真皮层细胞的方法。喷射导入是指通过无针注射器的超强压力将药液通过极细的液束压入皮肤,注射用持续时间约0.25秒,达到无痛,无声,安全,快捷进入真皮层的方法。皮内注射导入是指通过注射器将细胞生长因子复合制剂注入到真皮层待修复部位的方法。激光导入是指利用像素激光、点阵激光在角质层上形成的微孔将细胞生长因子复合制剂导入真皮层的方法。
附图说明
具体实施方式
活性成分:重组人血小板衍生生长因子rhPDGF-BB,来源:Merck chemical,invitrogen;转移生长因子rhTGF-β,来源:Merck chemical,invitrogen。
功效成分:透明质酸HA,来源:正大福瑞达(注射级)。
辅助成分:甘露醇、右旋糖苷、水溶性胶原蛋白、硼酸亮氨酸、硼酸缬氨酸、硼酸丙氨酸、N-乙酰半胱氨酸、丙二醇、佐恩,来源:市售(注射级)。
冻干粉制剂的制备:将活性成分、功效成分和辅助成分用低温纯化水配制成水溶液,并置于冰浴中备用。将上述水溶液分装到洁净的西林瓶中,将胶塞半加塞,置于冻干机中。开启真空冷冻干燥剂将制剂温度降至-60℃,降温时间延迟3-6小时。启动真空泵,将工作室内真空度抽至0.3MPa。逐渐升温,升华,升华时间为12-24小时。至制剂中的水分升华完毕,工作室内充入氮气,压塞,轧盖封装。
专用溶酶的制造:将辅助成分用pH5.0-7.4的PBS溶液溶解,加入丙三醇,混合均匀,按剂量分装到西林瓶中,加塞,轧盖封装,用105℃蒸汽高温灭菌20分钟。
实施例1
量取rhPDGF 0.01g~0.1g、TGF 0.001g~0.1g、HA 1g~10g、甘露醇10~100g、右旋糖苷10~100g、水溶性胶原蛋白5~50g、加纯化水至1000g,分装,冻干,充入氮气,压塞,轧盖封装。硼酸亮氨酸0g~10g、硼酸缬氨酸0g~10g、硼酸丙氨酸0g~10g、N-乙酰半胱氨酸0g~10g、丙二醇0g~5g、佐恩0g~5g、pH5.0~7.5PBS加至1000g,分装,轧盖封装,用105℃蒸汽高温灭菌20分钟。
实施例1所述细胞生长因子复合制剂适用于压力导入、磨砂去死皮导入、微波射频导入、超声波导入、电泳导入及其组合应用。
实施例2
量取rhPDGF 0.01g~0.1g、TGF 0.001g~0.1g、HA 5g~20g、甘露醇10~100g、加纯化水至1000g,分装,冻干,充入氮气,压塞,轧盖封装。右旋糖苷10~100g、水溶性胶原蛋白5~50g、pH5.0~7.5PBS加至1000g,分装,轧盖封装,用105℃蒸汽高温灭菌20分钟。
实施例2所述细胞生长因子复合制剂适用于微针导入、磨砂去死皮导入、喷射导入、皮内注射导入、激光导入及其组合应用。
实施例3
量取rhPDGF 0.01g~0.1g、TGF 0.001g~0.1g、HA 1g~10g、卡波姆3~10g、羧甲基纤维素5~15g、右旋糖苷10~100g、水溶性胶原蛋白5~50g、硼酸亮氨酸0g~10g、硼酸缬氨酸0g~10g、硼酸丙氨酸0g~10g、N-乙酰半胱氨酸0g~10g、丙二醇0g~5g、佐恩0g~5g、尼泊金脂0.01~0.5g、加纯化水至1000g,分装,轧盖封装,低温冷藏。
实施例3所述细胞生长因子复合制剂适用于压力导入、磨砂去死皮导入、微波射频导入、超声波导入、电泳导入及其组合应用。
质量评价:上述三项实施例进行安全性试验、稳定性试验和美容功效试验,结果表明本发明所述细胞生长因子复合制剂安全稳定,具有明确的美容抗衰祛皱效果,适合作为美容化妆品配合美容微介术实施应用,具有良好的应用前景。
安全性试验
过敏测试 | 测试实例 | 无刺激 | 轻度过敏 | 其他不良反应 | 安全性评价 |
实施例1 | 120 | 119 | 1 | 0 | 优良 |
实施例2 | 120 | 120 | 0 | 0 | 优良 |
实施例3 | 120 | 118 | 2 | 0 | 优良 |
稳定性试验
活性保持率 | 测试实例 | 6个月 | 12个月 | 18个月 | 24个月 | 稳定性评价 |
实施例1 | 10 | 99 | 98 | 96 | 95 | 优良 |
实施例2 | 10 | 99 | 98 | 96 | 95 | 优良 |
实施例3 | 10 | 95 | 90 | 86 | 80 | 良好 |
美容效果试验
除皱美白 | 测试实例 | 非常显著 | 显著 | 改善 | 无效果 | 评价 |
实施例1 | 90 | 19 | 25 | 40 | 6 | 良好 |
实施例2 | 50 | 30 | 20 | 0 | 0 | 优良 |
[0038]
实施例3 | 150 | 31 | 37 | 61 | 21 | 良好 |
Claims (7)
1.细胞生长因子复合制剂及其用于皮肤美容修复深层皱纹与皮肤缺陷的方法。
2.权利要求1所述的细胞生长因子复合制剂包括但不限于重组人血小板衍生生长因子(recombinanthuman Platelet-Derived Growth Factor,简称rhPDGF)、重组人转化生长因子(recombinant humanTransforming Growth Factor,rhTGF)、透明质酸(Hyaluronic Acid,简称HA)。
3.权利要求1所述的方法指通过真皮微量介入术是指通过导入手法或介入医学手段,将微量(微克级单位)含有细胞生长因子活性成分具有真皮组织修复机能的rhPDGF、TGF、透明质酸复合制剂导入真皮层目标位置的靶细胞与靶组织,使细胞生长因子复合制剂发挥确定的美容修复与抗衰除皱作用。真皮层微量介入术包括但不限于压力导入、微针导入、磨砂去角质导入、微波射频导入、超声波导入、电泳导入、喷射导入、皮内注射导入、激光导入及其组合应用。
4.权利要求2所述的细胞生长因子复合制剂其中rhPDGF-BB含量10ng/g-1mg/g,不包含rhPDGF-AB、rhPDGF-AA,分子量为23~28KDa,纯度不低于95%,比活性不低于1×105IU/mg,内毒素水平低于0.1ng/μg,优选纯度高于99%,比活性高于5×105IU/mg的rhPDGF-BB。
5.权利要求2所述的细胞生长因子复合制剂其中TGF-β含量0ng/g-100μg/g,其中不包含TGF-α,分子量为25KDa,纯度不低于95%,内毒素水平低于0.1ng/μg。
6.权利要求2所述的细胞生长因子复合制剂其中透明质酸1μg/g-50mg/g。
7.权利要求3所述的压力导入是指通过包括按摩、拍打、充气压盘等施加在皮肤外部的压力将涂敷在皮肤表面的细胞生长因子复合制剂通过毛囊和汗腺和角质层缝隙加压透过表皮屏障,提高真皮层对细胞生长因子复合制剂的吸收效率,实现皮肤美容修复深层皱纹与皮肤缺陷的目的。权利要求3所述的微针导入是指利用纹绣单针、纹绣排针、微针辊轮在目标部位的表皮表面制造细小的微孔,形成短时的导入通道,促进涂敷在皮肤表面的细胞生长因子复合制剂通过表皮屏障,提高真皮层对细胞生长因子复合制剂的吸收效率,实现皮肤美容修复深层皱纹与皮肤缺陷的目的。权利要求3所述的磨砂去角质导入是指利用磨砂材料在皮肤表面适当打磨,清除角质层外部的死皮和减少角质层的厚度,促进涂敷在皮肤表面的细胞生长因子复合制剂通过表皮屏障,提高真皮层对细胞生长因子复合制剂的吸收效率,实现皮肤美容修复深层皱纹与皮肤缺陷的目的。权利要求3所述的微波射频导入是指利用微波/射频导入仪器,以10KHz-100GHz的高频电磁波提高皮肤内部温度,加大角质层细胞间的间隙,以增强细胞生长因子制剂的角质层通透性,提高真皮层对细胞生长因子复合制剂的吸收效率,实现皮肤美容修复深层皱纹与皮肤缺陷的目的。权利要求3所述的超声波导入是指利用超声波机械振动的原理,以10KHz-1MHz的高速振波加大皮肤角质层细胞间的间隙,以增强细胞生长因子制剂的角质层通透性,提高真皮层对细胞生长因子复合制剂的吸收效率,实现皮肤美容修复深层皱纹与皮肤缺陷的目的。权利要求3所述的电泳导入是指通过电泳仪导入设备产生的静电的场力,导致细胞膜水通道蛋白(Aquaporins)开通,通过这个通道有效地将生物活性的物质渗入细胞,实现皮肤美容修复深层皱纹与皮肤缺陷的目的。权利要求3所述的喷射导入是指通过无针注射器的超强压力将药液通过极细的液束压入皮肤,注射用持续时间约0.25秒,达到无痛,无声,安全,快捷,实现皮肤美容修复深层皱纹与皮肤缺陷的目的。权利要求3所述的皮内注射导入是指通过注射器将细胞生长因子复合制剂注入到真皮层待修复部位,实现皮肤美容修复深层皱纹与皮肤缺陷的目的。权利要求3所述的激光导入是指利用像素激光、点阵激光在角质层上形成的微孔将细胞生长因子复合制剂导入真皮层,实现皮肤美容修复深层皱纹与皮肤缺陷的目的。
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