CN101784678B - 用于纤维素糖化的方法和反应器 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于在未损失酶的情况下通过酶降解进行纤维素糖化的连续工艺，并且还公开了用于实施所述工艺的生物反应器。

Description

用于纤维素糖化的方法和反应器

技术领域

本发明涉及生物化学工程领域。

背景技术

木质纤维素生物质是一种得自于木本植物、农业残渣以及其他类似形式的生物物质的可再生资源。对于本发明而言，纤维素和木质纤维素材料被表征为主要含有纤维素、半纤维素、木质素的复合混合物。根据木质纤维素生物质的类型，纤维素(其为通过β，1-4键连接在一起葡萄糖聚合物)的存在比例为按重量计30％至70％。

利用酶进行的纤维素生物质的水解是一种同时受到底物结构和反应条件影响的复杂现象。然而，降解这种复合生物质需要花费时间并消耗能量，从而增加了工艺成本。

实现快速纤维素水解所需的纤维素酶是一种由若干种蛋白质构成的生物催化剂；然而目前在实践中不使用这种催化剂，这是因为它非常昂贵并且到目前为止还没有开发出令人满意的方法以出于重新使用为目的而从水解产物混合物中回收这种酶。

另外，所形成的糖往往会抑制酶的催化作用，从而限制了该工艺的工业经济性。当除去糖的同时，也会损失一部分的酶。从经济角度来看，与市售的高成本酶相关的这些限制使得酶水解工艺不那么具有吸引力。

美国专利第4,220,721号描述了通过在指定时间后分离纤维素-纤维素酶复合物的而由SSF发酵过程中回收利用纤维素酶并将其用作分离产物后的新SSF过程的酶源的方法。美国专利第5,348,871号公开了通过两个反应器进行连续纤维素糖化的工艺，其中第一个反应器具有固定床以用于在纤维素酶的存在下进行纤维素水解，而第二个反应器含有纤维二糖水解酶以用于将纤维二糖水解成其单体产物。美国专利第4713334号描述了在水溶性介质中进行酶的纤维素糖化并分离可溶性糖以及回收利用未水解的纤维素-纤维素酶复合物以用于单独的分批糖化的工艺。美国专利第5,258,293号和第5,837,506号专利示出了用于糖化和发酵过程的连续反应器工艺，并且论述了多种反应器结构。如果从反应混合物中回收活性形式的酶并且可重新使用数次，那么纤维素的酶水解可变成较为经济的工艺。这可通过将纤维素酶固定于某种载体中以水解纤维底物来实现。然而，使用固定化酶来催化不溶性底物的水解是比较困难的，这是因为酶与底物之间的有效相互作用将极大地受到酶的固定化的削弱。然而，一些报道也描述了使用固定化的纤维素酶来水解不溶性纤维素。

简而言之，所有的现有糖化工艺均具有下述缺陷：

a.在糖化工艺中存在超过2％的糖导致酶活性受到抑制。为了将糖浓度维持在2％以下，不得不从***中不断地移除糖溶液。在糖的移除过程中也会损失纤维素酶，从而使得该工艺不是经济可行的。

b.在连续糖化过程中，不得不将未反应纤维素和存在的杂质与起始原料一起不断地移除以加入新的底物。在该移除期间也会损失酶，导致工艺成本增加。

c.回收损失的酶以重新利用的任何后续工艺都会增加成本。

由于这些原因，糖化工艺的成本较高。

为了克服上述的缺陷，需满足以下条件：

1.酶不应与可溶性产物一起被洗脱。

2.应使用在不损失反应性纤维素和酶的情况下除去杂质的装置。

发明内容

本发明的主要目的是开发一种糖化工艺，以及实施该工艺的***，其中酶的损失可被最小化或消除。本发明的另一个目的是开发具有上述优点的连续方法。

具体实施方式

因此，本发明公开了一种用于通过酶降解来水解生物质以产生其各自的单体的方法，其中聚合物生物质为不溶性固体而酶为水溶性的并能够吸附在聚合物表面上。

在一个方面，本发明公开了开发用于将木质纤维素生物聚合物以连续方式解聚成其组成的可发酵单糖的工艺以及反应器***，其中酶的损失基本上被消除。

在本发明的另一个方面，使酶吸附于底物表面上直至达到酶饱和以形成酶-底物复合物，并且将其定义为第一材料。下文中将不含任何酶而仅为生物质称为第二材料。

在本发明的又一个方面，糖化反应器部分地填充有第一材料而该反应器的剩余体积可选地装有第二材料。

此外，再一方面，使水以预定速率通过该反应器以便使纤维素酶能够与底物进行反应。少量的纤维素酶由于以下两个原因而保持向上移动。首先，极少量的酶随着水的移动而向上移动，其次，酶的一部分在底物中的纤维素降解之后也随着流动的水向上移动并且开始与未反应的纤维素反应。在进行降解过程中，第一材料的量开始减少而作为补充将相同的第二材料加入到反应器***中的第一材料之上。这样，就避免了当收集糖溶液同时酶随着水一起逸出，其中整个过程以使得第二材料的加入速率高于或等于酶水解的速率的方式保持。

利用纤维二糖酶强化纤维素酶或在较晚的阶段掺入纤维二糖酶提高了纤维素水解并且增加了单糖在水解产物中的比例。在30-70℃，优选在40-60℃，使纤维素持续水解80至100小时。多于87％(w/w)的所产生的糖为单体状态。

在本发明的另一种实施方式中，设计了用于实施聚合生物质的解聚工艺的反应器。

反应器的描述

因此，本发明提供了用于水解生物质的酶生物反应器。本发明的酶生物反应器包含伸长形的室，优选垂直放置。伸长形的室具有第一区域和第二区域。优选地，该伸长形的室的下部为第一区域而该伸长形的室的上部为第二区域。第一区域为反应室并且含有由一种或多种酶饱和的第一材料。第一材料为由酶饱和的生物质材料。第二区域含有第二材料。第二材料为纯生物质。伸长形的室在底部或第一区域附近具有一个用于供水的入口。伸长形的室在顶部或第二区域附近具有用于收集与水在一起的水解物质的出口。该伸长形的室可具有第二入口以用于供给第二材料或纯生物质。第一区域为反应区；因此，在第一区域中要保持预定温度。为了保持该温度，为伸长形的室提供水或蒸汽夹套。

在本发明的优选实施方式中，新型的酶生物反应器包含四个室。如图1所示，底部室(1)为反应室，其具有夹套壁以便将该室内的反应温度控制在最优条件并且在整个过程期间使热水或蒸汽不断地通过夹套壁以保持反应室内的期望温度。反应室的顶部装配有足以阻止纤维素通过反应室的多孔板(3)。该室的底部具有入口(4)以便以理想的流速进料缓冲液。在该室的一侧装配有螺旋型进料器(5)以用于不时地送入底物。第二室(2)装有蔗渣并且在该室的顶部装配有细筛网。第三室(6)填充有固定于藻酸钠小珠中的β-葡萄糖苷酶小丸，并且在柱的顶部盖有不允许小丸掉出的细筛网。该室的这部分具有出口装置(7)。整个室2和3具有外部夹套以便保持所需的温度，以使得β-葡萄糖苷酶糖化产生于底室1中的纤维二糖。

反应室1填充有吸附了纤维素酶的纤维素并且可选地加入β-葡萄糖苷酶。利用通过夹套壁的热水循环将反应室内部的温度保持在30℃-70℃、优选40℃-60℃，并且利用数字温度计不时地监测反应室的温度。进料颗粒物质(优选为纤维素)通过设置在反应室一侧的螺旋型进料器来进料。将pH值调节为3-6、更优选为4-6的缓冲水以足以维持该过程的优选流速通过位于所述反应器底部的入口。在所述反应器中保持预定时间之后，调节pH值的水以及产物流(主要包含纤维寡糖，优选纤维二糖、葡萄糖以及其他的未解离糖)一起通过柱的区域(2)的填料床到达固定的β-葡萄糖苷酶小丸的区域(6)。使柱2和3的整个区域保持为足以分解由热水经由其夹套的通道通过的糖的温度。在该特定区域中保持一段时间后，使所有的液体通过反应器的第一部分(1)的底部入口进行再次循环，直至出口的糖浓度达到不会抑制酶的特定水平。反应器室的进料器被构造为以预定速率接收纤维素生物质，以使得所吸附的酶在整个过程中与所述固体基质保持在一起。

当水解进程中的纤维素底物以吸附形式存在时，游离的酶向上移动，但当纤维素通过进料器进料时，可用的酶与进入的底物进行反应，因此酶在整个过程中都保持实际上的吸附。此外，该反应室上方的蔗渣填料床推动游离酶进行有效的糖化。水解的整个过程取决于反应速率、流速以及底物进料速率，并且以使得酶保持在床中的方式达到平衡。

图2示出了根据本发明的另一种实施方式的酶生物反应器。图2示出了用于研究酶的吸附以及回收酶进行连续使用的反应器。该反应器制作为具有多个平行端口。端口之间的垂直距离为5cm并且在工作时端口覆盖有橡皮头(dummy)。以不同的时间间隔，通过从端口的相反侧推动样品来从每个端口收集木质纤维样品。本领域中的技术人员清楚地理解该工作原理。反应器的底部装配有细的不锈钢筛网以用于为木质纤维素填料床提供支承。借助泵使得将pH值调节为3-7的自来水穿过位于反应器底部的入口(10)，并从位于反应器上部的出口(20)处进行收集。入口和出口均连接至缓冲水罐(30)。整个反应器外部具有夹套(50)，热水(40)在该夹套中进行循环以便在整个过程中将反应器的内部温度保持在30℃-70℃之间。

糖化工艺的工作流程基本上包含以下步骤：

1.将聚合物底物装入柱反应器以获得固体基质；

2.利用泵使缓冲液流过固体基质以开始解聚，并且随后移除产物。设置蠕动泵以便获得0.45ml/min的流速。将约100ml的调节pH为4.5的自来水置于250ml的缓冲罐中。从入口处进行循环。

3.将从出口流出的缓冲液进行洗脱并使其通过缓冲罐穿过入口进行再循环。持续进行该过程直至产物浓度达到抑制性水平。当达到抑制性浓度时，将其轻轻倒出并且利新鲜的缓冲液替换。当纤维素纤维被解聚至床高时，位于反应室上部的进料器加入新底物。

实施例：

以下实施例作为本发明的例子给出而不应认为限制本发明的范围。

实施例1

将90克具有大约65％的纤维素和接近14％的木质素的木质纤维素材料与大约450FPU的商用纤维素酶混合，装入长度为50cm且直径为3cm的柱状反应器中，并且进料至反应室1中。将约180克湿蔗渣在室2中进行小心装填以制备填料床。***运行0至96小时。使调节了pH值的水以50μL/min的速率进行循环。洗脱从出口6流出的糖溶液并使其通过缓冲罐通过入口1进入柱进行再循环。持续进行该过程直至产物浓度达到抑制性水平。当达到抑制性浓度时，将其轻轻倒出并利用新鲜的缓冲液进行替换。由于床高降低，因此加入新底物。不时地分析洗脱样品中是否存在蛋白质。直至96小时未检测到蛋白质。

实施例2：

将约80克包含大约85％水分的经氨和酸预处理的木质纤维素样品与包含423FPU纤维素和280CBU纤维二糖酶的商用酶制剂充分混合，以使得所有的蛋白质吸附于底物中。将全部质量的酶-底物复合物置于反应器的底部中。

实施例3：

将约400克预处理的木质纤维素底物装载至如实施例2中所举例说明的酶-底物制剂的上面，从而完全装载反应器并且使其成为紧密床反应器。参照图2，将调节了pH值的水从底部入口(1)泵入，直至洗脱水达到对酶具有抑制性的糖浓度阈值。当进行糖化时，不断地从反应器的顶部加入新底物以便补充糖化的纤维素并继续进行该过程。表1示出了其中糖化几乎达到接近87％且木质素含量提高的结果。在该过程中，酶保持活性，直至该过程在无额外的酶装载情况下进行96小时，并且当糖化率达到接近88％时还可进行该过程。

表1

时间	床高[cm]	木质素	纤维素	糖化
					小时	[cm]	[％]	[％]	[％]
24	5	46.65	27.69	87.09
						10	34.55	44.49	71.99
	15	25.68	56.69	51.98
						20	20.01	46.19	49.78
	25	14.25	62.34	4.83
						30	14.54	64.32	3.77
	35	14.14	65	0
48	5	47.32	26.83	87.67
						10	36.14	40.44	75.66
	15	27.72	55.34	56.57
						20	21.74	48.21	51.76
	25	14.62	63.35	5.74
						30	14.48	64.24	3.49
	35	14.44	65	2.08
72	5	49.28	24.98	88.97
						10	36.98	38.29	77.48
	15	29.14	52.18	61.05

	20	25.16	43.69	62.22
						25	18.61	62.46	26.99
	30	14.62	64.19	4.49
						35	14.14	65	0
					96	5	49.39	26.98	88.12
	10	34.74	38.64	75.8
						15	27.69	49.28	61.28
	20	23.55	40.32	62.76
						25	19.08	61.29	30.12
	30	14.69	64.19	4.94
						35	14.14	65	0

Claims (4)

1.一种通过酶降解来由生物质获得葡萄糖的方法，所述方法包含以下步骤：

a.在***中提供第一材料和第二材料，其中所述第一材料为不溶于水的固体生物质，其由一种或多种能够水解所述生物质的酶饱和，而所述第二材料仅为生物质；

b.使水以预定速率通过所述第一材料和第二材料，从而使得所述一种或多种酶能够水解所述第一材料的生物质并留下未反应的残渣；

c.收集与水在一起的所水解的物质；以及

d.从所述***中移除所述残渣，并用第二材料补充所述移除物，

其中，所述第二材料的添加速率等于或大于水解速率，

其中，所述生物质为纤维素，

且其中，第一材料中的所述酶为纤维素酶。

2.一种用于通过酶降解来水解生物质的生物反应器，所述酶生物反应器包含：

具有第一区域和第二区域的伸长形的室，所述第一区域含有由一种或多种酶饱和的第一材料，所述第二区域含有第二材料；所述伸长形的室具有位于所述第一区域附近的用于将水供到所述第一区域中的第一入口以及位于所述第二区域附近的用于收集与水在一起的所述水解的物质的出口，

其中，所述伸长形的室被垂直放置，以使得所述第一区域形成所述伸长形的室的下部，而所述第二区域形成所述伸长形的室的上部，并且所述伸长形的室设置有金属筛网，所述金属筛网将所述伸长形的室分成所述第一区域和所述第二区域。

3.根据权利要求2所述的生物反应器，其中，所述伸长形的室设置有用于提供所述第二材料的第二入口。

4.根据权利要求2所述的生物反应器，其中，所述伸长形的室设置有用于保持所述伸长形的室的温度的装置。

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