CN101774922B - 2,3-二羟基苯甲酸酯类化合物及制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供从中药龙胆中分离提取和制备一类2，3-二羟基苯甲酸酯类天然化合物，通过将中药龙胆粉碎后，用甲醇浸提，抽滤浓缩，得甲醇浸提物粗样，再用80％甲醇水溶液和正己烷萃取分离，得到正己烷层粗样；将粗样经硅胶开口柱分离，再通过ODS开口柱分离，用反向HPLC纯化，得到目的化合物。作为小分子化合物，天然分离的2，3-二羟基苯甲酸酯类化合物在老年性痴呆的体外筛选模型PC 12细胞中表现出显著的NGF mimics活性，可在制备预防老年痴呆症等神经退行性疾病的药物中的应用；本发明化合物的结构式：
Description
技术领域
本发明属化合物的制备方法及应用，涉及一种2，3-二羟基苯甲酸酯类天然化合物的制备方法，以及该类化合物在预防及治疗老年性痴呆等神经退行性疾病中的应用。
背景技术
老年性痴呆症大致可分为三大类型：阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，简称AD)、血管性痴呆症和其他类型的痴呆。随着老龄人口的增多，老年性痴呆的患病率明显升高，已成为导致成年人死亡的第四位主要原因，仅次于心脏病、癌症、中风。我国老年性痴呆患者估计超过500万，约占世界总病例数的1/4；而且，随着我国人口老龄化进程的加快，这个数字将更为庞大，给社会稳定与发展带来重大的影响。据统计，中国老年性痴呆症的发病率65岁以上是5％，70岁以上是10％，80岁以上是30％，到了85岁以上则高达40％。再过20年，如今的中年人都将步入老年人的行列，痴呆症患者数量将急剧增加，老年人的健康也必将关系到整个社会的稳定与发展。因此，研究和开发有效的预防治疗老年性痴呆等神经退行性疾病的药物已成为全世界迫切需要解决的医学问题。
在老年性痴呆症三大分类中，AD是发病率最高，也是最重要的一种痴呆型疾病。AD是一种神经退行性疾病，以记忆力和认知功能损害为主要临床病症，严重时会导致生活不能自理。AD的确切病理机制尚不清楚，目前主要学术观点有以下几种：1.β淀粉样多肽(Aβ)毒性及沉积；2.胆碱能缺失学说；3.神经退行性病变(Neurodegeneration)；4.其它多种因素，如基因突变学说、氧化应激学说。
Aβ沉积及毒性是阿尔茨海默症发病的主要因素之一。神经元内的APP基因的异常调节导致毒性Aβ在神经细胞内的聚集，引起病理变化的级联反应，进而导致神经细胞的退行性病变。国内外研究的热点集中在减少Aβ的产生、抑制Aβ聚集、改变Aβ的构型从而降低其神经毒性，目前已经有几种药物进入临床试验。
现阶段治疗AD的药物种类甚多，主要有胆碱能药，其中乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)抑制剂，主要上市的药物有他克林(tacrine)、酒石酸卡巴拉汀(rivastigmine)、石杉碱甲(huperzine A)、多奈哌齐(donepezil)等；β、γ分泌酶抑制药；脑代谢调节剂，如长春胺、尼莫地平、脑益嗪；影响自由基代谢的药物，如维生素C结合维生素E等。但这些治疗药物只能延缓AD病程的进展，且随病情发展药物疗效逐渐降低，有副作用，故人们将目光转向新的抗老年痴呆药物的研发，寻找针对AD病因的治疗药物和方法，成为当今研究的热点和难点。
研究表明，神经营养因子对神经发育和成年神经***的疾病过程都有重要的影响。在神经退行性变动物模型中，发现神经生长因子(nerve growthfactor，NGF)能阻止或减少神经元的退变。NGF是人类发现的第一个神经营养因子，也是最重要的神经营养因子；是一种对神经细胞的生长、发育、分化和功能保持等方面有重要调控作用的生物活性多肽；对神经萎缩、神经变性、外伤修复等神经疾病的治疗有显著效果。研究发现，NGF一定程度可阻止AD进展，其促进神经生长和神经保护作用是长期的研究热点。然而，它是一个由100多个氨基酸组成的多肽；由于分子量大和极性强等原因，不能通过血脑屏障(Blood Brain Barrier)，并且难以大规模制备等诸多因素，局限了它的实际临床应用，NGF除脑内手术直接投药之外还没有找到更好的治疗方法。因此，寻找具有类似NGF活性(NGF mimics)或能增强其活性(NGFenhancer)并且能通过血脑屏障的低分子化合物就自然成为了研究热点。由于PC12细胞(Pheochromocytoma cells，从大鼠肾上腺嗜铬细胞克隆得到)，具有神经细胞的一般特征和可传代特点，在NGF的作用下细胞会停止***，长出突起，转化成神经元样细胞。因此，在细胞分子水平研究NGF的功能PC12细胞是一个很好的模型。目前，已经有NGF mimics在三期临床试验阶段。
中草药是中药学的物质基础，是天然活性有机化合物的聚宝盆。我国有着几千年的中医文明，且地大物博，有很多宝贵的道地药材，因为中药材资源的利用较方便，所以对其新的成分和新的活性的研究也就十分重要。研究表明，中药对老年性痴呆症有显著疗效，其中最著名的是从蛇足石杉中提取的生物碱一石杉碱甲(huperzine A)，它是中国科学院药物研究所开发的具有自主知识产权的创新药物；它不仅是一种高效高选择性的乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制药，而且还能减少谷氨酸诱发的神经细胞死亡；具有明显的保护神经细胞对抗β淀粉样多肽(Aβ)产生的氧化应激反应；能够对抗过氧化氢、蛋白激酶C抑制剂等诱导的神经细胞凋亡作用；是目前全球治疗老年性痴呆症的最佳药物之一。
龙胆，别名：苦胆草、胆草。春、秋二季采挖，洗净，干燥。性味，苦，寒。归肝、胆经。2005版药典中介绍，龙胆的功能主治：清热燥湿、泻肝胆火。用于湿热黄疸、阴肿阴痒、带下、强中、湿疹瘙痒、目赤、耳聋、胁痛、口苦、惊风抽搐。在PC12细胞生物活性鉴定***的引导下从坚龙胆Gentianarigescens Franch.的干燥根及根茎的提取物中分离纯化得到十余种具有显著类似神经生长因子活性的2，3-二羟基苯甲酸酯类新化合物，命名为gentisides。迄今为止，关于2，3-二羟基苯甲酸酯类化合物只有化学合成的脂肪链含碳数低于11或16个碳的文献报道；欧洲专利(EP 1 930 002 A1)描述了苯甲酸酯类化合物式在治疗和预防病毒感染方面的应用；中国专利(CN 1411339A)和美国专利所描述的苯甲酸类化合物主要用于抑菌，作为食品添加剂等。
阿司匹林(Aspirin，又名乙酰水杨酸)，与天然获得的2，3-二羟基苯甲酸酯类化合物有相似的母核，是经典的小分子非甾体抗炎药(NSAIDs)，临床应用百余年来一直经久不衰，具有较强的解热、镇痛、抗炎，抗风湿作用。Aspirin对抑制血小板聚集有独特功效，能阻止血栓形成，用它防治脑中风、冠心病等，均能收到一定效果。近年来，随着对NSAIDs药理作用的不断深入研究，其临床新用途也不断被发掘。流行病学研究显示，经常服用阿司匹林的老人患AD和认知障碍的危险性明显降低，提示NSAIDs具有治疗AD的潜在应用价值。研究认为这可能的机理为：阿司匹林可防治AD的炎症过程及可直接调节Aβ的代谢。
Aspirin在体外筛选模型PC 12细胞***的活性测试，发现其没有明显的类似NGF活性，从中药龙胆中分离纯化得到的天然的2，3-二羟基苯甲酸酯类化合物的母核与Aspirin的结构虽然相似，但是能导致高比例的PC12细胞发生神经突起伸长现象，表明天然的2，3-二羟基苯甲酸酯具有很好的类似NGF活性，具有开发抗老年痴呆预防治疗药物的价值。此外，龙胆具有来源广泛，取材便利等优点，容易获得大量的2，3-二羟基苯甲酸酯类化合物。以2，3-二羟基苯甲酸酯类化合物作为活性先导物，研发预防和治疗老年痴呆症等神经退行性疾病的新药具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种2，3-二羟基苯甲酸酯类化合物，具有式(I)结构通式：
本发明的另一个目的是提供所述的2，3-二羟基苯甲酸酯类化合物的制备方法，通过以下步骤实现：
1)粉碎和浸提：
中药龙胆粉碎后，用甲醇(工业级)室温下浸提4～5天(偶尔震荡)，抽滤浓缩，得甲醇浸提物粗样，再用80％甲醇水溶液和正己烷萃取分离，得到正己烷层粗样；
2)分离和纯化：
将正己烷层粗样先经两次硅胶开口柱分离(200-300目，溶剂***为正己烷∶乙酸乙酯)；含目标化合物的样品进一步通过十八烷基键合硅胶色谱柱(ODS)开口柱分离(溶剂***为甲醇∶水，甲醇∶氯仿)；最后再用反向HPLC纯化两次，第一次流动相为甲醇水溶液，第二次流动相为乙醇水溶液，最终得到目的化合物。
本发明的再一个目的是提供2，3-二羟基苯甲酸酯类化合物式(I)在制备预防老年痴呆症等神经退行性疾病的药物中的应用。主要是在制备治疗阿尔茨海默症(AD)等神经退行性疾病药物中的应用。
本发明进一步还提供一种预防老年痴呆症等神经退行性疾病的药物组合物，该药物组合物含有生理有效量的(I)所示的2，3-二羟基苯甲酸酯类化合物和药学上可接受的载体或稀释剂。
这里所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如稀释剂、赋形剂如是等，填充剂如淀粉、蔗糖、微晶纤维素等；粘合剂如淀粉浆、羟丙纤维素、明胶、聚乙二醇等；湿润剂如硬脂酸镁、微粉硅胶、聚乙二醇类等；吸收促进剂聚山梨脂、卵磷脂等，表面活性剂伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦、聚山梨脂等等，另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明所述的2，3-二羟基苯甲酸酯类天然化合物可以以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道和非肠道，包括口服、肌肉、皮下和鼻腔。
本发明所述的化合物给药途径可为静脉给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射和穴位注射。
本发明的药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
给药剂型可以是固体制剂、胶囊剂或液体制剂，包括片剂、胶囊剂、分散片、口服液、大输液、小针、冻干粉针、软膏、搽剂或栓剂。
本发明所述的2，3-二羟基苯甲酸酯类天然化合物具有显著的类似神经生长因子的活性，可以在预防老年痴呆症等神经退行性疾病中获得应用。本发明的2，3-二羟基苯甲酸酯类化合物是从中药龙胆中分离纯化得到的，是天然产物中发现的一类具有新化学结构的化合物(化合物I-C为已知结构的化合物，但没有天然来源的报道。)。作为小分子化合物，天然分离的2，3-二羟基苯甲酸酯类化合物在老年性痴呆的体外筛选模型PC 12细胞中表现出显著的NGF mimics活性。以此类化合物作为先导物，优化结构，为预防和治疗老年痴呆症等神经退行性疾病的新药研发进行基础性研究，将具有重要的现实意义。
2，3-二羟基苯甲酸酯类化合物的制备过程是通过有机溶剂浸提、溶剂分配、开口色谱柱分离、高效液相色谱(HPLC)纯化等系列流程得到，制备方法具有简单、快速、获得的化合物纯度高等优点。
附图说明
图12，3-二羟基苯甲酸酯类天然化合物的HPLC制备。
图2加入天然化合物I-A和I-B，经48小时后PC 12细胞的神经突起分化率随剂量增加的变化。
图3加入天然化合物I-A和I-B，经48小时后PC 12细胞神经突起的显微照片。
图4加入天然化合物I-C～L，经48小时后PC 12细胞的神经突起分化率。
具体实施方式
以下通过对该类若干具体化合物制备实例的实施方式和附图再对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
从中药龙胆中分离提取2，3-二羟基苯甲酸酯类天然化合物式(I)的制备方法，具体步骤为：
1)粉碎和浸提：
1980g中药龙胆粉碎后，用10L甲醇(工业级)室温下浸提5天(偶尔震荡)。抽滤浓缩后，得到甲醇浸提物粗样353.6g，将其平均分成两份进行萃取，用80％甲醇水溶液(1500m1)和正己烷(500ml)交替萃取分离两次。共得到正己烷层粗样14.6g。
2)分离和纯化：
将正己烷层粗样先经两次硅胶开口柱分离(200-300目，以下溶剂***均按体积比，第一次分离为正己烷∶乙酸乙酯＝100∶0，90∶10，85∶15，80∶20，70∶30，50∶50；第二次分离为正己烷∶乙酸乙酯＝90∶10，85∶15)；然后，将含目标化合物的样品进一步用ODS开口柱分离(溶剂***按体积比为甲醇∶水＝80∶20，85∶15，90∶10，100∶0，甲醇∶氯仿＝1∶1)；最后，含目标化合物的样品(203.4mg)再用反向HPLC纯化，色谱条件：色谱柱ODS-HG-5(
10/250mm)，流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为甲醇∶水＝98∶2，得到第一次HPLC纯化后的化合物，参见图1。化合物I-A～L的保留时间依次为：47.1min，55.8min，20.0min，21.5min，25.1min，26.9min，36.8min，40.0min，43.3min，51.0min，55.8min，71.7min。
二次HPLC纯化的色谱条件为：流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为90min内85-100％乙醇水溶液的线性梯度，得到化合物I-A(14.8mg，保留时间为43.0min)；流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为90min内90-100％乙醇水溶液的线性梯度，得到化合物I-B(24.2mg，保留时间为31.9min)；流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为60min内80-95％乙醇水溶液的线性梯度，得到化合物I-C(1.4mg，保留时间为37.0min)；流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为60min内85-100％乙醇水溶液的线性梯度，得到化合物I-D(4.8mg，保留时间为26.1min)；流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为60min内85-100％乙醇水溶液的线性梯度，得到化合物I-E(1.6mg，保留时间为29.2min)；流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为120min内85-100％乙醇水溶液的线性梯度，得到化合物I-F(2.3mg，保留时间为37.3min)；流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为60min内85-100％乙醇水溶液的线性梯度，得到化合物I-G(2.9mg，保留时间为32.2min)；流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为90min内85-100％乙醇水溶液的线性梯度，得到化合物I-H(2.2mg，保留时间为43.0min)；流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为90min内85-100％乙醇水溶液的线性梯度，得到化合物I-I(3.2mg，保留时间为44.7min)；流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为90min内85-100％乙醇水溶液的线性梯度，得到化合物I-J(1.0mg，保留时间为47.0min)；流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为60min内90-100％乙醇水溶液的线性梯度，得到化合物I-K(0.2mg，保留时间为36.1min)；流速3ml/min，检测波长210nm，流动相为60min内90-100％乙醇水溶液的线性梯度，得到化合物I-L(0.2mg，保留时间为39.6min)。
实施例2
对实施例1所得化合物I-A～L的理化特征及化学结构的定性鉴定：
化合物I-A和I-B的结构经MS、HR MS、1H NMR、13C NMR、DEPT、H-HCOSY、HMBC、HSQC和HOHAHA确定。
化合物I-C～L的结构经MS、HR MS、1H NMR测试，与化合物I-A和I-B的结构进行比对后确定。
化合物I-A的理化性质：白色固体，分子式为C29H50O4；HR FT-ICR MS：m/z 485.3610[M+Na]+，理论值C29H50O4 Na：485.3601。红外光谱(KBr)值：3469，2920，1671，1469，1311和1155cm-1；紫外光谱(溶剂为乙腈)：最大吸收波长318nm；氢谱和碳谱数据见表-1。
化合物I-B的理化性质：白色固体，分子式为C30H52O4；比旋光值：[α]D 22+2.4°(c 2.04，CHCl3)；红外光谱(KBr)值：3476，2920，1674，1468，1309，1153cm-1；紫外光谱(溶剂为乙腈)：最大吸收波长318nm；HR FT-ICR MS m/z：499.3775[M+Na]+，理论值C30H52O4 Na：499.3758。氢谱和碳谱数据见表-1。
表-1.天然化合物I-A和I-B的氢谱和碳谱数据(CDCl3)
a500MHz，括号内为耦合常数(J in Hz)；
b125MHz.；
c化学位移值为：27.4，29.2，29.5，29.6，29.7，30.0；
d化学位移值为：27.1，29.2，29.5，29.6，29.7，30.1.
对化合物I-B脂肪链立体构型的确定(化合物I-B的水解反应)
将化合物I-B(8mg)、无水K2CO3(20mg)、10ml甲醇置于25ml圆底烧瓶中，室温搅拌27小时。用薄层色谱(展开剂：氯仿)跟踪反应，反应停止后，蒸出甲醇，粗产品用10ml水溶解，10ml正己烷萃取三次。合并正己烷层，浓缩，硅胶柱层析(展开剂：氯仿)，得化合物I-B-2(4.2mg，收率：74％)。化合物I-B的水解产物I-B-2的立体构型的确认进一步确定化合物I-B脂肪链的立体构型。反应式如下：
化合物I-B-2的理化性质：白色固体，[α]D 25+3.7°(c 1.40，CHCl3)，1HNMR(500MHz，CDCl3)δ：3.64(t，2H，J＝6.5Hz，H-1’)，1.57(m，2H，H-2’)，1.25～1.35(m，35H，H-3’～21’)，1.06～1.14(m，2H，H-19’，21’)，0.85(t，3H，J＝7.5Hz，H-22’)，0.84(d，3H，J＝6Hz，H-23’).
化合物I-C：
白色固体，分子式为C23H38O4；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：11.00(s，1H，2-OH)，7.37(dd，1H，J＝1.5，8.0Hz，H-6)，7.10(dd，1H，J＝1.0，8.0Hz，H-4)，6.80(t，1H，J＝8.0Hz，H-5)，5.63(s，1H，3-OH)，4.34(t，2H，J＝6.5Hz，H-1’)，1.77(m，2H，H-2’)，1.43(m，2H，H-3’)，1.25～1.35(m，24H，H-4’～15’)，0.88(t，3H，J＝7.0Hz，H-16’)；MS(m/z)：377.39[M-H]-.
化合物I-D：
白色固体，分子式为C24H40O4；HR FT-ICR MS：m/z 391.2844，理论值C24H39O4[M-H]：391.2854。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：11.00(s，1H，2-OH)，7.37(dd，1H，J＝1.0，7.5Hz，H-6)，7.10(dd，1H，J＝1.5，8.0Hz，H-4)，6.80(t，1H，J＝8.0Hz，H-5)，5.64(s，1H，3-OH)，4.34(t，2H，J＝6.5Hz，H-1’)，1.78(m，2H，H-2’)，1.44(m，2H，H-3’)，1.10～1.38(m，22H，H-4’～15’)，1.08(m，1H，H-15’)，0.86(t，3H，J＝7.0Hz，H-16’)，0.84(d，3H，J＝6.0Hz，H-17’).
化合物I-E：
白色固体，分子式为C25H42O4；HR FT-ICR MS：m/z 405.2999，理论值C25H41O4[M-H]：405.3010。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：11.00(s，1H，2-OH)，7.37(dd，1H，J＝1.0，8.0Hz，H-6)，7.10(dd，1H，J＝1.0，7.5Hz，H-4)，6.80(t，1H，J＝8.0Hz，H-5)，5.63(s，1H，3-OH)，4.34(t，2H，J＝6.5Hz，H-1’)，1.77(m，2H，H-2’)，1.51(m，1H，H-16’)，1.45(m，2H，H-3’)，1.23～1.36(m，22H，H-4’～14’)，1.14(m，2H，H-15’)，0.86(d，6H，J＝6.5Hz，H-17’，18’).
化合物I-F：
白色固体，分子式为C25H42O4；HR FT-ICR MS：m/z 405.2999，理论值C25H41O4[M-H]：405.3010。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：11.01(s，1H，2-OH)，7.37(dd，1H，J＝1.5，8.0Hz，H-6)，7.10(dd，1H，J＝1.5，8.0Hz，H-4)，6.80(t，1H，J＝7.5Hz，H-5)，5.64(s，1H，3-OH)，4.34(t，2H，J＝6.0Hz，H-1’)，1.77(m，2H，H-2’)，1.42(m，2H，H-3’)，1.25～1.34(m，28H，H-4’～17’)，0.88(t，3H，J＝7.0Hz，H-18’).
化合物I-G：
白色固体，化学式为C26H44O4；HR FT-ICR MS：m/z 419.3154，理论值C26H43O4[M-H]：419.3167。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：11.00(s，1H，2-OH)，7.37(dd，1H，J＝1.0，8.0Hz，H-6)，7.10(dd，1H，J＝1.0，8.0Hz，H-4)，6.80(t，1H，J＝8.0Hz，H-5)，5.63(s，1H，3-OH)，4.34(t，2H，J＝6.5Hz，H-1’)，1.77(m，2H，H-2’)，1.43(m，2H，H-3’)，1.10～1.38(m，26H，H-4’～17’)，1.08(m，1H，H-17’)，0.86(m，3H，J＝6.5Hz，H-18’)，0.84(d，3H，J＝6.5Hz，H-19’).
化合物I-H：
白色固体，分子式为C27H46O4；HR FT-ICR MS：m/z 433.3310，理论值C27H45O4[M-H]：433.3323。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：11.01(s，1H，2-OH)，7.37(dd，1H，J＝1.5，8.0Hz，H-6)，7.10(dd，1H，J＝1.5，8.0Hz，H-4)，6.80(t，1H，J＝7.5Hz，H-5)，5.64(s，1H，3-OH)，4.31(t，2H，J＝6.5Hz，H-1’)，1.77(m，2H，H-2’)，1.43(m，2H，H-3’)，1.10～1.38(m，28H，H-4’～18’)，1.08(m，1H，H-18’)，0.85(m，3H，J＝6.5Hz，H-19’)，0.84(d，3H，J＝6.0Hz，H-20’).
化合物I-I：
白色固体，分子式为C28H48O4；HR FT-ICR MS：m/z 447.3463，理论值C28H47O4[M-H]：447.3480。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：11.00(s，1H，2-OH)，7.37(dd，1H，J＝1.0，8.0Hz，H-6)，7.10(dd，1H，J＝1.0，8.0Hz，H-4)，6.80(t，1H，J＝8.0Hz，H-5)，5.63(s，1H，3-OH)，4.34(t，2H，J＝6.5Hz，H-1’)，1.77(m，2H，H-2’)，1.43(m，2H，H-3’)，1.10～1.38(m，30H，H-4’～19’)，1.08(m，1H，H-19’)，0.85(m，3H，J＝7.5Hz，H-20’)，0.84(d，3H，J＝6.5Hz，H-21’).
化合物I-J：
白色固体，化学式为C28H48O4；HR FT-ICR MS：m/z 447.3464，理论值C28H47O4[M-H]：447.3480。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：11.00(s，1H，2-OH)，7.37(dd，1H，J＝1.5，8.0Hz，H-6)，7.10(dd，1H，J＝1.5，8.0Hz，H-4)，6.80(t，1H，J＝8.0Hz，H-5)，5.63(s，1H，3-OH)，4.34(t，2H，J＝6.5Hz，H-1’)，1.77(m，2H，H-2’)，1.42(m，2H，H-3’)，1.25～1.34(m，34H，H-4’～20’)，0.88(t，3H，J＝6.5Hz，H-21’).
化合物I-K：
白色固体，分子式为C29H50O4；HR FT-ICR MS：m/z 461.3627，理论值C29H49O4[M-H]：461.3636。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：11.00(s，1H，2-OH)，7.37(dd，1H，J＝1.5，8.0Hz，H-6)，7.10(dd，1H，J＝1.5，8.0Hz，H-4)，6.80(t，1H，J＝8.0Hz，H-5)，5.63(s，1H，3-OH)，4.34(t，2H，J＝6.5Hz，H-1’)，1.77(m，2H，H-2’)，1.45(m，2H，H-3’)，1.25～1.34(m，36H，H-4’～21’)，0.88(t，3H，J＝7.0Hz，H-22’).
化合物I-L：
白色固体，分子式为C31H54O4；HR FT-ICR MS：m/z 489.3931，理论值C31H53O4[M-H]：489.3949。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：11.00(s，1H，2-OH)，7.37(dd，1H，J＝1.5，8.0Hz，H-6)，7.10(dd，1H，J＝1.5，8.0Hz，H-4)，6.80(t，1H，J＝8.0Hz，H-5)，5.63(s，1H，3-OH)，4.34(t，2H，J＝6.5Hz，H-1’)，1.77(m，2H，H-2’)，1.43(m，2H，H-3’)，1.25～1.34(m，40H，H-4’～23’)，0.88(t，3H，J＝6.5Hz，H-24’).
实施例3
龙胆来源的2，3-二羟基苯甲酸烷酯的生物活性。
在神经退行性变动物模型中，研究发现NGF能阻止或减少神经元的退变，一定程度可阻止AD进展，具有促进神经生长和神经保护作用。由于PC12细胞具有神经细胞的一般特征，在NGF的作用下PC12细胞会停止***，长出突起，转化成神经元样细胞。因此，能导致PC12细胞转化成神经元样细胞的化合物具有预防及治疗老年性痴呆等神经退行性疾病的应用价值。
实验方法：
1)PC 12细胞的培养：接20×104个PC 12细胞于100mm的培养皿中，含10ml DMEM培养基(其中含10％马血清、5％胎牛血清)，两天后更换一次培养基，再过三天继代。先用PBS将细胞洗两次，再加入10ml PBS于培养皿中，在37℃，5％CO2的培养箱内培养10分钟，吹洗，转移到15ml的一次性离心管，离心后血球计数板上计数。24孔细胞培养板每孔先加入1ml含血清的DMEM培养基，细胞计数后，每孔接2×104个细胞，CO2培养箱培养24小时后加样。
2)活性测试：以DMSO为阴性对照，NGF 40ng为阳性对照，将主要含量的天然化合物I-A和I-B配置成不同浓度的DMSO溶液。用1ml含1％DMSO和样品的DMEM溶液(不含血清)将24孔细胞板的每孔原培养基取代后，放入37℃，5％CO2的培养箱中培养。倒置显微镜下每隔24小时、连续6天观察细胞形态变化，记录细胞的神经突起分化率(神经突起长于胞体直径一倍的细胞数目与视野下总细胞数目的比值)，每个视野下约100个细胞，随机选取3处，并统计作图分析。
3)实验结果：
①在1-30μM的浓度下，48小时候后两个化合物均显示出很好的NGF-mimics活性。由图2，图3可见，以1％的DMSO作为阴性对照，化合物I-A和I-B在最适浓度10μM的条件下，诱导PC 12细胞产生的神经突起率可以超过阳性对照NGF诱导的突起率；同时此实验结果还表明，化合物I-A和I-B比较，可知化合物长脂肪链末端的基团不同并不影响此类物质的生物活性，且浓度超过最适浓度会引起细胞毒性。图2是加入天然化合物I-A和I-B，经48小时后PC 12细胞的神经突起分化率随剂量增加的变化，图中C：1％DMSO为阴性对照；NGF(40ng/ml)为阳性对照，I-A和I-B的浓度单位M。图3是加入天然化合物I-A和I-B，经48小时后PC 12细胞神经突起的显微照片，图a，1％DMSO为阴性对照；图b，NGF 40ng/ml为阳性对照；图c，化合物I-A(10M)；图d，化合物I-B(1M)。
②天然化合物I-C～L在1-30μM的浓度下，48小时候后均显示出显著的NGF mimics活性。参见图4，以1％的DMSO作为阴性对照，化合物I-C～L在最适浓度条件下，诱导PC 12细胞产生的神经突起率可以与阳性对照NGF诱导的神经突起率相比，且化合物浓度过高会引起细胞毒性。图4是加入天然化合物I-C～L，经48小时后PC 12细胞的神经突起分化率，其中C：1％DMSO为阴性对照；NGF(40ng/ml)为阳性对照，I-C～L的浓度单位：M。
Claims (6)
1.一种2,3-二羟基苯甲酸酯类化合物，具有以下结构通式（Ⅰ）：
2.权利要求1所述的2,3-二羟基苯甲酸酯类化合物的制备方法，通过以下步骤实现：
（1）粉碎和浸提：
中药龙胆粉碎后，用工业级甲醇室温下浸提4～5天，抽滤浓缩，得甲醇浸提物粗样，再用80%甲醇水溶液和正己烷萃取分离，得到正己烷层粗样；
（2）分离和纯化：
将正己烷层粗样先经硅胶开口柱分离，溶剂***为正己烷:乙酸乙酯，含目的化合物的样品进一步通过十八烷基键合硅胶色谱柱分离，溶剂***为甲醇:水，甲醇:氯仿，最后再用反向HPLC纯化两次，第一次流动相为甲醇水溶液，第二次流动相为乙醇水溶液，最终得到目的化合物。
3.根据权利要求1所述的2,3-二羟基苯甲酸酯类化合物在制备预防老年痴呆症的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在制备治疗阿尔茨海默症药物中的应用。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述药物的给药途径为肠道和非肠道。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为固体制剂或液体制剂。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: NANJING MEDICAL UNIVERSITY |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Qi Jianhua Inventor after: Chen Ling Inventor after: Gao Lijuan Inventor after: Luo Yan Inventor after: Li Jinyou Inventor before: Qi Jianhua Inventor before: Gao Lijuan Inventor before: Luo Yan Inventor before: Li Jinyou |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: QI JIANHUA GAO LIJUAN LUO YAN LI JINYOU TO: QI JIANHUA CHEN LING GAO LIJUAN LUO YAN LI JINYOU |
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| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20110126 Address after: 310027 Hangzhou, Zhejiang Province, Xihu District, Zhejiang Road, No. 38, No. Applicant after: Zhejiang University Co-applicant after: Nanjing Medical University Address before: 310027 Hangzhou, Zhejiang Province, Xihu District, Zhejiang Road, No. 38, No. Applicant before: Zhejiang University |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20121226 Termination date: 20190129 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |