CN101772353B - 在受治疗组织中展现高停留时间的氧化的抗生物素蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明描述经化学改质的抗生物素蛋白，其与野生型抗生物素蛋白相比较，在受治疗的组织中具有较高的持久性。抗生物素蛋白的氧化作用是在低亲和性配体HABA的存在下借由与过碘酸盐一起培养来进行，该占据生物素结合部位的HABA阻止蛋白质在氧化步骤期间变性。过碘酸盐氧化作用自抗生物素蛋白甘露糖开环中产生CHO基团，一旦注射后便与组织NH2残基反应以形成稳定的席夫氏碱(Schiff′sbase)。该固定的抗生物素蛋白可保持结合具有治疗活性的生物素化作用剂(如：经放射性标记的生物素、干细胞及体细胞)的能力，可用于近距离放射治疗(brachytherapy)(如：术中抗生物素蛋白化放射性核素疗法(Intraoperative Avidination Radionuclide Therapy))或退化性或遗传性疾病中。
Description
发明所属的技术领域
此处所描述的发明是关于可用来结合生物素化的化合物或细胞并使其维持在需要治疗的部位内的经改质的抗生物素蛋白。
先前技术
多年来已知抗生物素蛋白-生物素***为一种用于小分子及生物受体间的交互作用的定性及定量研究中的优异工具(Wilchek，M.，etal.，Immunol.Today，1984，6，39)。
抗生物素蛋白为一种存于蛋白中的约68kDa的糖蛋白，其显示出对维生素H生物素的高亲和力。其解离常数(Kd～10-15M)为自然界中已知的最低者(Green N.M.，et al.，Biochem.J.，1970，118，67；Green，N.M.，Adv.Protein Chem.，1975，29，85)。其是由四种同等的胺基酸序列的次单位所组成，其各可能结合一生物素分子。糖基化部分约占其分子量的10％，每一次单位平均带有4至5个甘露糖及3个N-乙酰基葡糖胺残基(Bruch R.C.，et al.，Biochemistry，1982，21，5334)。
1988年时报道关于介于经放射标示的生物素衍生物及抗生物素蛋白间的交互作用的研究(Garlick R.K.，et al.，J.Biol.Chem.，1988，263，210)。在为申请者之名的WO04093916中描述一种实体肿瘤的二步骤围手术期疗法来作为新颖形式的近距离放射治疗。第一个步骤涉及在手术区域投与生物素化的特殊抗体，再注射天然或聚乙二醇化的抗生物素蛋白，以构造出“人工受体”。然后，在第二个步骤中是***性投与与生物素偶合的适当的抗癌剂。第二个步骤需要在手术移除肿瘤后的4至72小时内进行。然而，其中并未建议透过抗生物素蛋白共价结合所考虑的组织来直接使组织抗生物素蛋白化。
临床应用此在第一个步骤中使用抗生物素蛋白及在第二个步骤中使用经放射标示的生物素-DOTA(ST2210)的二步骤近距离放射治疗时证明可在乳癌患者中有效递送部分放射性至手术区域(Paganelli G.，et al.，The Breast，2007，16，17；Paganelli G.，et al.，Clin.Canc.Res.，2007，13，5646)。在11个患者中，投与100mCi的剂量时，释放入外科手术标的象限区的放射剂量平均为20Gy。此加强剂量代表预期的60Gy中有约1/3可借由目前标准的体外放射线治疗(External Beam Radiotherapy)(EBR)递送给此类型的患者。
最近已报道具有生物素-放射性核素联接体的抗生蛋白链菌素抗体构造物在治疗患有恶性神经胶瘤患者上的用途及具有半抗原-放射性核素的双特异性抗体在治疗表达肿瘤胚胎抗原的肿瘤疗法中的用途(Goldenberg，D.M.，et al.，J.Clin.Oncol.，2006，24，823)。然而，在许多病例中，肾脏毒性显示出是由于通过肾脏的剂量提高太多。
当以抗生物素蛋白治疗时，主要的问题之一在于其快速自身体清除。最近，研究工作集中在寻找具有较长半衰期的“经改质的抗生物素蛋白”。这类方法之一包含将蛋白质经由游离氨基连接至单甲氧基聚乙二醇以产生具有延长的血浆半衰期的经改质的抗生物素蛋白，当将抗生物素蛋白与PEG-20kDa偶合时，经i.v.注射后5小时仍有8％的剂量，注射后72小时仍有6％的剂量存于肿瘤中(Caliceti P.，et al.，J.Control.Release，2002，83，97)。
证实PEG部分的尺寸的影响的药代动力学研究强调PEG单位愈重则半衰期愈短的事实，同时生物素-抗生物素蛋白亲和程度则依循相反的趋势(Salmaso S.，et al.，Biochim.Phys.Acta，2005，1726，57)。
另一对不同的聚乙二醇化抗生物素蛋白的药代动力及生物素结合性质的研究显示出每一抗生物素蛋白带7个PEG部分时为最佳比例，如此可增加血浆半衰期并降低抗生物素蛋白的致免疫性。然而，动物模型中并无关于肿瘤内生物素化的药物累积情形的详细资料(Chinol M.，et al.，Br.J.Cancer，1998，78，2，189)。
在作为PEG-抗生物素蛋白的替换物方面已对热反应性聚合物进行研究。与抗生物素蛋白相比较，聚(N-异丙基丙烯酰胺-co-丙烯酰胺)-抗生物素蛋白显示出在血流中有较长的停留时间且在肝脏中的累积较少(Salmaso S.，et al.，Int.J.Pharm.，2007，340，20)。然而，此案例中也未报告动物模型中关于肿瘤内生物素化的药物累积情形的详细资料。
不幸地，目前为止无可用的有效及选择方法来特异定位治疗剂。
因此，抗癌疗法的改良仍极需要且为制药公司的主要努力领域。
抗生物素蛋白-生物素结合交互作用是依赖蛋白质部分。事实上，去糖基化的抗生物素蛋白保留生物素结合能力(Hiller Y.，et al.，Biochem.J.，1987，248，167；Rosebrough S.F.，et al.，J.Nucl.Med.，1996，37，8，1380)。
治疗剂在欲治疗的区域内的增加累积及持久性可通过组织抗生物素蛋白化来达到，此是以一种与野生型抗生物素蛋白相比较具有更高的组织持久性的经改质的抗生物素蛋白来进行。
这类策略可避免***性投与生物素蛋白的需求，因此，可防止任何与这类疗法相关的副作用。另外，相关组织的抗生物素蛋白化增加可因抗癌剂在非相关器官中的较少分布而带来较低治疗毒性，并可以较低的抗癌剂剂量取得与野生型抗生物素蛋白相同的效果。
现已发现：将抗生物素蛋白的糖基化部分氧化可围绕肿瘤的组织稳定地抗生物素蛋白化，使生物素化的抗癌剂更集中在这类区域。
发明内容
本发明涉及可在活体内与组织交互作用的经化学氧化的抗生物素蛋白，其是透过可逆的共价化学键以延迟其扩散的方式作用。这类氧化的抗生物素蛋白是在外科手术步骤或经由注射投与至需要治疗的选定的器官或组织。
借由10mM过碘酸钠进行的抗生物素蛋白的氧化作用最近有报道(US20020137125)。后者中，作者将氧化的抗生物素蛋白与磷酸五甘露糖-肼偶合，以取得高度磷酸化的亚胺衍生物，然后可将其给予患者，以修改溶酶体酶，如此可加强溶酶体病的酶替代疗法的效力。值得注意的是，亚胺形成作用并未在活体内发生。也需注意，该申请案中并未报道这类经改质的抗生物素蛋白的活性。
尤其是，本发明是关于经由将糖蛋白的糖部分氧化来取得氧化的抗生物素蛋白，与野生型抗生物素蛋白(WTavidin)相比较，其显示出在组织中有更高的持久性，同时也将在使用先前报道的经改质的抗生物素蛋白时所面临的副作用减至最低。
氧化的抗生物素蛋白的组织结合作用为高度同质性且不像在IART中般依赖带正电的抗生物素蛋白在肿瘤及发炎组织中定位的能力。因此，氧化的抗生物素蛋白的作用并不局限于与肿瘤细胞的特殊交互作用，如此，可将围绕在经手术移除的肿瘤周围的组织(已知其含有以野生型抗生物素蛋白靶向时不易接近的多余的肿瘤细胞)抗生物素蛋白化。
本发明的第一种优选实施方式是关于借由吡喃糖苷糖的氧化开环来化学改质的野生型抗生物素蛋白，如此可产生可与存在于所关注的组织中的氨基残基交互作用的醛部分。
由于存在质子化NH3 +形式，CHO基团在酸性pH(低于6.0)下对蛋白质NH2大体上为惰性。然而，在pH≥7下，CHO基团与蛋白质NH2残基反应以形成希夫氏碱。图表1中呈现野生型抗生物素蛋白的代表性甘露糖残基的化学氧化作用以及接下去新形成的CHO基团与氨基团(R-NH2，其中R为组织蛋白质残基)的反应的实例。
图表1
此糖氧化作用是根据为人熟知的基于天然抗生物素蛋白与过碘酸钠的反应的方法来获得(Zaborsky，O.R.，et al.，Biochem.Bioph.Res.Comm.，1974，61，1，210；Green，N.M.，Biochem.J.，1963，89，599)。
然而，已知抗生物素蛋白的氧化作用会对某些蛋白质氨基-酸性残基造成损害(即，涉及生物素结合部位的色胺酸的氧化)，使得对生物素及/或生物素衍生物的亲和力较低(US20040191832；Green，N.M.，Biochem.J.，1963，89，599)。
现已发现：抗生物素蛋白在氧化步骤前结合至低亲和性配体4-羟基偶氮苯-2′-甲酸(HABA)时可提供前者防止色胺酸残基氧化的构型，此点可由这类衍生物的UV光谱揭露出。UV光谱中，282nm及291nm处的独特曲折减低是与色胺酸氧化程度严格相关；同时，250-260nm区中吸收的增加为形成经取代的羟吲哚的特征。
与野生型抗生物素蛋白(WTavidin)的吸收光谱相比较，氧化的抗生物素蛋白(OXavidin)及HABA-饱和的氧化的抗生物素蛋白(OXavidinHABA)的吸收光谱指出在氧化期间使用HABA来保护生物素结合部位可大为降低色胺酸的损害率(图1)。
本发明的一种优选实施方式为氧化的抗生物素蛋白，其UV光谱中在282nm及291nm处的吸收与所观察到的WTavidin的吸收相比较并未呈现色胺酸残基氧化的弯曲特征。
本发明的另一优选实施方式为氧化的抗生物素蛋白，其UV光谱中该250nm至260nm处的吸收与所观察到的WTavidin的吸收相比较并未出现任何增加。
本发明的又一优选实施方式是在配体HABA(由于氧化表现出色氨酸残基)的存在下氧化抗生物素蛋白和/或抗生物素蛋白衍生物的方法。
与HABA的保护作用完全一致，OXavidinHABA显示出与WTavidin非常类似的构造及热动力学性质。热稳定性及构形改变是在氧化前及氧化后，有或无4当量的生物素的情况下借由圆二色谱测定。经由追踪在25-95℃的温度范围内，225nm处的二色性信号减少来记录熔解曲线。借
7.0软件，Boltzman配合模型来计算S型曲线的拐点和斜率(p)，其代表通过变性条件的转变点。
对各特定化合物而言，热稳定性相当于在25-95℃的温度范围内，该配合对应曲线中的拐点的温度。
由于确定了OXavidin的熔解温度(Tm)及S型曲线的斜率(p)与WTavidin相比较较低(分别为74.3℃对79.0℃及8.9对14.7)，数据(表1)指出氧化作用将降低热稳定性。
令人惊讶地，当氧化作用是在经HABA保护的抗生物素蛋白上进行时几乎可以忽略该不稳定化作用(由OXavidinHABA及抗生物素蛋白的Tm及p值确认，分别为78.1℃对79.0℃及11.2对14.7)。
表1
| Tm(℃) | p* | |
| 抗生物素蛋白 | 79.0±0.1 | 14.7±0.3 |
| 抗生物素蛋白+4当量生物素 | ＞95 | n.a. |
| OXavidin | 74.3±0.1 | 8.9±0.1 |
| OXavidin+4当量生物素 | 86.3±0.2 | 20.7±1.1 |
| OXavidinHABA | 78.1±0.3 | 11.2±0.4 |
| OXavidinHABA+4当量生物素 | ＞95 | n.a. |
*S型曲线的斜率；n.a.＝不适用
虽然在加热时未加入生物素时热变性对OXavidinHABA及OXavidin二者均为不可逆，但当在生物素的存在下加热/冷却时仅OXavidinHABA可回复其二极构造，类似于WTavidin(其数据未显示)。这些发现可确认HABA饱和作用为抗生物素蛋白进行化学氧化时用来保存其构形的一种非常有效的方式，并且解释了因此保留的生物素结合能力。
本发明的另一优选实施方式为呈现高于或等于78℃的热稳定性的氧化的抗生物素蛋白。
本发明的一种更佳实施方式为呈现高于或等于78℃的热稳定性且S型曲线的斜率大于10的氧化的抗生物素蛋白。
先前的发现也借由氧化的抗生物素蛋白(OXavidinHABA)对生物素化的加合物ST2210的结合力(如表2中所示，其类似于WTavidin)得到证实。
表2
N＝独立实验的数目；SD＝标准偏差；NT＝未测试
借由HABA分析与游离生物素相比较时，以生物素DOTA(ST2210)取得的实验值97.4±0.5是被假定为100％来作为改质的抗生物素蛋白的参考值；*p＜0.05对10mM；#p＜0.01对10mM(单向Anova，再接续Student-Newman-Keuls)；**p＜0.001对相同物但无HABA(双向Anova，再接续Bonferroni)
根据最优化的方法所取得的氧化的抗生物素蛋白(OXavidinHABA)与无HABA保护作用时所制得的氧化的抗生物素蛋白相比较，其在结合ST2210方面显示出改良的性质，但在受治疗的组织(经肌肉内注射后的小鼠肌肉肢体)中仍维持高持久性。确实，若在氧化作用前加入HABA，则当以10mM NaIO4将抗生物素蛋白氧化后，其在结合ST2210方面的能力增加(86.3％，相对于无HABA存在时，对应的氧化的抗生物素蛋白仅为50.9％)。当氧化作用是在较高浓度(20mM)的过碘酸钠的存在下发生时可取得类似的结果(81.4％对49.1％)。
本发明的另一优选实施方式为一种氧化的抗生物素蛋白，相关于WTavidin与ST2210结合的程度为97.4％，其呈现出与ST2210的结合程度是高于或等于75％。
再者，不管这类氧化作用是否是在HABA的存在下发生，在小鼠后肢中的氧化的抗生物素蛋白的组织持久性较WTavidin高出很多。此行为与抗生物素蛋白的糖基化侧链内存有CHO基团绝对相关。
在本发明的一更佳实施方式中，以10和20mM NaIO4氧化后可产生每一抗生物素蛋白约带有8至15个CHO残基(此是借Purpald氏方法估计)。
再于本发明的一更佳实施方式中，“经HABA保护”的氧化的抗生物素蛋白衍生物(OXavidinHABA)在注射后2 4小时及一周时仍维持高ST2210结合能力并展现出组织持久性，这与CHO基团数目相关。
借由等温滴定量热法(ITC)测得的这类抗生物素蛋白/生物素交互作用的物化特性揭露出ST2210能够以可相比拟的方式与WTavidin和OXavidinHABA结合，此可由结合常数(KA)及热函变化(ΔH)证实(分别为3.45对2.50×106M-1及-1.48对-1.71×104千卡摩尔-1)。相反地，ST2210/OXavidin交互作用显示出较低的KA(6.45×105M-1)及较高的ΔH(-0.79×104千卡摩尔-1)。
根据ST2210结合氧化的抗生物素蛋白的数据，在实验误差内，该测得的交互作用的化学计量为每分子WTavidin、OXavidinHABA及OXavidin分别结合3.0、1.7及1.2个分子的ST2210。
表3
| N | KAM-1 | ΔH千卡摩尔-1 | ΔS卡摩尔-1K-1 | |
| WTavidin | 3.0±0.016 | 3.45E6±3.07E5 | -1.48E4±114.0 | -19.6 |
| OXavidin20mM NaIO4 | 1.2±0.012 | 6.45E5±5.69E4 | -0.79E4±117.8 | 0.16 |
| OXavidinHABA1mM NaIO4 | 2.5±0.008 | 4.58E6±2.49E5 | -1.29E4±56.2 | -12.7 |
| OXavidinHABA5mM NaIO4 | 1.9±0.012 | 5.42E6±5.90E5 | -1.56E4±145.0 | -21.6 |
| OXavidinHABA10mM NaIO4 | 1.7±0.008 | 3.34E6±2.12E5 | -1.60E4±109.9 | -23.7 |
| OXavidinHABA20mM NaIO4 | 1.5±0.007 | 2.50E6±1.32E5 | -1.71E4±113.7 | -28.0 |
根据本发明的氧化的抗生物素蛋白大体上维持野生型抗生物素蛋白的生物素结合能力，但取得以可逆方式与组织蛋白质交互作用的性质，如此可产生用于近距离放射治疗中(如用于
中)的理想的候选作用剂。
于本发明的一种优选实施方式中，氧化的抗生物素蛋白是在手术间阶段投与以产生用于接下去的抗癌剂的“人工受体”。
本发明的一更佳实施方式是提供作为第一种近距离放射治疗剂的以化学方式氧化的抗生物素蛋白(其在受治疗的组织中具有高持久性)与对所述第一种氧化的抗生物素蛋白具亲和性的第二种作用剂。
本发明的一甚至更佳的实施方式是提供作为第一种近距离放射治疗剂的以化学方式氧化的抗生物素蛋白(其在受治疗的组织中具有高持久性)与对所述第一种氧化的抗生物素蛋白具亲和性的第二种抗癌剂。
本发明的另一优选实施方式为一种药学组合物，其含有该经化学改质的抗生物素蛋白作为第一种成分及生物素化的治疗剂作为第二种活性成分。
于本发明的一优选体现中，上述药学组合物的第二种活性成分为生物素化的抗癌剂。
抗癌剂意指可对抗肿瘤的试剂。抗癌剂的非详尽列表中包含化疗药物、经放射标示的化合物、效应细胞、毒素、细胞因子及抗癌细胞。
于本发明的另一优选体现中，该疗法采用放射治疗的形式。
本发明的另一优选实施方式包含用于***、肌肉、肝脏、胰脏、膀胱、脑、肺、***、卵巢、眼及其他器官的近距离放射治疗的试剂盒的制备方法。
于该试剂盒的优选体现中，所述二种成分是在二个分开的容器中。
于一更佳的实施方式中，该经化学改质的抗生物素蛋白的容器中包含适量的产物，此产物是在可相容的酸性溶液中配制或与合适的赋形剂一起冻干以形成冻干块。
于一特佳的实施方式中，上述容器将为特定的针筒形式，此针筒形式可适合连续投与数个精准体积至由于重要器官浸润而无法借手术移除的生病组织的切除边缘或残余部分。
较合宜地，该容器也可为适合以喷雾形式给予经化学改质的抗生物素蛋白的形式。
优选地，该已含有个别成分的剂量的不同容器是制成携带用于该投与模式的规格的单一包装。
更佳地，所述各种容器为针筒的形式。
于另一特佳实施方式中，该用于近距离放射治疗中(如用于
中)的试剂盒适合用于依序局部投与第一种成分及接下去的***性或局部投与第二种成分。
本发明组合物的第二种成分可借任何数目的途径投与，包括，但不限于：口服、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、鞘内、室内、皮内或透皮施用、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、***内、直肠装置或在生病组织上局部投与。
有些临床病例的近距离放射治疗是借由直接将放射同位素直接投至肿瘤块体(即，Julow J.，et al.，Prog.Neurol.Surg.，2007，20，303中所描述的不宜手术的脑肿瘤)或肿瘤影响器官(即，Saito S，et al.，Int.J.Clin.Oncol.，2007，12，395中所描述的***)中来进行。在这类病例中，理想的近距离放射治疗设备为在受治疗部位中显示出均匀分布及稳定性的设备。
根据实验数据，现已发现组织抗生物素蛋白化可在不同组织中出现，如：在肌肉、乳腺(显示于此处的实施例中)及脑组织中。
于另一特佳实施方式中，该复合的氧化的抗生物素蛋白-生物素化的治疗剂可经由将二种成分混合来取得，再接着投给患者。
本发明的组合物构成用于可手术或不可手术或不可完全移除的实体肿瘤的治疗的药物，这些肿瘤是诸如，但不只限于：乳癌、胰脏癌、肺癌、胸膜癌、腹膜癌、面颈癌、膀胱癌、脑癌、***癌、卵巢癌、眼癌及其他器官的癌(如以本申请人的名义申请的专利申请案WO2004/093916中所描述者)。
根据本发明的优选实施方式，该借由本发明的方法所取得的氧化的抗生物素蛋白可定义为经化学改质的抗生物素蛋白，该经化学改质的抗生物素蛋白中至少一甘露糖残基已被下列式(I)的残基取代
本发明的另一目的为先前描述的药学组合物加上赋形剂及/或药学上可接受的稀释剂。
本发明的另一优选实施方式为用于制备药学组合物的方法，该方法的特征为将该经化学改质的抗生物素蛋白与合适的赋形剂、稳定剂及/或药学上可接受的稀释剂混合。
赋形剂为加入药物中以提供体积的惰性物质。
该药学组合物也可含有为投与治疗剂的药学上可接受的载体。这类载体包括抗体及其他多肽、基因和其他治疗剂(诸如脂质体)，其先决条件为投与该载体时不会产生不当的毒性。
合适的载体可为大的、慢慢代谢的巨分子，诸如蛋白质、多醣、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物及非活性的病毒颗粒。
药学上可接受的载体的详尽讨论可在Remington′sPharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中找到。
治疗组合物中的药学上可接受的载体可另外含有液体，诸如水、生理食盐水、甘油及乙醇。
另外，这类组合物中也可存有辅助性物质，诸如湿润或乳化剂、pH缓冲物质等。这类载体使药学组合物可配制成冻干块、片剂、药丸、糖衣锭、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆体、混悬液等形式以供患者食入。
欲治疗的个体可为动物；尤其是可用来治疗人类个体。
配药治疗可为单剂量用药或多剂量用药。该剂量可由该领域的技术人员决定，以递送展现有效的治疗作用的量至标靶组织。
一般的剂量范围可介于10-100毫升的浓度为3-5毫克/毫升的氧化的抗生物素蛋白溶液。剂量体积是取决于欲治疗的标靶组织的体积，即，***四分之一切除术(quadrantectomy)的部位周围的***区域的典型治疗中是使用30毫升(Paganelli G.，et al.，The Breast，2007，16，17)或治疗腹膜腔中是使用至多100毫升。
氧化的抗生物素蛋白的生化特征包括借由本领域的技术人员已知的比色
法(Avigad G.，Anal.Biochem.，1983，134，2，499)，使用丙醛作为标准来估计CHO基团。
附图简要说明
图1：
其显示三种不同形式的抗生物素蛋白的UV光谱。
图2：
曲线A、B及C分别关于在体积排阻色谱法(Biosep-SEC-S3000柱(300x7.8毫米，体积：14.3毫升))上的WTavidin、OXavidinHABA及OXavidin的洗脱变化形廓，该层析法是利用恒组成溶剂洗脱条件，以100mM醋酸钠缓冲液pH5.5及0.15M NaCl，流速1毫升/分钟，在室温下进行。后二者是利用NaIO4(20mM)，借氧化作用自WTavidin取得。280/260比是关于抗生物素蛋白在色胺酸残基的氧化及羟吲哚的形成方面的完整性。
图3：
其显示经肌肉内给予后，在受治疗的小鼠中的氧化的抗生物素蛋白的生物分布。尤其是，图3a指出注射后1小时，在受治疗的肢体中氧化的抗生物素蛋白的量超过二倍的天然抗生物素蛋白。其差异随时间增加：天然抗生物素蛋白在24和48小时后几乎测不到，而氧化的抗生物素蛋白分别代表约22％及15％注射剂量/100毫克组织。因此，如图3b、c及d中分别显示的血液、肾脏及肝脏的结果，在受治疗的肢体中，与野生型抗生物素蛋白相比较，较高浓度的氧化的抗生物素蛋白是与非标靶器官中氧化的抗生物素蛋白的分布较少及野生型抗生物素蛋白的分布较多有关，尤其是在第1小时中。图3e显示对侧肢体中氧化的抗生物素蛋白及野生型抗生物素蛋白的分布情形。
图4：
其显示经125I-放射性标记的WTavidin及OXavidinHABA在受治疗及对侧肢体中至多14周的组织持久性。参考第1小时的水平时，这类图形指出相对于WTavidin的组织半衰期为2小时，OXavidinHABA的组织半衰期为约2周。
图5：
其显示以配制在100mM醋酸盐缓冲液pH5.5中的45微克(在15微升体积中)经125I-标记的WTavidin、PEGavidin或OXavidin注射Balb/c小鼠的一边后肢后24小时，WTavidin、PEGavidin及OXavidinHABA的组织持久性。在受治疗的肢体中的放射活性是借由γ计数器测量(Camberra Packard，Schwadorf Austria)。
图6：
其显示取自注射WTavidin(板面a)或OXavidinHABA(板面b)的Balb/c小鼠肌肉的切片，该切片是先以用于免疫萤光的抗-抗生物素蛋白抗体：小鼠抗-抗生物素蛋白腹水(A5680批次064K4826，SigmaAldrich)，再以抗小鼠Alexa Fluor 488(批次99E2.2，分子探针)染色。板面a显示微弱的局部点状，而来自注射OXavidinHABA的肌肉的切片显示强而均匀的分布。二种情况中抗生物素蛋白均定位在间质。
图7：
其显示在经i.v.，注射111In-ST2210的Balb/c小鼠后肢中于不同时点的持久性，该Balb/c小鼠是在48小时前以WTavidin或OXavidinHABA(板面a)处理。板面b、c及d是分别指经i.v.注射111In-ST2210后肝脏、肾及脾脏中所捕集的111In-ST2210。
板面e显示组织抗生物素蛋白化48小时后所捕集的111In-ST2210。在第二个案例的情况中(重复111In-ST2210)，所述动物空腹接受一个冷ST2210(cold ST2210)剂量，24小时后再给予第二个111In-ST2210剂量。
图8：
其显示注射在一只后肢中1周后，与ST2210复合的WTavidin或OXavidinHABA的组织停留时间。
图9：
其显示注射入头骨左侧后24小时，OXavidinHABA的脑组织停留时间。
下列实施例进一步说明本发明而非限制本发明。
实施例
实施例1：氧化的抗生物素蛋白的合成方法及生化特征
该氧化程序的方法包含下列连续步骤：
a)将预先与一摩尔过量的HABA混合的野生型抗生物素蛋白与氧化剂(诸如在pH值低于6.0的50-100mM醋酸盐缓冲液中的10-20mM过碘酸钠)于4℃或室温下培养1-5小时；
b)阻断反应，并借由色谱法、超滤作用、透析作用或其他本领域的技术人员所已知的纯化方法移除氧化剂及HABA，以进行纯化；及
c)在酸性pH下进行冻干或制剂。
将氧化的抗生物素蛋白在Biosep-SEC-S3000柱(300×7.8毫米，体积：14.3毫升)上，利用恒组成溶剂洗脱条件，以100mM醋酸钠缓冲液pH5.5及0.15M NaCl，流速1毫升/分钟，在室温下利用体积排阻色谱法，以进一步分析分子尺寸。
如图2所示，氧化的抗生物素蛋白的洗提液显示出与天然抗生物素蛋白相比较稍有些延迟。
实施例2：氧化的抗生物素蛋白在受治疗的小鼠中的生物分布
在小鼠模型的刺激性
中评估与野生型抗生物素蛋白(WTavidin)相比较，氧化的抗生物素蛋白(Oxavidin)在受治疗的组织中的持久性、其在未受治疗的器官中的生物分布及其捕捉111In-ST2210的能力。
手术切开一小鼠后肢以建立
的动物模型，令经放射性标记的抗生物素蛋白浸润手术边缘和周围组织并在投药后于不同时间点测量受治疗肢体中的放射活性。在小鼠的平行组中令放射活性的抗生物素蛋白浸润未手术的肢体中。
在投药后的1及24小时，经手术治疗及未经手术治疗的动物中的放射活性量类似。因此，通过浸润抗生物素蛋白而不手术来进行进一步研究。根据IodoGen方法(伊利诺州(IL)Rockford市，Pierce)，以125I(意大利，Perkin Elmer)标示WTavidin。在PD-10柱(瑞典Uppsala，Amersham Biosciences)上借由色谱法将经标记的抗生物素蛋白自游离碘分离出并依先前实施例1中的描述进行氧化，无任何预先的HABA保护。
根据先前描述的方法(Urbano N.，et al.，Eur.J Nucl.Med.Mol.Imaging，2007，34，68)，以111In(意大利，Perkin Elmer)标示专利申请案WO 02/066075中所描述的ST2210(第18页，1-[2-[6-[5-[(3aS，4S，6aR)-六氢-2-氧代-1H-噻吩并[3，4-d]咪唑-4-基]-1-五氨基]-1-六氨基]-2-氧代乙基]-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-4，7，10-三醋酸五盐酸盐)。
将Balb/c nu/nu小鼠(意大利，Harlan Udine)分成8组，每组5只。经由肌肉内途径(i.m.)在每只小鼠的一只后肢中给予以125I标示的WTavidin或OXavidin(400微克/小鼠，在40微升的体积中)并在1、24或48小时后经由静脉内途径(i.v.)给予小鼠16微克的111In-ST2210。
投与111In-ST2210后的1、24或48小时处死小鼠并收集受治疗及对侧的肢体、肾脏、肝脏及血液样本，在γ-计数器(奥地利Schwadorf，Camberra Packard)中计算。
如图3a中所示，注射1小时后，受治疗的肢体中，氧化的抗生物素蛋白的量超过二倍的抗生物素蛋白。其差异随时间增加：WTavidin在24及48小时后几乎测不到，而OXavidin分别为约22％及15％的注射剂量/100毫克组织。因此，如图3b、c及d中的血液、肾脏及肝脏的结果所示，在受治疗的肢体中，与野生型抗生物素蛋白相比较，较高浓度的氧化的抗生物素蛋白是与非标靶器官中氧化的抗生物素蛋白的分布较少及野生性抗生物素蛋白的分布较多有关，尤其是在第1小时中。图3e显示对侧肢体中OXavidin及WTavidin的分布情形。
如专利申请案WO 2004/093916中所描述，由于
预先局部投与WTavidin(手术间注射)，4-72小时后再经由静脉内途径注射抗癌剂，显然地，使用经化学改质的抗生物素蛋白(如本发明的实施例中)可提供很好的助益。
实施例3：野生型及氧化的抗生物素蛋白的长期组织持久性
在Balb/c nu/nu小鼠(意大利Lecco，Charles River)的一只后肢中注射体积为15微升的配制在pH5.5的100mM醋酸盐缓冲液中的45微克以125I标示的WTavidin或以125I标示的OXavidin并在指出的时间点处死小鼠，借γ-计数器(奥地利Schwadorf，Camberra Packard)测量受治疗的肢体及其他非标靶器官中的放射活性。
监测WTavidin及OXavidinHABA的组织持久性至多14周。当指1小时的水平时，相对于WTavidin的组织半衰期为2小时，OXavidin的组织半衰期为约2周(图4)。
实施例4：氧化的抗生物素蛋白在***组织中的生物分布
评估与WTavidin相比较，OXavidinHABA在***组织中的持久性。将依实施例1中所描述的一般方法制备的50微克(在15微升体积中)的以125I标示的WTavidin或OXavidinHABA投至兔子(意大利Rieti，FrancucciEnzo)***下方的***区域(每一抗生物素蛋白3个***)。注射后24小时处死动物并自注射区收集约200毫克的组织样本，依前述那样在γ-计数器中计算。该数据为3个测定值的平均值(+/-SD)。
表4中的数据显示出24小时后***组织中的WTavidin及OXavidinHABA分别为8.5％及65.8％ID。这些数据确认与先前在小鼠的肌肉组织中所观察到的WTavidin相比较，兔子***组织中的OXavidinHABA具较高的持久性。
表4：兔子***组织中WTavidin及OXavidinHABA的24小时持久性
实施例5：野生型、聚乙二醇化或氧化的抗生物素蛋白的组织持久性
其他科学小组先前曾描述意图改良抗生物素蛋白在循环***中的半衰期的经化学改质的抗生物素蛋白(Caliceti P.，et al.，J.Control.Release，2002，83，97；Salmaso S.，et al.，Int.J.Pharm.，2007，340，20)。在C57B1/6小鼠中(意大利Lecco，CharlesRiver)评估WTavidin、根据Caliceti制备的PEGavidin或OXavidinHABA(根据本发明的氧化的抗生物素蛋白)的组织持久性。在动物的一只后肢中注射(i.m.)体积为15微升的在pH5.5的100mM醋酸盐缓冲液中配制的45微克以125I标示的WTavidin、PEG-avidin或OXavidinHABA。注射后24小时处死小鼠，用γ-计数器(奥地利Schwadorf，CamberraPackard)测量受治疗的肢体中的放射活性。
PEG-结合作用不会影响WTavidin的组织持久性，但可确认OXavidinHABA的组织持久性增加(图5)。
实施例6：WTavidin或OXavidinHABA的组织定位
在Balb/c裸鼠(意大利Udine，Harlan)的一只后肢中经肌肉内注射OXavidinHABA及WTavidin后，在抗生物素蛋白化组织的冷冻切片中评估与WTavidin相比较，OXavidinHABA的组织定位。治疗后24小时切开肌肉并自各样本制备一系列冷冻切片。将各载玻片以苏木精/洋红染色以评估组织形态或将其先与小鼠抗-抗生物素蛋白抗体(意大利，SigmaAldrich，A5680)一起培养，再与抗-小鼠Alexa fluor488(意大利米兰，Invitrogen)一起培养。最后，在载玻片上盖上盖玻片并在显微镜下观察。如图6中所示，自注射WTavidin(板面a)的肌肉取得的切片显示出微弱的局部点状，而来自注射OXavidinHABA的肌肉的切片(板面b)显示强而均匀的分布。在二种情况中抗生物素蛋白均定位在间质处。苏木精/洋红染色显示出以WTavidin或OXavidinHABA注射后24小时肌肉并无组织学上的异常(数据未显示)。
实施例7：111In-ST2210的单次及重复捕集
在小鼠模型的刺激性
中评估与WTavidin相比较，OXavidinHABA捕集111In-ST2210的能力。
在Balb/c nu/nu小鼠(意大利，Harlan Udine)的一只后肢中注射(i.m.)体积为15微升的配制在pH5.5的100mM醋酸盐缓冲液中的45微克WTavidin或OXavidinHABA。注射后48小时，经由静脉内途径(i.v.)给予动物5微克的111In-ST2210。
在指定的时间点处死各为5只的动物组并用γ-计数器(奥地利Schwadorf，Camberra Packard)测量受治疗的肢体及其他非标靶器官中的放射活性。
如图7a中所示，在i.v.注射2小时后，以OXavidinHABA治疗的组织所特异捕集的111In-ST2210较以WTavidin治疗者高出很多。这些放射活性的持久性差异在i.v.投与111In-ST2210后的接续时点仍可持续至多24小时，由此可确认以OXavidinHABA取得的长期持续的组织抗生物素蛋白化。以WTavidin及OXavidinHABA治疗时，111In-ST2210在非标靶器官中的分布类似(图7b、c、d)。
令一组动物先接受5微克冷ST2210的第1个静脉内剂量后24小时再接受5微克111In-ST2210的第2个剂量。前者是在抗生物素蛋白化24小时后进行。经i.v.注射经放射性标示的ST2210后2小时处死动物并依上述γ-计数器测量受治疗的肢体中的放射活性。
如图7e中所示，以OXavidinHABA治疗的肢体中所捕集的第二个111In-ST2210剂量的量与以单一剂量所捕集者相当。此结果暗示本研究中所使用的单一ST2210剂量并未使该抗生物素蛋白化组织被浸透饱和，而将给定的所欲剂量分成几部分是合适的。
实施例8：在NeuT转基因小鼠中的111In/90Y-ST2210捕集及疗效
意大利托林(Turin)大学Guido Forni教授亲切提供携带活化的大鼠HER-2/neu致癌基因的Balb/c转基因小鼠(Balb-NeuT小鼠)(DiCarlo E.，et al.，Lab.Invest.，1999，79，10，1261)。在动物12周大时(此时期相当于动物的所有10个***中原位发展出癌症的期间)为每组四只的动物的二边IV***经***内途径注射25微升(3.3毫克/毫升)的介质、WTavidin或OXavidinHABA。48小时后给予(i.v.)动物剂量为4.4微克的经放射标示的ST2210。此剂量相当于用于治疗目的的800μCi的90Y(40μCi的111In-ST2210突起是用于计算剂量)。在投药后3小时处死2只动物/组并切开***IV及III，依上述在γ-计数器中计算。也收集非标靶器官进行称重及计算。数据以％D/克组织表示。依前述的乳腺整体分析来评估此预先靶向的近距离放射治疗对肿瘤损害的效果(De Giovanni C.，et al.，Cancer Research，2004，64，4001)。
表5中所示的数据指出在NeuT小鼠中，经OXavidinHABA治疗的IV***中有明显的经放射标示的ST2210的特异捕集，但在经WTavidin治疗及经介质治疗的IV***中均无。来自所有动物组的***III为阴性(血液背景水平)，此暗示抗生物素蛋白化是仅局限于受治疗的***。全部数据与先前关于WTavidin及OXavidinHABA的组织持久性方面的差异相一致。在任何案例中，血液及非标靶器官(包括肾脏、肝脏及脾脏)中的背景放射活性均低于0.2％ID/克组织，此暗示不需如目前的变体般以生物素化白蛋白进行追踪步骤。此以OXavidinHABA为基础的近距离放射治疗对NeuT小鼠的乳腺的效果使经OXavidinHABA治疗的***中的癌症损害与经载剂或WTavidin治疗的***相比较明显减少(数据未显示)。
表5
实施例9：单步骤近距离放射治疗
在体外以ST2210将125I-OXavidinHABA饱和后借由超滤作用将125I-OXavidinHABA自未结合的ST2210中纯化出来，再将其经由肌肉内途径注射入Balb/c小鼠的一只后肢中。在WTavidin方面也依循相同的实验计划。
1周后，将受治疗的肢体中该以ST2210饱和的WTavidin或OXavidinHABA的量与游离的WTavidin或OXavidinHABA相比较。图8中的结果同时指出在注射后一周仍存有与ST2210复合的OXavidinHABA或未复合的OXavidinHABA(17％ID/100毫克)，WTavidin则几乎完全消失(＜0.5％ID/100毫克)，由此可证明预先以生物素化试剂饱和的OXavidinHABA与游离OXavidinHABA有相同的作用方式，其可用于单步骤近距离放射治疗。
实施例10：OXavidinHABA与WTavidin相比较的脑部持久性
在全身麻醉下，将5微升体积(16微克剂量)依前述制备的125I-WTavidin或OXavidinHABA注射至Balb/c小鼠的脑部。注射入脑部时是使用Hamilton注射器通过头骨左侧，深度达4-5毫米。图9中的结果指出：类似于肌肉和***，于注射后24小时，仪在脑部的OXavidinHABA为约12.65±6.59％ID/100毫克组织。如先前在其他组织中所评估者，WTavidin的量低于2.08±1.03％ID/100毫克组织。此结果指出OXavidinHABA可用于脑瘤的近距离放射治疗中或用来眶准脑部生物素化的治疗剂。
Claims (15)
1.一种氧化的抗生物素蛋白，其中每一抗生物素蛋白分子至少有一甘露糖残基被下式所示的残基所取代
所述氧化的抗生物素蛋白包含8至15个醛部分且具有等于或高于78℃的热稳定性。
2.一种复合物，其是由如权利要求1的氧化的抗生物素蛋白及生物素化的治疗剂所组成。
3.如权利要求2的复合物，其中该生物素化的治疗剂为抗癌剂。
4.一种如权利要求2或3的复合物在制备治疗癌症或治疗自体免疫/退化性/遗传性疾病的药物中的用途。
5.一种如权利要求1的氧化的抗生物素蛋白在制备治疗癌症或治疗自体免疫/退化性/遗传性疾病的药物中的用途，其中该氧化的抗生物素蛋白是在治疗的第一个步骤中投与，接着投与生物素化的治疗剂。
6.如权利要求4或5的用途，其是在近距离放射治疗中用于治疗罹患癌症的患者。
7.如权利要求6的用途，其中所述癌症为乳癌、胰脏癌、肺癌、胸膜癌、腹膜癌、面颈癌、膀胱癌、脑癌、***癌、卵巢癌或眼癌。
8.如权利要求6的用途，其中该生物素化的治疗剂是选自放射性同位素、化疗剂、细胞因子、毒素及抗癌细胞。
9.如权利要求4或5的用途，其中该生物素化的治疗剂为用于治疗癌症、退化性或遗传性疾病的生物素化的干细胞或体细胞。
10.如权利要求1的氧化的抗生物素蛋白在制备药物中的用途，其中所述氧化的抗生物素蛋白任选与生物素化的治疗剂组成复合物，所述药物是应用于可用来治疗自体免疫/退化性/遗传性疾病的组织再生中，该自体免疫/退化性/遗传性疾病包括糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、阿尔兹海默氏症、脊髓受伤、杜兴氏肌肉失养症、心肌梗死及中风。
11.如权利要求8的用途，其中所述放射性同位素是选自Fe-52、Mn-52m、Co-55、Cu-64、Ga-67、Ga-68、Tc-99m、In-111、I-123、I-125、I-131、P-32、Sc-47、Cu-67、Y-90、Pd-109、Ag-111、I-131、Pm-149、Re-186、Re-188、A t-211、Pb-212、Bi-212及Lu-177。
12.一种药学组合物，其包含如权利要求1至3中任一项的氧化的抗生物素蛋白或复合物以及药学上可接受的赋形剂。
13.一种试剂盒，其包含在一种容器中的如权利要求12的药学组合物及在第二种容器中的生物素化的治疗剂，所述药学组合物包含如权利要求1的氧化的抗生物素蛋白。
14.如权利要求13的试剂盒，其是用于二步骤的辅助性手术间及围手术期的局部区域及/或***性疗法中，其中所述二种容器为注射器形式。
15.一种氧化抗生物素蛋白的方法，其中该氧化作用包括下列步骤：
a)将预先与摩尔过量的HABA混合的野生型抗生物素蛋白与在pH值低于6.0的50-100mM醋酸盐缓冲液中的10-20mM过碘酸钠于4℃或室温下培养1-5小时；
b)阻断反应，并借由色谱法、超滤作用、透析作用或其他本领域的技术人员所已知的纯化方法移除氧化剂及HABA，以进行纯化；及
c)在酸性pH下进行冻干或制剂。
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