CN101766584B - 聚乙二醇/水溶性壳聚糖协同修饰的长循环可降解聚合物纳米微囊及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚乙二醇/水溶性壳聚糖协同修饰的长循环可降解聚合物纳米微囊及其制备方法。本发明的纳米微囊以可生物降解聚合物为壳材，水溶性药物/蛋白为芯材，通过具有良好生物相容性的聚乙二醇和水溶性壳聚糖的协同作用来构建平均粒径大小为70～200nm、体内半停留时间高达60小时以上的长循环可降解聚合物纳米微囊。本发明对纳米微囊型药物载体进行修饰后，可大大提高微囊表面的亲水性，使表面电荷接近于中性，从而有利于避免体内网状内皮***的吞噬，达到长循环的效果，对于药物靶向输送体系效用的提高具有重要意义，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种长循环可降解聚合物纳米微囊及其制备方法，更具体涉及以具有良好生物相容性的聚乙二醇和水溶性壳聚糖协同修饰的可降解聚合物纳米微囊及其制备方法。
背景技术
由于具有良好的生物相容性、生物降解性以及对药物或蛋白质释放的可控性，可降解聚合物(尤其是聚己内酯、聚乳酸或聚乳酸-乙交酯)纳米微囊被广泛用作药物、蛋白质质和基因等的载体材料，发展迅猛。然而，和其它的纳米粒子相同，由于血浆蛋白质的调理和网状内皮细胞的吞噬作用，纳米微囊一旦进入血液循环，会迅速被体内网状内皮***识别、捕获而从体循环中被清除掉，从而极大地影响其在病灶靶位的富集以及治疗效果。因此，体内循环时间是影响纳米微囊治疗效果的主要因素之一。通过对纳米粒表面进行修饰构建长循环纳米粒是制备高效、长效纳米微囊药物输送体系的关键手段之一。
已有的研究结果表明，微囊的粒径、表面性质，如电荷、亲水性等直接影响到纳米载药***的体内循环时间和靶区的药物浓度。有报道指出，构建体内长循环纳米粒子的理想粒径范围为70-200nm(Zhao J，Liu CS，Yuan Y，Tao XY，Shan XQ，Sheng Y等，Preparation of hemoglobin-loaded nano-sizedparticles with porous structure as oxygen carriers.Biomaterials2007；28：1414-22.)。纳米粒的表面电荷直接影响纳米粒子与体内物质如调理素等的静电作用力(Zahr AS，Davis CA，Pishko MV.Macrophage uptake ofcore-shell nanoparticles surface modified with poly(ethylene glycol).Langmuir 2006；22：8178-85)。带电的表面往往使纳米粒相对于中性的表面在体内更容易被清除。一般而言，纳米粒的表面亲脂性越大，则其对调理蛋白质的结合力越强(Illium L，Hunneyball IM，Davis SS.The effect ofhydrophilic coatings on the uptake of colloidal particles by the liverand by peritoneal macrophages.Int J Pharm 1986；29：53-65)。故要延长纳米粒在体内的循环时间，则需要增加其表面的亲水性。因此在对纳米粒进行表面修饰时一般选用非离子型的表面活性剂和亲水性材料。目前，用于纳米粒表面修饰的聚合物材料主要包括：聚乙二醇(PEG)、多糖、聚乙烯醇等。其中，PEG是目前认为最有效的修饰材料(Gref R.，Minamitake Y，Peracchia MT，Trubetskoy V，Torchilin V，Langer R.Biodegradable long-circulatingpolymeric nanospheres.Science 1994；263：1600-3)。经PEG修饰的聚合物纳米粒表面亲水性大大提高，而且PEG分子可在微囊表面形成一层类似于“毛刷状”的结构，从而有效地躲避巨噬细胞的吞噬、延长体内循环时间，减少肝、脾的摄取。目前采用PEG修饰的聚合物纳米微球在老鼠体内的半停留时间最长可达24.2小时(Chang TMS，Powanda D，Yu WP.Analysis ofpolyethylene-glycol-polylactide nano-dimension artificial red bloodcells in maintaining systemic hemoglobin levels and prevention ofmethemoglobin formation.Artif Cells Blood Substit Biotechnol2003；31：231-47)。肝素、葡聚糖等多糖被证明可有效减少吞噬细胞的吞噬，延长纳米粒在体内的循环时间，但效果明显不如PEG修饰。尽管通过PEG、多糖等进行修饰可在一定程度上延长纳米粒在血液中的停留时间，但仍然很难满足临床的需求。
因此，本领域迫切需要开发一种具有更长血液半停留时间(长循环)、可生物降解的纳米微囊。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有更长血液半停留时间(长循环)、可生物降解的纳米微囊。
本发明的另一目的在于提供一种本发明微囊的制备方法。
在本发明的第一方面，提供了一种聚乙二醇/水溶性壳聚糖协同修饰的长循环可降解聚合物纳米微囊，所述微囊包括：
(a)以药物和/或蛋白质为芯材(即芯材为药物和/或蛋白质，其中所述的药物为非蛋白质类化合物或提取物)；
(b)以含有聚乙二醇生物可降解性聚合物为壳材，并且所述的壳材包裹所述的芯材，并且在所述壳材中聚乙二醇共价键合于聚合物；
(c)水溶性壳聚糖外层，所述的水溶性壳聚糖外层包覆于所述的壳材上；
并且所述微囊的平均粒径为70-200nm。
在另一优选例中，所述的水溶性壳聚糖通过物理作用吸附于壳材表面。
在另一优选例中，所述微囊中大于75体积％(较佳地85体积％，更佳地大于90体积％)微囊的粒径为80-180nm。
在另一优选例中，所述的可降解聚合物壳材包括：聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-乙交酯、聚己内酯聚乙二醇共聚物、聚乳酸聚乙二醇共聚物、聚乳酸-乙交酯聚乙二醇共聚物、或其组合。
在另一优选例中，所述聚己内酯聚乙二醇共聚物、聚乳酸聚乙二醇共聚物或聚乳酸-乙交酯聚乙二醇共聚物中聚己内酯、聚乳酸或聚乳酸-乙交酯与聚乙二醇的质量比为40∶60-95∶5。
在另一优选例中，所述壳材聚合物的重均分子量为15000-300000道尔顿。
在另一优选例中，所述微囊在哺乳动物(如小鼠)体内的血液半停留时间大于30小时，较佳地，所述的血液半停留时间大于40小时，较佳地大于50小时，更佳地大于60小时(上限没有特别限制，通常为小于200小时)。
在另一优选例中，所述的微囊与水的静态接触角≤18度，较佳地≤16度，更佳地≤15度。
更佳地，所述的静态接触角是通过以下方法测定的：
将1mg/mL微囊悬浮液悬涂于干净平滑的载玻片上，转速为1500rpm，时间45s。于60℃下将体系中的水分挥发完全形成纳米微囊膜。然后在25℃下，使用静态接触角仪测量纳米微囊表面的静态接触角。
在另一优选例中，所述的微囊的用ζ电位表示的表面电荷为-10至10eV，更佳地为-8至8eV。
在另一优选例中，所述芯材包括：水溶性药物或蛋白质。
在另一优选例中，所述水溶性壳聚糖包括脱乙酰化壳聚糖(部分脱乙酰化的壳聚糖和全部脱乙酰化的壳聚糖)、羧化壳聚糖、氯化壳聚糖、类透明质酸壳聚糖、或其组合。
在另一优选例中，所述水溶性壳聚糖的重均分子量为50000-500000道尔顿。
在另一优选例中，所述的微囊是用本发明第二方面中所述的方法制备的。
在本发明的第二方面，提供了一种制备本发明第一方面中所述的聚乙二醇/水溶性壳聚糖协同修饰的长循环可降解聚合物纳米微囊的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提供有机溶液O，所述有机溶液O中溶解有作为壳材的聚乙二醇生物可降解性聚合物；
(2)将溶液W1与步骤(1)所得的有机溶液O混合，经超声波分散、剪切分散和/或均质分散(如高压均质分散)，形成初乳液W1/O，
其中所述的溶液W1为水溶性药物/蛋白的水溶液；
(3)将步骤(2)所得的初乳液W1/O与外水相W2混合，经超声波分散、剪切分散和/或均质分散(如高压均质分散)，形成复乳液W1/O/W2，
其中所述的W2外水相为含有水溶性壳聚糖和表面活性剂的水溶液；
(4)将步骤(3)所得的复乳液加入到水溶性壳聚糖的水分散液或等渗溶液中，挥去有机溶剂，从而获得表面硬化成型的微囊；
(5)分离步骤(4)所形成的微囊。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(6)：将获得的微囊分散于生理盐水或等渗溶液。
在另一优选例中，所述的W2外水相为含有水溶性壳聚糖、表面活性剂和氯化钠的水溶液，其中水溶性壳聚糖的质量浓度为0.1～30％，表面活性剂的质量浓度为0.1％～10％，氯化钠的质量浓度为0.5％～10％，和/或所用的表面活性剂选自：Tween60、Tween80、Tween85、泊洛沙姆188、泊洛沙姆908或其组合。
在另一优选例中，所述的有机溶剂选自二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮或其组合。
在另一优选例中，所述的水溶性药物/蛋白的质量浓度为0.01％～35％，氯化钠的质量浓度为0.9％。
在另一优选例中，所述的溶液W1和/或所述的W2外水相中还含有氯化钠，且氯化钠的质量浓度为0.1％～10％，更佳地为0.5％～2％。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：对分离的微囊进行冻干。
在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有药学上可接受的载体和本发明第一方面中所述的聚乙二醇/水溶性壳聚糖协同修饰的长循环可降解聚合物纳米微囊。
应理解，在本发明范围内，本申请上述以及下述的各技术特征可以各种方式进行组合，以构成各种优选例。例如，对于氯化钠一般浓度范围0.1％～10％和优选范围0.5％～2％而言，一般范围的下限(0.1％)可以与优选范围的上限(2％)进行组合，从而构成范围0.1-2％。
附图说明
图1为纳米微囊冻干粉的电镜照片(放大倍数20000)。
图2为纳米微囊的激光粒径分布图。
图3为纳米微囊表面电荷的比较(单位：eV)。
图4为纳米微囊血药浓度随时间变化的曲线图。
发明详述
本发明经过广泛而深入的研究，首次通过水溶性壳聚糖和PEG的协同作用，制备了长循环的长效纳米微囊。本发明的微囊以含有聚乙二醇的可生物降解聚合物为壳材，并在外水相中加入水溶性壳聚糖，通过聚乙二醇和水溶性壳聚糖的协同作用来制备平均粒径大小为70-200nm(满足长循环粒径基本要求)的长循环可降解聚合物纳米微囊。实验表明，本发明制备的纳米微囊，聚乙二醇和水溶性壳聚糖同时覆盖于纳米微囊表面，使得纳米微囊表面的亲水性大大提高，表面电荷趋于中性，聚乙二醇的分子构象更佳，因而可延长体内滞留时间，以获得更充足的时间到达病变靶位，实现长效、有效的治疗效果。在此基础上完成了本发明。
壳聚糖
壳聚糖作为一种重要的多糖，因其优良的生物相容性、生物可降解性、安全无毒和价格低廉等特点在生物学领域广泛应用。然而，壳聚糖在水中的溶解度低，限制了其在药物载体领域的应用。近年来，大量的研究工作制备了各种水溶性壳聚糖，被赋予了优良的亲水性并且保持了原有的生物学优点。
可用于本发明的壳聚糖没有特别限制，可以是各种常规的水溶性壳聚糖，代表性的例子包括(但并不限于)：
所述水溶性壳聚糖包括脱乙酰化壳聚糖(包括部分脱乙酰化的壳聚糖和全部脱乙酰化的壳聚糖)、羧化壳聚糖、氯化壳聚糖、类透明质酸壳聚糖、或其组合。
在本发明的纳米微囊中，所述的水溶性壳聚糖通过物理作用吸附于微囊表面。
聚乙二醇生物可降解性聚合物
如本文所用，术语“聚乙二醇生物可降解性聚合物”指聚乙二醇作为单体参与聚合反应、或经过聚乙二醇修饰过的可生物降解的聚合物。较佳地，所述的聚乙二醇通过共价键结合于所述的聚合物。
可用于本发明的聚乙二醇生物可降解性聚合物没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-乙交酯、聚己内酯聚乙二醇共聚物、聚乳酸聚乙二醇共聚物、聚乳酸-乙交酯聚乙二醇共聚物、或其组合。
更佳地，所述聚己内酯聚乙二醇共聚物、聚乳酸聚乙二醇共聚物或聚乳酸-乙交酯聚乙二醇共聚物中聚己内酯、聚乳酸或聚乳酸-乙交酯与聚乙二醇的质量比为40∶60-95∶5。
另外，优选的适用于本发明的壳材聚合物的重均分子量为15000-300000道尔顿，较佳地为20000-250000道尔顿。
本发明的微囊和协同作用
简而言之，本发明的一种聚乙二醇/水溶性壳聚糖协同修饰的长循环可降解聚合物纳米微囊包括：
(a)以药物和/或蛋白质为芯材(即芯材为药物和/或蛋白质，其中所述的药物为非蛋白质类化合物或提取物)；
(b)以含有聚乙二醇生物可降解性聚合物为壳材，并且所述的壳材包裹所述的芯材，并且在所述壳材中聚乙二醇共价键合于聚合物；
(c)水溶性壳聚糖外层，所述的水溶性壳聚糖外层包覆于所述的壳材上；
并且所述微囊的平均粒径为70-200nm。
普通纳米粒进入体循环***后，易被单核巨噬细胞***(MPS)识别和吞噬，从而降低药物在病灶部位的浓度。与之相反，本发明通过PEG和可溶性壳聚糖材料协同修饰纳米微囊表面后，使得纳米微囊表面的亲水性大大提高，电性趋于中性，(故而可能PEG的分子构象更佳并可以有利于避免单核巨噬细胞***的吞噬)，从而获得更充足的时间到达靶向部分，有望成为理想的靶向药物载体。
为了便于理解本发明，本发明人提供了以下基本机理。然而，应理解，本发明的保护范围并不受限于本发明的基本机理。
申请人认为，通过水溶性壳聚糖和PEG的协同作用，主要通过以下因素延长纳米微囊在血液中的循环时间：提高血液半停留时间：提高微囊表面的亲水性、调节表面电荷接近中性，以及调控PEG在微囊表面的构象。
具体而言，聚乙二醇通过其在纳米微囊的表面构象来躲避体内巨噬细胞的吞噬，延长体内停留时间。水溶性壳聚糖作为一种聚多糖可以有效调节微囊的表面电荷和亲水性从而抑制调理；同时，水溶性壳聚糖作为一种表面活性剂可调控纳米微囊的形成过程。
微囊及其制备方法
本发明提供了具有长的半血停留时间的微囊及其制备方法。
通常，本发明的制备方法包括以下步骤：
(1)提供有机溶液O，所述有机溶液O中溶解有作为壳材的聚乙二醇生物可降解性聚合物；
(2)将溶液W1与步骤(1)所得的有机溶液O混合，经超声波分散、剪切分散和/或均质分散，形成初乳液W1/O，
(3)将步骤(2)所得的初乳液W1/O与外水相W2混合，经超声波分散、剪切分散和/或均质分散，形成复乳液W1/O/W2，
(4)将步骤(3)所得的复乳液加入到水溶性壳聚糖的水分散液或等渗溶液中，挥去有机溶剂，从而获得表面硬化成型的微囊；
(5)分离步骤(4)所形成的微囊。
此外，本发明方法制得的长循环聚合物纳米微囊可任选被冻干，从而制得微囊冻干粉。
在一个具体实施方式中，还制备了纳米血红蛋白微囊，其中，外水相多采用生理盐水、等渗溶液等，优选等渗溶液，以防止微囊静脉输注后，由于微囊内外环境渗透压的差别在注射部位附近就迅速破坏。所述等渗溶液的组分和质量浓度为：NaCl 6.8g/L；CaCl2 0.2g/L；KCl 0.4g/L；MgSO4 0.1g/L；NaHCO32.2g/L；Na2HPO4·12H2O 0.126g/L；NaH2PO4·2H2O 0.26g/L。
药物组合物
由于本发明微囊具有优异的血半停留时间，因此本发明微囊可用作靶向药物载体。
本发明还提供了一种组合物(如药物组合物、疫苗组合物等)，所述的组合物本发明微囊及药学上可接受的赋形剂或载体。
“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温
)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明的药物组合物的剂型没有特别限制，可以是固体剂型如胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂；也可以是液体剂型，例如口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。
用于肠胃外注射的组合物包括生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
本发明的主要优点在于：
(a)本发明制备的表面修饰的纳米微囊在体循环中滞留时间可长达60小时以上，远长于目前的有关报道(约20小时)。
(b)制备方法简便。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。百分比和份数，除非另外说明，否则为重量百分比和重量份数。
实施例1
将1mL 18％(质量浓度)的维生素B2溶液加入到2mL 10％(质量浓度)的聚己内酯聚乙二醇的共聚物(聚己内酯与聚乙二醇的质量比为40∶60)的二氯甲烷、丙酮的混合溶剂溶液中，超声27W或高压均质200bar乳化30s，将制成的初乳液加入到50mL 0.1％部分脱乙酰化壳聚糖的外水相中，经400W超声或1000bar高压均质2min后，加入200mL 0.5％部分脱乙酰化壳聚糖的水溶液中，室温常压下连续搅拌4小时以上，直至微囊表面硬化。离心、洗涤、冻干收集微囊。
采用实施例10的方法评价纳米微囊的血液半停留时间为62.9小时。
实施例2
将1mL 1％(质量浓度)的阿霉素溶液加入到2mL 10％(质量浓度)的聚乳酸聚乙二醇的共聚物(聚乳酸与聚乙二醇的质量比为70∶30)的二氯甲烷、丙酮的混合溶剂溶液中，超声27W或高压均质200bar乳化30s，将制成的初乳液加入到50mL 10％羧化壳聚糖的外水相中，经400W超声或1000bar高压均质2min后，加入200mL 0.5％羧化壳聚糖的水溶液中，室温常压下连续搅拌4小时以上，直至微囊表面硬化。离心、洗涤、冻干收集微囊。
采用实施例10的方法评价纳米微囊的血液半停留时间为68.2小时。
实施例3
将1mL 35％(质量浓度)的牛血红蛋白溶液加入到2mL 5％(质量浓度)的聚乳酸-乙交酯聚乙二醇的共聚物(聚乳酸-乙交酯与聚乙二醇的质量比为80∶20)的二氯甲烷、丙酮的混合溶剂溶液中，超声27W或高压均质200bar乳化30s，将制成的初乳液加入到50mL 5％氯化壳聚糖的外水相中，经400W超声或1000bar高压均质2min后，加入200mL 0.5％氯化壳聚糖的水溶液中，室温常压下连续搅拌4小时以上，直至微囊表面硬化。离心、洗涤、冻干收集微囊。
采用实施例10的方法评价纳米微囊的血液半停留时间为61.7小时。
实施例4
将1mL 0.01％(质量浓度)的骨形态发生蛋白质-2溶液加入到2mL 5％(质量浓度)的聚乳酸聚乙二醇的共聚物(聚乳酸与聚乙二醇的质量比为90∶10)的二氯甲烷、乙酸乙酯的混合溶剂溶液中，超声27W或高压均质200bar乳化30s，将制成的初乳液加入到50mL 2％部分脱乙酰化壳聚糖的外水相中，经400W超声或1000bar高压均质2min后，加入200mL 0.5％部分脱乙酰化的水溶液中，室温常压下连续搅拌4小时以上，直至微囊表面硬化。离心、洗涤、冻干收集微囊。
采用实施例10的方法评价纳米微囊的血液半停留时间为66.5小时。
实施例5
将1mL 15％(质量浓度)的牛血红蛋白溶液加入到2mL 10％(质量浓度)的聚己内酯聚乙二醇的共聚物(聚己内酯与聚乙二醇的质量比为70∶30)的二氯甲烷、丙酮的混合溶剂溶液中，超声27W或高压均质200bar乳化30s，将制成的初乳液加入到50mL 15％羧化壳聚糖的外水相中，经400W超声或1000bar高压均质2min后，加入200mL 0.5％羧化壳聚糖的水溶液中，室温常压下连续搅拌4小时以上，直至微囊表面硬化。离心、洗涤、冻干收集微囊。
采用实施例10的方法评价纳米微囊的血液半停留时间为67.1小时。
实施例6
将1mL 5％(质量浓度)的阿霉素溶液加入到2mL 5％(质量浓度)的聚乳酸聚乙二醇的共聚物(聚乳酸与聚乙二醇的质量比为80∶20)的二氯甲烷、乙酸乙酯的混合溶剂溶液中，超声27W或高压均质200bar乳化30s，将制成的初乳液加入到50mL 5％部分脱乙酰化壳聚糖的外水相中，经400W超声或1000bar高压均质2min后，加入200mL 0.5％部分脱乙酰化壳聚糖的水溶液中，旋转蒸发除去有机溶剂，直至微囊表面硬化。离心、洗涤、冻干收集微囊。
采用实施例10的方法评价纳米微囊的血液半停留时间为64.5小时。
实施例7
将1mL 18％(质量浓度)的维生素B2溶液加入到2mL 3％(质量浓度)的聚乳酸-乙交酯聚乙二醇的共聚物(聚乳酸-乙交酯与聚乙二醇的质量比为95∶5)的二氯甲烷、丙酮的混合溶剂溶液中，超声27W或高压均质200bar乳化30s，将制成的初乳液加入到50mL 10％类透明质酸壳聚糖的外水相中，经400W超声或1000bar高压均质2min后，加入200mL 0.5％类透明质酸壳聚糖的水溶液中，旋转蒸发除去有机溶剂，直至微囊表面硬化。离心、洗涤、冻干收集微囊。
采用实施例10的方法评价纳米微囊的血液半停留时间为62.5小时。
实施例8
采用PEG表面修饰的纳米微囊(对比例)
将1mL 10％(质量浓度)的***磷酸钠溶液加入到2克0.5％(质量浓度)的聚己内酯-乙交酯聚乙二醇的共聚物(聚己内酯与聚乙二醇的质量比为80∶20)的二氯甲烷溶液中，超声27W或高压均质200bar乳化30s，将制成的初乳液加入到50mL 10％聚乙烯醇的外水相中，经400W超声或1000bar高压均质2min后，加入200mL 1％聚乙烯醇的水溶液中，室温常压下连续搅拌4小时以上，直至微囊表面硬化。离心、洗涤、冻干收集微囊。
采用实施例10的方法评价纳米微囊的血液半停留时间为21.5小时。
实施例9
采用水溶性壳聚糖表面修饰的纳米微囊(对比例)
将1mL 15％(质量浓度)的牛血红蛋白溶液加入到2mL 10％(质量浓度)的聚乳酸的二氯甲烷、乙酸乙酯混合溶剂溶液中，超声27W或高压均质200bar乳化30s，将制成的初乳液加入到50mL 1％羧化壳聚糖的外水相中，经400W超声或600bar高压均质2min后，加入200mL 0.5％羧化壳聚糖的水溶液中，室温常压下连续搅拌4小时以上，直至微囊表面硬化。离心、洗涤、冻干收集微囊。
采用实施例10的方法评价纳米微囊的血液半停留时间为7.1小时。
实施例10
对上述实施例1-9制备的纳米微囊进行以下评价：
(1)外观形貌观察
采用扫描电镜(JSM-6360LV/Falcon，JEOL/EDAX，日本)对纳米微囊的外观形貌进行直接观察。纳米微囊冻干粉置于铜铁台上喷金后，在扫描电镜下观察。电镜照片示于图1。
(2)粒径及粒径分布的测定
粒径及其分布采用激光散射粒度分布仪(Zetasizer Nano ZS，MalvernInstruments，Ltd，UK)测定，在25℃下进行。把纳米微囊的冻干粉分散在等渗PBS缓冲溶液，于合适的测试浓度下进行测定。
粒径分布结果示于图2。其中，实施例1-9的微囊粒径为80-220纳米，平均粒径约130±20纳米。此外，约75％以上的微粒的粒径处于100-160纳米范围内。
(3)表面亲水性
评价纳米微囊表面亲水性的高低采用测量微囊表面的静态接触角。步骤如下：将1mg/mL微囊悬浮液悬涂于干净平滑的载玻片上，转速为1500rpm，时间45s。于60℃下将体系中的水分挥发完全形成纳米微囊膜。然后在25℃下，使用静态接触角仪测量纳米微囊表面的静态接触角。每个测量的结果取样品5个不同位置测量数据的平均值。
结果如下表1所示。
表1纳米微囊表面亲水性的比较
(4)表面电荷
微囊表面电荷采用测定表面ζ电位，把纳米微囊的冻干粉分散在等渗PBS缓冲溶液，使用ζ电位仪于合适的测试浓度下进行测定。所有的测量是在25℃和100-2000Hz的条件下进行的。
结果示于图3。结果表明，本发明微囊的电性趋于中性。
(5)体内停留时间评价：
采用荧光素香豆素-6标记实施例1-9的表面修饰纳米微囊用来定量血液中纳米微囊的含量。ICR鼠，体重范围在25±5g。禁食过夜后，将实施例1-9的荧光标记的表面修饰纳米微囊，通过尾静脉注射浓度为10mg/mL的微囊悬浮液，给药剂量为10mL/kg小鼠体重。分别在注射后的给定时间点(0-72h)立即采血，每样采0.5mL，置于20℃下待分析。血液样品中微囊的定量方法如下：血液样品在冷冻前加入含0.1mM EDTA的去离子水。接着将冷冻的血液样品震荡、解冻。冷冻、解冻这样的过程重复3次，以确保细胞完全破坏，分离出其中的微囊。此后，血液样品冻干36h，所有血液样品冻干品均加入准确计量的乙腈，于25℃下机械震动18h萃取其中的香豆素-6。萃取液用荧光分光光度计在Ex 485nm和Em 530nm下测量其值。每种微囊梯度浓度同空白血液的混合物，用同上的处理方法绘制标准曲线。对照标准曲线，由测得的各血液样品的荧光值对应计算得血液中微囊存留量，进一步计算各血液样品的存留量占初始给药量的百分比，作为血液存留百分比。
绘制血药浓度随时间变化的曲线(图4)，使用药代动力学软件DAS2.0计算得到血液半停留时间(表2)，实验结果如下：
表2可降解聚合物纳米微囊的血液半停留时间
| 样品 | 血液半停留时间(小时) |
| 实施例1 | 62.9 |
| 实施例2 | 68.2 |
| 实施例3 | 61.7 |
| 实施例4 | 66.5 |
| 实施例5 | 67.1 |
| 实施例6 | 64.5 |
| 实施例7 | 62.5 |
| 实施例8(对照) | 21.5 |
| 实施例9(对照) | 7.1 |
结果表明，采用PEG或者水溶性壳聚糖修饰的纳米微囊，其血液停留时间分别为21.5小时和7.1小时，而采用本发明制备的聚乙二醇/水溶性壳聚糖协同修饰的可降解聚合物纳米微囊在血液中的循环时间可达60小时以上，可有效延长体内停留时间，是一种非常理想的药物靶向输送载体。
实施例4
药物组合物
实施例2中制备的微囊 20g
淀粉 140g
微晶纤维素 60g
按常规方法，将上述物质混合均匀后，装入普通明胶胶囊，得到1000颗胶囊。
此外，还将实施例2中制备的微囊与注射用水混合，制得注射剂(阿霉素浓度为0.05wt％)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (4)
1.一种聚乙二醇/水溶性壳聚糖协同修饰的长循环可降解聚合物纳米微囊，其特征在于，所述微囊包括：
(a)以水溶性药物和/或蛋白质为芯材；
(b)以含有聚乙二醇生物可降解性聚合物为壳材，并且所述的壳材包裹所述的芯材，并且在所述壳材中聚乙二醇共价键合于聚合物；
(c)水溶性壳聚糖外层，所述的水溶性壳聚糖通过物理作用吸附于所述壳材表面；
并且所述微囊的平均粒径为70-200nm；
其中，所述含有聚乙二醇生物可降解性聚合物选自：聚己内酯聚乙二醇共聚物、聚乳酸聚乙二醇共聚物或聚乳酸-乙交酯聚乙二醇共聚物，所述共聚物中聚己内酯、聚乳酸或聚乳酸-乙交酯与聚乙二醇的质量比为40:60-95:5；
所述水溶性壳聚糖选自：脱乙酰化壳聚糖、羧化壳聚糖、氯化壳聚糖、类透明质酸壳聚糖、或其组合。
2.如权利要求1所述的微囊，其特征在于，所述壳材的聚合物的重均分子量为15000-300000道尔顿。
3.如权利要求1所述的微囊，其特征在于，所述水溶性壳聚糖的重均分子量为50000-500000道尔顿。
4.一种药物组合物，其特征在于，它含有药学上可接受的载体和权利要求1所述的聚乙二醇/水溶性壳聚糖协同修饰的长循环可降解聚合物纳米微囊。
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