CN101755996B

CN101755996B - 固定化酶水解粗奶酪和超滤膜分离方法连续生产酪蛋白磷酸肽

Info

Publication number: CN101755996B
Application number: CN2010101001380A
Authority: CN
Inventors: 胡先望; 张瑞贞; 陈朋; 梁宁
Original assignee: GANNAN KERI DAIRY PRODUCTS DEVELOPMENT CO LTD
Current assignee: GANNAN KERI DAIRY PRODUCTS DEVELOPMENT CO LTD
Priority date: 2010-01-20
Filing date: 2010-01-20
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2030-01-20
Also published as: CN101755996A

Abstract

本发明涉及一种固定化酶水解粗奶酪和超滤膜分离方法连续生产酪蛋白磷酸肽，其步骤包括：a.胰蛋白酶的提取；b.制备胰蛋白酶固定化反应柱；c.水解粗奶酪；d.超滤膜分离提纯酪蛋白磷酸肽(CPP)；e.将CPP的超滤液进行柱层析。本发明工艺设计合理、操作性强，生产过程短，中间产物浓度高，生产能耗低：主要分离纯化过程均采用常温处理，干燥过程蒸发量少，极大降低了生产中的能耗，节约了成本。产品经真空浓缩、喷雾干燥得到，其主要成份为小分子生物活性多肽，分子量在2000～6000范围的多肽占多肽的45％以上。

Description

固定化酶水解粗奶酪和超滤膜分离方法连续生产酪蛋白磷酸肽

技术领域

本发明涉及食品产品加工工艺。

背景技术

酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptides，CPP)是以牛奶酪蛋白为原料，经过单一或复合蛋白酶的水解，再对水解产物分离纯化，进而干燥后得到的含有磷酸丝氨酸簇的天然生理活性肽。

CPP的核心部位为-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu-，具有很强的促钙以及其它矿物元素吸收的活性，可以与钙、铁、锌等二价和某些三价矿物离子结合，不仅可以作为钙的载体，也可以作为铁、锰、锌、硒的载体，所以，CPP已被公认为应用较广泛的功能性食品添加剂，它能促进婴幼儿与青少年的健康成长和提高对中老年人的保健作用。

谷坤睿等人在陕西科技大学学报，No.4，VOI.2l，Aug，2003介绍了固定化胰蛋白酶及其用于制备酪蛋白磷酸肽(CPP)的实验研究。实验以壳聚糖作为固定化胰蛋白酶的载体，方法是：酪蛋白→酪蛋白水解液→过滤→固定化酶水解→分离→浓缩→干燥→CPP产品。这种方法的特点是：酶的固定化后可多次使用，节约了成本；酶不进入终产品，提升了产品的风味。其缺点是：以壳聚糖为载体，载体价格昂贵，费用高，不易工业化生产。2006-12-8，天津大学对开展的“高效促钙吸收因子酪蛋白磷酸肽的连续制备工艺开发”项目进行了《科技成果鉴定》，并申请了《酶解与膜滤集成连续制取酪蛋白活性多肽的工艺》发明专利，申请号为200310107554.3。本方法针对制备CPP所采用的间歇酶解工艺中普遍存在的反应转化率及目标多肽产率低、产品质量不稳定、酶耗量大、工艺成本高等共性问题，提出酶膜耦合一步法连续生产新方法，设计并安装了一套由20L酶解罐与不同截留分子量的超滤膜件组合而成的多级酶膜耦合反应器扩试***；确定了间歇与连续酶解制备CPP的工艺路线，并优化了操作参数；完成了20L罐间歇水解和40L/hr长时间连续、稳定、高效制取CPP的扩试开发，酶耗量比传统方法降低3倍，反应器生产能力提高1倍；并对离子交换树脂纯化工艺进行了设计与优化；各级产品经权威机构检测证明：体外持钙能力效果明显，各项指标均达到国家保健(功能)食品通用标准。但是，该方法不足之处是水解过程于一个反应釜中，易造成底物多次水解产生小肽，为后续分离带来困难，并影响终产品风味和品质。

发明内容

“曲拉”是藏区牧民将牛奶自然发酵后，经加热沉淀出蛋白质，然后自然干燥后制成牦牛粗奶酪，俗称“曲拉”。其主要成分为蛋白质，它是藏区游牧民的重要食物来源。

本发明以藏区丰富的低成本“曲拉”——粗奶酪为原料，结合现有技术的优点，其目的是提供一种固定化酶水解粗奶酪和超滤膜分离方法连续生产酪蛋白磷酸肽。该方法以固定化酶水解粗奶酪，并对水解液进行有效分离提取以获得高纯度的CPP产品，提升产品风味，提高生产工艺的连续性，降低生产能耗和产品成本。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种固定化酶水解粗奶酪和超滤膜分离方法连续生产酪蛋白磷酸肽，其步骤分为：

a.胰蛋白酶的提取方法

i.将新鲜牛胰脏剔出脂肪、***后，浸入硫酸铵溶液，搅拌，压滤，得到浸提滤液；

ii.在浸提滤液中加入固体硫酸铵，搅拌、静置、去沉淀，过滤后得到上清液；

iii.上清液调pH值至3.0以下，保持溶液中的硫酸铵浓度在3.0～3.5mol/L，搅拌均匀后静置沉淀，弃上清，沉淀物为胰蛋白酶原粗品；

iv.胰蛋白酶原粗品加入乙醇，CaCl₂，溶解、静置活化，再加入乙醇，搅拌、静置、沉淀，过滤后即得胰蛋白酶。

本工艺可得到水解“曲拉”——粗奶酪所需要的胰蛋白酶原料。

b.制备胰蛋白酶固定化反应柱

弱碱性苯乙稀阴离子树脂加入2.5％戊二醛，在10℃～20℃下交联反应10～12小时，再加入1～4％胰蛋白酶，在10℃～15℃下固定化20小时，装入直径∶高度＝1∶10的不锈钢反应柱；

c.水解粗奶酪

粗奶酪用10～15倍水在55～60℃溶胀1小时，以1mol/L的NaOH调整pH值不超过8.0，溶解后，经过滤、分离脱脂后的蛋白质溶液在40℃～60℃下以10L/min的速度逆向通过固定化酶反应柱，保持与固定化酶循环接触时间为3小时～5小时；然后将水解液经热交换柱冷却至室温，压滤除去沉淀，经由硅藻土过滤机澄清后得到CPP水解液；

d.超滤膜分离提纯酪蛋白磷酸肽(CPP)

CPP水解液经过超滤膜过滤设备两次分离，其工艺参数：第一次分离膜，截流分子量上限≤50000，膜起始压力2Bar，终止压力10Bar，循环流量200L/hr，平均循环时间2～5小时；第二次超滤膜，分离膜截流分子量下限≤1000，膜起始压力4Bar，终止压力15Bar，循环流量150L/hr，平均循环时间3～6小时；

e.将CPP的超滤液进行柱层析

分离后的水解液用20～40目的颗粒活性炭柱进行层析吸咐，流速为20L/hr，压力为1.2Bar～5Bar，然后将水解液经低温真空浓缩，真空度40mmHg～60mmHg、温度30℃～40℃，至固形物含量30％～40％，再喷雾干燥，压力6Bar，温度60℃～70℃，即得到酪蛋白磷酸肽(CPP)产品。

本发明的优点和产生的有益效果是：

1、与现有技术比较，本发明蛋白质液体经逆向注入固定化酶反应柱进行连续循环水解，水解过程可由2～3个串联的反应柱完成，每次底物水解完成进入下步工序后，酶反应柱可再进行下次的水解过程，固定化酶重复水解次数一般为8～10次。利用胰蛋白酶固定化反应柱，提高酶的利用率，节约酶用量比一次酶解法少5～8陪，并降低了酶的固定化成本。反应过程不需要加热使酶失活，酶及酶自身分解带来的附产物也不进入终产品。另外，采用直接提取蛋白酶进行固定化，利用处理后以弱碱性苯乙稀阴离子树脂作为载体，替代价格昂贵的壳聚糖，降低了生产成本，易于工业化生产。

2、提高工艺生产的连续性：生产过程中除水解工艺产生沉淀利用压滤和硅藻土过滤澄清后，后续工艺在得到终产品前全部为液相流动操作，易于控制。反应过程中不需要添加底物、酶和其他物质，每个过程均为连续操作，每步流量控制以分配各工艺步骤设备量和流速来实现，以保证整个工艺中产物流量的均衡。

3、产品纯度高，分离效率高，除盐效果好。本方法以弱碱性苯乙稀阴离子树脂(树脂型号包括301～400)作为载体制备固定化胰蛋白酶反应柱，以粗奶酪(或“曲拉”)为原料，溶解后的蛋白质经固定化酶连续水解后，经由两次超滤膜截留，一次活性炭层析分离，能有效除去产品中的非磷酸肽、盐、水份和大分子多肽，同时使用活性炭层析吸附去除小肽，产品经真空浓缩、喷雾干燥，风味得到极大提升，产品中酪蛋白磷酸肽含量可达到45％，具有促进机体钙、铁、锌吸收和储留的作用，产品质量高于国内同类产品标准。

4、本发明工艺设计合理、操作性强，生产过程短，中间产物浓度高，生产能耗低：主要分离纯化过程均采用常温处理，干燥过程蒸发量少，极大降低了生产中的能耗，节约了成本。

附图说明

图1为本发明工艺流程图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明再作进一步的说明：

实施例1：

a.胰蛋白酶的提取取新鲜牛胰脏10kg，人工剔出脂肪、***，经绞肉机绞碎立即浸入装有1L 0℃～4℃0.1mol/L硫酸铵溶液的50L夹层反应罐中，经搅拌后成为浆液，加入浆液2倍体积的0.1mol/L硫酸铵，在0℃～4℃的夹层反应罐提取20小时，每隔半小时缓缓搅拌。经空气压滤机压滤，收集滤液，残渣再以1倍浆液体积的0.1mol/L硫酸铵重复浸提一次，合并两次滤液，弃去残渣。

50L夹层反应罐中的滤液在0℃～4℃下加入0.2kg/L固体硫酸铵至浓度1.5mol/L，搅拌后静置8小时，过滤、去沉淀。在滤液中继续加入0.27kg/L固体硫酸铵至浓度3.5mol/L，搅拌后静置12小时，压滤后得到上清液，弃去残渣。

上清液以2mol/L硫酸0.1L调pH值至3.0以下，并保持溶液中的硫酸铵浓度在3.5mol/L，搅拌均匀后静置沉淀10小时。压滤弃去上清后得沉淀。此沉淀即为胰蛋白酶原粗品。

将上述所得胰蛋白酶原粗品(湿重)加入3倍(重量比)的25％乙醇，同时加入胰蛋白酶粗品原料量2％的CaCl₂，使其溶解并调溶液pH值为5-6之间，0℃～4℃静置活化12小时，然后加入乙醇使其浓度达到70％以上，充分搅拌，0℃～4℃静置充分沉淀3小时，过滤后即得胰蛋白酶。收率在3.0％左右。

b.胰蛋白酶固定化反应柱制备

在5L夹层反应罐中装入经活化处理后的弱碱性苯乙稀阴离子树脂1kg，搅拌下缓缓滴加1/5树脂重的2.5％戊二醛，在10℃～20℃下充分搅拌交联反应10小时，过滤，水洗去除戊二醛。在2L容器中将0.04kg胰蛋白酶(湿重)加入1L pH6.5～7.0的0.2mol/L醋酸缓冲液中配成约1.5％胰蛋白酶溶液，与反应后的树脂在10～15℃下固定化20小时，然后装入直径与高度比为1∶10的反应柱中，每柱装入固定化酶量为0.2kg，并用pH6.5～7.0的0.2mol/L醋酸缓冲液洗去未固定化的酶，测定酶活力，备用。

游离酶活力定义：在反应条件下，每分钟酶水解酪氨酸后的滤液光吸收增值与1μmol酪氨酸在275nm处吸光度相当时的酶量为一个胰蛋白酶活力单位(U/mg)。

固定化酶的活力定义：在相同反应条件下，固定化酶的活力与游离酶活力的比值为固定化酶的相对活力。

相对活力(％)＝(固定化酶的活力/游离酶活力)×100％。

胰蛋白酶活力测定方法：以酪蛋白为底物测定。详见《中华人民共和国药典》2005年版二部第625页“胰酶”一栏。

本工艺在于得到水解过程所需要的固定化酶。固定化酶活力约为游离酶活力的75％左右。

c.粗奶酪水解生成CPP

在10L夹层反应罐中将0.5kg粗奶酪用10倍、55～60℃的水溶胀1小时，搅拌下缓缓加入1mol/L的氢氧化钠溶液50mL左右，调整pH8.0。待蛋白溶解后，经过滤器过滤、离心机分离脱脂。得到的蛋白质溶液在40℃～60℃下由压力泵以0.01L/min的速度压入固定化酶反应柱，保持液体与固定化酶循环接触时间为3小时，蛋白质水解可由2至3个固定化酶反应柱串联实现。然后将水解液经热交换柱冷却至室温，压滤除去沉淀，经由硅藻土过滤机澄清后得到CPP水解液4L左右。

d.CPP分离提纯

CPP水解液经过超滤膜过滤设备两次分离，其工艺参数：第一次分离膜截流分子量≤50000，膜起始压力2Bar，终止压力10Bar，循环流量200L/hr，平均循环时间2小时以上。第二次超滤膜分离膜截流分子量≤1000，膜起始压力4Bar，终止压力15Bar，循环流量1.50L/hr，平均循环时间3小时以上。

分离后的水解液3.5L左右用装有原料量0.5％(重量比)的20～40目的颗粒活性炭柱进行层析吸咐，然后将水解液经低温真空浓缩和干燥，即得到CPP产品。

e.产品分析检测结果

上述生产方法等到的CPP收率在35％～45％之间，产品中分子量在2000～6000范围的多肽占45％，产品中CPP含量30％～35％，产品苦味较重。生产成本为120～150元/kg。

产品标准符合以下列检测方法确定的产品标准。

酪蛋白磷酸肽(CPP)产品主要检测方法：

①蛋白质的测定：用微量凯氏定氮法，见GB5424-85。

②脂肪的测定：用索氏抽提法，见GB 5009.6-85。

③水分、灰分的测定：用重量法，见GB5424-85。

④磷酸肽的测定：用高压液相色谱和柱色谱测定CPP中的特征吸收峰，以CPP吸收峰面积与总吸收峰面积相比，并用钼蓝比色法测定磷含量，再与CPP中平均磷含量的2.82相比较。(《功能性食品活性成分测定》，化学工业出版社，2005年5月第一版第201页)。

⑤卫生指标及微生物指标测定以国家食品及添加剂卫生标准为准。主要标准有：GB/T 5009.11-2003《食品中总砷及无机砷的测定》、GB/T5009.12-2003《食品中铅的测定方法》、GB/T 4789.2-2003《食品卫生微生物学检验菌落总数测定》、GB/T 5009.46-2003《乳与乳制品卫生标准的分析方法》、GB 2760-2007《食品添加剂使用卫生标准》。

⑥酪蛋白磷酸肽(CPP)产品标准见表1-3

表1：感官指标

表2：理化指标

水分(％)

≤10

灰分(％))	≤6
		全蛋白(以凯氏定氮计，％)	≥80
磷酸肽(％)	≥45
		pH(10％溶液)	6.5±1

表3：卫生及微生物指标

细菌总数(个/g)	≤5000
		致病菌	不得检出
砷	≤0.5ppm
		铅	≤0.5ppm

产品用内衬牛皮纸袋包装，装量为1Kg、5Kg和10Kg三种。贮存于干燥的环境中，注意防潮。

实施例2：

a.胰蛋白酶的提取

取新鲜牛胰脏100kg，人工剔出脂肪、***，经绞肉机绞碎立即浸入装有10L 0℃～4℃的0.1mol/L硫酸铵溶液的500L夹层反应罐中，经搅拌后成为浆液，加入浆液3倍体积的0.1mol/L硫酸铵在0℃～4℃的夹层反应罐提取30小时，每隔半小时缓缓搅拌。经空气压滤机压滤，收集滤液，残渣再以1倍浆液体积的0.1mol/L硫酸铵重复浸提一次，合并两次滤液，弃去残渣。

500L夹层反应罐中的滤液在0℃～4℃下加入0.2kg/L固体硫酸铵至浓度1.5mol/L，搅拌后静置10小时，过滤、去沉淀。在滤液中继续加入0.27kg/L固体硫酸铵至浓度3.5mol/L，搅拌后静置14小时，压滤后得到上清液，弃去残渣。

上清液以2mol/L硫酸1.0L/100L调pH值至3.0以下，并保持溶液中的硫酸铵浓度在3.5mol/L，搅拌均匀后静置沉淀12小时。压滤弃去上清后得沉淀。此沉淀即为胰蛋白酶原粗品。

将上述所得胰蛋白酶原粗品(湿重)加入5倍(重量比)的25％乙醇，同时加入胰蛋白酶粗品原料量2％的CaCl₂，使其溶解并调溶液pH值为5-6之间，0℃～4℃静置活化14小时，然后加入乙醇使其浓度达到70％以上，充分搅拌，0℃～4℃静置充分沉淀4小时，过滤后即得胰蛋白酶。收率在5.0％左右。

b.胰蛋白酶固定化反应柱制备

在500L夹层反应罐中装入经活化处理后的弱碱性苯乙稀阴离子树脂100kg，搅拌下缓缓滴加1/5树脂重的2.5％戊二醛，在10℃～20℃下充分搅拌交联反应12小时，在200L贮罐中将4kg胰蛋白酶(湿重)加入100L pH6.5～7.0的0.2mol/L醋酸缓冲液中配成约1.5％胰蛋白酶溶液，与反应后的树脂在夹层反应罐中10～15℃下固定化20小时，然后装入直径与高度比为1∶10的不锈钢反应柱，每柱装入固定化酶量为20kg，并用pH6.5～7.0的0.2mol/L醋酸缓冲液洗去未固定化的酶，测定酶活力，备用。

酶活力定义和测定方法同实施例1。

本工艺在于得到水解过程所需要的固定化酶。固定化酶活力约为游离酶活力的80％以上。

c.粗奶酪水解生成CPP

在1000L夹层反应罐中将50kg粗奶酪用15倍55～60℃的水溶胀1小时，搅拌下缓缓加入1mol/L的氢氧化钠溶液5L/100L，调整pH8.0。待蛋白溶解后，经双联过滤器过滤、碟片离心机分离脱脂。得到的蛋白质溶液在40℃～60℃下由压力泵以10L/min的速度压入固定化酶反应柱，保持液体与固定化酶循环接触时间为5小时，水解时可根据水解效果由3个固定化酶反应柱串联实现蛋白质水解。然后将水解液经热交换柱冷却至室温，压滤除去沉淀，经由硅藻土过滤机澄清后得到CPP水解液700L左右。

d.CPP分离提纯

CPP水解液经过超滤膜过滤设备两次分离，其工艺参数：第一次分离膜截流分子量≤500C0，膜起始压力2Bar，终止压力10Bar，循环流量200L/hr，平均循环时间2小时以上。第二次超滤膜分离膜截流分子量≤1000，膜起始压力4Bar，终止压力15Bar，循环流量150L/hr，平均循环时间4小时以上。

分离后的水解液650L左右用装有原料量6％(重量比)的20～40目的颗粒活性炭柱进行层析吸咐，然后将水解液经低温真空浓缩和喷雾干燥，即得到CPP产品。

e.产品分析检测结果

产品标准和检测方法同实施例1。

本实施例得到的CPP收率在25％～35％之间，产品中分子量在3000～6000范围的多肽占45％，产品中CPP含量35％～45％，产品有较淡的苦味。生产成本为180～200元/kg。

本发明工艺条件的变化对生产过程和产品的影响

1、提取的胰蛋白酶在固定化反应中温度由15℃～20℃提升到25℃以上，固定化酶活力则大大降低，一般情况下只有游离酶活力的50％～55％，水解过程将变得不完全，最终影响到产品收率降到25％以下。

2、溶解的蛋白质溶液要以逆向方式流经固定化酶反应柱，若正向流动，由于在反应中产生细小沉淀会造成反应柱堵塞，使工艺过程时间加长，严重时会使工艺不可进行。

3、活性炭层析吸附是为了去除分子量小于1000的游离小肽，这些小肽是产品中存在苦味的主要成分，在实施过程中若不采用活性炭层析进行吸咐除去苦味肽，虽可降低部分生产成本，但产品中苦味加重，产品风味降低。

4、超滤膜截留分子量大小与产品质量和收率有直接关系，膜截留分子量下限为1000，上限为50000。截留分子量大小可分为1000～10000、1000～20000、1000～30000、1000～40000、1000～50000五种范围，其产品收率从25％到45％依次升高，产品中的CPP含量也从45％到30％依次降低。膜的通透量影响工艺时间和生产成本，生产过程中需保持膜的通透量达到出厂值的80％以上，否则需对膜进行CIP清洗或更换新的超滤膜。

5、产品收率和生产成本与原料粗奶酪(“曲拉”)质量有较大关系，一般要求原料中蛋白质含量在70％以上，若蛋白质含量低于65％，则CPP收率可低于25％以下。

Claims

1.一种固定化酶水解粗奶酪和超滤膜分离方法连续生产酪蛋白磷酸肽的方法，其步骤分为：

a.胰蛋白酶的提取方法

iv.胰蛋白酶原粗品加入乙醇，CaCl₂，溶解、静置活化，再加入乙醇，搅拌、静置、沉淀，过滤后即得胰蛋白酶；

b.制备胰蛋白酶固定化反应柱

弱碱性苯乙烯阴离子树脂加入2.5％戊二醛，在10℃～20℃下交联反应10～12小时，再加入1～4％胰蛋白酶，在10～15℃下固定化20小时，装入直径∶高度＝1∶10的不锈钢反应柱；

c.水解粗奶酪

粗奶酪用10～15倍水在55～60℃溶胀1小时，以1mol/L的NaOH调整pH值不超过8.0，溶解后，经过滤、分离脱脂后的蛋白质溶液在40℃～60℃下以10L/min的速度逆向通过固定化酶反应柱，蛋白质溶液保持与固定化酶循环接触时间为3～5小时；然后将水解液经热交换柱冷却至室温，压滤除去沉淀，经由硅藻土过滤机澄清后得到酪蛋白磷酸肽水解液；

d.超滤膜分离提纯酪蛋白磷酸肽

酪蛋白磷酸肽水解液经过超滤膜过滤设备两次分离，其工艺参数：第一次分离膜截流分子量≤50000，膜起始压力2Bar，终止压力10Bar，循环流量200L/hr，平均循环时间2～5小时；第二次超滤膜分离膜截流分子量≥1000，膜起始压力4Bar，终止压力15Bar，循环流量150L/hr，平均循环时间3～6小时；

e.将酪蛋白磷酸肽的超滤液进行柱层析

分离后的水解液用20～40目的颗粒活性炭柱进行层析吸咐，流速为20L/hr，压力为1.2Bar～1.5Bar，然后将水解液经低温真空浓缩，真空度40mmHg～60mmHg、温度30℃～40℃，至固形物含量30％～40％，再喷雾干燥，压力为6Bar，温度为60℃～70℃，即得到酪蛋白磷酸肽产品。