CN101735984A - 一种组织工程支架材料接种细胞的简便方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在多孔生物工程支架材料上，实现种子细胞三维均匀接种的简便有效的方法。其特征是使用临床常用的灭菌注射器为接种工具，将所需的生物支架材料从注射器后部放入，然后吸入所需接种的相应的细胞数量的细胞悬液。注射器内预留一定量空气，封闭注射器口，回抽注射器，利用形成的负压使细胞悬液渗透入多孔材料的空隙内，实现种子细胞在支架材料内的初期均匀分布接种。本发明方法与现有的组织工程实践中，实现支架材料初期三维均匀接种方法相比，不需要花费大量资金购买专门的仪器，简便易行，可以取得专门设备相似的初期三维均匀接种效果。并且由于负压作用时间短，压力小，不会损伤接种细胞。

Description

一种组织工程支架材料接种细胞的简便方法

技术领域

本发明涉及一种组织工程体外研究和临床应用中，在多孔支架材料上实现初期三维均匀细胞接种的方法。

背景技术

组织工程实践中，有些需要将种子细胞在体外二维的环境下培养扩增，以达到一定的数目，或者是通过在培养过程中的干预措施实现细胞的定向分化，然后接种于支架材料上；有些则在采集了种子细胞之后直接接种于支架材料上。细胞接种过程在初期细胞三维空间分布以及其后的组织工程培养分化过程中扮演着非常重要的角色。接种初期达到达到细胞在支架材料中的均匀分布是细胞接种方法的重要评价指标之一。

目前使用的接种方法包括静态接种法和动态接种法。其中，静态接种就是直接将细胞悬液滴加在支架材料上面，通过渗透作用让细胞悬液进入支架材料内部。这种方法由于操作简便，是目前比较常用的接种法，但是无法实现细胞在三维结构上的均匀分布。目前比较常见的动态接种方法有生物反应器法、离心法、真空机法、旋转瓶法等，这些动态接种方法都可以达到初期细胞在多空材料支架三维空间上的均匀分布。但是这些方法都需要专门的昂贵的仪器配合，操作较复杂。因此，在本领域迫切需要开发出一种新的简便易行的实现细胞接种初期三维空间上均匀分布的细胞接种方法。

发明内容

本发明旨在利用实验室和临床常用的设备装置、简便高效地完成种子细胞在生物支架材料上的初期均匀接种。并且在细胞接种过程中，采用最短的干预时间和最小的干预强度，最大程度的保持细胞的生物学活性。

为了实现上述目的本发明提供了一种简便高效地方法，其步骤如下：

a.准备好所需接种细胞的支架材料，并且根据支架材料的大小选择相应的临床常用的一次性注射器规格。

b.将准备好的支架材料从注射器后部放入，放回注射器活塞柱，推出多余空气。

c.从注射器开口处吸入细胞悬液，细胞悬液量以刚好淹没支架材料为准。细胞悬液的细胞浓度根据不同接种目的，浓度不一样。

d.推出多余空气，在注射器内，除支架细胞悬液复合体外只保留1ml空气。

e.堵住注射器口，回抽活塞柱，使注射器筒内空气增加到3ml，并且在此状态下维持5秒钟。如此反复回抽维持三次。

f.拔出活塞柱，倒出多余细胞悬液，取出支架材料置于培养皿内。在37℃，含5％CO2细胞培养孵箱内静置2小时，待细胞完全贴付后加入所需培养基。或者在接种后直接填充入手术缺损部位。

附图说明

图1常规静态细胞接种方式将细胞悬液滴加在孔隙率为60％TCP支架材料上两小时后，进行MTT染色观察细胞分布。可见活性细胞主要堆积在添加细胞悬液的爱料一侧。(MTT可以作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下生成formazan蓝色结晶。使得具有活性的细胞在肉眼下可见。)

图2是采用本发明的方法接种细胞在相同TCP支架材料上，两小时后进行MTT染色观察细胞分布。可见细胞均匀分布在材料中。

图3静态接种TCP支架材料培养2周后中心位置扫描电镜照片，没有细胞存活。(×200)

图4采用本发明接种TCP支架材料培养2周后中心位置扫描电镜照片，可见细胞存活。(×200)

具体实施方式

实施例1：

人骨髓基质干细胞接种在TCP支架材料上进行成骨诱导。

医院临床采集的骨髓组织经PBS液稀释之后置于等量的Percoll液面上，3000rpm离心30分钟。采集乳白色浑浊的单核细胞层进行培养扩增。培养至第三代细胞之后调整细胞悬液为5×10⁶/ml，准备接种支架。

制备TCP支架材料为5mm×5mm×4mm大小，消毒干燥后将三个支架材料放入10ml注射器内部。吸入1ml细胞悬液，并预留1ml空气在注射器内部。

阻塞注射器开口，回抽活塞柱，使得注射器内部空气达到3ml，维持5秒钟好缓慢恢复压力。如此反复三次。将多余的细胞悬液回收下次继续使用，接种好的细胞支架复合体移入培养皿，在细胞培养箱中静置2小时后，加入成骨诱导培养基。

实施例2：

人骨髓基质干细胞接种在TCP支架材料上进行成软骨诱导。

医院采集的骨髓组织经PBS液稀释之后置于等量的Percoll液面上，3000rpm离心30分钟。采集乳白色浑浊的单核细胞层进行培养扩增。培养至第三代细胞之后调整细胞悬液为14×10⁶/ml，准备接种支架。

制备TCP支架材料为5mm×5mm×4mm大小，消毒干燥后将三个支架材料放入10ml注射器内部。吸入1ml细胞悬液，并预留1ml空气在注射器内部。

阻塞注射器开口，回抽活塞柱，使得注射器内部空气达到3ml，维持5秒钟好缓慢恢复压力。如此反复三次。将多余的细胞悬液回收下次继续使用，接种好的细胞支架复合体移入培养皿，在细胞培养箱中静置2小时后，加入成软骨诱导培养基。

实施例3：

MC3T3-E1细胞接种在PDLLA支架上，进行成骨诱导实验。

体外培养MC3T3-E1细胞系，到足够数目后调整细胞悬液为5×10⁶/ml，准备接种支架。

制备PDLLA支架材料为10mm×10mm×5mm大小，消毒干燥后将三个支架材料放入10ml注射器内部。吸入2ml细胞悬液，并预留1ml空气在注射器内部。

阻塞注射器开口，回抽活塞柱，使得注射器内部空气达到3ml，维持5秒钟好缓慢恢复压力。如此反复三次。将多余的细胞悬液回收下次继续使用，接种好的细胞支架复合体移入培养皿，在细胞培养箱中静置2小时后，加入成骨诱导培养基。

实施例4：

人成骨细胞接种在TCP支架上，研究成骨细胞与TCP支架材料的相互作用。

医院临床采集的人松质骨，采用消化法收集人成骨细胞，在体外二维状态培养。收集第3-5代细胞，调整细胞悬液为5×10⁶/ml，准备接种支架。

制备TCP支架材料为5mm×5mm×4mm大小，消毒干燥后将三个支架材料放入10ml注射器内部。吸入1ml细胞悬液，并预留1ml空气在注射器内部。

阻塞注射器开口，回抽活塞柱，使得注射器内部空气达到3ml，维持5秒钟好缓慢恢复压力。如此反复三次。将多余的细胞悬液回收下次继续使用，接种好的细胞支架复合体移入培养皿，在细胞培养箱中静置2小时后，加入成骨诱导培养基。

实施例5：

猪软骨细胞接种在PDLLA支架上三维培养，观察机械应力对体外三维培养的软骨细胞的作用。

采集6月龄猪膝关节表面软骨，使用消化法收集猪软骨细胞。为了防止软骨细胞在体外的退行性变，收集第二代软骨细胞，调整细胞悬液为14×10⁶/ml，准备接种支架。

制备PDLLA支架材料为10mm×10mm×5mm大小，消毒干燥后将三个支架材料放入10ml注射器内部。吸入2ml细胞悬液，并预留1ml空气在注射器内部。

阻塞注射器开口，回抽活塞柱，使得注射器内部空气达到3ml，维持5秒钟好缓慢恢复压力。如此反复三次。将多余的细胞悬液回收下次继续使用，接种好的细胞支架复合体移入培养皿，在细胞培养箱中静置2小时后，加入含TGF-β的软骨诱导培养基培养。随后按照试验设计，施加低频超声刺激。

Claims (5)

1.一种生物材料实现初期三维均匀接种细胞的方法，它步骤包括：

1)前期分离培养足够的所需接种的细胞，并且根据接种目的，调整适合的细胞悬液浓度，并且准备好所需接种细胞的支架材料，灭菌待用；

2)根据支架材料的大小选择相应的接种工具：无菌注射器的规格；

3)拔出注射器活塞后，将准备好的支架材料从注射器后部放入，放回注射器活塞柱，推出多余空气；

4)从注射器开口处吸入准备好的细胞悬液，同时同抽活塞柱，细胞悬液量以刚好淹没支架材料为准，推出多余空气，在注射器内，除支架细胞悬液复合体外只保留1ml空气；

5)堵住注射器口，回抽活塞柱，使注射器筒内空气增加到3ml，并且在此状态下维持5秒钟，如此反复回抽维持三次；

6)拔出活塞柱，倒出多余细胞悬液，取出支架材料置于培养皿内，在37℃，含5％CO₂细胞培养孵箱内静置2小时，待细胞完全贴付后加入所需培养基，或者直接将以接种支架材料填充于手术缺损部位。

2.如权利1所述方法的细胞接种工具，其特征在于：使用临床常用一次性注射器或者灭菌玻璃注射器进行细胞接种。

3.如权利2所述接种方法，其特征在于：体系初始空气为1ml，回抽后达到3ml。

4.如权利3所述接种方法，其特征在于：接种体系负压维持时间为5秒钟，接种过程重复三次。

5.根据权利1所获得种子细胞多空材料复合体具有在三维空间上细胞均匀分布的特点，并且可适用于多种需要达到三维空间上均匀接种的多孔支架材料和种子细胞。

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