CN101732765B

CN101732765B - 生物型高交联网状缓释ecmo涂层材料及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN101732765B
Application number: CN200910229051.0A
Authority: CN
Inventors: 李彤; 于美丽
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2009-12-10
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2029-12-10
Also published as: CN101732765A

Abstract

本发明涉及生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料及其制备方法与应用，所述涂层材料主要由带负电荷的天然生物多糖高分子与达到一定治疗浓度的抗凝血物质相结合形成的复合物，通过带负电荷的天然生物多糖高分子与抗凝血物质以物理共混和物理吸附的形式结合制备而成，在制备膜肺、血泵、管道或插管方面具有广泛应用前景，所述涂层材料在提高涂层管道的血液相容性、提高肝素等抗凝血物质的结合密度、增强安全性、降低医疗费用等方面具有十分重要的意义。

Description

生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种涂层材料及其制备方法与应用，尤其是生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料及其制备方法与应用。

背景技术

心肺衰竭是一个严重的全球性公众健康和临床问题，有着很高的病残率和死亡率。终末期心肺疾病最有效的手段是心肺移植，但由于供体匮乏而限制心肺移植广泛的开展，许多患者在等待心脏移植或心肺移植中死去，而另一些可逆性的心肺衰竭者由于很难渡过短暂的危重关而丧生。

随着体外膜肺氧合(ECMO)技术的出现，极大的提高了危重心肺患者的救治率。体外膜肺氧合(ECMO)是运用生物工程技术抢救垂危患者生命的新方法，ECMO本质是一种改良的人工心肺机，最核心的部分是肝素涂层的膜肺、血泵、管道及插管；膜肺和血泵分别起人工肺和人工心的作用。当患者的心肺功能严重受损，对常规治疗无效时，ECMO可以较长时间全部或部分代替心肺功能，使心脏、肺脏得以充分休息，以争取心脏、肺脏病变治愈及功能恢复的时间。

ECMO实施的关键是其管路的肝素涂层技术。肝素涂抹表面(HCS)技术是在管路内壁结合肝素，肝素保留抗凝活性，通过在人工材料表面涂覆肝素可有效改善人工材料的血液生物相容性，减轻术后的全身炎性反应。作为ECMO中肝素减量的唯一方法，肝素涂层技术的临床应用也越来越受到人们的重视。目前肝素涂层方法大体上可分为三类：(1)离子键结合方式：离子键的结合方式是利用肝素本身含有大量负电荷的属性，将高分子材料表面引入带正电荷的季胺基团偶联剂、表面活性剂或含有阳离子的聚合物，再与肝素作用，使材料表面靠离子键作用形成肝素化层，由于离子键结合的不稳定性，具有亲和力的白蛋白等血浆大分子物质可以同肝素结合而导致肝素分子脱落，所以仅能作为短期使用；(2)共价键结合方式：此种结合方式一般利用高分子材料表面的-CNS基、-NH2基、-OH基等特异性活性基团与肝素分子的-OH基作用来固定肝素，但由于肝素具有大量功能性基团，往往与材料表面的结合过于牢固，导致肝素分子失去活性，因而往往不能得到预期的抗凝效果；(3)终点固定方式：终点固定方式首先在生物材料表面制备一种约束性离子复合物，再通过一种控制的亚硝酸来活化肝素，将肝素以共价键方式固定于含氨基的材料表面，此种固定方式成本高、且脱落的涂层材料会对人体造成伤害。

综上所述，目前肝素涂层技术并不能达到理想的生物相容性，仍具有一定的局限性，因此研发一种新的ECMO涂层材料是现阶段亟待解决的一个重要问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料的制备方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料的应用。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料，主要由带负电荷的天然生物多糖高分子与达到一定治疗浓度的抗凝血物质结合形成的复合物，其中带负电荷的天然生物多糖高分子与抗凝血物质的重量用量关系为90-99∶1-10，即抗凝血物质的重量百分比为1-10％，从而使抗凝血物质浓度达到抗凝血性能，其结合方式为物理共混和物理吸附。

优选的，上述生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料，所述抗凝血物质为肝素或低分子肝素等抗凝血药物。

优选的，上述生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料，还包括与带负电荷的天然生物多糖高分子进行交联的可提高强度的聚乙烯醇类聚合物，其中聚乙烯醇类聚合物与带负电荷的天然生物多糖高分子、抗凝血物质的重量用量关系为10-30∶60-89∶1-10，即抗凝血物质的重量百分比为1-10％，从而有效增加所述涂层材料的弹性、柔韧性、含水率、延长缓释时间，使其达到临床应用要求。

优选的，上述生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料，还包括与带负电荷的天然生物多糖高分子形成包囊材料的带正电荷的天然生物多糖高分子，其中带正电荷的天然生物多糖高分子与带负电荷的天然生物多糖高分子、抗凝血物质的重量用量关系为45.0-49.5∶45.0-49.5∶1-10，即抗凝血物质的重量百分比为1-10％。

上述生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料的制备方法：带负电荷的天然生物多糖高分子与抗凝血物质以物理共混和物理吸附的形式结合，形成缓释生物多糖高分子-抗凝血物质复合物。

优选的，上述生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料的制备方法：先将高强度的聚乙烯醇类聚合物与带负电荷的天然生物多糖高分子进行交联，再与抗凝血物质以物理共混和物理吸附的形式结合，利用聚乙烯醇类聚合物的高强度和天然生物多糖高分子的高含水率优势，制备具有弹性好、柔韧性大和含水率高、缓释时间长的缓释生物多糖高分子-抗凝血物质复合物。

优选的，上述生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料的制备方法：先将带正电荷的天然生物多糖高分子与带负电荷的天然生物多糖高分子通过静电自组装形成包囊材料，再对抗凝血物质进行微胶囊化，以保证抗凝血物质在体内的稳定性，调节抗凝血物质的释放时间，使其达到一种长期平稳缓释的效果。

上述三种缓释生物多糖高分子-抗凝血物质复合物交联后肝素等抗凝血物质有不同的释放速率，可以根据临床应用的需要自由进行选择。

上述生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料在制备膜肺、血泵、管道或插管方面的应用。

生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路，是在体外循环管路的高分子材料内表面上通过能够形成凝胶涂层的二价金属离子交联上述生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料的管路。

上述生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路的制备方法：

1.体外循环管路的高分子材料内表面离子修饰：

①体外循环高分子材料内表面预处理：预处理是对体外循环高分子材料管路内表面进行清洗等，方法是利用溶液浸泡和/或超声处理等方式；

②体外循环管路的高分子材料内表面通过Ca²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺等能够形成凝胶涂层的二价金属离子进行修饰：在预处理过的体外循环高分子材料内表面吸附一层Ca²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺等二价金属离子化合物，经过干燥和固化等步骤，完成体外循环管路的高分子材料内表面离子修饰；

2.体外循环修饰管道与上述生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料交联：

①带负电荷的天然生物多糖高分子与体外循环管路的高分子材料内表面的二价金属离子络合形成离子交联纤维状聚合物，这种纤维状聚合物具有很好的生物相容性和生物粘连性，经二价阳离子修饰的体外循环高分子材料内表面，进行化学交联在体外循环管道内壁形成网状结构，具有缓释肝素等抗凝血物质的抗凝血性能；

②上述生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料的天然生物多糖高分子包埋物质，即抗凝血物质再经离子交联方法固定于体外循环管路的高分子材料内表面，这样不仅可以保持肝素等抗凝血物质的活性，而且可以使肝素等抗凝血物质达到缓慢释放。

本发明的有益效果是：

所述生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料，选择天然生物多糖高分子复合载体材料包埋肝素等抗凝血物质形成生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料，利用该天然生物多糖与二价金属离子络合形成多点位离子交联纤维状聚合物的特点，将体外循环管路的高分子材料内表面用二价金属离子修饰，再经多点位高交联结合缓释生物多糖高分子-抗凝血物质复合物，分别在体外循环管路的内壁形成网状复合物，使其具有缓释肝素等抗凝血物质的作用，达到抗凝血功能，所述涂层材料在提高涂层管道的血液相容性、提高肝素等抗凝血物质的结合密度、增强安全性、降低医疗费用等方面具有十分重要的意义。

将本发明所述的生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路应用到复杂、重症心脏病手术患者体外循环中，可减少肝素等抗凝血物质的用量，使血液在低ACT水平时不在管路产生血栓；并能减少炎症反应、保护血小板及凝血因子，且脱落的涂层材料不会对人体造成伤害；也可减少病人术后失血和库血用量、缩短拔管时间、病人在ICU停留时间及住院时间、相应减少住院费用，从而抵消了使用肝素等涂层管道增加的费用，并能部分缓解临床血荒问题。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

实施例1

将浓度为18mM的FeCI₂溶液50ml，注入一端封闭的25cm医用聚氯乙烯体外循环管道中，37℃水浴30min后倒出剩余溶液，反复3次，真空常温下干燥后备用。

配制1.6％褐藻酸钠溶液95ml，加入肝素后溶液浓度为0.5mg/ml，搅拌30分钟，室温放置过夜。

将经过18mM的FeCI₂处理过的25cm长的医用聚氯乙烯管道一端封闭，另一端注入1.6％褐藻酸钠与0.5％(pH＝1)肝素溶液共100ml，37℃中水浴30min后倒出剩余溶液，反复3次，真空常温下干燥；剩余溶液用于测定肝素浓度，计算出医用聚氯乙烯管道内涂层材料中肝素的含量。

L(w/w％)＝(C₁-C₂)/C₃×100

式中L为医用聚氯乙烯管道内所含肝素的量；C₁为混合体系中肝素的总浓度；C₂为剩余溶液肝素的浓度；C₃为褐藻酸钠的浓度。

最终得到医用聚氯乙烯管道内涂层材料中肝素的含量为220μg/cm²。

实施例2

将浓度为16mM的CaCI₂溶液50ml，注入一端封闭的25cm医用聚氯乙烯体外循环管道中，37℃水浴30min后倒出剩余溶液，反复3次，真空常温下干燥后备用。

配制1.5％褐藻酸钠溶液100ml，加入6％聚乙烯醇5ml，室温搅拌交联后静置过夜，加入肝素后溶液浓度为0.8mg/ml，搅拌30分钟，室温放置过夜。

将经过16mM的CaCI₂处理过的25cm长的医用聚氯乙烯管道一端封闭，另一端注入1.5％褐藻酸钠-聚乙烯醇与1.2％(pH＝1)肝素溶液共100ml，37℃中水浴30min后倒出剩余溶液，反复3次，真空常温下干燥，剩余溶液用于测定肝素浓度，计算出医用聚氯乙烯管道内涂层材料中肝素的含量。

最终得到医用聚氯乙烯管道内涂层材料中肝素的含量为460μg/cm²。

实施例3

将浓度为17mM的ZnCI₂溶液50ml，注入一端封闭的25cm医用聚氯乙烯体外循环管道中，37℃水浴30min后倒出剩余溶液，反复3次，真空常温下干燥后备用。

配制1.3％褐藻酸钠溶液90ml，与2％HAC溶解的壳寡糖静电交联反应过夜，加入肝素后溶液浓度为1.5mg/ml，搅拌30分钟，室温放置过夜。

将经过17mM的ZnCI₂溶液处理过的25cm长的医用聚氯乙烯管道一端封闭，另一端注入1.3％褐藻酸钠与2％HAC溶解的壳寡糖静电交联溶液，加入1.8％(pH＝1)肝素溶液共100ml，37℃中水浴30min后倒出剩余溶液，反复3次，真空常温下干燥，剩余溶液用于测定肝素浓度，计算出医用聚氯乙烯管道内涂层材料中肝素的含量。

最终得到医用聚氯乙烯管道内涂层材料中肝素的含量为662μg/cm²。

实施例4

配制1.6％褐藻酸钠溶液90ml，与2％HAC溶解的壳寡糖静电交联反应过夜，加入低分子肝素后溶液浓度为0.7mg/ml，搅拌30分钟，室温放置过夜。

将经过19mM的ZnCI₂溶液处理过的25cm长的医用聚氯乙烯管道一端封闭，另一端注入1.6％褐藻酸钠与2％HAC溶解的壳寡糖静电交联溶液，加入0.9％(pH＝1)低分子肝素溶液共100ml，37℃中水浴30min后倒出剩余溶液，反复3次，真空常温下干燥，剩余溶液用于测定低分子肝素浓度，计算出医用聚氯乙烯管道内涂层材料中低分子肝素的含量。

最终得到医用聚氯乙烯管道内涂层材料中低分子肝素的含量为348μg/cm²。

实施例5

生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料性能评定

①实施例1-3所述涂层管路的三种生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料中肝素的含量测定：

甲苯胺蓝与肝素呈显色反应，在600nm处有最大吸收，根据肝素含量对透光率所作的标准曲线可测定肝素从材料中的洗脱量，由此可计算肝素在复合缓释涂层材料中的反应量，肝素的反应量＝加人材料中反应前肝素量-材料反应后肝素洗脱量。

a.标准曲线制作：取10ml的肝素标准液，浓度分别为0.1、0.2、0.3.0.4、0.6mg/ml，加入浓度为35mg/L的甲苯胺蓝溶液1.5ml，在722型光栅分光光度计上，波长600nm，用0.5cm厚度的比色杯，以PBS洗液为空白，进行比色，制作标准曲线；标准曲线方程：C＝52.69A-1.6722(r＝0.9996)。

b.制备好的三种生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料样品分别用100ml PBS洗液浸泡，在振荡器上室温下振荡，每24h换一次洗液，连续浸泡15d，收集每次浸泡液，用甲苯胺蓝法根据标准曲线测定浸泡液中肝素的洗脱量，结果见表1。

表1三种生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料样品中肝素的洗脱量

时间样品	实施例1样品浸泡液	实施例2样品浸泡液	实施例3样品浸泡液
				24h	0.96％	0.83％	0.22％
48h	0.77％	1.03％	0.57％
				72h	0.81％	0.64％	0.43％
96h	1.02％	0.77％	0.42％
				120h	0.62％	0.95％	0.31％
144h	0.99％	0.79％	0.55％
				168h	1.03％	1.00％	0.26％
192h	0.59％	0.71％	0.36％
				216h	0.71％	0.98％	0.34％
240h	0.66％	0.69％	0.50％
				264h	0.85％	0.84％	0.42％
288h	1.01％	0.59％	0.53％
				312h	0.64％	0.73％	0.23％
336h	0.81％	0.96％	0.35％
				360h	0.82％	0.83％	0.54％

洗脱量小于1％说明三种生物型高交联网状缓释ECMO材料涂层方法稳定性良好，几乎没有肝素游离脱落，可满足心脏外科体外循环手术的需求。

肝素释放速率的测定：将已经分别通过三种生物型高交联网状缓释ECMO材料涂层处理的PVC管路在室温下浸泡于生理盐水中，制备浸提液。在不同的浸泡时间取样，用甲苯胺蓝法检测浸提液中的游离肝素量，除以网状缓释ECMO材料中的肝素含量，即可计算肝素分子的释放速率。

实施例6

生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路的血液相容性试验

①溶血实验：新采的人血20ml加入质量分数为2％草酸钾1ml，制成新鲜抗凝人血。

取配好的抗凝人血8ml，加质量分数为0.9％氯化钠溶液10ml稀释备用.实施例1-3所述三种涂层管路样品分别切成0.5cm×2.5cm小条，称样3份，每份5g，用蒸馏水冲洗后再用双蒸水摇洗2次，每次约5min，加入质量分数为0.9％的氯化钠溶液50ml浸泡24h，倾去浸泡液，重新加入质量分数为0.9％的氯化钠溶液10ml，置于37℃水浴中恒温60min后放人750r/min的离心机上离心5min；吸取上清液移入比色杯中，用722型光栅分光光度计在545nm波长处测定其吸收率。

阳性对照用双蒸水10ml加稀释人血0.2ml，阴性对照用质量分数为0.9％NaCl溶液10ml加稀释人血0.2ml，保温条件和测定方法与样品相同。

实验结果见表2。

表2三种生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料样品的溶血程度

平行组别样品	实施例1样品	实施例2样品	实施例3样品
				1组	1.67％	0.85％	0.35％
2组	1.33％	1.14％	0.57％
				3组	1.42％	0.61％	0.46％

结果表明溶血程度为0.35-1.67％，符合ISO关于医用材料溶血率小于5％的要求。

②全血凝血实验：

取10cm×10cm的洁净玻璃试管分为两组，一组为空白，二组为样品组，其中样品组分别为实施例1-3所述样品，每组3个平行样，于37℃恒温，顺序沿壁加入1ml人血于试管中，开始计时，5min后，每隔半分钟倾斜试管，至试管中血液不流动即为凝血时间。

结果各组涂层管道材料无溶血、无凝血，具有良好的血液相容性，说明能够满足临床对抗凝血体外循环涂层管路的需求。

实施例7

生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路的细胞毒性研究

将实施例1-3所述三种生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路制备成0.7cm×0.7cm大小薄片，三蒸水漂洗3遍并接受钴60照射后加入6孔细胞培养板中央；再将培养3d、生长旺盛的L929细胞制备成浓度为3×10⁴个/ml的细胞悬液，持续搅拌后吸取3ml注入6孔板中，摇床水平振荡3min，使细胞均匀分散；将细胞在5％(V/V)CO2、37℃恒温培养箱中培养24h后，于倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况。

结果细胞在生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料表面正常生长，说明三种生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料毒性轻微。

实施例8

生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路抗凝血性能

分别向实施例1-3所述三种生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路中加入新鲜全血3ml，密封两端口，37℃恒温振荡箱中水浴10min，后将血液离心(2000r/min，2min)，2h内进行血浆凝血酶原时间(PT)及部分凝血活酶时间(APTT)检测。应用Modular体外循环机建立测试回路，将待测三种生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路分别连接于回路中，2000ml生理盐水预充，以4L/min流量进行转流，于规定转流时间将管道取出，自然干燥后加入新鲜全血3ml，37℃恒温振荡箱中水浴10min后进行凝血酶原时间(PT)及部分凝血活酶时间(APTT)检测：

实施例1所述三种生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路PT为205，APTT为299。

实施例2所述三种生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路PT为235，APTT为312。

实施例3所述三种生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路PT为241，APTT为327。

结果PT＞169不凝，APTT＞249不凝。

综上实验表明，所述生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路具有良好的抗凝血性能，能够满足体外循环心脏手术中短期使用。

总之，生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料本身无毒，与肝素结合的涂层材料细胞生长好，同时具有优异的抗凝血性能和稳定性，能够满足体外循环心脏手术中短期使用，还可应用于透析设备，临床输血器等方面，具有广阔的应用前景。

上述参照具体实施方式对该生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料及其制备方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims

1.生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路，其特征在于：是在体外循环管路的高分子材料内表面上通过能够形成凝胶涂层的二价金属离子交联生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料的管路，所述生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料，主要由带负电荷的天然生物多糖高分子与达到一定治疗浓度的抗凝血物质以物理共混和物理吸附方式结合形成的复合物，其中带负电荷的天然生物多糖高分子与抗凝血物质的重量用量关系为90-99：1-10，所述带负电荷的天然生物多糖高分子与二价金属离子络合形成离子交联纤维状聚合物，所述抗凝血物质包埋于所述离子交联纤维状聚合物中。

2.根据权利要求1所述的生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路，其特征在于：所述抗凝血物质为肝素。

3.根据权利要求1所述的生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路，其特征在于：所述抗凝血物质为低分子肝素。

4.权利要求1所述的生物型高交联网状缓释ECMO涂层管路的制备方法，其特征在于：

(1)体外循环管路的高分子材料内表面离子修饰：

①体外循环高分子材料内表面预处理：预处理是对体外循环高分子材料管路内表面进行清洗，方法是利用溶液浸泡和/或超声处理方式；

②体外循环管路的高分子材料内表面通过能够形成凝胶涂层的二价金属离子进行修饰：在预处理过的体外循环高分子材料内表面吸附一层二价金属离子化合物，经过干燥和固化步骤，完成体外循环管路的高分子材料内表面离子修饰；

(2)体外循环修饰管道与生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料交联：

①带负电荷的天然生物多糖高分子与体外循环管路的高分子材料内表面的二价金属离子络合形成离子交联纤维状聚合物，这种纤维状聚合物具有很好的生物相容性和生物粘连性，经二价阳离子修饰的体外循环高分子材料内表面，进行化学交联在体外循环管道内壁形成网状结构；

②上述生物型高交联网状缓释ECMO涂层材料的天然生物多糖高分子包埋物质，即抗凝血物质再经离子交联方法固定于体外循环管路的高分子材料内表面。