CN101724033A - 人类附睾表达***结合蛋白hel-28及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术和医学领域。本发明公开了一种新的人附睾特异表达***结合蛋白HEL-28及其制备和应用。公开了本发明编码HEL-28蛋白的氨基酸序列,提供携带编码本发明蛋白的DNA序列的重组表达载体。该蛋白定位于成熟***的头后区。RT-PCR结果显示该蛋白在附睾及人体各种组织表达量很低。用Western blot在附睾体部检测到一条187KD条带。HEL-28蛋白可作为免疫性避孕药的研发,以及***的临床诊断与治疗的靶蛋白。基于HEL-28蛋白开发的相应基因或蛋白检测方法,将广泛用于生殖医学研究领域。
Description
技术领域
本发明属于生物技术与医学领域。具体地说,本发明涉及一种新的人类附睾表达***结合蛋白以下简称HEL-28及其编码基因与应用
背景技术
本世纪人类的发展面临着两个严峻的问题:一方面,全球人口在急速膨胀,预计在2050年将达到90亿;另一方面,据世界卫生组织调查,大约15%的夫妇存在着不育问题,发达国家不育症的发病率在最近10年飚升,欧洲发达国家可高达30%,其中男性因素约占一半。世界卫生组织预测,随着环境污染和性传播疾病等致病因素的增加,本世纪,不育症将成为仅次于肿瘤和心脑血管病的第三大疾病。但男性不育并未引起社会和医学界的足够重视,因此有关男性生殖健康的研究进展缓慢,明显落后于其它学科。缺少分子生物学层面诊断与治疗不育症的有效方法。由于***发育障碍不能自然受精,需要医生通过做试管婴儿获取后代。利用此种技术获取后代,不仅耗费了宝贵的时间与资金,而且存在很多影响健康的潜在因素,失去了正常生育过程中精卵天然结合、优势选择遗传后代的机会。给家庭与社会带来了沉重的精神和经济负担。
全世界人口的急剧增长造成了资源耗竭和环境恶化,成为人类健康与生存的严重威胁。当前世界人口已超过60亿,据专家估计,中国资源环境能支撑的最大人口容量为15-16亿。目前可供人类选择的避孕措施还很有限,离“高效、安全、可逆”的标准还相差较远。发展安全有效、先进实用的避孕节育新技术、新产品,以满足不同人群、不同层次的避孕用药的个性化要求是近年来国内外避孕节育技术发展的总趋势。
附睾是***成熟的重要器官,睾丸产生的***需要通过与***腔微环境相互作用才能获得运动、受精、防御和维持正常胚胎发育以及防御等生物学功能。附睾内大约有200余种分泌蛋白与***相互作用,参与***成熟过程,但是人们对这些蛋白的功能知之甚少。与***成熟相关的附睾蛋白的研究将有助于推动男性生殖医学的研究进展,为***的诊断和治疗以及开发新型避孕药物提供侯选分子靶标,同时有可能对附睾环节的男性避孕带来新的思路和突破。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种新的人类附睾表达***结合蛋白HEL-28。
一种人类附睾表达***结合蛋白HEL-28,它具有序列表中序列2的氨基酸序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质或多肽。
本发明的人附睾分泌蛋白命名为:HEL-28,由1663个氨基酸残基组成。HEL-1蛋白存在有3个N糖基化位点,16个N-十四烷酰基化位点和52个磷酸化位点,包括1个cAMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点,22个酪蛋白激酶II磷酸化位点和26个蛋白激酶C磷酸化位点,3个酪氨酸激酶磷酸化位点。而且,分子中含有2个Anaphylatoxin功能域,1个Bipartite nuclearlocalization signal profile,1个NTR功能域。
本发明的第二个目的是提供编码人类附睾表达蛋白HEL-28的基因。它是下列核苷酸序列之一:
序列表中序列1的DNA序列,GenBank注册号为:EU794602;
编码序列表中SEQ ID No.2蛋白质序列的多核苷酸;
与序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的SEQID No.1,全长cDNA序列为5091bp,定位于人19号染色体上,编码1663个氨基酸,编码蛋白为HEL-28,含有信号肽,其开放阅读框为4992bp,是一个完整的读码框。
本发明的第三方面,提供了采用基因工程技术制备具有人类附睾表达***结合蛋白HEL-28活性多肽的方法,它包括含有上述多核苷酸序列的载体,以及被该载体转化或转导的宿主细胞。
本发明的第四方面,提供了与上述人类附睾表达***结合蛋白HEL-28特异性结合的抗体,以及由此开发的用于附睾功能异常所致的不育症的辅助诊断。
本发明的第五方面,提供了检测样本中是否存在人类附睾表达***结合蛋白HEL-28的方法,它包括:将待测样品与分泌蛋白的特异性抗体在一定条件下共同作用,观察是否形成抗原抗体复合物,有抗原抗体复合物形成就提示样品中存在分泌蛋白。
本发明的第六方面,提供了本发明蛋白和其编码序列的用途。例如本发明蛋白可被作为诊断不育症的分子靶点,或作为有效药物成分用于治疗不育症,或作为开发新型避孕药物的靶分子,或被用于筛选促进人类附睾表达***结合蛋白HEL-28活性的激动剂,或被用于筛选抑制人类附睾表达***结合蛋白HEL-28活性的拮抗剂,或被用于肽指纹图谱鉴定。根据人类附睾表达***结合蛋白HEL-28的编码序列或其片段,可设计引物或探针用于PCR或核酸杂交,或者用于制备基因芯片。本发明蛋白还可用于药物组合物,以此作为有效活性成分,用于生产一种对抗病原微生物感染以及肿瘤等疾病的药物。
本发明的第七方面,提供了一种药物组合物,所述组合物包含本发明所述的蛋白、核苷酸序列、构建物或细胞,以及药学上可接受的载体。
本发明的蛋白能够在附睾内特异性表达,定位于***头后区域,因此可能与精卵识别、运动、受精有关。因为它是一种天然的蛋白多肽,可以预见可能具有较少的副作用,本发明的其他优点可从以下的详细描述获知。
附图说明
图1.HEL-28蛋白在人***上的免疫荧光定位
红色荧光显示***核;绿色荧光显示HEL-28蛋白在***上的定位;
A组:阳性对照,A3显示HEL-75蛋白结合于整个***(文章已发表);
B组:阴性对照。
C组:HEL-28蛋白定位,C3.显示HEL-28蛋白结合在***头后区域。
比例尺:5mm。
图2HEL-28基因组织表达图谱
1附睾头 2附睾体 3附睾尾 4睾丸 5心 6肝 7脾 8肾 9胃 10阴性对照
图3.HEL-28蛋白在***表达的western blot结果
M:Marker;1:阳性对照,HEL-75蛋白;2:阴性对照,小鼠血清;3:HEL-28蛋白
本发明的蛋白包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似性生物活性或功能的变异形式,这些变异形式包括(但并不限于):相对于天然蛋白的氨基酸序列有若干个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳的1-10个)氨基酸的缺失、***和取代。另外,所述缺失或***(增加)也可发生在C末端和/或N末端(通常有20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内的氨基酸缺失或增加),在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变氨基酸的功能,提供功能相似氨基酸的保守性置换表是本领域所熟知的。下列5组各自含有能相互保守置换的氨基酸;脂族:甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I);芳族:苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);含硫:甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C);碱性:精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H);酸性:天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)。另外,该术语还包括了蛋白的片段或衍生物,条件是该片段或衍生物保留了所希望的蛋白生物活性。
本发明的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,用本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA文库作为模板,扩增而得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明中,使用本领域技术人员已知的常规方法将包含编码本发明的蛋白的核苷酸序列***到载体中,这些方法包括但不限于体外重组DNA技术,体内重组技术等。
上述载体可用于转化或转染适当的原核和真核细胞,以使其能够表达所编码的本发明的蛋白,宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞,或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如昆虫细胞等。可采用的转化、转染方法包括但并不限于:磷酸钙共沉淀法、显微注射、电穿孔、脂质体介导等。
本发明的蛋白在细胞内表达,如果需要,可利用其物理的、化学的和其他特性通过各种方法分离和纯化表达产物,这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但不限于:常规的复性处理、用常规的蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、声波破菌、超离心、分子筛层析、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析和其它各种层析技术及这些方法的结合。
本发明还包括对蛋白或其片段具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体,还包括具有免疫活性的抗体片段或嵌合抗体,如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如重组抗体、纯化的基因产物或者其具有抗原性的片段,可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生,本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。
发明人通过研究进一步发现,该蛋白定位于成熟***的头后区(图1)。RT-PCR结果显示该蛋白在附睾及人体各种组织表达量很低(图2)。发明人在大肠杆菌中表达了人HEL-28蛋白,用其免疫小鼠,获得了其多抗血清。发明人用Western blot在附睾体部检测到一条187KD条带(图3)。
本发明的药物组合可根据各种需要制成各种剂型,通常可将药物组合物制成可注射剂,例如液体溶液或悬浮液;还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、溶液载体的固体形式,脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中,本发明的药物组合物可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用,为了提高用药效果,本发明的蛋白也可以与其他药物共同使用。
下面结合具体实例,进一步阐述本发明,应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围,除非另有描述,本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术,这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下面文献中有完整的描述:例如Sambrook《分子克隆实验指南》第二版(1989);《DNA克隆》第I和第II卷(D.N.Glover编辑,1985);《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑,1984);《核酸杂交》(B.D.Hames和S。J。Higgins编辑。1984);《蛋白质纯化;原理和实践》第2版(Spring-Verlag,N.Y.),以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)或者,可以按照试剂生产商所提供的说明书进行。
具体实施方式
实施例1.采用基因工程技术制备人类附睾表达蛋白HEL-28
基因克隆及序列分析
对本实验室构建的人附睾cDNA文库进行大规模测序筛选,获取表达序列标签(EST),利用Unigene数据库进行电子克隆,获得人HEL-28全长cDNA。使用Expasy Translate tool(http://us.expasy.orghttp://us.expasy.org),InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/Tools/http://www.ebi.ac.uk/Tools/)和Protein杙roteinblast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)等预测HEL-28肽序列及假定功能。SignalP(http://www.cbs.dtu.dkhttp://www.cbs.dtu.dk),PSORTII和WoLFPSORT(http://psort.nibb.ac.jp)等软件分析预测该蛋白的信号肽及胞内定位。ProfileScan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCANhttp://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN)预测N端糖基化和磷酸化位点。
对获得的人HEL-28全长cDNA,根据生物信息学预测编码HEL-28成熟肽的基因序列设计一对特异引物:F01:5’-TTGGTACCGACGACGACGACAAG GGACCCACCTCAGGTC-3’,F02:5’-GCGGCGAATTC GTTGGGGCACCCAAA-3’,上下游引物两端分别引进限制性内切酶位点KpnI和EcoRI。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以本实验室构建的人附睾cDNA文库为模板,PCR扩增HEL-28基因片段。PCR反应条件:94℃预变性10min,(94℃,40s;55℃,45s;70℃,30s)30个循环,70℃延伸10min,4℃保存。反应结束后,1.0%琼脂糖凝胶电泳检测并分离回收目的片段,***克隆载体pMD-18T中进行测序鉴定。
重组HEL-28蛋白表达及纯化
测序鉴定后HEL-28基因通过KpnI和EcoRI位点克隆至表达载体pET-32b(+)中,使其与融合标签阅读框一致。重组表达载体pET32b(+)-HEL-28转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,利用菌落PCR筛选阳性克隆,工程菌株在1mM IPTG,32℃条件下诱导4h后,N端带有His-tag的重组蛋白通过″两步镍亲和层析法″对重组HEL-28蛋白进行分离纯化。简单地说,″第一步亲和层析″用于纯化重组Trx-HEL-28融合蛋白。然后融合蛋白用重组肠激酶裂解,释放融合标签。最后,运用″第二步亲和层析″回收重组HEL-28蛋白。纯化后的重组蛋白用Bradford(Bradford 1976)法进行定量,然后用冷冻干燥进行保存。
实施例2.抗HEL-28多克隆抗血清的制备
用重组HEL-28蛋白免疫BALB/C小鼠制备多抗。简单地说,每只老鼠于第1天注射50μg重组蛋白与等量的完全福氏佐剂(CFA)。然后在第15,30和45天注射25μg重组蛋白和等量的不完全福氏佐剂(IFA)加强免疫。第60天从眼球取血,分离血清后用ELASA和western blot分析抗体的效价和特异性。ELISA分析表明抗体效价达到1∶10000。Westernblot显示对重组蛋白和从人***中抽取的天然HEL-28都具有良好的特异性。
实施例3.人HEL-28mRNA组织表达谱研究
为了确定HEL-28的表达模式,采用半定量RT-PCR分析HEL-28基因在人附睾头、体、尾,睾丸,心,肝,脾,肺,肾,胃等组织中的表达差异。用TRIzol(Tiangen,Beijing,China)抽提总RNA,1ug总RNA用20UAMV逆转录酶(Promega)和0.3ugoligodT18(Promega)反转录成cDNA。然后,2ul合成的cDNA利用基因特异引物进行PCR扩增。20ul反应体系含有:2ul10×PCR buffer(with MgCl2),2ul dNTP Mix(10mmol/L),1ul每个引ul(25umol/L),1ul Taq DNA聚合酶(2.5U/ul),2ulcDNA模板以及11ulddH2O。PCR反应的程序为:94℃,10min;94℃,1min;54℃(对HEL-28)/49℃(β-actin)30s;72℃,1min(35循环);72℃延伸7min。β-actin的表达作为内参。所有PCR扩增产物用1.5%琼脂糖电泳分析。RT-PCR结果显示该蛋白在附睾及人体各种组织表达量很低。
实施例4.人HEL-28蛋白在组织的免疫荧光定位
取人睾丸、附睾组织冰冻切片,进行免疫荧光染色,其中一抗为鼠抗rHEL-28多抗(1∶400),二抗为FITC-标记羊抗鼠IgG(1∶200),细胞核用PI染色。染色后所有的切片用80%甘油封片,然后用共聚焦显微镜(LeicaTCSSP2 AOBS)观察结果。实验同时以小鼠免疫前血清替代一抗作为阴性对照。
实施例5.人附睾蛋白提取物与Western blot
将从人***中提取的总蛋白抽提物20ug,用15%SDS-PAGE分离,然后湿转到PVDF膜上进行western blot。鼠抗人HEL-28多抗为一抗(1∶5000),二抗为HRP-标记羊抗鼠IgG(1∶500)。辣根过氧化酶的活性用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒分析Westernblot显示抗人HEL-28多抗对重组蛋白和从人***中抽取的天然HEL-28都具有良好的特异性。
实施例6.人HEL-28蛋白在***的免疫荧光定位
收集***用PBS洗涤后涂布于1%明胶包被的载玻片上,自然晾干,然后用甲醇固定10分钟。含有***的载玻片用3%BSA在室温下封闭1小时,然后添加鼠抗HEL-28多抗(1∶200),4℃过夜。免疫前小鼠血清做阴性对照。用PBST(PBScontaining0.1%Tween-20)洗涤三次,加入对应的FITC-标记羊抗鼠IgG二抗(1∶200)。载玻片用PBST洗涤三次,然后用80%甘油封片。用Olympus BX-52显微镜观察,HEL-28蛋白结合在***头后区,可能与精卵识别及运动、受精有关。
实施例7.HEL-28重组蛋白的抗菌活性
运用克隆菌落形成单位(CFU)分析抗菌活性。简单地说,过夜培养的E.coli XL-1blue生长到对数期(OD600=0.4-0.5)后用10mM PBS(pH 7.4)稀释。大约2×106CFU/ml细菌在与12.5~100ug/ml的HEL-28混合,37℃培养。在开始培养后的15,30,60和120min分别在取样。将样品用10mMPBS(pH7.4)做系列稀释,每个稀释度取100ul涂布于LB琼脂平板,37℃培养过夜至形成单菌落。统计菌落个数,抗菌活性用细菌存活的百分数表示,公式为:%存活=(蛋白处理后存活克隆数/未经蛋白处理后存活的克隆数)×100。实验以10mM PBS(pH 7.4)代替蛋白处理细菌作为阴性对照。
实施例8HEL-28与***运动性以及体外受精的关系研究
利用HEL-28多抗封闭正常人***,然后进行***运动性和体外受精分析。实验按照vitro life标准试剂盒提供的方法进行。简单地说,***先用SpermRinse-30于37℃、5%CO2培养1小时获能。然后按照1∶200加入鼠抗rHEL-28多抗,于37℃、6%CO2培养2小时进行封闭。封闭后的***分成两部分,一部分直接利用计算机辅助***分析***的运动性。另一部分用G-Fert洗涤2次,并调整至终浓度为1.0×107cells/ml。加入100ul***样品于35mm的培养皿中,然后覆盖石蜡油放入37℃、6%CO2和饱和湿度培养箱内待用。经G-MOPS处理后成熟***加入预先准备好的受精滴中,在37℃、6%CO2和饱和湿度培养箱中培养观察受精情况,每日记录胚胎发育情况。以上所有实验同时用免疫前小鼠血清作为阴性对照。
序列表
<110>李建远
<120>人类附睾表达***结合蛋白HEL-28及其编码基因与应用
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>5091
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<220>
<221>CDS
<222>(33)..(5024)
<400>1
ctgtccctct gaccctgcac tgtcccagca cc atg gga ccc acc tca ggt ccc 53
Met Gly Pro Thr Ser Gly Pro
1 5
agc ctg ctg ctc ctg cta cta acc cac ctc ccc ctg gct ctg ggg agt 101
Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr His Leu Pro Leu Ala Leu Gly Ser
10 15 20
ccc atg tac tct atc atc acc ccc aac atc ttg cgg ctg gag agc gag 149
Pro Met Tyr Ser Ile Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu
25 30 35
gag acc atg gtg ctg gag gcc cac gac gcg caa ggg gat gtt cca gtc 197
Glu Thr Met Val Leu Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro Val
40 45 50 55
act gtt act gtc cac gac ttc cca ggc aaa aaa cta gtg ctg tcc agt 245
Thr Val Thr Val His Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser
60 65 70
gag aag act gtg ctg acc cct gcc acc aac cac atg ggc aac gtc acc 293
Glu Lys Thr Val Leu Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val Thr
75 80 85
ttc acg atc cca gcc aac agg gag ttc aag tca gaa aag ggg cgc aac 341
Phe Thr Ile Pro Ala Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn
90 95 100
aag ttc gtg acc gtg cag gcc acc ttc ggg acc caa gtg gtg gag aag 389
Lys Phe Val Thr Val Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu Lys
105 110 115
gtg gtg ctg gtc agc ctg cag agc ggg tac ctc ttc atc cag aca gac 437
Val Val Leu Val Ser Leu Gln Ser Gly Tyr Leu Phe Ile Gln Thr Asp
120 125 130 135
aag acc atc tac acc cct ggc tcc aca gtt ctc tat cgg atc ttc acc 485
Lys Thr Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Thr Val Leu Tyr Arg Ile Phe Thr
140 145 150
gtc aac cac aag ctg cta ccc gtg ggc cgg acg gtc atg gtc aac att 533
Val Asn His Lys Leu Leu Pro Val Gly Arg Thr Val Met Val Asn Ile
155 160 165
gag aac ccg gaa ggc atc ccg gtc aag cag gac tcc ttg tct tct cag 581
Glu Asn Pro Glu Gly Ile Pro Val Lys Gln Asp Ser Leu Ser Ser Gln
170 175 180
aac cag ctt ggc gtc ttg ccc ttg tct tgg gac att ccg gaa ctc gtc 629
Asn Gln Leu Gly Val Leu Pro Leu Ser Trp Asp Ile Pro Glu Leu Val
185 190 195
aac atg ggc cag tgg aag atc cga gcc tac tat gaa aac tca cca cag 677
Asn Met Gly Gln Trp Lys Ile Arg Ala Tyr Tyr Glu Asn Ser Pro Gln
200 205 210 215
cag gtc ttc tcc act gag ttt gag gtg aag gag tac gtg ctg ccc agt 725
Gln Val Phe Ser Thr Glu Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu Pro Ser
220 225 230
ttc gag gtc ata gtg gag cct aca gag aaa ttc tac tac atc tat aac 773
Phe Glu Val Ile Val Glu Pro Thr Glu Lys Phe Tyr Tyr Ile Tyr Asn
235 240 245
gag aag ggc ctg gag gtc acc atc acc gcc agg ttc ctc tac ggg aag 821
Glu Lys Gly Leu Glu Val Thr Ile Thr Ala Arg Phe Leu Tyr Gly Lys
250 255 260
aaa gtg gag gga act gcc ttt gtc atc ttc ggg atc cag gat ggc gaa 869
Lys Val Glu Gly Thr Ala Phe Val Ile Phe Gly Ile Gln Asp Gly Glu
265 270 275
cag agg att tcc ctg cct gaa tcc ctc aag cgc att ccg att gag gat 917
Gln Arg Ile Ser Leu Pro Glu Ser Leu Lys Arg Ile Pro Ile Glu Asp
280 285 290 295
ggc tcg ggg gag gtt gtg ctg agc cga aag gta ctg ctg gac ggg gtg 965
Gly Ser Gly Glu Val Val Leu Ser Arg Lys Val Leu Leu Asp Gly Val
300 305 310
cag aac ccc cga gca gaa gac ctg gtg ggg aag tct ttg tac gtg tct 1013
Gln Asn Pro Arg Ala Glu Asp Leu Val Gly Lys Ser Leu Tyr Val Ser
315 320 325
gcc acc gtc atc ttg cac tca ggc agt gac atg gtg cag gca gag cgc 1061
Ala Thr Val Ile Leu His Ser Gly Ser Asp Met Val Gln Ala Glu Arg
330 335 340
agc ggg atc ccc atc gtg acc tct ccc tac cag atc cac ttc acc aag 1109
Ser Gly Ile Pro Ile Val Thr Ser Pro Tyr Gln Ile His Phe Thr Lys
345 350 355
aca ccc aag tac ttc aaa cca gga atg ccc ttt gac ctc atg gtg ttc 1157
Thr Pro Lys Tyr Phe Lys Pro Gly Met Pro Phe Asp Leu Met Val Phe
360 365 370 375
gtg acg aac cct gat ggc tct cca gcc tac cga gtc ccc gtg gca gtc 1205
Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser Pro Ala Tyr Arg Val Pro Val Ala Val
380 385 390
cag ggc gag gac act gtg cag tct cta acc cag gga gat ggc gtg gcc 1253
Gln Gly Glu Asp Thr Val Gln Ser Leu Thr Gln Gly Asp Gly Val Ala
395 400 405
aaa ctc agc atc aac aca cac ccc agc cag aag ccc ttg agc atc acg 1301
Lys Leu Ser Ile Asn Thr His Pro Ser Gln Lys Pro Leu Ser Ile Thr
410 415 420
gtg cgc acg aag aag cag gag ctc tcg gag gca gag cag gct acc agg 1349
Val Arg Thr Lys Lys Gln Glu Leu Ser Glu Ala Glu Gln Ala Thr Arg
425 430 435
acc atg cag gct ctg ccc tac agc acc gtg ggc aac tcc aac aat tac 1397
Thr Met Gln Ala Leu Pro Tyr Ser Thr Val Gly Asn Ser Asn Asn Tyr
440 445 450 455
ctg cat ctc tca gtg cta cgt aca gag ctc aga ccc ggg gag acc ctc 1445
Leu His Leu Ser Val Leu Arg Thr Glu Leu Arg Pro Gly Glu Thr Leu
460 465 470
aac gtc aac ttc ctc ctg cga atg gac cgc gcc cac gag gcc aag atc 1493
Asn Val Asn Phe Leu Leu Arg Met Asp Arg Ala His Glu Ala Lys Ile
475 480 485
cgc tac tac acc tac ctg atc atg aac aag ggc agg ctg ttg aag gcg 1541
Arg Tyr Tyr Thr Tyr Leu Ile Met Asn Lys Gly Arg Leu Leu Lys Ala
490 495 500
gga cgc cag gtg cga gag ccc ggc cag gac ctg gtg gtg ctg ccc ctg 1589
Gly Arg Gln Val Arg Glu Pro Gly Gln Asp Leu Val Val Leu Pro Leu
505 510 515
tcc atc acc acc gac ttc atc cct tcc ttc cgc ctg gtg gcg tac tac 1637
Ser Ile Thr Thr Asp Phe Ile Pro Ser Phe Arg Leu Val Ala Tyr Tyr
520 525 530 535
acg ctg atc ggt gcc agc ggc cag agg gag gtg gtg gcc gac tcc gtg 1685
Thr Leu Ile Gly Ala Ser Gly Gln Arg Glu Val Val Ala Asp Ser Val
540 545 550
tgg gtg gac gtc aag gac tcc tgc gtg ggc tcg ctg gtg gta aaa agc 1733
Trp Val Asp Val Lys Asp Ser Cys Val Gly Ser Leu Val Val Lys Ser
555 560 565
ggc cag tca gaa gac cgg cag cct gta cct ggg cag cag atg acc ctg 1781
Gly Gln Ser Glu Asp Arg Gln Pro Val Pro Gly Gln Gln Met Thr Leu
570 575 580
aag ata gag ggt gac cac ggg gcc cgg gtg gta ctg gtg gcc gtg gac 1829
Lys Ile Glu Gly Asp His Gly Ala Arg Val Val Leu Val Ala Val Asp
585 590 595
aag ggc gtg ttc gtg ctg aat aag aag aac aaa ctg aca cag agt aag 1877
Lys Gly Val Phe Val Leu Asn Lys Lys Asn Lys Leu Thr Gln Ser Lys
600 605 610 615
atc tgg gac gtg gtg gag aag gca gac atc ggc tgc acc ccg ggc agt 1925
Ile Trp Asp Val Val Glu Lys Ala Asp Ile Gly Cys Thr Pro Gly Ser
620 625 630
ggg aag gat tac gcc ggt gtc ttc tcc gac gca ggg ctg acc ttc acg 1973
Gly Lys Asp Tyr Ala Gly Val Phe Ser Asp Ala Gly Leu Thr Phe Thr
635 640 645
agc agc agt ggc cag cag acc gcc cag agg gca gaa ctt cag tgc ccg 2021
Ser Ser Ser Gly Gln Gln Thr Ala Gln Arg Ala Glu Leu Gln Cys Pro
650 655 660
cag cca gcc gcc cgc cga cgc cgt tcc gtg cag ctc acg gag aag cga 2069
Gln Pro Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Leu Thr Glu Lys Arg
665 670 675
atg gac aaa gtc ggc aag tac ccc aag gag ctg cgc aag tgc tgc gag 2117
Met Asp Lys Val Gly Lys Tyr Pro Lys Glu Leu Arg Lys Cys Cys Glu
680 685 690 695
gac ggc atg cgg gag aac ccc atg agg ttc tcg tgc cag cgc cgg acc 2165
Asp Gly Met Arg Glu Asn Pro Met Arg Phe Ser Cys Gln Arg Arg Thr
700 705 710
cgt ttc atc tcc ctg ggc gag gcg tgc aag aag gtc ttc ctg gac tgc 2213
Arg Phe Ile Ser Leu Gly Glu Ala Cys Lys Lys Val Phe Leu Asp Cys
715 720 725
tgc aac tac atc aca gag ctg cgg cgg cag cac gcg cgg gcc agc cac 2261
Cys Asn Tyr Ile Thr Glu Leu Arg Arg Gln His Ala Arg Ala Ser His
730 735 740
ctg ggc ctg gcc agg agt aac ctg gat gag gac atc att gca gaa gag 2309
Leu Gly Leu Ala Arg Ser Asn Leu Asp Glu Asp Ile Ile Ala Glu Glu
745 750 755
aac atc gtt tcc cga agt gag ttc cca gag agc tgg ctg tgg aac gtt 2357
Asn Ile Val Ser Arg Ser Glu Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Asn Val
760 765 770 775
gag gac ttg aaa gag cca ccg aaa aat gga atc tct acg aag ctc atg 2405
Glu Asp Leu Lys Glu Pro Pro Lys Asn Gly Ile Ser Thr Lys Leu Met
780 785 790
aat ata ttt ttg aaa gac tcc atc acc acg tgg gag att ctg gct gtc 2453
Asn Ile Phe Leu Lys Asp Ser Ile Thr Thr Trp Glu Ile Leu Ala Val
795 800 805
agc atg tcg gac aag aaa ggg atc tgt gtg gca gac ccc ttc gag gtc 2501
Ser Met Ser Asp Lys Lys Gly Ile Cys Val Ala Asp Pro Phe Glu Val
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aca gta atg cag gac ttc ttc atc gac ctg cgg cta ccc tac tct gtt 2549
Thr Val Met Gln Asp Phe Phe Ile Asp Leu Arg Leu Pro Tyr Ser Val
825 830 835
gtt cga aac gag cag gtg gaa atc cga gcc gtt ctc tac aat tac cgg 2597
Val Arg Asn Glu Gln Val Glu Ile Arg Ala Val Leu Tyr Asn Tyr Arg
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cag aac caa gag ctc aag gtg agg gtg gaa cta ctc cac aat cca gcc 2645
Gln Asn Gln Glu Leu Lys Val Arg Val Glu Leu Leu His Asn Pro Ala
860 865 870
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Phe Cys Ser Leu Ala Thr Thr Lys Arg Arg His Gln Gln Thr Val Thr
875 880 885
atc ccc ccc aag tcc tcg ttg tcc gtt cca tat gtc atc gtg ccg cta 2741
Ile Pro Pro Lys Ser Ser Leu Ser Val Pro Tyr Val Ile Val Pro Leu
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aag acc ggc ctg cag gaa gtg gaa gtc aag gct gcc gtc tac cat cat 2789
Lys Thr Gly Leu Gln Glu Val Glu Val Lys Ala Ala Val Tyr His His
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ttc atc agt gac ggt gtc agg aag tcc ctg aag gtc gtg ccg gaa gga 2837
Phe Ile Ser Asp Gly Val Arg Lys Ser Leu Lys Val Val Pro Glu Gly
920 925 930 935
atc aga atg aac aaa act gtg gct gtt cgc acc ctg gat cca gaa cgc 2885
Ile Arg Met Asn Lys Thr Val Ala Val Arg Thr Leu Asp Pro Glu Arg
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ctg ggc cgt gaa gga gtg cag aaa gag gac atc cca cct gca gac ctc 2933
Leu Gly Arg Glu Gly Val Gln Lys Glu Asp Ile Pro Pro Ala Asp Leu
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970 975 980
ggg acc cca gtg gcc cag atg aca gag gat gcc gtc gac gcg gaa cgg 3029
Gly Thr Pro Val Ala Gln Met Thr Glu Asp Ala Val Asp Ala Glu Arg
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ctg aag cac ctc att gtg acc ccc tcg ggc tgc ggg gaa cag aac 3074
Leu Lys His Leu Ile Val Thr Pro Ser Gly Cys Gly Glu Gln Asn
1000 1005 1010
atg atc ggc atg acg ccc acg gtc atc gct gtg cat tac ctg gat 3119
Met Ile Gly Met Thr Pro Thr Val Ile Ala Val His Tyr Leu Asp
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gaa acg gag cag tgg gag aag ttc ggc cta gag aag cgg cag ggg 3164
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Ser Thr Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val Phe Ser Leu Ala
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Val Asn Leu Ile Ala Ile Asp Ser Gln Val Leu Cys Gly Ala Val
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Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln Lys Pro Asp Gly Val Phe Gln
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aac aac aac gag aaa gac atg gcc ctc acg gcc ttt gtt ctc atc 3479
Asn Asn Asn Glu Lys Asp Met Ala Leu Thr Ala Phe Val Leu Ile
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tcg ctg cag gag gct aaa gat att tgc gag gag cag gtc aac agc 3524
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Leu Pro Gly Ser Ile Thr Lys Ala Gly Asp Phe Leu Glu Ala Asn
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tac atg aac cta cag aga tcc tac act gtg gcc att gct ggc tat 3614
Tyr Met Asn Leu Gln Arg Ser Tyr Thr Val Ala Ile Ala Gly Tyr
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Asp Ala Pro Asp His Gln Glu Leu Asn Leu Asp Val Ser Leu Gln
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Leu Pro Ser Arg Ser Ser Lys Ile Thr His Arg Ile His Trp Glu
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Ser Ala Ser Leu Leu Arg Ser Glu Glu Thr Lys Glu Asn Glu Gly
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Val Thr Met Tyr His Ala Lys Ala Lys Asp Gln Leu Thr Cys Asn
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Lys Phe Asp Leu Lys Val Thr Ile Lys Pro Ala Pro Glu Thr Glu
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Lys Arg Pro Gln Asp Ala Lys Asn Thr Met Ile Leu Glu Ile Cys
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1390 1395 1400
ata tcc atg atg act ggc ttt gct cca gac aca gat gac ctg aag 4289
Ile Ser Met Met Thr Gly Phe Ala Pro Asp Thr Asp Asp Leu Lys
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Gln Leu Ala Asn Gly Val Asp Arg Tyr Ile Ser Lys Tyr Glu Leu
1420 1425 1430
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Asp Lys Ala Phe Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ile Ile Tyr Leu Asp
1435 1440 1445
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Lys Val Ser His Ser Glu Asp Asp Cys Leu Ala Phe Lys Val His
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Tyr Ala Tyr Tyr Asn Leu Glu Glu Ser Cys Thr Arg Phe Tyr His
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Gly Val Asp Tyr Val Tyr Lys Thr Arg Leu Val Lys Val Gln Leu
1540 1545 1550
tcc aat gac ttt gac gag tac atc atg gcc att gag cag acc atc 4739
Ser Asn Asp Phe Asp Glu Tyr Ile Met Ala Ile Glu Gln Thr Ile
1555 1560 1565
aag tca ggc tcg gat gag gtg cag gtt gga cag cag cgc acg ttc 4784
Lys Ser Gly Ser Asp Glu Val Gln Val Gly Gln Gln Arg Thr Phe
1570 1575 1580
atc agc ccc atc aag tgc aga gaa gcc ctg aag ctg gag gag aag 4829
Ile Ser Pro Ile Lys Cys Arg Glu Ala Leu Lys Leu Glu Glu Lys
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Lys His Tyr Leu Met Trp Gly Leu Ser Ser Asp Phe Trp Gly Glu
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1630 1635 1640
caa tgc cag gac ctc ggc gcc ttc acc gag agc atg gtt gtc ttt 5009
Gln Cys Gln Asp Leu Gly Ala Phe Thr Glu Ser Met Val Val Phe
1645 1650 1655
ggg tgc ccc aac tga ccacaccccc attcccccac tccagataaa gcttcagtta 5064
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1660
taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 5091
<210>2
<211>1663
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
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Leu Pro Leu Ala Leu Gly Ser Pro Met Tyr Ser Ile Ile Thr Pro Asn
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Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu Glu Ala His Asp
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50 55 60
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Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val Gln Ala Thr Phe
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Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser Leu Gln Ser Gly
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Gly Lys Ser Leu Tyr Val Ser Ala Thr Val Ile Leu His Ser Gly Ser
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340 345 350
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485 490 495
Lys Gly Arg Leu Leu Lys Ala Gly Arg Gln Val Arg Glu Pro Gly Gln
500 505 510
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Glu Val Val Ala Asp Ser Val Trp Val Asp Val Lys Asp Ser Cys Val
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1490 1495 1500
Lys Leu Cys Arg Asp Glu Leu Cys Arg Cys Ala Glu Glu Asn Cys
1505 1510 1515
Phe Ile Gln Lys Ser Asp Asp Lys Val Thr Leu Glu Glu Arg Leu
1520 1525 1530
Asp Lys Ala Cys Glu Pro Gly Val Asp Tyr Val Tyr Lys Thr Arg
1535 1540 1545
Leu Val Lys Val Gln Leu Ser Asn Asp Phe Asp Glu Tyr Ile Met
1550 1555 1560
Ala Ile Glu Gln Thr Ile Lys Ser Gly Ser Asp Glu Val Gln Val
1565 1570 1575
Gly Gln Gln Arg Thr Phe Ile Ser ProIle Lys Cys Arg Glu Ala
1580 1585 1590
Leu Lys Leu Glu Glu Lys Lys His Tyr Leu Met Trp Gly Leu Ser
1595 1600 1605
Ser Asp Phe Trp Gly Glu Lys Pro Asn Leu Ser Tyr Ile Ile Gly
1610 1615 1620
Lys Asp Thr Trp Val Glu His Trp Pro Glu Glu Asp Glu Cys Gln
1625 1630 1635
Asp Glu Glu Asn Gln Lys Gln Cys Gln Asp Leu Gly Ala Phe Thr
1640 1645 1650
Glu Ser Met Val Val Phe Gly Cys Pro Asn
1655 1660
Claims (10)
1.一种人类附睾表达***结合蛋白HEL-28,其特征在于,它具有序列表中序列2的氨基酸序列或将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的序列2衍生的蛋白质和通过化学方法合成的蛋白质。
2.一种人类附睾表达***结合蛋白HEL-28的编码基因,它是下列核苷酸序列之一:
序列表中序列1的核苷酸序列;
与序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性,且编码相同功能蛋白的DNA序列。
3.含有权利要求2所述基因的真核和原核表达载体。
4.含有权利要求2所述基因的细胞系。
5.针对权利要求1所述蛋白质所制备的各种抗体以及以该抗体为活性成分的试剂。
6.针对权利要求1所述蛋白质提供的药物组合物,所述组合物包含本发明所述的蛋白、核苷酸序列、构建物或细胞,以及药学上可接受的载体。
7.根据权利要求1所述的蛋白在不育症诊断中的应用。
8.根据权利要求1所述的蛋白在不育症治疗中的应用。
9.根据权利要求2所述的基因在开发新的避孕药物中的应用。
10.根据权利要求1所述的蛋白在制备新的抗生素中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200810305129A CN101724033A (zh) | 2008-10-24 | 2008-10-24 | 人类附睾表达***结合蛋白hel-28及其编码基因与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200810305129A CN101724033A (zh) | 2008-10-24 | 2008-10-24 | 人类附睾表达***结合蛋白hel-28及其编码基因与应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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CN101724033A true CN101724033A (zh) | 2010-06-09 |
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Family Applications (1)
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Country | Link |
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CN (1) | CN101724033A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111733148A (zh) * | 2020-06-15 | 2020-10-02 | 南通大学 | 一种重组spam1蛋白及其应用 |
-
2008
- 2008-10-24 CN CN200810305129A patent/CN101724033A/zh active Pending
Cited By (1)
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