CN101724015A - 一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法，包括如下步骤：菌种培养活化，种子培养，菌种接入摇瓶发酵培养，收集发酵液，分离纯化得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。本发明通过微生物发酵制备α-葡萄糖苷酶抑制剂，所得的α-葡萄糖苷酶抑制剂不仅可用于降糖药物的开发，还为进一步研究α-葡萄糖苷酶等酶活性位点提供了新的工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其微生物发酵制备方法。
背景技术
糖尿病、肥胖症和高脂血症在世界范围人口中的发病频率很高并且继续增加。在一般人群中，糖尿病是最慢性的疾病之一，其随着肥胖和年龄的增多而发生。虽然有用于治疗糖尿病综合症所开发的药物，但是今天在对糖尿病病人的治疗中最具有挑战的目标仍然是使血糖水平尽可能地接近正常。另外，餐后高血糖症和高胰岛素血症是发生糖尿病大血管并发症的独立危险因素。《糖尿病医学》中报道，α-葡萄糖苷酶抑制剂存在于小肠微绒毛的α-葡萄糖苷酶，从而抑制进食后的急速上升和其引起的胰岛素浓度上升，因能够抑制人类和人类以外动物的糖，特别是淀粉来源的寡糖、蔗糖代谢，显示出抑制血糖上升的作用，对改善高血糖症状和高血糖所致的肥胖症、糖尿病等各种疾病很有用。此外，添加α-葡萄糖苷酶抑制剂的食品，适用于代谢异常的患者食用，也适用于健康人作为代谢异常预防食品。
目前已有三种α-葡萄糖苷酶抑制剂应用于临床，分别为阿卡波糖(Acarbose)，米格列醇(Miglitol)，伏格列波糖(Viglibose)，但是已经发现这些药物存在腹部不适，胃肠胀气，肠鸣音，排气等消化道反应，偶有腹泻等副作用，其应用受到了限制(Uchida，R，Nasu，Aet.al Chem..Pharm.Bull 47，187-193，1999)。由于这些限制，寻求新型的α-葡萄糖苷酶抑制剂迫在眉睫。
目前，国内外生产α-葡萄糖苷酶抑制剂大都是从中药中提取，中药提取效率较低，成本高，很难产业化。
发明内容
本发明的目的是提供一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法，该方法能够解决中药提取效率低，难于实现产业化的问题。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，所述抑制剂为分子量小于1000多肽。
制备所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的微生物菌种为玫瑰暗黄链霉菌。
所述α-葡萄糖苷酶抑制剂在制备治疗糖尿病药物中的应用。
制备该α-葡萄糖苷酶抑制剂是通过微生物发酵得到的，其方法步骤如下：
(1)菌种活化
制备种子之前采用高氏合成一号固体培养基进行菌种活化，并将活化的菌种转入斜面培养基上培养积累孢子供种子制备用，
培养基重量组成为：可溶性淀粉1.0～3.0％，KNO3 0.01～0.1％，NaCl 0.001～0.05％，K2HPO4 0.01～0.05％，MgSO4·7H2O 0.01～0.05％，FeSO4 0.001～0.005％，琼脂粉1.2～2.2％，余量为水，pH 7.0～10.0，
所述斜面培养基上培养的条件为pH7.0～10.0，温度温度28～35℃，培养时间为5～7d，
(2)种子培养
然后将菌种在如下的培养基按所述培养条件进行培养：
培养基重量组成为：玉米粉1.0～3.0％，可溶性淀粉1.0～3.0％，KNO3 0.1～1.0％，NaCl 0.01～0.05％，K2HPO4 0.01～0.05％，MgSO4·7H2O 0.01～0.05％，FeSO4 0.001～0.005％，余量为水，
种子培养条件为pH7.0～10.0，装液量为25～50ml/250ml，温度温度28～35℃，培养时间为1～2d。
(3)将发酵生产α-葡萄糖苷酶抑制剂的种子液体接种于发酵培养基中进行发酵，
所述发酵培养基重量组成为：玉米粉1.0～4.0％，黄豆粉0.5～2.0％，可溶性淀粉0.1～1.0％，KNO3 0.5～2.0％，NaCl 0.01～0.05％，K2HPO4 0.01～0.05％，MgSO4·7H2O 0.01～0.05％，FeSO4 0.001～0.005％，CaCO3 0.1～0.35％，余量为水，
发酵培养的条件为pH7.0～10.0，装液量为25～50ml/250ml，温度28～35℃，培养时间4～6d，
(4)然后采用常规的方法，从发酵培养产物中分离纯化得到α-葡萄糖苷酶抑制剂。
本发明的突出优点在于：
1、采用从土壤中筛选得到的高产α-葡萄糖苷酶抑制活性的野生菌株作为生产菌株，以玉米粉、玉米浆作为发酵基料，能够保证链霉菌生产繁殖快，生产的α-葡萄糖苷酶抑制剂无毒、无害，含有对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖淀粉酶有很强的抑制率。
2、通过微生物生产酶抑制剂，原料来源简单，生产成本低，无污染，操作实施方便，可以大大提高生产效率。本发明发酵产生次级代谢产物是一种新型的α-葡萄糖苷酶抑制剂，新型α-葡萄糖苷酶抑制剂的出现也为进一步研究α-葡萄糖苷酶等酶活性位点提供了新的工具。
具体实施方式
以下通过具体实例进一步说明本发明。
实施例1
(1)菌种活化：并将活化的菌种转入斜面培养基上培养积累大量孢子供种子大量制备用。
培养基重量组成为：可溶性淀粉2.0％，KNO3 0.1％，NaCl 0.01％，K2HPO40.01％，MgSO4·7H2O 0.01％，FeSO4 0.001％，琼脂粉1.8％，余量为水，pH 7.0，培养温度28℃，培养时间为7d。
(2)种子培养
将斜面上的孢子用接种环挑取一环孢子接到种子培养基中，接种后，将摇瓶分别于26℃、28℃、30℃、32℃、34℃温度下，160r/min培养，24h，每个温度设置三个平行实验。
培养基重量组成为：玉米粉2％，可溶性淀粉1.0％，KNO3 0.5％，NaCl 0.05％，K2HPO4 0.05％，MgSO4·7H2 0.05％，FeSO4 0.001％，余量为水。
pH 7.2，装液量为50ml/250ml。
(3)发酵培养
发酵摇瓶为250ml，装入发酵培养基50ml，灭菌后，转接时，首先将三个平行的种子摇瓶混合在一起，而后用5ml移液枪吸取5ml的种子转移到发酵摇瓶中，培养自26℃、28℃、30℃、32℃、34℃的种子各接种9个摇瓶，置于相应的温度条件相下，160r/min培养，5d，6d，7d取三个摇瓶进行检测。
培养基重量组成为：玉米粉2.0％，黄豆粉0.8％，可溶性淀粉0.5％，KNO31.2％，NaCl 0.05％，K2HPO4 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，FeSO4 0.001％，CaCO30.25％，余量为水，pH8.0。
(4)然后采用常规的方法，从发酵培养产物中分离纯化新型的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
发酵液离心去除菌体后，通过前述的方法来测定α-葡萄糖苷酶抑制活性，。其结果见表1
表1不同温度不同培养时间下对α-葡萄糖苷酶的抑制活性
实验结果分析：
温度在28℃以上较适合α-葡萄糖苷酶抑制剂的生物合成，其中30℃时抑制率达到最高，当培养时间为5d时，次级代谢产物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性达到最高。
实施例2
(1)菌种活化
同实施例1。
(2)种子培养
配制好种子培养基，各种子培养基的初始pH分别为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，灭菌冷却后。将斜面上的孢子用接种环挑取一环孢子接到种子培养基中，将摇瓶分别于30℃，160r/min培养，24h，每个pH值设置三个平行实验。
培养基重量组成同实施例1。
(3)发酵培养
发酵摇瓶为250ml，装入发酵培养基50ml，发酵培养基的初始pH值分别为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0灭菌后，转接时，首先将三个平行的种子摇瓶混合在一起，而后用5ml移液枪吸取5ml的种子转移到发酵摇瓶中，培养自pH6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的种子各接种3个摇瓶，置于30℃，160r/min的条件下培养，5d取出摇瓶进行检测。
培养基重量组成同实施例1。
(4)然后采用常规的方法，从发酵培养产物中分离纯化新型的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
发酵液离心去除菌体后，按前述方法测定α-葡萄糖苷酶抑制活性。其结果见表1
表1不同初始pH下发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制活性
实验结果分析：
培养基的初始pH在8.0以上较适合α-葡萄糖苷酶抑制剂的生物合成，其中9.0时抑制率达到最高，次级代谢产物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性达到最高。
实施例3
(1)菌种活化：
同实施例1。
(2)种子培养
配制好种子培养基，初始pH值为9.0，种子培养基的装液量50ml/250ml、将斜面上的孢子用接种环挑取一环孢子接到种子培养基中，将摇瓶分别于30℃，160r/min培养，24h，设置三个平行实验。
培养基重量组成同实施例1。
(3)发酵培养
配制好发酵培养基，初始pH为9.0，装液量分别为20ml/250ml、30ml/250ml、40ml/250ml、50ml/250ml、60ml/250ml、70ml/250ml、80ml/250ml、90ml/250ml、100ml/250ml，灭菌后，转接时，首先将三个平行的种子摇瓶混合在一起，而后用5ml移液枪吸取5ml的种子转移到发酵摇瓶中，各接种3个摇瓶，置于30℃，160r/min的条件下培养，5d取出摇瓶进行检测。
培养基重量组成同实施例1。
(4)然后采用常规的方法，从发酵培养产物中分离纯化新型的α-葡萄糖苷酶抑制剂。
发酵液离心去除菌体后，按前述的方法测定α-葡萄糖苷酶抑制活性。其结果见表1
表1不同装液量下发酵液对α-葡萄糖苷酶的抑制活性
实验结果分析：
实验结果表明，中等程度的通气条件下，如40ml/250ml，有利于α-葡萄糖苷酶抑制剂的生物合成，过高或者过低的通气条件都将不利于α-葡萄糖苷酶抑制剂的生物合成。
Claims (3)
1.一种α-葡萄糖苷酶抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为分子量小于1000多肽。
2.制备权利要求1所述α-葡萄糖苷酶抑制剂的微生物菌种为玫瑰暗黄链霉菌。
3.权利要求1所述α-葡萄糖苷酶抑制剂在制备治疗糖尿病药物中的应用。
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| CN200910114494A CN101724015A (zh) | 2009-10-30 | 2009-10-30 | 一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法 |
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| CN200910114494A Pending CN101724015A (zh) | 2009-10-30 | 2009-10-30 | 一种α-葡萄糖苷酶抑制剂及其制备方法 |
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| CN (1) | CN101724015A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103114099A (zh) * | 2013-02-07 | 2013-05-22 | 广西大学 | 编码糖基水解酶家族1的β-葡萄糖苷酶基因及其应用 |
| CN109021075A (zh) * | 2018-08-31 | 2018-12-18 | 华南理工大学 | 一种降血糖十肽 |
| CN109021079A (zh) * | 2018-08-31 | 2018-12-18 | 华南理工大学 | 一种降血糖十六肽 |
| CN109021076A (zh) * | 2018-08-31 | 2018-12-18 | 华南理工大学 | 一种降血糖七肽 |
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2009
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