CN101717719A - 一种体外细胞压力加载装置及其体外细胞压力加载方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种体外细胞压力加载装置及其体外细胞压力加载方法，其特点是该装置包括气压源(1)、进气电磁阀(2)、过滤器(3)、减压阀(4)，压力腔体(5)和数字调控***，气压源通过进气电磁阀、过滤器、减压阀与压力腔体连接；压力腔体(5)的一端与出气电磁阀(6)连接；出气电磁阀通过驱动电路(7)、多功能数据采集卡(8)与计算机(14)连接；驱动电路(7)另一侧与进气电磁阀(2)连接；压力腔体(5)的另一端与压力传感器(9)连接；压力传感器通过可程控增益放大器(10)、多功能数据采集卡(8)与计算机(14)连接；压力腔体(5)通过标准气缸(11)、直线步进电机(12)、功率放大器(13)、多功能数据采集卡(8)与计算机(14)连接。

Description

一种体外细胞压力加载装置及其体外细胞压力加载方法

技术领域

本发明涉及一种体外细胞压力加载装置及其体外细胞压力加载方法，属于组织工程和细胞工程领域。

背景技术

细胞力学是组织工程和细胞工程的基础之一，常常要研究力学因素对细胞形态变化及生长的影响。由于生物体组织和器官的结构极其复杂，生物个体之间也存在较大的差异，致使在体细胞的力学环境复杂多样，从而增加在体细胞力学行为研究的难度。在体组织、细胞受压是生物体常见的一种承载方式，如肌骨***中，骨骼是人体主要的承载结构，它为人体提供支撑框架，保护内脏器官，并完成力的传递；关节部位的人体软骨，常承受经骨骼传递的压力载荷，压力的作用对关节软骨的生长、代谢等至关重要。因此，研究压力载荷下细胞的力学行为具有十分重要的意义。细胞力学研究的基础和关键是细胞加载技术，由于人体细胞的大小在十几到几十个微米之间，细胞膜的厚度仅有几个纳米到几十个纳米，常规的宏观力学加载方法和实验技术无法直接使用，因此，体外分离细胞和建立合适的加载培养模型是细胞力学面临的首要问题。

细胞体外培养时，通过模拟在体组织中细胞的应力环境，研究压力载荷下细胞的力学特性的实验方法，可追溯到早期的Glucksmann(Anatomical Record，1939；73：39-56)的研究工作：将鸡胚胫骨内膜细胞培养在肋间肌基质上，随着肌肉的萎缩，肋骨彼此靠近，细胞受到压力作用。Rodan(Science，1975；189：467-469；Calcifid Tissue Research，1975；18：125-131；Journal of Cellular Physiology，1976；88(3)：353-361)等的研究具有划时代的意义，他们利用气体或液体产生的静压使细胞受到相应的压应力作用，研究进入量化阶段。经过多年改进和发展，多种体外培养细胞的加力装置已经被研制出来。大致可分为离心力加载装置、流体剪切力加载装置、空气液体静压力加载装置、基底形变加载装置(短形基底拉伸加载装置、静态膜式细胞牵张力加载装置、Flexercell细胞加载装置(Bone Miner Res，1998，13：218-28)、Petriperm弹力膜培养皿加载装置(Am J OrthodDentofac Orthop，1991，99：226-40))等，部分加载装置已经商品化，但是所有这些装置都各有优缺点，并各自适用于所要研究的细胞类型。如离心力加载装置不能真正反应细胞的生理状态，Flexercell细胞加载装置、Petriperm弹力膜培养皿加载装置结构复杂、价格昂贵，流体剪切力加载装置仅适用于研究血管内皮细胞的体外加载实验等。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种体外细胞压力加载装置及其体外细胞压力加载方法，其特点是在体外对培养细胞在指定的培养条件下进行压力加载，对加载压力的大小、作用频率及作用持续时间等进行定量控制。它具有界面友好、性能稳定、操作简单的优点。

本发明所用的细胞加载装置是可控压力细胞加载装置，用来模拟在体组织中细胞的应力环境。***的工作原理是：将维持细胞体外生存和生长的培养皿及其培养的细胞放入压力腔中，高压储气室内(钢瓶)的高压气体经两级减压装置减压到一定压强后由稳压阀调控以稳定的压强进入压力腔中，当压力腔内的压强达到预定值时，关闭进气电磁阀，压力腔内形成稳定的密闭环境，压力加载部分原理为利用直线步进电机驱动汽缸加压，使压力腔内形成一定频率、大小的周期性气压变化，从而使压力腔里的细胞受到相应的压力作用。实验完毕，打开排气电磁阀，气体经其排出。***使用恒温水槽控制装置使内环境的温度恒定在37℃，保证实验过程中细胞的生物活性。

发明的目的由以下技术措施实现：

该装置包括气压源、进气电磁阀、过滤器、减压阀，压力腔体和数字调控***，气压源通过进气电磁阀、过滤器、减压阀与压力腔体连接；压力腔体的一端与出气电磁阀连接，出气电磁阀通过驱动电路、多功能数据采集卡与计算机连接；驱动电路另一侧与进气电磁阀连接；压力腔体的另一端与压力传感器连接；压力传感器通过可程控增益放大器、多功能数据采集卡与计算机连接；压力腔体通过标准气缸、直线步进电机、功率放大器。多功能数据采集卡与计算机连接。

压力腔体内设多层培养皿盘，每层培养皿盘上设有多个样品凹槽，培养皿层固定在盖板上，盖板通过密封圈与压力腔体紧固，盖板上设有进气口，出气口和压力传感器进口，压力腔体由底板支架支撑，盖板推、拉动使培养皿层自由进出压力腔体。

驱动电路由反相器，限流电阻，固态继电器，续流二极管组成和电磁阀组成。多功能数据采集卡输出的控制信号为逻辑电平U1N，当U1N＝5V时，反相器输出低电平，使固态继电器中发光二极管发光，处罚固态继电器内部可控硅导通，电磁阀得电工作，当U1N＝0V时，反相器输出为高电平，固态继电器发光二极管不发光，固态继电器内可控硅截止，电磁阀截止，计算机通过多功能数据采集卡接收气压变化信号，经过程序计算后，将指令反馈至多功能数据采集卡，通过驱动电路控制出气及进气电磁阀，达到调节压力腔内气体的目的。

体外细胞压力加载装置的体外细胞压力加载方法包括以下步骤：

(1)打开钢瓶气阀，使培养腔体内充满95％空气和5％CO₂的混合气体；

(2)将受试细胞连同培养皿放入压力腔体中，通过电脑，密闭压力腔；

(3)设定需要的持续压强以及变化波形，电脑通过驱动电路控制进气电磁阀，出气电磁阀，以此调节压力腔内压力；

(4)压力腔内压力通过压力传感器传达到可程控增益放大器，转化为电子信号，由多功能数据采集卡反馈至电脑，通过程序进行压强调整以及维持；

(5)对于要求压力呈波形变化的加载方式，电脑通过多功能数据采集卡，可程控增益放大器，功率放大器，控制直线步进电机，通过推动标准气缸，调节压力腔内气体变化，而压力腔内压力也通过压力传感器，可程控增益放大器，多功能数据采集卡反馈至电脑，精细调整气压，达到实验要求。

压应力加载流程***的气压源选择5％CO₂与95％空气的混合气体，利用空气过滤器净化气体，保证气体无菌环境；鉴于细胞培养的特殊性，压力腔选用无污染、无毒性的医用耐酸不锈钢材料加工而成。

数字调控部分包括四个环节：多功能数据采集卡完成计算机与测控通道之间的信息传递，也就是模拟量与数字量之间的相互转换；可程控增益放大器配合压力传感器构成测量通道，测试压力腔内的压力；功率放大器和执行机构步进电机构成控制通道，驱动汽缸活塞；计算机完成数据的显示、存储和处理.

软件设计是数字调控的核心，使用Borland C++ builder5编写压力加载计算机控制软件，其功能如下：

电磁阀控制功能：任意时刻，在选择所要调节的电磁阀打开或关闭相应电磁阀。

步进电机控制功能：设定脉冲频率(单位为Hz)、或电机推动活塞运行距离(单位为mm)两种方式控制步进电机运行。同时检测电机活塞的位移，监视直线步进电机的运行状态。根据检测到的情况，通过计算机采样控制电路自动调整装置的压力参数，使***处于理想状态。

数据采集：采样方式采用等点采样方式，完成压力信号的A/D转换。

数据存储功能：为手动存储和定时采集存盘两种方式。手动方式下，任意时刻按下按钮，程序在采集10个周期后自动存盘，定时采集存盘方式下，先通过菜单项设置存盘间隔时间，然后启动定时采集存储功能。

数据处理功能：以直线步进电机驱动的周期为时间间隔，当完成一个周期的数据采集后，计算该周期压力的最大值、平均值和最小值，并在相应的显示框中显示。

数据显示功能：数据采集模块完成对压力腔内压力的数据采集工作，并且将采集到的数据以数字示波器的方式实时显示出来。

本发明具有如下优点：

1.本装置将***分成四个部分，互相以导线或导气管连接，做到远程操作，能够在不影响整个培养***连续性的前提下，对实验进行适时调控。

2.采用计算机来控制加载的压力值、加压时间，具有方便、精确。

3.频率控制程序COM通过串口微电流，再通过直流放大后调控电磁阀的开关阀门，使达到的循环加载较为客观、可信。

4.友好控制面板也使得操作简便；兼之使用压力传感器，能够准确地控制压力值的大小，因此压力的作用准确可靠，对不同压力值作用下细胞的变化特点进行研究，加压时间可调，实验过程可根据需要设定。

附图说明

图1为体外细胞压力装载装置图

1、钢瓶，2、进气电磁阀，3、空气过滤器，4、减压阀，5、压力腔，6、出气电磁阀，7、振动电路，8、多功能数据采集卡，9、传感器，10、可程控增益放大器，11、标准气缸，12、直线步进电机，13、功率放大器，14、电脑，15、控制柜。

图2为压应力加载腔结构示意图

16、底板支架，17、培养皿盘，18、样品凹槽，19、密封圈，20、盖板，21、出气口，22、压力传感器，23、进气口。

图3为驱动电路原理图

24、反相器，25、限流电阻，26、固态继电器，27、续流二极管，28、电磁阀。

图4为气体压力加载计算机控制界面

图5为压力腔内压力变化波形图

a)静态压力波形图

b)动态压力波形图

图6为动、静态压应力对MSCs成骨分化早期细胞形态学的影响

a)骨诱导0天，无压力

b)骨诱导0天，施动态压力5天

c)骨诱导0天，施静压力5天

d)骨诱导3天，无压力

e)骨诱导3天，施动态压力5天

f)骨诱导3天，施静压力5天

g)骨诱导7天，无压力

h)骨诱导7天，施动态压力5天

i)骨诱导7天，施静压力5天

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例：

体外细胞压力加载装置如图1所示，体外细胞压力加载装置包括气压源1、进气电磁阀2、过滤器3、减压阀4，压力腔体5和数字调控***，气压源通过进气电磁阀、过滤器、减压阀与压力腔体连接；压力腔体5的一端与出气电磁阀6连接，出气电磁阀通过驱动电路7。多功能数据采集卡8与计算机14连接；驱动电路7另一侧与进气电磁阀2连接；压力腔体5的另一端与压力传感器9连接；压力传感器通过可程控增益放大器10，多功能数据采集卡8与计算机14连接；压力腔体5通过标准气缸11、直线步进电机12、功率放大器13，多功能数据采集卡8与计算机14连接。

压力腔体5内设多层培养皿盘17，每层培养皿盘设有多个样品凹槽18，培养皿层固定在盖板20上，盖板通过密封圈19与压力腔体紧固，盖板上设有进气口23，出气口21和压力传感器进口22，压力腔体由底板支架16支撑，盖板推、拉动使培养皿层自由进出压力腔体。

驱动电路7由反相器24，限流电阻25，固态继电器26，续流二极管组成27和电磁阀28组成，多功能数据采集卡输出的控制信号为逻辑电平U1N，当U1N＝5V时，反相器输出低电平，使固态继电器中发光二极管发光，处罚固态继电器内部可控硅导通，电磁阀得电工作。当U1N＝0V时，反相器输出为高电平，固态继电器发光二极管不发光，固态继电器内可控硅截止，电磁阀截止。计算机通过多功能数据采集卡接收气压变化信号，经过程序计算后，将指令反馈至多功能数据采集卡，通过驱动电路控制出气及进气电磁阀，达到调节压力腔内气体的目的。

体外细胞压力加载装置的体外细胞压力加载方法包括以下步骤

(1)打开钢瓶气阀，使培养腔体内充满95％空气和5％CO₂的混合气体；

(2)将受试细胞连同培养皿放入压力腔体中，通过电脑，密闭压力腔；

(3)设定需要的持续压强以及变化波形，电脑通过驱动电路控制进气电磁阀，出气电磁阀，以此调节压力腔内压力；

(4)压力腔内压力通过压力传感器传达到可程控增益放大器，转化为电子信号，由多功能数据采集卡反馈至电脑，通过程序进行压强调整以及维持；

(5)对于要求压力呈波形变化的加载方式，电脑通过多功能数据采集卡，可程控增益放大器，功率放大器，控制直线步进电机，通过推动标准气缸，调节压力腔内气体变化，而压力腔内压力也通过压力传感器，可程控增益放大器，多功能数据采集卡反馈至电脑，精细调整气压，达到实验要求。

以下是本发明加载装置在骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨分化早期阶段细胞心态以及增值活性力的影响。

1.实验细胞

生长良好的2～4代2-3周龄雄性大鼠间充质干细胞

以上细胞由四川大学华西口腔医学院重点实验室提供

2.压力腔培养条件

温度：37恒温水浴

气体环境：5％CO2和95％空气混合气体

压力：静态压应力23Kpa，，压应力大小为动态压应力10～35Kpa，动态压应力的频率选择0.25Hz。

3.实验流程

细胞亚融合后分别成骨诱导3天(OS-3d)和7天(OS-7d)。分别施加动态压应力和静态压应力刺激，每天加力时间一个小时，持续1、3、5天。另放培养皿在CO₂恒温孵箱作为对照组。

4.实验结果示例

A.实验分组

根据对压力腔中对细胞加载压力的不同，分为以下各组：

对照组：无体外压力加载

静态压力组细胞：加以23Kpa压力

动态压力组细胞：加以10~35Kpa，频率0.25Hz

B.压力腔内各种压力加载后细胞形态变化

细胞均贴壁生长良好。相应时间点动态压力组与对照组比较，未见明显的细胞排列、细胞形态学改变(图5)，而有些静态压力组细胞形态可”膨胀”由长梭形变圆(图f所示典型的加载静态压力后细胞形态发生的改变)。

实验采用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA消化未成骨诱导或成骨诱导3d和7d的MSCs，用不含成骨诱导剂的血清培养液中止，计数并调整细胞密度，以4×10³/孔接种于96孔板，培养24h后，将培养皿放入压力腔中开始进行压力加载，加力条件同上。

实验样本放入甲基噻唑基四唑20μL混匀，孵箱孵育3.5h，吸去液体。加入200μL二甲基亚砜置于培养箱中0.5h后摇床震荡15min，使用HTS 7000 Plus多孔板高效分析仪(PE，USA)，设定570nm波长。可以看出，动、静压力组MSCs成骨分化早期阶段增殖活力与同时间点未加力对照组很相似。只有静压力加载未诱导MSCs5天后MSCs增殖活性有明显的增强(P＜0.05)。

Claims (4)

1.一种体外细胞压力加载装置，其特征在于该装置包括气压源(1)、进气电磁阀(2)、过滤器(3)、减压阀(4)，压力腔体(5)和数字调控***，气压源(1)通过进气电磁阀、过滤器、减压阀与压力腔体连接；压力腔体(5)的一端与出气电磁阀(6)连接，出气电磁阀通过驱动电路(7)，多功能数据采集卡(8)与计算机(14)连接；驱动电路(7)另一侧与进气电磁阀(2)连接；压力腔体(5)的另一端与压力传感器(9)连接；压力传感器通过可程控增益放大器(10)，多功能数据采集卡(8)与计算机(14)连接；压力腔体(5)通过标准气缸(11)、直线步进电机(12)、功率放大器(13)、多功能数据采集卡(8)与计算机(14)连接。

2.如权利要求1所述体外细胞压力加载装置，其特征在于压力腔体(5)设多层培养皿盘(17)，每层培养皿盘设有多个样品凹槽(18)，培养皿层固定在盖板(20)上，盖板通过密封圈(19)与压力腔体紧固，盖板上设有进气口(23)，出气口(21)和压力传感器进口(22)。压力腔体由底板支架(16)支撑，盖板推拉动使培养皿层自由进出压力腔体。

3.如权利要求1所述体外细胞压力加载装置，其特征在于驱动电路(7)由反相器(24)，限流电阻(25)，固态继电器(26)，续流二极管组成(27)和电磁阀(28)组成，多功能数据采集卡输出的控制信号为逻辑电平U1N，当U1N＝5V时，反相器输出低电平，使固态继电器中发光二极管发光，处罚固态继电器内部可控硅导通，电磁阀得电工作，当U1N＝0V时，反相器输出为高电平，固态继电器发光二极管不发光，固态继电器内可控硅截止，电磁阀截止，计算机通过多功能数据采集卡接收气压变化信号，经过程序计算后，将指令反馈至多功能数据采集卡，通过驱动电路控制出气及进气电磁阀，达到调节压力腔内气体的目的。

4.如权利要求1-3之一所述体外细胞压力加载装置的体外细胞压力加载方法，其特征在于：

(1)打开钢瓶气阀，使培养腔体内充满95％空气和5％CO₂的混合气体；

(2)将受试细胞连同培养皿放入压力腔体中，通过电脑，密闭压力腔；

(3)设定需要的持续压强以及变化波形，电脑通过驱动电路控制进气电磁阀，出气电磁阀，调节压力腔内压力；

(4)压力腔内压力通过压力传感器传达到可程控增益放大器，转化为电子信号，由多功能数据采集卡反馈至电脑，通过程序进行压强调整以及维持；

(5)对于要求压力呈波形变化的加载方式，电脑通过多功能数据采集卡，可程控增益放大器，功率放大器，控制直线步进电机，通过推动标准气缸，调节压力腔内气体变化，而压力腔内压力也通过压力传感器，可程控增益放大器，多功能数据采集卡反馈至电脑，精细调整气压，达到实验要求。

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