CN101716348B - 一种基于金磁纳米粒子的载药平台的构建与应用 - Google Patents
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Abstract
一种基于金磁纳米粒子的载药平台的构建与应用，属于磁性纳米材料技术领域。本发明包括磁性纳米粒子的合成，Fe3O4-SiO2核壳结构的合成，Fe3O4-SiO2核壳结构的表面氨基修饰，表面修饰后质子化及静电吸附金纳米粒子，偶联姜黄素和偶联带巯基聚乙二醇PEG-SH，制得多功能金磁纳米平台。本发明优点在于，金磁纳米粒子的载药平台为表面修饰的磁性载体既具有较强的磁性，又具有良好的化学惰性、生物相容性和易功能化等特点，且制备方法简单。这种磁性纳米材料可在悬浮体系中用磁场进行快速分离；在外加磁场的导向下，高度浓集、作用于肿瘤细胞；可广泛的应用于生物领域，如生物分离、药物运输、生物标记、细胞成像和显影、细胞或其他生物分子的分离研究。
Description
技术领域
一种基于金磁纳米粒子的载药平台的构建与应用，本发明属纳米材料领域，更具体地，是涉及应用于生命科学中药物运输与肿瘤治疗的纳米材料。
背景技术
生物功能化材料是材料学研究的热门领域，其中的纳米材料自上世纪80年代以来由于其特殊的物理化学性质，引起科学家更广泛的关注，从而利用纳米技术来研究和解决生物学领域的重大问题也成为前沿的研究领域之一。
超顺磁性纳米颗粒由于其独特的性质(无剩磁)在生物分离、免疫检测、靶向药物等生物医学领域具有广泛的应用前景。但其自身化学稳定性、胶体稳定性及生物相容性差等缺点，其表面常需要修饰一些聚合物或二氧化硅等。由于二氧化硅具有化学和胶体稳定性、生物相容性好等优点使其成为保护磁性粒子的最理想材料之一。磁性粒子表面修饰二氧化硅后适用于生物分离，但所得的铁氧体-二氧化硅核壳结构微粒粒径分布和核数都不易控制，需要成熟的技术。
金纳米粒子不仅具有量子尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道效应，而且还具有独特的电学、光学和催化性能，这些特性适用于纳米颗粒在细胞吞噬后的表征。
姜黄素是一种从姜科植物姜黄根茎中提取的天然酚类抗氧化剂，色泽稳定且毒性很低，并能抑制体内多种肿瘤细胞系的生长，对肿瘤具有化学预防作用。但由于姜黄素不溶于水，因此需要一种载体增强其生物相容性，并能被有效地运载入相应的肿瘤部位发挥效用。姜黄素分子结构式
当前迫切需要解决的技术问题是提供一种具有生物相容性的表面生物功能化的核壳型纳米平台及其制备方法和应用，以克服单纯药物极低的溶解性和很差的生物相容性，很难有效被有机体吸收，不能发挥抗癌功效的不足。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于磁性纳米粒子和金纳米粒子的纳米平台的构建方法，并将之应用于运输抗癌药物，诱导肿瘤细胞发生凋亡，进而抑制其生长，达到发挥抗癌功效。
本发明的技术方案：一种基于金磁纳米粒子的载药平台的构建方法，包括磁性纳米粒子的合成，Fe3O4-SiO2核壳结构的合成，Fe3O4-SiO2核壳结构的表面氨基修饰，表面修饰后质子化及静电吸附金纳米粒子，偶联姜黄素和偶联带巯基聚乙二醇PEG-SH，制得多功能纳米平台，细胞培养吸收并表征；工艺步骤为：
(1)磁性纳米粒子的合成：用共沉淀法合成具有超顺磁性的磁性纳米粒子；
(2)Fe3O4-SiO2核壳结构的合成：利用步骤(1)得到的磁性纳米粒子，根据反相微乳液法在油包水的环境里合成Fe3O4-SiO2核壳结构；
(3)Fe3O4-SiO2核壳结构的表面氨基修饰：用步骤(2)所得到的Fe3O4-SiO2核壳结构，将其外层的硅球表面氨基化；
(4)表面修饰后质子化及静电吸附金纳米粒子：表面氨基修饰后在pH 6.0的磷酸盐缓冲液中质子化；所得产物静电吸附金纳米粒子；
(5)偶联姜黄素和偶联带巯基聚乙二醇PEG-SH：先共轭偶联姜黄素；再偶联PEG-SH，与金纳米粒子形成稳定的金硫键，制得金磁纳米粒子的纳米平台；
(6)细胞培养吸收并表征：将金磁纳米粒子的载药平台运载进入细胞并以多种检测手段进行表征：
磁共振显像MRI表征细胞吞噬多功能纳米平台；
四甲基偶氮唑MTT表征细胞活力；
流式细胞仪FCM，激光共聚焦扫描显微镜CLSM表征分析肿瘤细胞早期凋亡的特征；
细胞电镜切片表征多功能纳米平台被细胞吞噬后在细胞内位置。
一、磁性纳米粒子的合成：
①分别称取Fe3+，Fe2+溶于80mL超纯水，Fe3+和Fe2+的总浓度为0.08mol/L，Fe3+∶Fe2+摩尔比1-1.2∶2，80℃、400r/min搅拌反应10min；
②逐滴加入5mL氨水，并维持pH 10.0，滴加完毕后反应30min；
③超声混匀，水洗2～3遍；
④磁分离干粉。
二、Fe3O4-SiO2核壳结构的合成：
①加曲拉通，正己醇各7mL混合超声约20min至无油丝状液体；
②28mL环己烷超声45min，倒入100mL三颈烧瓶中，400r/min搅拌30min；
③4mg磁性纳米粒子MNP/2mLH2O分散于2mL氨水中，混合液逐滴加入步骤②的三颈烧瓶中，滴加速度50μL/min，滴加完毕后继续搅拌30min；
④加入3mL正硅酸四乙酯TEOS，搅拌24h；
⑤加8mL丙酮，停止搅拌，倒入烧杯中静置60min，沉淀分层；
⑥4000r/min离心10min，沉淀加乙醇溶解，超声10min，再离心，重复6～8次；
⑦55℃真空干燥7小时；
⑧干燥器中冷却，备用。
三、Fe3O4-SiO2核壳结构的表面氨基修饰：
①100mL具塞锥形瓶中加入15mL丙三醇和25mL甲醇，超声混匀；
②加60mg Fe3O4-SiO2继续超声分散；
③加200μL超纯水，超声使均匀分散；
④加入2mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTS，60℃水浴磁力搅拌6h；
⑤反应结束后，用无水乙醇洗涤2～3遍，真空干燥。
四、表面修饰后质子化，静电吸附金纳米粒子：
①取上述氨基修饰的磁性微球30mg加入到4mL 0.01mol/L pH6.0的磷酸缓冲液PB中，氨基修饰的磁性微球表面带氨基正离子；
②5min后加入4mL的0.3mmol/L金纳米粒子；
③静电吸附20min后3000r/min离心，紫外表征，得静电吸附金纳米粒子的载体。
五、共轭偶联姜黄素和带巯基聚乙二醇PEG-SH：
①将上述静电吸附金纳米粒子的载体以超纯水配成浓度为6mg/mL的悬液A，称取姜黄素溶于二甲亚砜DMSO中得B，浓度2mg/mL；
②将A/B按2∶1体积比放在一起反应15min后离心，滤饼加超纯水恢复体积，紫外表征；
③加入PEG-SH反应20min，离心，滤饼加超纯水恢复体积。
用所述方法构建的基于金磁纳米粒子的载药平台的应用，应用于生物领域：药物运输、生物标记、细胞成像和显影、细胞或其他生物分子的分离研究。
本发明的有益效果：本发明的金磁纳米粒子的载药平台为表面修饰的磁性载体，既具有较强的磁性，又具有良好的化学惰性、生物相容性和易功能化等特点，且制备方法简单。这种磁性纳米材料可在悬浮体系中用磁场进行快速分离；在外加磁场的导向下，高度浓集、作用于肿瘤细胞；可广泛的应用于生物领域，如生物分离、药物运输、生物标记、细胞成像和显影、细胞或其他生物分子的分离研究。
附图说明
图1修饰后的磁性纳米粒子静电吸附金纳米粒子，偶联姜黄素紫外表征。
图2细胞培养及磁共振显像(MRI)表征，其中左侧为实验组：制得的多功能纳米平台MNPS-Au-Curcumin-PEG；右侧为空白组。
| A | B | C | D | |
| Mean/SD | 1164.9/434 | 1299.3/284 | 3042.5/1580 | 2391.8/1937 |
图3流式细胞仪检测细胞凋亡。
具体实施方式
实施例1
(1)共沉淀法合成磁性纳米粒子
①分别称取Fe3+，Fe2+溶于80mL超纯水，Fe3+和Fe2+的总浓度为0.08mol/L，Fe3+∶Fe2+摩尔比1-1.2∶2，80℃、400r/min搅拌反应10min；
②逐滴加入5mL氨水，并维持pH10.0，滴加完毕后反应30min；
③超声混匀，水洗2～3遍；
④磁分离干粉，制得磁性纳米粒子。
(2)SiO2包裹磁性纳米粒子
利用反相微乳液法，在油包水的环境里，将正硅酸四乙酯溶解成硅球，将磁性纳米粒子包裹起来。
①加曲拉通，正己醇各7mL混合超声约20min至无油丝状液体；
②28mL环己烷超声约45min，倒入100mL三颈烧瓶中，400r/min搅拌约30min；
③4mg磁性纳米粒子(MNP)/2mLH2O分散于2mL氨水中，混合液逐滴加入②的三颈烧瓶中，滴加速度约50μL/min，滴加完毕后继续搅拌30min
④加入3mL TEOS(正硅酸四乙酯)搅拌24h；
⑤加8mL丙酮同时停止搅拌，倒入烧杯中静置60min，沉淀分层；
⑥4000r/min离心10min，沉淀加乙醇溶解，超声10min，再离心，重复6～8次；
⑦55℃真空干燥7h；
⑧干燥器中冷却，制得核壳结构的纳米粒子，备用。
(3)表面氨基修饰
①100mL具塞锥形瓶中加入15mL丙三醇和25mL甲醇，超声混匀；
②加60mg MNP继续超声分散；
③加200μL超纯水，超声使均匀分散；
④加入2mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTS)，60℃水浴磁力搅拌6h；
⑤反应结束后，用无水乙醇洗涤2～3遍，真空干燥，制得表面氨基修饰的核壳结构纳米粒子。
(4)质子化，静电吸附金纳米粒子
①取上述制得的表面氨基修饰的核壳结构纳米粒子30mg加入到4mL0.01mol/L pH6.0的PB中，氨基修饰的核壳纳米粒子的二氧化硅表面带氨基正离子；
②5min后加入4mL的0.3mmol/L金纳米粒子液；
③静电吸附20min后3000r/min离心，紫外表征。
(5)共轭偶联姜黄素和PEG-SH
①将上述偶联物以超纯水配成浓度为6mg/mL的悬液A，称取姜黄素溶于二甲亚砜(DMSO)中得B，浓度2mg/mL；
②将A/B按2∶1体积比放在一起反应15min后离心，滤饼加超纯水恢复体积，紫外表征；
③加入PEG-SH(MW3000)反应20min，离心，加超纯水恢复体积，制得多功能纳米平台。
实施例2
(1)细胞培养
白血病细胞HL-60复苏后，以含20％胎牛血清的IMDM培养液，37℃，5％CO2环境下培养，至细胞进入指数生长期(对数期)。
(2)多功能纳米平台的表征
①磁共振显像(Magnetic Resonance Imaging，MRI)表征细胞吞噬多功能纳米平台
实验采用Siemens Avanto 1.5T磁共振***。细胞培养，收集对数期细胞，实验组细胞以合成的多功能纳米平台作用24h以后，收集细胞于1.5mL PE管内，调节细胞悬液浓度1×106/mL。对照组细胞不添加多功能纳米平台，其余处理相同。
②四甲基偶氮唑(MTT)表征细胞活力
收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/mL，取100uL加入到96孔板(边缘孔用pH7.4的PBS填充)，同时设置调零孔(培养液、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质二甲亚砜DMSO、培养液、MTT、DMSO)，每组设定4复孔。置37℃，5％CO2孵育48h，倒置显微镜下观察。实验组中加入合成的多功能纳米平台，设9个时间梯度，设定浓度3.2mg/mL，每孔添加10uL。
呈色：培养36h后，每孔加入10uL MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT，以pH7.4PBS配制)，继续培养4h
每孔加入100uL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD450nm测量各孔的吸光值(Absorbance，Ab)
③流式细胞仪(FCM)，激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)表征分析肿瘤细胞早期凋亡的特征
对白血病细胞HL60加入合成的多功能纳米平台进行凋亡刺激后，1000g离心5min，弃上清，收集细胞，pH7.4PBS重悬细胞并计数；取50000～100000重悬的细胞，1000g离心5min，弃上清，加入195uL Annexin V-FITC结合液(1X)轻轻重悬细胞；加入5uL Annexin V-FITC，轻轻混匀；室温(20～25℃)避光孵育10min；1000g离心5min，弃上清，加入190uL AnnexinV-FITC结合液(1X)轻轻重悬细胞；加10uL碘化丙啶(PI)，轻轻混匀，冰浴避光，随即进行FCM和CLSM检测
④细胞电镜切片表征多功能纳米平台细胞吞噬后细胞内位置
实验采用100kV Hitachi-600透射电镜。实验设三组：空白组；实验组1：单纯以姜黄素作凋亡刺激，姜黄素浓度2mg/mL；实验组2：以合成的多功能纳米平台作凋亡刺激，浓度3.2mg/mL。凋亡刺激后36h，收集2mL细胞，以2.5％戊二醛溶液调整细胞悬液浓度1-1.2×107/mL，固定1h。以pH 7.4PBS洗涤两次后，再用1％四氧化锇固定。以梯度浓度的乙醇溶液进行细胞样品脱水，乙醇梯度浓度为：50％，70％，90％，95％，100％。然后，样品浸润到醋酸异戊醚中30min，重复三次。取出晾干后，样品切成片状，随后进行透射电镜观察。
Claims (1)
1.一种基于金磁纳米粒子的载药平台的构建方法，其特征是包括磁性纳米粒子的合成，Fe3O4-SiO2核壳结构的合成，Fe3O4-SiO2核壳结构的表面氨基修饰，表面修饰后质子化及静电吸附金纳米粒子，偶联姜黄素和偶联带巯基聚乙二醇PEG-SH制得多功能纳米平台，细胞培养吸收并表征；步骤为：
(1)磁性纳米粒子的合成：用共沉淀法合成具有超顺磁性的磁性纳米粒子；
①分别称取Fe3+，Fe2+溶于80mL超纯水，Fe3+和Fe2+的总浓度为0.08mol/L，Fe3+∶Fe2+摩尔比1-1.2∶2，80℃、400r/min搅拌反应10min；
②逐滴加入5mL氨水，并维持pH 10.0，滴加完毕后反应30min；
③超声混匀，水洗2～3遍；
④磁分离干粉；
(2)Fe3O4-SiO2核壳结构的合成：利用步骤(1)得到的磁性纳米粒子，根据反相微乳液法在油包水的环境里合成Fe3O4-SiO2核壳结构；
①加曲拉通，正己醇各7mL混合超声20min至无油丝状液体；
②28mL环己烷超声45min，倒入100mL三颈烧瓶中，400r/min搅拌30min；
③4mg磁性纳米粒子MNP/2mLH2O分散于2mL氨水中，混合液逐滴加入步骤②的三颈烧瓶中，滴加速度50μL/min，滴加完毕后继续搅拌30min；
④加入3mL正硅酸四乙酯TEOS，搅拌24h；
⑤加8mL丙酮，停止搅拌，倒入烧杯中静置60min，沉淀分层；
⑥4000r/min离心10min，沉淀加乙醇溶解，超声10min，再离心，重复6～8次；
⑦55℃真空干燥7小时；
⑧干燥器中冷却，备用；
(3)Fe3O4-SiO2核壳结构的表面氨基修饰：用步骤(2)所得到的Fe3O4-SiO2核壳结构，将其外层的硅球表面氨基化；
①100mL具塞锥形瓶中加入15mL丙三醇和25mL甲醇，超声混匀；
②加60mg Fe3O4-SiO2继续超声分散；
③加200μL超纯水，超声使均匀分散；
④加入2mL 3-氨丙基三乙氧基硅烷APTS，60℃水浴磁力搅拌6h；
⑤反应结束后，用无水乙醇洗涤2～3遍，真空干燥；
(4)表面修饰后质子化及静电吸附金纳米粒子：表面氨基修饰后在pH 6.0的磷酸盐缓冲液中质子化；所得产物静电吸附金纳米粒子；
①取上述氨基修饰的磁性微球30mg加入到4mL 0.01mol/L pH6.0的磷酸缓冲液PB中，氨基修饰的磁性微球表面带氨基正离子；
②5min后加入4mL的0.3mmol/L金纳米粒子液；
③静电吸附20min后3000r/min离心，紫外表征，得静电吸附金纳米粒子的载体；
(5)偶联姜黄素和偶联带巯基聚乙二醇PEG-SH：先共轭偶联姜黄素；再偶联PEG-SH，与金纳米粒子形成稳定的金硫键，制得金磁纳米粒子的纳米平台；
共轭偶联姜黄素和带巯基聚乙二醇PEG-SH：
①将上述静电吸附金纳米粒子的载体以超纯水配成浓度为6mg/mL的悬液A，称取姜黄素溶于二甲亚砜DMSO中得B，浓度2mg/mL；
②将A/B按2∶1体积比放在一起反应15min后离心，滤饼加超纯水恢复体积，紫外表征；
③加入PEG-SH反应20min，离心，滤饼加超纯水恢复体积；
(6)细胞培养吸收并表征：将金磁纳米粒子的载药平台运载进入细胞并以多种检测手段进行表征：
磁共振显像MRI表征细胞吞噬多功能纳米平台；
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