CN101715489B - 用于体内递送至哺乳动物细胞的、包含无质粒的功能性核酸的、源自细菌的完整小细胞 - Google Patents

Abstract

完整的、细菌衍生的小细胞可将治疗上有效量的无质粒的功能性核酸安全地引入靶标哺乳动物细胞。为此，功能性核酸可被直接包裹进入完整的小细胞，而不需要借助表达构建体、宿主细胞的表达机制、刺激性的化学物质或电穿孔。

Description

用于体内递送至哺乳动物细胞的、包含无质粒的功能性核酸的、源自细菌的完整小细胞

相关专利申请的交叉引用

本申请要求2007年3月30日提交的、申请号为60/909070的美国临时申请的优先权，前述申请在此通过引用全部并入本文。

背景技术

最近，许多基于核酸的策略已被开发出来用于调节多种细胞功能(Opalinska和Gewirtz，2002)。各种寡核苷酸，例如：适配体、转录因子结合诱杀寡核苷酸、核酶、三链结构寡核苷酸、免疫刺激CpG模体、反义寡核苷酸(包括肽核酸)、小干扰RNA和微RNA，因为它们的高度特异性的作用模式而作为研究工具已吸引了很多注意力。这些寡聚核酸作为治疗剂也具有相当大的潜能。但是，这样的治疗剂面临几个障碍，包括游离核酸的不稳定性以及这些大分子的安全、有效和靶向的细胞递送(Dykxhoorn和Lieberman，2005)。

许多基于核酸的治疗策略的焦点是RNA干扰(RNAi)现象，通过RNAi细胞中长的、双链RNA(dsRNA)导致同源的(互补的或部分互补的)基因转录体的序列特异性降解。更具体而言，长的dsRNA分子通过被称为“切酶”的内源性核糖核酸酶加工成较小的RNA(Grishok等，2000，Zamore等，2000)。当该较小的RNA来自于外源性源时，它们被称作“短干扰RNA”(siRNA)，而当该较小的RNA由细胞自身基因组中的RNA编码基因产生时，它们被称作“微RNA”(miRNA)。这两类小的(通常为21至23个核苷酸)调节性RNA的区别还在于，miRNA与信使RNA(mRNA)靶标仅部分互补。

短的调节性RNA结合至具有解旋酶活性和核酸内切酶活性的所谓的“RNA诱导性沉默复合物”(RISC)。解旋酶活性解开双链RNA分子，使得反义链可结合至靶标RNA分子(Zamore等，2000；Zamore，2002；Vickers等，2003)。核酸内切酶活性在反义链结合的位置水解靶标RNA。

因此，在RNAi中，单链RNA分子(ssRNA)通过Watson-Crick碱基配对原则结合至靶标RNA分子并征集降解靶标RNA的核糖核酸酶。相反，基因表达的反义抑制使得ssRNA结合至mRNA，阻断翻译，而不催化mRNA的降解。

通常，调节性RNA在人类血浆中具有小于一个小时的半衰期(Layzer等，2004)并且通过肾被快速地***掉。因此，几个研究团体已尝试制备包括siRNA在内的抗核酸酶的调节性RNA。这样的努力的例子包括化学修饰核苷酸(例如，2’-F、2’-OMe、锁定核酸；LNA)或磷酸二酯骨架，例如磷酸二酯键(Chiu和Rana2003；Choung等，2006；Czauderna等，2003；Elmen等，2005；Layzer等，2004；Morrissey等，2005)。此外，为使得siRNA或其他调节性RNA在循环中花费的时间最小化，操作人员已将RNA分子接合至蛋白质和抗体，以靶定所期望的哺乳动物细胞。在解决低稳定性和快速肾***问题的进一步努力中，操作人员已开发出用于递送调节性RNA的载体。多聚复合物(由核酸与聚阳离子的自组装形成)、脂多聚复合物(通过首先缩合核酸与聚阳离子，随后添加阳离子脂类而形成)、脂质体和合成纳米颗粒也在开发当中。

这些方法也面临许多障碍，例如：(a)载体蛋白通过肾***而从血清中快速清除，(b)少数可接合至每个载体蛋白的调节性RNA分子，(c)完整的调节性RNA难以与载体蛋白细胞内脱离，(d)由可用作调理素的多聚复合物结合血清蛋白导致的快速清除(Dash等，1999)，和(e)脂质体在体内的不稳定性，导致核酸释放进入血清和潜在的非特异性转化。

病毒载体也已被开发用来内源性地产生调节性RNA。参见，例如，Devroe和Silver，2004。但是，这些病毒载体具有严重的安全顾虑。例证性的问题包括与野生型病毒的重组、***潜能和致癌潜能、病毒诱导的免疫抑制、病毒载体携带DNA大片段的有限能力、复原至减毒病毒的毒力、难以制造和销售、低稳定性和有害反应(Hacein-Bey-Abina等，2003；Kootstra和Verma，2003；Raper等，2003；Verma和Weitzman，2005；Check，2005)。

基于质粒的***也已被开发用于调节性RNA(例如siRNA或更大的(～70nt)前体、短发卡RNA(shRNA))的重组和原位表达。shRNA含有来自靶标基因的正义序列和反义序列，它们通过发卡环连接。参见，例如，Paddison等，2002。shRNA可由pol-III型启动子表达，或者在是miRNA的情况下可由polII启动子表达。

如在国际申请WO03/033519中所描述的，编码shRNA、siRNA或其他调节性RNA的质粒可通过导致细胞不对称***的突变被转化至产生完整小细胞的亲代菌株中。这种转化产生重组细胞，其中质粒在细胞内复制，从而在细菌细胞质中引入大量的质粒。在不对称***期间，一些质粒分离进入小细胞细胞质内，导致产生重组小细胞。随后，小细胞可将质粒DNA递送进入哺乳动物细胞，在那里质粒DNA迁移至细胞核。在细胞核中，质粒DNA根据具体情况表达出shRNA或其他调节性RNA，且所产生的核酸随后迁移至细胞质，在那里核酸可影响RNAi或基因抑制，这取决于所涉及的调节性RNA的性质。

但是，因为这些方法需要宿主***，通过基于表达的***来递送治疗上有效量的核酸涉及复杂且耗时的过程，这限制了它们的效力。因此，需要一种将功能性核酸(例如调节性RNA)递送至靶细胞的更有效的方法。

发明内容

因此，根据本发明的一个方面，本发明提供一种组合物，其包含(a)多个完整小细胞，所述多个完整小细胞中的每个小细胞包含无质粒的功能性核酸，和(b)用于所述小细胞的药学上可接受的载体。“功能性核酸”的种类的例子有单链的、双链的或多链的DNA或RNA。在一种实施方式中，所述多个小细胞含有的无质粒功能性核酸是调节性RNA。这种调节性RNA的例子包括，但不限于，siRNA、miRNA和shRNA。

被小细胞包裹的功能性核酸可靶定编码有助于抗药性、抗凋亡性或瘤形成等的蛋白质的RNA转录体。此外，本发明的组合物可进一步包含双特异性配体，该双特异性配体例如由对小细胞表面结构特异性的第一个臂和对非吞噬性哺乳动物细胞表面受体特异的第二个臂组成。

在本发明的另一个方面，本发明提供一种将功能性核酸递送至靶标哺乳动物细胞的方法。本发明的方法包括(a)提供在药学上可接受的载体中的多个完整小细胞，每个小细胞包含无质粒的功能性核酸，和(b)将小细胞与哺乳动物细胞接触，使得哺乳动物细胞吞噬小细胞，因而功能性核酸被释放进入靶细胞的细胞质。如所提及的，功能性核酸，以调节性RNA(例如siRNA、miRNA和shRNA)为例，可靶定编码有助于抗药性、抗凋亡性或瘤形成的蛋白质的RNA转录体。在其他实施方式中，本发明的方法进一步包括将不同于功能性核酸的药物递送至靶标哺乳动物细胞。所述药物可在给予小细胞组合物之后、同时甚至之前给药。

根据另一方面，本发明设计一种使用无质粒的功能性核酸配制(formulate)小细胞的方法。该方法包括将多个小细胞与功能性核酸(例如，像siRNA、miRNA或shRNA之类的调节性RNA)在缓冲液中共培育。在一些实施方式中，共培育可包括温和的摇动，而在其他实施方式中，共培育是静止的。在一些方面，共培育持续约半个小时，而在其他方面，其持续约一个小时。在一种实施方式中，缓冲液包含缓冲盐，例如，1×磷酸缓冲溶液。在另一种实施方式中，共培育在约4℃至约37℃、约20℃至约30℃、约25℃或约37℃的温度进行。共培育可包含约10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²或10¹³个小细胞。

其他目的、特点和优点将从以下详细的描述中变得显而易见。详细的描述和特定的实施例仅为说明性目的而给出，因为根据此详细的描述，在本发明的精神和范围内作出的各种改变和修饰对于本领域技术人员来说将变得显而易见。而且，实施例论证本发明的原理，而不能被预期为具体地说明将本发明应用至对于现有技术领域的技术人员将是明显有用的所有实施例中。

附图说明

图1图示包裹有Cy3荧光团标记的siRNA的完整小细胞。图1A来自光学显微镜，而图1B显示相同的、但在具有515-560激发滤光片的荧光下观察的载玻片，显示出与小细胞一致的强荧光siRNA分子。

图2是由荧光共焦显微镜检术捕获的图像，并显示EGFR-靶定的、包裹有siRNA-Plk1的小细胞附着并内化进入体外的人乳癌细胞。

图3图示通过使用EGFR-靶定的、包裹有KSP-siRNA的小细胞处理在裸鼠中的人乳癌(MDA-MB-468)异种移植物而获得的显著的抗肿瘤效应。对照组1()接受无菌生理盐水，而实验组2()接受

^EGFR小细胞_siRNA-KSP(10⁹)，每周四次。

图4图示通过使用EGFR-靶定的、包裹有KSP-siRNA的小细胞和EGFR-靶定的、包裹有脱羧铂氨的小细胞来处理在裸鼠中的人结肠癌(HCT116)异种移植物而获得的显著的抗肿瘤效应。组1()的鼠接受无菌生理盐水，而组2()、组3()和组4()的鼠，对于前10次剂量(见图4)，分别使用10⁹个_EGFR小细胞_siRNA-Plk1、^EGFR小细胞_siRNA-KSP-1和^EGFR小细胞_siRNA-KSP-2来处理。

图5提供使用实验小细胞(^EGFR小细胞_siRNA-KSP或^EGFR小细胞_siRNA-Plk1)处理的结肠癌(HCT116)细胞的来自不同转染后时间的FACS分析。图5A-图5D提供在转染后4小时收集的样品的FACS分析，而图5E-图5H显示转染后8小时的样品分析。图5A和图5E显示仅来自细胞的结果，而图5B和图5F涉及细胞+空^EGFR小细胞。图5C和图5G显示来自细胞+^EGFR小细胞_siRNA-KSP的结果，并且图5D和图5H涉及细胞+^EGFR小细胞_siRNA-Plk1。

图6提供使用实验小细胞(^EGFR小细胞_siRNA-KSP或^EGFR小细胞_siRNA-Plk1)处理的结肠癌(HCT116)细胞的来自不同转染后时间的FACS分析。图6A-图6D提供在转染后16小时收集的样品的FACS分析，而图6E-图6H显示转染后24小时的样品分析。图6A和图6E显示仅来自细胞的结果，而图6B和图6F涉及细胞+空^EGFR小细胞。图6C和图6G显示来自细胞+^EGFR小细胞_siRNA-KSP的结果，并且图6D和图6H涉及细胞+^EGFR小细胞_siRNA-Plk1。

图7提供使用实验小细胞(^EGFR小细胞_siRNA-KSP或^EGFR小细胞_siRNA-Plk1)处理的结肠癌(HCT116)细胞的来自不同转染后时间的FACS分析。图7A-图7D提供在转染后32小时收集的样品的FACS分析，而图7E-图7H显示转染后48小时的样品分析。图7A和图7E显示仅来自细胞的结果，而图7B和图7F涉及细胞+空^EGFR小细胞。图7C和图7G显示来自细胞+^EGFR小细胞_siRNA-KSP的结果，且图7D和图7H涉及细胞+^EGFR小细胞_siRNA-Plk1。

具体实施方式

根据本发明，治疗上有效量的功能性核酸可被包裹进小细胞中，而不需要采用刺激性的化学物质或电穿孔。就这点来说，已开发出一种将这种治疗上有效浓度的功能性核酸包裹进完整小细胞的简单方法，该方法不涉及基于质粒的表达构建体或宿主细菌细胞的表达***。因此，编码功能性核酸的多核苷酸片段不被克隆进入质粒DNA或病毒载体中。取而代之的是，无质粒的功能性核酸经小细胞的完整细胞膜被直接包裹进小细胞。而且，本发明的小细胞组合物可安全且有效地将治疗上有效量的功能性核酸分子(例如调节性RNA，如siRNA、miRNA和shRNA)递送至靶标哺乳动物细胞。

定义

除非另有说明，用在此说明书中的所有技术术语和科学术语具有如相关领域技术人员普遍理解的相同含义。

为简便起见，以下提供用在说明书、实施例和所附权利要求书中的某些术语和词语的含义。其他术语和词语在说明书各处定义。

除非文中明确地另外规定，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数涵义。

“反义寡核苷酸”是指与特定基因转录体的一部分互补的核酸分子，该核酸分子可杂交至转录体并阻断其翻译。反义寡核苷酸可包含RNA或DNA。

“生物分子序列”或“序列”是指多核苷酸或多肽序列的全部或部分。

可在本文中互换使用的“癌症”、“瘤”、“肿瘤”、“恶性肿瘤”和“癌”是指表现出以细胞增殖的显著失控为特征的异常生长表型的细胞或组织。本发明的方法和组合物特别应用在恶性的、转移前的、转移性的和非转移性的细胞上。

“互补”是指两种分子(例如siRNA分子及其靶标mRNA)的相互作用表面的拓扑学相容性或相互匹配。该分子可被描述为互补的，而且接触表面特性为彼此互补。

当用在，例如，“对应于”或“代表”基因的多核苷酸或序列的语句中时，“对应于”或“代表”是指多核苷酸的序列存在于基因中或核酸基因产物中，例如，mRNA。多核苷酸可整个存在于基因的基因组序列的外显子内，或多核苷酸序列的不同部分可存在于不同外显子中，例如，使得邻接的多核苷酸序列存在于剪接前或剪接后的mRNA(一种基因的表达产物)中。

“诱杀RNA”是一种分子，其可采用与要被靶定的RNA的重要功能区相同的结构。后一RNA可以是对哺乳动物宿主来说是天然的，或者是已感染哺乳动物细胞的病原体，例如HIV。诱杀RNA隔离通常与靶标RNA相互作用的蛋白质，导致哺乳动物宿主或病原体宿主的正常加工的破坏。

“药物”是指在动物(特别是哺乳动物和人类)中产生局部或全身性的效应的任何生理上或药理上有活性的物质。

“表达”通常是指一种过程，通过该过程多核苷酸序列经历成功的转录和翻译，从而表达出可检测水平的氨基酸序列或蛋白质。在本文的某些情况下，表达是指产生mRNA。在另外的情况下，表达是指产生蛋白质。

“功能性核酸”是指一旦引入宿主细胞即特异性地干扰蛋白质的表达的核酸分子。通常，功能性核酸分子具有通过直接干扰编码蛋白质的转录体而降低蛋白质的表达的能力。调节性RNA(例如siRNA、shRNA、短RNA(长度通常少于400个碱基)、微RNA(miRNA)、核酶和诱杀RNA)和反义核酸构成了示例性的功能性核酸。

“基因”是指包含产生多肽或前体所需的控制序列和编码序列的多核苷酸序列。多肽可由全长编码序列或由编码序列的任何部分编码。基因可以为不间断的编码序列，或者它可包括由适当的剪接点连接的一个或多个内含子。而且，基因在编码区或非翻译区可含有可能影响表达产物的生物学活性或化学结构、表达速率或表达控制的方式的一个或多个修饰。这种修饰包括，但不限于，一个或多个核苷酸的突变、***、缺失和取代。就这点而言，这种被修饰的基因可被称为“天然”基因的“变体”。

“宿主细胞”是指可被或已被用作重组质粒或其他多核苷酸转移体(transfer)的受体的细胞，且包括已被转染的原始细胞的子代。由于天然的、偶然的或蓄意的突变的原因，单个细胞的子代不能必然地在形态学上或在基因组或总DNA上与原始亲代细胞完全相同。

“杂交”是指将多核苷酸序列通过碱基配对结合至互补序列的任何方法。

在本说明书中可互换使用的“个体”、“对象”、“宿主”和“患者”是指需要诊断、处理或治疗的任何哺乳动物对象。在一个优选的实施方式中，该个体、对象、宿主或患者是人。其他对象可包括但不限于牛、马、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、灵长类和小鼠。

“标记物”是指能够直接提供或通过与信号产生***的一个或多个额外成员相互作用而提供可检测的信号的试剂。可直接检测的且可用于本发明的标记物包括荧光标记物。具体的荧光团包括荧光素、若丹明、BODIPY、花菁染料等等。本发明还设计使用放射性同位素作为标记物，例如³⁵S、³²P、³H等等。也可使用色度标记物，例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳)珠粒。例如，参见专利号为4,366,241、4,277,437、4,275,149、3,996,345、3,939,350、3,850,752和3,817,837的美国专利。

“寡核苷酸”是指包含例如约10个核苷酸(nt)至约1000nt的多核苷酸。用于本发明的寡核苷酸优选为约10个nt至约150个nt。寡核苷酸可为天然的寡核苷酸或合成的寡核苷酸。寡核苷酸可被修饰。

“小细胞”是指细菌细胞的无核形式，它是通过在细胞***的二***期间与DNA分离协同的干扰(disturbance)而产生的。小细胞不同于在特定情况下自然生成和释放的其他小泡(并非由特异性基因重排或游离基因表达引起)。在本发明中，小细胞是完整的，因为其他“裸露”形式(例如原生质球、原生质孔(poroplast)、原生质体)可能渗漏被包裹的功能性核酸且可能不是治疗上有效的。完整小细胞的细胞膜让负载物保留在小细胞内并在靶标宿主哺乳动物细胞中细胞内释放。

在本说明书中，“修饰的”和“化学修饰的”是指下述寡核苷酸或多核苷酸，其中所有或任何碱基、糖部分和核苷酸间磷酸键的天然分子结构以及在这些位点具有额外的取代或修饰的组合的分子具有一个或多个化学改变。核苷酸间磷酸键可以为磷酸二酯核苷酸间键、磷酸三酯核苷酸间键、氨基磷酸酯核苷酸间键、硅氧烷核苷酸间键、碳酸酯核苷酸间键、羧甲基酯核苷酸间键、乙酰胺核苷酸间键、氨基甲酸酯核苷酸间键、硫醚核苷酸间键、桥连氨基磷酸酯核苷酸间键、桥连膦酸亚甲酯核苷酸间键、硫代磷酸酯核苷酸间键、甲基磷酸酯核苷酸间键、二硫代磷酸酯核苷酸间键、桥连硫代磷酸酯核苷酸间键或砜核苷酸间键，或3′-3′、5′-3′或5′-5′键，和这样的类似键的组合。磷酸二酯键可被替代的键取代，例如硫代磷酸酯、甲氨基、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯和胍，且多核苷酸的核糖亚单位也可被取代(例如，己糖磷酸二酯键；肽核酸)。修饰可在寡核苷酸分子的内部(单个或重复的)或在末端，且可包括如核苷酸间磷酸键上添加例如脱氧核糖修饰和磷酸酯修饰，这种修饰粘着或交联至相反的链或相关的酶或其他蛋白质。术语“修饰的寡核苷酸”和“修饰的多核苷酸”也包括包含对糖部分(例如，3’-取代的核糖核苷酸的或脱氧核糖核苷酸的单体)修饰的寡核苷酸或多核苷酸，任何修饰都是通过5’至3’键而结合在一起。

词语“核酸分子”和术语“多核苷酸”表示任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。它们包括单链的、双链的或多链的DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体，或包含嘌呤碱基和嘧啶碱基或其他天然的、化学或生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的骨架可包含糖和磷酸基团(如通常可在RNA或DNA中找到)，或被修饰或被取代的糖或磷酸基团。可选地，多核苷酸的骨架可包含合成亚单位(例如亚磷酰胺)的聚合物，因此骨架可为寡聚脱氧核糖核苷酸氨基磷酸酯或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸(例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物)、尿嘧啶(uracyl)、其他糖和连接基团(例如氟代核糖和硫代核糖)以及核苷酸支链。多核苷酸可通过诸如与标记成分结合之类的方法而被进一步修饰。其他类型的修饰包括加帽、使用类似物取代一个或多个天然核苷酸和引入将多核苷酸附着至蛋白质、金属离子、标记成分、其他多核苷酸或载体的手段。

“药学上可接受的”是指生理学的相容性。药学上可接受的载体或赋形剂不会废除被给药的组合物的生物学活性、是化学惰性的且对被给药的生物体没有毒性。

修饰语“无质粒的”意指没有用于功能性核酸的原位表达的构建体(例如质粒或病毒载体)。

可在本文中互换使用的“多肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可包括翻译的、未翻译的、化学修饰的、生化修饰的和衍生的氨基酸。多肽或蛋白质可以是天然的、重组的或合成的，或这些的任何组合。而且，多肽或蛋白质可包含天然蛋白质或肽的片段。多肽或蛋白质可以为单个分子，或者可以是多分子复合物。另外，这种多肽或蛋白质可具有被修饰的肽骨架。该术语包括融合蛋白质，所述融合蛋白质包括具有异源氨基酸序列的融合蛋白质、具有异源和同源前导序列的融合蛋白质、具有或不具有N末端蛋氨酸残基的融合蛋白质、免疫学标记的蛋白质等等。

“纯化的”是指从其自然环境中移除的化合物，且其至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或99.99％不含与其天然结合的其他成分。

“调节性RNA”表示一个种类，该种类包括通过RNA干扰、抑制基因表达或另外的机制影响表达的RNA。因此，除了shRNA、siRNA、miRNA和反义ssRNA，调节性RNA的种类包括核酶和诱杀RNA等等。

“核酶”是指具有酶活性的RNA分子，该酶活性可以核苷酸碱基序列特异性的方式重复切割其他RNA分子。

“RNA干扰”(RNAi)表示如上所述的RNA导引的机制，包括互补的或部分互补的靶标RNA的降解，用于基因表达(蛋白质合成)的序列特异性调节或基因特异性调节。

“序列同一性”表示相似性或互补性的程度。可能有部分同一性或完全同一性。部分互补的序列至少部分地抑制相同序列杂交至靶标多核苷酸；使用功能性术语称它为“基本相同的”。使用杂交分析(Southern或Northern杂交、溶液杂交等)在低严格性的条件下，可检查对完全互补的序列杂交至靶标序列的抑制。基本相同的序列或探针将竞争和抑制完全相同的序列或探针在低严格性条件下结合(即，所述杂交)至靶标序列。这并不是说，低严格性条件允许非特异性结合；低严格性条件需要彼此结合的两个序列是特异性(即选择性)相互作用。非特异性结合的缺失可通过使用甚至缺乏部分互补度(例如，小于约30％同一性)的第二个靶标序列来测试；在缺少非特异性结合时，探针将不会杂交至第二个非互补性的靶标序列。

在本文中，检查两个核酸序列或多肽序列的序列同一性的另一种方式使得在两个序列中需有参考残基(referencingresidue)，当在指定区域为获得最大对应而比对时，参考残基是相同的。如本文中所使用的，“序列同一性的百分数”意指通过在对比窗口比较两个最佳比对的序列而测定的值，其中在对比窗口的多核苷酸序列的部分与用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即，空隙)。该百分数是通过以下方式计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基的位置的数目以获得匹配位置的数目、将匹配位置的数目除以对比窗口中的位置的总数，再将结果乘以100以获得序列同一性的百分数。

“短干扰RNA”(siRNA)是指长度通常为约10至约30个核苷酸、能够介导RNA干扰(RNAi)的双链RNA分子。通常，siRNA分子具有通过直接与编码蛋白质的转录体相互作用而降低蛋白质的表达的能力。

功能性核酸的“治疗上有效”量是当根据本发明给对象给药时引起药理学反应的所讨论的分子(例如siRNA、miRNA或游离的shRNA)的剂量。因此在本发明中，如以下详细描述的，当包裹有功能性核酸的小细胞被给药时，治疗上有效量可参考在动物模型或人类对象中的与疾病或失调有关的有害情况或症状的预防或改善来测定。在给定情况下，对于特定对象证明是“治疗上有效量”的量，可能不是对于被类似治疗所考虑的疾病或症状的100％的对象都是有效的，即使这样的剂量被技术实践者视为“治疗上有效量”。就这点而言，适当的剂量将随着例如所受侵袭的疾病或症状的类型、阶段和严重性而改变。无论如何，当根据全文考虑时，本发明所说明的体外测试(实施例2)和体内测试(实施例4、5和6)以及定量功能性核酸分子的小细胞递送量的方法(实施例3)，使得有候选药物的临床前测试和临床测试知识的人能够通过例行试验确定对于特定病征来说功能性核酸的治疗上有效量。

术语“治疗”(“treatment”“treating”“treat”)是指获得所需的药理学和/或生理学效果。该效果可以是预防性的，表现为完全或部分预防疾病或其症状，并且/或者可以是治疗性的，表现为部分或完全稳定或治愈疾病和/或由该疾病引起的有害效果。“治疗”涵盖在哺乳动物(特别是人)体内的疾病的任何治疗，且包括：(a)防止疾病或症状出现在易患该疾病或症状但尚未被诊断患有该病的对象中；(b)抑制疾病症状，即，阻止其发展；或(c)减轻疾病症状，即，导致疾病或症状的消退。

小细胞

本发明的小细胞是大肠杆菌或其他细菌细胞的无核形式，它们是在细胞***的二***期间，通过与DNA分离协同的干扰而产生的。原核染色体复制与正常的二***有关，其涉及细胞中隔(mid-cellseptum)形成。例如，在大肠杆菌中，min基因(例如minCD)的突变可去除细胞***期间在细胞极体(cellpole)处的中隔形成的抑制，导致产生常规的子细胞和无核的小细胞。参见deBoer等，1992；Raskin&deBoer，1999；Hu&Lutkenhaus，1999；Harry，2001。小细胞不同于在特定情况下自然生成和释放的其他小泡，与小细胞相反，这些小泡并非由特异性基因重排或游离基因表达引起。在优选的实施方式中，小细胞具有完整的细胞壁(“完整的小细胞”)。

除了min操纵子突变外，无核小细胞还可根据影响中隔形成的一类其他基因重排或突变而产生，例如在枯草杆菌中的divIVB1中的基因重排或突变。参见Reeve和Cornett，1975。小细胞也可根据在细胞分类/染色体分离中的蛋白质的基因表达水平的微扰而形成。例如，minE的过度表达导致小细胞的极体***和小细胞的产生。相似地，染色体较少的小细胞可由染色体分离的缺陷产生，例如在枯草杆菌中的smc突变(Britton等，1998)、在枯草杆菌中的spoOJ缺失(Ireton等，1994)、在大肠杆菌中的mukB突变(Hiraga等，1989)和在大肠杆菌中的parC突变(Stewart和D′Ari，1992)。基因产物可被提供在转化进入细胞的质粒中(intrans)。例如，当由高拷贝数质粒过度表达时，CafA可提高细胞***的速率和/或抑制复制后的染色体分配(Okada等，1994)，导致形成链状的(chained)细胞和无核的小细胞(Wachi等，1989)。小细胞可由来源于革兰氏阳性或革兰氏阴性的任何细菌细胞来制备。

在一个方面，小细胞含有一种或多种需要递送的无质粒功能性核酸。本发明的功能性核酸具有通过与编码蛋白质的转录体直接相互作用而降低蛋白质的表达的能力。

将功能性核酸包裹进入完整小细胞

功能性核酸可被直接包裹进入完整小细胞。该方法省略了之前需要的步骤，例如，将编码功能性核酸的核酸克隆进入表达质粒，使用质粒转化产生小细胞的亲代细菌并产生重组的小细胞。取而代之的是，无质粒的功能性核酸可通过将多个完整的小细胞与功能性核酸在缓冲液中共培育而被直接包裹进入完整的小细胞。在一些实施方式中，共培育可包括温和的摇晃，而在其他实施方式中，共培育是静止的。已证实，约一个小时的共培育时间是足够的，但较短的时间(例如约半个小时)也可能是有效的。在一种实施方式中，缓冲液包含缓冲盐，例如1×磷酸缓冲溶液。缓冲盐可为凝胶形式。在另一种实施方式中，共培育在约4℃至约37℃；约20℃至约30℃；约25℃；或约37℃的温度进行。在其他方面，共培育可包含约10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²或10¹³个小细胞。温度、时间、缓冲液、小细胞浓度等的具体参数可被优化，以获得特定的条件组合。

该方法的成果是惊人的，因为在四十多年的时间内，实践者已开发出各种化学方法和电化学方法(Miller写过评论，1994)来将核酸转化进入细菌细胞。实践者已利用了这些苛刻的手段，因为常规的认识已认为核酸(例如siRNA、miRNA或无质粒的shRNA)太大而不能被动进入小细胞细胞质。例如，孔蛋白(β-桶蛋白，通常起扩散孔的作用)允许具有600道尔顿或更小分子量的分子被动传输通过细菌外膜(Nikaido，1994)。同时，编码shRNA的双链质粒DNA超过一百万道尔顿，而双链siRNA或miRNA超过15000道尔顿。

而且，一旦被包裹，功能性核酸保留在小细胞内部且受保护而不被降解。就这点而言，使用在无菌生理盐水中培育的包裹有siRNA的小细胞进行延长的培育研究未显示出siRNA的渗漏。另外，将包裹有siRNA的小细胞与核酸酶共培育证实，siRNA已穿透完整小细胞的外膜且受保护而不被降解。类似地，尽管小细胞可能被预期从亲代细菌的细胞质携带残留的核酸酶，但被包裹的siRNA在小细胞细胞质中是稳定的。被包裹的siRNA还避免了存在于吞噬溶酶体内的降解机制(例如酸、氧自由基和酸解酶(Conner和Schmid，2003))，以实现在哺乳动物细胞内的靶标mRNA击倒。

在其他实施方式中，靶定不同mRNA靶标的多个功能性核酸可被包裹在相同的小细胞中。这样的方法可被用来对抗抗药性和抗凋亡性。例如，癌症患者通常表现对化疗药物的抗药性。这种抗药性可通过基因(例如，多抗药性(MDR)泵和抗凋亡基因等)的过度表达来调节。为对抗这种抗药性，可使用治疗上有效浓度的编码MDR-相关基因的功能性核酸包裹小细胞，在化疗之前向患者给药。而且，靶定不同的mRNA靶标的多个功能性核酸包裹进相同的小细胞，可提高治疗成功率，因为大多数分子靶标会突变且具有复等位基因。

因此如本文所述，将无质粒的功能性核酸直接包裹进入完整的小细胞提供了许多优点。例如，因为本发明的方法不需要基因修饰亲代细菌以适应功能性核酸的表达，一个亲代细胞可被用来产生包含许多类型核酸、针对多种病征的小细胞。相似地，小细胞可被装载有多种不同的RNA，从而避免或克服抗药性机制。

功能性核酸

如上所述，功能性核酸表示包括通过RNA干扰、基因表达的抑制或另外的机制影响表达的核酸分子在内的一个种类。这种分子的例子有单链的、双链的或多链的DNA或RNA。因此，功能性核酸的例子包括，但不限于调节性RNA(例如shRNA、siRNA、miRNA和反义ssRNA)、核酶和诱杀RNA和反义核酸。

在本发明的优选实施方式中，完整小细胞携带siRNA分子。短干扰RNA分子对于进行RNAi(一种转录后基因沉默机制)是有用的。如所提及的，“siRNA”通常是指长度为约10至约30个核苷酸的双链RNA分子，它们因为其特异性地干扰蛋白质表达的能力而被命名。优选地，siRNA分子的长度为12-28个核苷酸，更优选为15-25个核苷酸，还更优选为19-23个核苷酸，最优选为21-23个核苷酸。因此，优选的siRNA分子的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸。

一个链的长度表示了siRNA分子的长度。例如，被描述为21个核糖核苷酸长(21-mer)的siRNA可包含两个相反链的RNA，它们退火在一起形成19个连续的碱基配对。在每个链上的两个剩余的核糖核苷酸将形成“突出端”。当siRNA含有两个不同长度的链时，较长的链表示siRNA的长度。例如，含有21个核苷酸长的一个链和20个核苷酸长的另一个链的dsRNA为21-mer。

包含突出端的siRNA是合乎需要的。突出端可位于链的5’端或3’端。优选地，突出端位于RNA链的3’端。突出端的长度可改变，但优选为约1至约5个碱基，且更优选为约2个核苷酸长。优选地，本发明的siRNA将包含具有约2至4个碱基的3’突出端。更优选地，3’突出端为2个核糖核苷酸长。还更优选地，构成3’突出端的2个核糖核苷酸为尿苷(U)。

shRNA包含形成茎环结构的单链RNA，其中茎是由包含双链siRNA的互补的正义链和反义链组成，而环是具有不同尺寸的连接体。shRNA的茎结构通常为约10至约30个核苷酸长。优选地，shRNA分子的茎的长度为12-28个核苷酸，优选为15-25个核苷酸，还更优选为19-23个核苷酸，最优选21-23个核苷酸。因此，优选的shRNA分子包含的茎的长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29个核苷酸。

本发明的siRNA被设计用来与靶标核糖核苷酸序列相互作用，意味着它们充分地与靶标序列互补以杂交至靶标序列。在一种实施方式中，本发明提供一种siRNA分子，其包含与靶标核糖核苷酸序列或靶标核糖核苷酸序列的互补体(complement)至少70％、75％、80％、85％或90％相同的核糖核苷酸序列。优选地，siRNA分子与靶标核糖核苷酸序列或靶标核糖核苷酸序列的互补体至少90％、95％、96％、97％、98％或100％相同。最优选地，siRNA将与靶标核苷酸序列或核糖核苷酸序列的互补体100％相同。但是，相对靶标具有***、缺失或单点突变的siRNA分子也可能是有效的。

因此，在本发明的一个方面，完整小细胞可携带用来使抗药性基因或抗凋亡性基因沉默的一种或多种siRNA序列。使用编码多种siRNA的小细胞可能治疗表达多抗药性机制的细胞。

通常，辅助siRNA设计的工具和调节性RNA对于公众来说可轻易获得。例如，一种基于计算机的siRNA设计工具可在互联网www.dharmacon.com上获得。

功能性核酸的标靶

本发明的功能性核酸靶定促进抗药性、抑制凋亡、促进瘤生成表型、抑制病原体增殖或抑制病毒复制或增殖的蛋白质的基因或转录体。在本文中的功能性核酸策略的成功应用已在本领域中实现，但没有受益于小细胞载体。参见，例如，Sioud(2004)，Caplen(2003)，Wu等(2003)，Yague等(2004)。

有助于抗药性或促进瘤生成表型的蛋白质是功能性核酸的优选靶标。所述蛋白质可促进获得性抗药性或固有抗药性。当患病细胞(例如肿瘤细胞)最初对药物作出反应，但在后续的治疗循环中变得难以治愈，则获得了抗药性表型。涉及获得性或固有抗药性的有用靶标包括但不限于ATP结合盒型转运蛋白，例如P-糖蛋白(P-gp、P-170、PGY1、MDR1、ABCB1、MDR相关蛋白、多抗药性蛋白1、MDR-2和MDR-3)、MRP2(多抗药性相关蛋白)、BCR-ABL(断裂点簇区-Abelson原癌基因)、STI-571耐药相关蛋白、肺耐药相关蛋白、环氧酶-2、核因子κ、XRCC1(X射线修复交叉互补蛋白1)、ERCC1(切除修复交叉互补基因)、GSTP1(谷胱甘肽S-转移酶)、突变的β-微管蛋白、Abcb1a(ABCB4)、Abcc1、Abcc2、Abcc3(MLP-2)、Abcc5、Abcc6、Abcd2、Abcg2、Bax、Bcl2、Bcl21(bcl-x)、Mvp、Rb1、Top1、Top2a、Top2b、Trp53(p53)。涉及抗药性的其他基因还包括(a)涉及药物代谢的基因，例如Art、Blmh、C130052I12Rik(CRR9p)、Comt、Crabp1、Cyp1a1、Cyp1a2、Cyp2b19、Cyp2b20、Cyp2c29、Cyp2c40、Cyp2c70、Cyp2d22、Cyp2e1、Dhfr、Ephx1、Ephx2、Gstm1(MGST1)、Gstp1、Nat2、Nqo1、Sod1、Ste、Tpmt、Tyms、Ugcg；(b)涉及DNA修复的基因，例如Ape、Atm、Brca1、Brca2、Ercc3(XPB)、Mgmt、MIh1、Xpa、Xpc；(c)涉及细胞周期的基因，例如Ccnd1(细胞周期蛋白D1)、Ccne1(细胞周期蛋白E1)、Cdk1、Cdk2、Cdk4、Cdkn1a(p21Waf1)、Cdkn1b(p27Kip1)、Cdkn2a(p16Ink4a)、Cdkn2d(p19)、KSP.；(d)涉及生长因子受体的基因，例如Egfr、Erbb2(Neu、HER2)、Erbb3、Erbb4、Fgf2(bFGF)、Met；(e)涉及激素受体的基因，例如Ar、Esr1、Esr2、Igf2r、Ppara、Ppard、Pparg、Ppargc1、Rara、Rarb、Rxra、Rxrb、Rxrg、Srd5a2；和(f)涉及转录因子的基因，例如Ahr、Ap1s1、Ap1s2、Elk1、Fos(c-fos)、Gabpa、Hif1a、Mafb、Myc(c-myc)、Nfkb1、Nfkb2、Nfkbib、Nfkbie、ReIb(l-rel)、Tnfrsf11A。

有用的靶标还包括有助于抗凋亡性的蛋白质。这些包括Bcl-2(B细胞白血病/淋巴瘤)、Bcl-X_L、A1/Bf11、黏着斑激酶和p53突变蛋白。

有用的靶标进一步包括致癌蛋白和突变肿瘤抑制蛋白。例子包括β-联蛋白、PKC-α(蛋白激酶C)、C-RAF、K-Ras(V12)、h-Ras、DP97Dead框RNA解旋酶、DNMT1(DNA甲基化转移酶1)、FLIP(Flice样抑制蛋白)、C-Sfc、53BPI、聚梳家族蛋白EZH2(zeste基因增强子同源物)、ErbB1、HPV-16E5和E7(人***瘤病毒早期蛋白5和早期蛋白7)、Fortilin&MCI1P(髓样细胞白血病1蛋白)、DIP13α(DDC相互作用蛋白13a)、MBD2(甲基CpG结合域)、p21、KLF4(Kruppel样因子4)、tpt/TCTP(翻译控制的肿瘤蛋白)、SPK1&SPK2(鞘氨醇激酶)、P300、PLK1(Polo样激酶-1)、Trp53、Ras、ErbB1、VEGF(血管内皮细胞生长因子)和BAG-1(BCL2-相关抗死亡基因1)。

大量的分子靶标已被发现用于治疗癌症，且RNAi发现平台正在快速地确认一系列不同的新靶标。对于本发明有用的这种分子靶标的例子包括，酪氨酸激酶(变体)、Akt(蛋白激酶B，PKB)、Akt1、αLβ2整联蛋白、氨基肽酶、雄激素受体、AuroraA、AuroraB、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)受体(bFGFr)、Braf、癌胚抗原(CEA)、CD142、CD37、CD44、CD5、CD74、CD77、Chk1、CHK2、CHras、CSF1r、CXCR4、细胞周期蛋白D1(CCND1)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B(CDKN1B、p27、KIP1)、CYP26、成纤维细胞生长因子受体3(FGFr3)、成纤维细胞生长因子受体4(FGFr4)、G250、Hedgehog(Hh)信号途径、肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF或SF/HGF)、HEr4(ErbB4)、HIF、组蛋白去乙酰酶9(HDAC9)、同源异型盒基因(HOXB7)、透明质酸(HA)、***(IGF)、***1受体(IGF1r、IGF1r、IGFIr、IGFIr)、***结合蛋白2(IGFBP2)、***结合蛋白5(IGFBP5)、整联蛋白样激酶(ILK)、白细胞介素(IL6)受体、白细胞介素1(IL1)受体II、白细胞介素10(IL10)、白细胞介素4(IL4)受体、白细胞介素6(IL6)、白细胞介素15(IL15)、白细胞介素3受体α(IL3rα)链、JAK、JAK3、JNK1、JNK2、纺锤体驱动蛋白(KSP)、层粘连蛋白5、Lewis(b)、淋巴毒素(LT)β受体(LTBr)、溶血磷脂酸(LPA)受体(LPAr)、溶血磷脂酸乙酰转移酶、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、MAGE3、微管、MUC2、刻缺蛋白1(TAN1)、P38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、P53正调节的凋亡介体(PUMA)、PDGF酪氨酸激酶(TK)信号途径、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、磷脂酰肌醇3’激酶(PI3K)、纤溶酶原激活物、尿激酶(PLAU)受体(PLAUr)、Polo样激酶(Plk1)、多腺苷二磷酸核糖、聚合酶(PARP)、增殖细胞核抗原(PCNA)、***肝细胞抗原(PSCA)、***特异性抗原(PSA)773、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)、Rad51蛋白、RAF1、视磺酸受体(RAr)α、视磺酸受体(RAr)γ、类视黄醇受体(RXr)β、丝氨酸(或半胱氨酸)蛋白酶抑制剂、端粒酶反转录酶(TERT、hTERT)、端粒、ThomsenFriedenreich(TF)抗原、血小板反应蛋白1(TSP1)、转铁蛋白、肿瘤坏死因子α(TNFa、TNFA)、肿瘤坏死因子受体(TNFr、TNFr)、肿瘤相关碳酸酐酶(CA)IX(CA9)、I型干扰素、泛素连接酶、血管细胞黏连分子1(VCAM，CD106)、血管内皮细胞生长因子(VEGF、VEGFA)、血管内皮细胞生长因子D(VEGFD)、玻连蛋白(VTN)、肾母细胞瘤1(WT1)等。

关于HIV感染，靶标包括HIV-Tat、HIV-Rev、HIV-Vif、HIV-Nef、HIV-Gag、HIV-Env、LTR、CD4、CXCR4(趋化因子受体)和CCR5(趋化因子受体)。

因为肿瘤细胞的异质性，许多不同的抗药性或抗凋亡性途径可在靶标细胞中操作。因此，用在本发明方法中的功能性核酸可随着时间变化而需要改变。例如，如果活体解剖样品显示导致获得性抗药性的新的突变，那么特异性的功能性核酸可被设计并被包裹进入完整的小细胞，该小细胞被给药至哺乳动物宿主以解决所获得的抗药性。

经完整的小细胞递送功能性核酸

在另一个方面，本发明提供一种递送功能性核酸的方法，其包括(a)提供在药学上可接受的载体中的多个完整小细胞，每个小细胞包含无质粒的功能性核酸，和(b)将小细胞与哺乳动物细胞接触，使得哺乳动物细胞吞噬小细胞，从而将功能性核酸释放进入靶标细胞的细胞质。如在公布的PCT申请WO05/056749中所描述的，小细胞通过双特异性配体而与靶标哺乳动物细胞接触。小细胞与靶标哺乳动物细胞之间的接触可在体外或在体内进行。

克服抗药性和治疗疾病的方法

在另一方面，本发明提供一种克服抗药性并治疗对象中的疾病(例如癌症或AIDS)的方法。该方法包括(a)将一种或多种靶定促进抗药性的蛋白质的基因或转录体的功能性核酸包裹进入完整的、纯化的小细胞，(b)将含功能性核酸的小细胞与靶标哺乳动物细胞接触，如以上引用的’749号PCT申请(在此通过引用将其并入本文)所描述的，使得哺乳动物细胞吞噬小细胞，和(c)如在公布的PCT申请WO05/079854中所描述的，将药物递送至靶标哺乳动物细胞。优选地，步骤(c)在步骤(a)和步骤(b)之后进行，以在给药之前使功能性核酸减少抗药性。递送药物和引入功能性核酸可连续发生、以任何顺序发生或同时发生。

根据本发明，药物可通过任何常规手段被递送。例如，药物可通过口服递送、肠胃外(包括皮下、静脉内、肌内、腹膜内和通过灌输)递送、局部递送、经皮递送或通过吸入递送。每种药物的适当的递送模式和剂量可很容易地由药物领域技术人员确定。

经小细胞的药物递送

虽然药物递送可通过常规手段进行，但如在公布的PCT申请WO05/079854(在此通过引用将其并入本文)中所描述的，优选地经小细胞递送。就这点而言，发明人已发现，相同的哺乳动物细胞可通过包裹有不同负载物的靶定的完整小细胞而被成功地重复转染。例如，包裹有功能性核酸的小细胞可转染哺乳动物细胞，其后包裹有药物的小细胞可将药物递送至相同的哺乳动物细胞，以获得互补的或协同的抗肿瘤效果。

药物可被包裹在不同于功能性核酸的单独小细胞中。或者，药物可被包裹在与功能性核酸相同的小细胞中。某些药物可与核酸相互作用，并阻止药物和核酸在相同小细胞中的共同包裹(co-packaging)。例如，已知阿霉素与DNA相互作用。

优选地，本发明的小细胞包含足够量的药物，以在靶标细胞上发挥药物的生理学或药理学作用。同样优选地，被包含在小细胞内的药物对于小细胞来说是异质的的或外来的，意味着小细胞的亲代细菌细胞通常不产生该药物。

通过在含有小细胞的细胞外介质和小细胞细胞质之间产生药物的浓度梯度，亲水的和疏水的药物都可被包裹在小细胞中。当细胞外介质含有比小细胞细胞质高的药物浓度，药物自然地沿此浓度梯度向小细胞细胞质内移动。然而当浓度梯度相反时，药物不会移出小细胞。药物装载进入小细胞的程序和机制如公布的PCT申请WO05/079854所述。

为使用通常不溶于水的药物装载小细胞，药物首先可被溶解在适当的溶剂中。例如，紫杉醇可被溶解在乙醇与聚氧乙烯EL(聚乙氧基化蓖麻油)的1∶1混合物中，随后在PBS中稀释，以获得紫杉醇溶液，该紫杉醇溶液被部分稀释在含水介质中且携带最少量的有机溶剂以保证药物保留在溶液中。小细胞可在此最终介质中培育，以实现药物装载。因此，发明人发现，即使疏水性药物也可扩散进行小细胞的细胞质以获得高的、治疗上显著的细胞质药物装载量。这是未预料到的，因为小细胞细胞膜是由疏水性磷脂双层构成的，其被预期以阻止疏水性分子扩散进入细胞质。

使用药物装载小细胞的另一种方法包括在一定条件下培养重组的亲代细菌细胞，使得亲代细菌细胞转录并翻译编码药物的核酸，且药物被释放进入亲代细菌细胞的细胞质。例如，编码所需药物的细胞生物合成的基因簇可被克隆并转移进入能够产生小细胞的亲代菌株。基因簇的基因转录和翻译导致药物在亲代细菌细胞的细胞质内的生物合成，使得细菌细胞质中充满药物。当亲代细菌细胞***并形成子代小细胞时，小细胞也在其细胞质中含有该药物。预包裹的小细胞可通过任何合适的小细胞纯化的方法来纯化，包括以上所述的方法。

相似地，使用药物装载小细胞的另一种方法包括在一定条件下培养含有编码药物的表达质粒的重组小细胞，使得编码药物的基因在小细胞内被转录和翻译。

药物

用于本发明中的药物可以是任何生理或药理活性物质，其在动物，尤其是哺乳动物和人体内产生所期望的局部或全身效应。药物可以是无机或有机化合物，不受限制地，包括肽、蛋白质、核酸和小分子，其中任何一种可被特征化或不被特征化。它们可以为各种形式，例如未改变的分子、分子复合物、药理上可接受的盐，例如氢氯化物、氢溴化物、硫酸盐、月桂酸盐、棕榈酸盐、磷酸盐、亚硝酸盐、硝酸盐、硼酸盐、醋酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、油酸盐、水杨酸盐等。对于酸性药物，可使用金属盐、铵盐或有机阳离子，例如季铵盐。还可以使用药物衍生物，例如碱、酯和酰胺。不溶于水的药物能以其水溶性衍生物的形式或作为其碱性衍生物被使用，无论在任何情况下或通过其递送，该药物可通过酶被转化成、通过体内pH或其它代谢过程被水解成原始的治疗上有活性的形式。

有用的药物包含化疗制剂、免疫抑制剂、细胞因子、细胞毒素剂、核溶解化合物(nucleolyticcompound)、放射性同位素、受体和药物前体活化酶，它们可以是天然的或通过重组方法制备的。

受经典多药抗药性影响的药物在本发明中具有特别的用处，例如长春花生物碱(例如，长春碱和长春新碱)、蒽环类抗生素(例如，阿霉素和柔红霉素)、RNA转录抑制剂(例如，放线菌素-D)和微管稳定药物(例如，紫杉醇)。

通常，癌症化疗剂为优选的药物。有用的癌症化疗药物包括氮芥、亚硝基脲(nitrosorueas)、乙烯亚胺、磺酸烷酯、四嗪、铂化合物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、叶酸类似物、蒽环类抗生素、紫杉烷类、长春花生物碱、拓扑异构酶抑制剂和激素剂。示例性的化疗药物为放线菌素-D、左旋苯丙氨酸氮芥、阿糖胞苷(Ara-C)、阿那曲唑、天冬酰胺酶、BiCNU、比卡鲁胺、博来霉素、白消安、卡培他滨、卡铂、碳铂、卡莫司汀、CCNU、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、CPT-11、环磷酰胺、阿糖胞苷(Cytarabine)、阿糖胞苷(Cytosinearabinoside)、环磷酰胺(Cytoxan)、达卡巴嗪、放线菌素(Dactinomycin)、柔红霉素、右丙亚胺、多西他赛、阿霉素、DTIC、表柔比星、乙烯亚胺、依托泊苷、氟尿嘧啶脱氧核苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟他胺、福莫司汀、吉西他滨、赫赛汀、六甲胺、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、氨羟二磷酸二钠、喷司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、利妥昔单抗、类固醇、链佐星、STI-571、链佐星、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、四嗪、硫鸟嘌呤、塞替派、雷替曲塞、托泊替康、曲奥舒凡、三甲曲沙、长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、VP-16和希罗达。

有用的癌症化疗药物还包括烷基化剂，例如塞替派和环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如硫丹、卡波醌、麦吞多派(Meturedopa)和尤里多派(Uredopa)；乙烯亚胺和甲基氨基吖啶，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫化磷酰胺和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(Cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、氧氮芥盐酸化物、美法仑、Novembiehin、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀；硝基脲，例如卡莫司汀(Cannustine)、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，例如阿柔比星(Aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素(Authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、刺孢霉素、洋红霉素(Carabicin)、去甲柔红霉素、嗜癌霉素、色霉素(Chromoinycins)、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、重氮氧代正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(Potfiromycin)、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素(Tubercidin)、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物；例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟脲嘧啶脱氧核苷和5-FU；雄激素类，例如卡普睾酮、屈他雄酮、丙酸酯、环硫雄醇、Rnepitiostane和睾内酪；抗肾上腺抗体(anti-adrenals)，例如氨格鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinicacid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；Bestrabucil；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(Elfornithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；磨茹多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌、莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；足叶草酸；2-乙基肼；丙卡巴肼；雷佐生；Sizofrran；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；三氯乙胺；2，2’，2”-三氯代三乙基胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；Gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷，例如紫杉醇(Bristol-MyersSquibbOncology，Princeton，NJ)和多烯紫杉醇(Doxetaxel)(Rhone-PoulencRorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物例如顺铂和卡铂；长春碱；铂、依托泊苷(VP-16)；异磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；能灭瘤；替尼泊苷；柔红霉素；氨喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构抑制剂酶RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维A酸；Esperamicins；卡培他滨；以及上述任意药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。还包括用于调节或抑制肿瘤上激素作用效果的抗激素剂，例如抗***类，其包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制剂4(5)-咪唑、4羟泰米芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬盐酸盐(Keoxifene)、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；以及抗雄激素类，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及上述任意药物的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

有用的药物还包括细胞因子。这样的细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。所述细胞因子中包括生长激素，例如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；前胰岛素；松弛素；前松弛素(prorelaxin)；糖蛋白激素，例如促卵胞激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒氏抑制物质；小鼠***相关肽；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，例如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β；***I和II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，例如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，例如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(GCSF)；白细胞介素(IL)，例如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子，例如TNF-α或TNF-β；以及其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如在此文中所使用的，术语细胞因子包括来源于自然资源或来源于重组细胞培养物的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性等价物。

所述药物可以是前体药物，之后由将例如肽基化疗剂的前体药物转化为活性抗癌药物的前体药物激活酶来激活。参见例如WO88/07378；WO81/01145；美国专利第4,975,278号。通常，酶成分包括任何能够以这种方式作用于前体药物从而将其转化成更有活性、更有细胞毒性形式的酶。

将小细胞导向特异性哺乳动物细胞

在本发明的一个方面，如在公布的PCT申请WO05/056749和WO05/079854中所描述的，小细胞经双特异性配体被导向至靶标哺乳动物细胞。双特异性配体具有对小细胞成分和哺乳动物细胞成分的特异性，导致小细胞结合至哺乳动物细胞，使得小细胞被哺乳动物细胞吞噬，从而使功能性核酸被释放进入哺乳动物细胞的细胞质。这种靶向的递送方法可在体内或体外进行，或者在体内和体外进行。

双特异性配体、小细胞和哺乳动物细胞之间的接触可以以多种不同的方式进行。对于体内递送，优选地给予已附着有双特异性配体的小细胞。因此，当双特异性配体靶定的小细胞在体内达到靶标细胞时，小细胞、双特异性配体和靶标细胞都可接触。或者，双特异性配体和小细胞可在体内被单独给药。

双特异性配体、小细胞和哺乳动物细胞之间的接触也可以在体外的一个或多个培育期间进行。在一种实施方式中，三者被同时一起培育。可选地，可进行分步培育。在逐步法的一个实施例中，小细胞和双特异性配体首先被培育在一起，以形成双特异性配体靶定的小细胞，该小细胞随后倍于靶标细胞一起培育。在另一个实施例中，双特异性配体首先与靶标细胞一起培育，随后与小细胞一起培育。一个或多个体外培育和体内给药的组合也可使双特异性配体、小细胞和哺乳动物靶细胞接触。

发明人发现，靶向递送法可广泛地适用于多种哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包括通常不易于特异性粘合和内吞小细胞的细胞。例如，在一个臂上有抗O-多糖特异性和在另一个臂上具有抗HER2受体特异性或抗EGF受体特异性的双特异性抗体配体，有效地将小细胞结合至多种靶标非噬菌性细胞上的各种受体。这些细胞包括：肺癌细胞、卵巢癌细胞、脑癌细胞、乳腺癌细胞、***癌细胞和皮肤癌细胞。而且，所述有效的结合优先于由每种非噬菌性细胞进行的小细胞的快速内吞作用。

本发明的靶细胞包括其中被引入功能性核酸的任何细胞。理想的靶细胞的特征是，一旦结合配体，细胞表面受体的表达有利于内吞作用。优选的靶细胞是非噬菌性的，意味着该细胞不是诸如巨噬细胞、树突状细胞以及自然杀伤细胞(NK)之类的专业的噬菌细胞。优选的靶细胞还有哺乳动物细胞。

用于本发明的靶向递送方法中的配体包括结合至靶细胞上的表面成分和小细胞上的表面成分的任何试剂。优选地，靶细胞上的表面成分是受体，特别是能够介导内吞作用的受体。配体可包含多肽和/或碳水化合物成分。抗体是优选的配体。例如，携带对由细菌衍生的完整小细胞上的表面成分和靶标哺乳动物细胞上的表面成分具有双重特异性的双特异性抗体，可被有效地用来将小细胞靶定至在体外和体内的靶标哺乳动物细胞。有用的配体还包括受体、酶、结合肽、融合/嵌合蛋白和小分子。

具体配体的选择基于两个主要的标准：(i)特异性地结合至完整小细胞的表面上的一个或多个区域，和(ii)特异性地结合至靶细胞表面上的一个或多个区域。因此，配体优选地具有携带对由细菌衍生的完整小细胞表面结构特异性的第一个臂和携带对哺乳动物细胞表面结构特异性的第二个臂。第一个臂和第二个臂都可以是多价的。优选地，即使是多价的，每个臂也是单特异性的。

对于结合至由细菌衍生的小细胞而言，理想的是，配体的其中一个臂对在亲代细菌细胞上发现的脂多糖的O-多糖成分具有特异性。其它可被开发用于配体结合的小细胞表面结构包括细胞表面暴露的多肽和外膜上的碳水化合物，例如菌毛(pilli)、伞毛、外膜蛋白和暴露于鞭毛细胞表面的肽片段。

对于结合至靶细胞而言，配体的其中一个臂对哺乳动物细胞的表面成分具有特异性。这样的成分包括细胞表面蛋白、肽和碳水化合物，不论是特征化的或未被特征化的。细胞表面受体，特别是能够激活受体介导的内吞作用的受体，是用于靶定的理想的细胞表面成分。如果在靶细胞表面过度表达，对于靶定要被治疗的细胞，这样的受体会赋予额外的选择性，从而减少递送至非靶细胞的可能性。

例如，通过选择将细胞表面受体模体(motif)特异性地结合在所期望的细胞的配体上，所述配体可以靶定肿瘤细胞、转移细胞、脉管***细胞(例如内皮细胞和平滑肌细胞)、肺细胞、肾细胞、血细胞、骨髓细胞、脑细胞、肝细胞等等，或任何被选细胞的前体。细胞表面受体的例子包括癌胚抗原(CEA)，其在大多数的结肠癌、直肠癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和胃肠道癌中过度表达(Marshall，2003)；调蛋白受体(HER-2、neu或c-erbB-2)，其常常在乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、***癌和子***中过度表达(Hung等，2000)；表皮生长因子受体(EGFR)，其在一系列实体瘤中高度表达，所述实体瘤包括乳腺癌、头颈癌、非小细胞肺癌和***癌(Salomon等，1995)；唾液酸糖蛋白受体(Stockert，1995)；转铁蛋白受体(Singh，1999)；丝氨酸蛋白酶抑制剂酶复合体受体，其在肝细胞中表达(Ziady等，1997)；纤维母细胞生长因子受体(FGFR)，其在胰腺癌细胞中过量表达(Kleeff等，2002)；血管内皮生长因子受体(VEGFR)，用于血管生成抑制基因治疗(Becker等，2002和Hoshida等，2002)；叶酸盐受体，其在90％的非粘液卵巢癌中选择性地过量表达(Gosselin和Lee，2002)；细胞表面多糖-蛋白质复合物(Batra等，1994)；碳水化合物受体(Thurnher等，1994)；和聚免疫球蛋白受体，其可用于将基因递送至呼吸上皮细胞，且对于肺病(例如囊性纤维性变病)的治疗具有吸引力(Kaetzel等，1997)。

优选的配体包含抗体和/或抗体衍生物。此处所用“抗体”包括由在体内或体外发生的免疫源应答而获得的免疫球蛋白分子。术语“抗体”包括多克隆的、单特异性的和单克隆的抗体，以及抗体衍生物，如单链抗体片断(scFv)。用于本发明中的抗体和抗体衍生物也可通过DNA重组技术而获得。

野生型抗体有四个多肽链，两个相同的重链和两个相同的轻链。两种类型的多肽链有恒定区和可变区，恒定区在同种类的抗体中不变化或极少变化。可变区对于特定的抗体是唯一的，且包括一个识别特异性表位的抗原结合区。与抗体结合最直接相关的抗原结合区的区域即是“互补性决定区域”(CDR)。

术语“抗体”也包括抗体衍生物，例如保留了特异性结合至抗原的能力的抗体片段。这样的抗体片段包括Fab片段(含有抗原结合区并包括由二硫键桥接的轻链和部分重链的片段)、Fab’(含有单个抗原结合区的抗体片段，其包括Fab和穿过铰链区的重链的另外的部分)、F(ab′)2(由重链铰链区的链间二硫键连接的两个Fab’分子)、双特异性Fab(具有两个抗原结合区的Fab分子，每个抗原结合区可指向不同的表位)和scFv(由氨基酸链连接在一起的、抗体的单个轻链和重链的可变抗原结合决定区)。

当抗体(包括抗体片段)构成部分或全部配体时，抗体优选是人源性的或被修饰以适合用于人类。所谓的“人源化抗体”在本领域是已知的。参见，例如Osbourn等，2003。通过遗传操作和/或体外处理来修饰抗体以减少它们在人体内的抗原性。例如，用于人源化抗体的方法已在专利号分别为6,639,055、5,585,089和5,530,101的美国专利中描述。在最简单的情况下，人源化抗体通过将来自小鼠mAb的被称为互补性决定区域(CDR)的抗原结合环移植进入人IgG而形成。参见Jones等，1986；Riechmann等，1988；和Verhoeyen等，1988。然而，高亲和力人源化抗体的产生通常需要从小鼠亲代mAb的所谓的构架区(FR)转移一个或多个额外的残基。也已开发出几个人源化技术的变体。参见Vaughan等，1998。

在本发明中也可使用人抗体(而不是“人源化抗体”)。它们对其各自的抗原具有很高的亲和力，且可从非常大的、单链可变片段(scFvs)或Fab噬菌体展示库中按常规获得。参见Griffiths等，1994；Vaughan等，1996；Sheets等，1998；deHaard等，1999；和Knappik等，2000。

有用的配体还包括双特异性单链抗体，该抗体通常是重组多肽，该重组体多肽由可变轻链部分(通过连接分子共价地连接至相应的可变重链部分)组成。参见专利号分别为5,455,030、5,260,203和4,496,778的美国专利。双特异性抗体也可通过其他方法制备。例如，化学复共轭对配合物可通过以化学方法连接具有不同特异性的完整抗体或抗体片段而制得。参见Karpovsky等，1984。但是，这种复共轭对配合物难于以可再生的方式制得，并且至少是正常单克隆抗体的两倍大。双特异性抗体也可通过二硫化物交换而制得，这涉及酶裂解和抗体片段的重新组合。参见Glennie等，1987。

因为Fab片段和scFv片段是单价的，因此它们通常对靶结构具有低亲和力。因此，由这些成分制得的优选的配体被改造成二聚的、三聚的或四聚的共轭物以增强功能性亲和力。参见Tomlinson和Holliger，2000；Carter，2001、Hudson和Souriau，2001；和Todorovska等，2001。这种共轭结构可通过化学交联和/或遗传学交联而制备。

本发明的双特异性配体优选在每一端都是单特异性的，即，在一端对小细胞上的单个成分是特异性的，而在另一端对靶细胞上的单个成分是特异性的。配体可以在一端或两端都是多价的，例如，以所谓的双抗体、三链抗体和四链抗体形式存在。参见Hudson和Souriau，2003。双抗体是通过两个scFv的非共价连接而形成的二价二聚体，其产生两个Fv结合位点。同样地，三链抗体通过形成三个scFv的三价三聚体而得到，产生三个结合位点，而四链抗体通过形成四个scFv的四价四聚体而得到，产生四个结合位点。

对哺乳动物细胞上的受体具有特异性的几个人源化的、人的以及小鼠的单克隆抗体和抗体片段已被批准用于人类的医疗用途，并且数量快速增多。参见Hudson和Souriau，2003。这种可被用来形成对HER2具有特异性的双特异性配体的一个臂的抗体的例子是：赫赛汀TM；曲妥珠单抗。

抗体可变区也可被融合至许多蛋白质域。融合至人免疫球蛋白域(例如IgG1CH3)既增加了质量又促进了二聚化。参见Hu等，1996。融合至人Ig铰合部-Fc区可增加效应子功能。同样，融合至来自多聚体蛋白的异源蛋白区域促进多聚化。例如，将短scFv融合至短的两亲性螺旋已被用于制备微型抗体。参见Pack和Pluckthun，1992。来自形成异源二聚体(例如fos/jun)的蛋白质的区域，可被用于制备双特异性分子(Kostelny等，1992)，可选地，同源二聚化区域可通过工程化策略，如“凹凸配合(knobsintoholes)”(Ridgway等，1996)，而被改造形成异源二聚体。最后，可选择使用融合蛋白伴侣(partner)，其提供多聚化作用和额外的功能，例如链霉抗生物素蛋白。参见Dubel等，1995。

递送至有吞噬或内吞能力的细胞

本发明还提供通过将细菌衍生的小细胞与有吞噬或内吞能力的哺乳动物细胞接触的递送。这样的能够以胞内细菌性病原体的方式吞噬亲代细菌细胞的哺乳动物细胞同样吞噬小细胞，该小细胞将它们的负载物释放至哺乳动物细胞的细胞质。不需要使用靶向配体即可实现这种递送方法。

在小细胞被给定类型的细胞吞噬的过程中可能涉及多种机制，而本发明在这点上并不依赖于任何特定机制。例如，吞噬作用是一个被众多文件记载的过程，在该过程中巨噬细胞和其它吞噬细胞(例如中性白细胞)通过在颗粒表面伸展伪足直到该颗粒被完全包裹的方式摄取该颗粒。虽然被描述为“非特异性”吞噬作用，但在该过程中已证实涉及特异性受体。参见Wright等(1986)；Speert等(1988)。

因此，一种形式的吞噬作用涉及表面配体与位于伪足膜上的配体受体之间的相互作用。这种由特异性受体介导的附着步骤被认为依赖于细菌表面粘附素。对于毒性较小的细菌，例如非肠毒性大肠杆菌，在缺乏噬菌细胞受体的表面配体的情况下也可发生吞噬作用。参见例如Pikaar等(1995)。因此，本发明包括但不限于利用具有或缺乏表面粘附素的小细胞，是否具有粘附素要与它们的亲代细菌细胞的性质一致，并且该小细胞被噬菌细胞(即“有吞噬能力的”宿主细胞)吞噬，其中中性粒细胞和巨噬细胞是哺乳动物中的主要类型。

另一个吞噬过程是内吞作用，细胞内病原体，例如沙门氏菌属、埃希氏菌属、志贺氏菌属、螺杆菌属、假单胞菌属和乳杆菌属，通过这种方式进入哺乳动物上皮细胞中并在那里复制。在这点上，两个基本机制是网格蛋白依赖型的受体介导的内吞作用，也称为“有被小窝内吞作用”(Riezman，1993)，以及网格蛋白非依赖型的内吞作用(Sandvig&Deurs，1994)。当有吞噬能力的细胞通过内吞作用(即，“有内吞能力”的宿主细胞)吞噬本发明的小细胞时可能涉及其中一个机制或两个机制。代表性的有内吞能力的细胞为乳腺上皮细胞、胃肠道中的肠上皮细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞以及泌尿道和膀胱上皮细胞。

当不使用靶向配体向有吞噬能力的哺乳动物细胞有效递送时，本申请设计的本质将影响所使用的小细胞的细菌来源的选择。例如，沙门氏菌种、埃希氏菌种和志贺氏菌种携带粘附素(可被胃肠道中肠上皮细胞上内吞作用介导的受体识别)，且可能适合于递送对结肠癌细胞有效的药物。类似地，由幽门螺杆菌衍生的、携带对胃上皮细胞有特异性的粘附素的小细胞，可适合于针对胃癌细胞的递送。对于由假单胞菌种衍生的、携带由肺上皮细胞上的受体识别的粘附素的小细胞，吸入法或吹入法可能是理想的给药方法。由乳杆菌衍生的、携带对泌尿道和膀胱上皮细胞具有特异性的粘附素的小细胞，可非常适合于将药物尿道内递送至泌尿道癌或膀胱癌。

制剂

在一个方面，本发明提供一种组合物，其包含(a)多个完整的小细胞，所述多个完整小细胞中的每个小细胞包含无质粒的功能性核酸，和(b)用于小细胞的药学上可接受的载体。

该制剂任选地包含药物。在一个实施例中，制剂的小细胞含有药物，而在另一个实施例中，小细胞可含有编码药物的核酸分子，例如质粒。

制剂还任选地含有用于将小细胞靶定至靶细胞的双特异性配体。小细胞和配体可为本文所述的任何一种。因此，小细胞含有编码功能性核酸的核酸，且双特异性配体优选地能够结合至小细胞的表面成分和靶标哺乳动物细胞的表面成分。

制剂可以单位剂量地形式提供，例如，以安瓿或管形瓶的形式，或者以多次剂量容器的形式，所述制剂具有或不具有添加的防腐剂。所述制剂可为溶液、悬浮液或者在油性或水性载体中的乳状液，并可包含配方剂，例如：悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。合适的溶液与接受者血液等压，以生理盐溶液、林嘉氏溶液和葡萄糖溶液为例。可选地，制剂可为冻干粉末形式，用于使用诸如无菌、无热原水或生理盐水之类的合适载体来复原。制剂还可制备成微球的形式。这种长效制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)或肌内注射给药。

给药途径

本文所述的制剂可通过各种途径给药至哺乳动物体内的不同位点，以获得所需的局部或***治疗效果。可通过以下方法完成递送，例如，通过口服给药、通过将制剂应用至体腔、通过吸入或吹入法、或者通过肠胃外、肌内、静脉内、门静脉内、肝内、腹膜、皮下、肿瘤内或经皮给药。给药的模式和位点取决于靶细胞的位置。例如，通过被靶定的小细胞的吸入递送可有效靶定囊性纤维性变细胞。类似地，通过被靶定的小细胞的静脉递送可更加有效地***转移。通过被靶定的小细胞的腹腔内递送可治疗源发性卵巢癌。

纯度

在一个方面，小细胞基本上不含杂质亲代细菌细胞。因此，含小细胞的制剂优选为每10⁷个小细胞含有少于约1个杂质亲代细菌细胞，更优选为每10⁸个小细胞含有少于约1个杂质亲代细菌细胞，甚至更优选为每10⁹个小细胞含有少于约1个杂质亲代细菌细胞，还更优选为每10¹⁰个小细胞含有少于约1个杂质亲代细菌细胞，且最优选为每10¹¹个小细胞含有少于约1个杂质亲代细菌细胞。

纯化小细胞的方法在本领域是已知的，且在国际公开号为WO03/033519的申请中有描述。一种这样的方法将交叉流过滤(进料流动与膜表面平行；Forbes，1987)与死端过滤(进料流动与膜表面垂直)组合。任选地，在过滤组合之前，可进行低离心力的差速离心，以出去一些部分的细菌细胞，从而使上清液富集小细胞。

另一种纯化方法使用在生物学相容性介质中的密度梯度离心。离心后，从梯度中收集小细胞带，且任选地，小细胞经受进一步的密度梯度离心循环，以使纯度最大化。该方法可进一步包括在含小细胞的样品上进行差速离心的预备步骤。当以低离心力进行时，差速离心将除去一些部分的亲代细菌细胞，从而使上清液富集小细胞。

特别有效的纯化方法使用细菌丝化(filamentation)以增加小细胞纯度。因此，小细胞纯化方法可包括以下步骤：(a)使含有小细胞的样品经受一定条件以诱导亲代细菌细胞采取丝状形式，随后(b)过滤样品以获得纯化的小细胞制剂。

也可组合已知的小细胞纯化方法。一种高效的方法组合如下：

步骤A：差异离心小细胞产生细菌细胞培养物。此步骤(可在2000g进行约20分钟)除去大多数亲代细菌细胞，而在上清液中留下小细胞。

步骤B：使用等压的和无毒的密度梯度介质的密度梯度离心。此步骤将小细胞与许多污染物分开，包括亲代细菌细胞，而具有最小的小细胞损失。优选地，在纯化方法中重复此步骤。

步骤C：通过0.45μm过滤器的交叉流过滤，以进一步减少亲代细菌细胞污染。

步骤D：残留亲代细菌细胞的应激诱导丝化。这可通过将小细胞悬浮液经受几种应激诱导的环境条件中的任何一种而完成。

步骤E：抗生素处理以杀死亲代细菌细胞。

步骤F：交叉流过滤以除去小的污染物，例如膜泡、膜碎片、细菌残骸、核酸、机制成分等等，并浓缩小细胞。可使用0.2μm过滤器以将小细胞与小污染物分离，可使用0.1μm过滤器以浓缩小细胞。

步骤G：死端过滤以消除丝状死亡细菌细胞。0.45μm过滤器可被用于此步骤。

步骤H：从小细胞制剂中除去内毒素。抗脂质A涂布的磁珠可被用于此步骤。

给药安排

通常，本文公开的制剂可以按通过给药途径测试确定的适当剂量被使用，以获得最佳的生理学作用，同时使任何潜在的毒性最小化。可根据多种因素选择剂量方案，这些因素包括年龄、体重、性别、患者的医疗条件；被治疗病症的严重程度、给药途径以及患者的肾功能和肝功能。

在获得小细胞和药物产生最大效力和最小副作用的范围内的浓度的最佳精确度时，可能需要一种基于功能性核酸动力学和对靶位点及靶细胞的药物利用度的方案。当确定治疗方案的最佳浓度时，可考虑小细胞或药物的分散、平衡和消除。当结合使用小细胞和药物时，可调整小细胞和药物的剂量以达到所需效果。

而且，可使用药动学/药效学模型***优化所述制剂的给药剂量。例如，可选择一个或多个剂量方案来确定所述一个或多个剂量方案的药动学/药效学曲线。随后，选择其中一个用于给药的剂量方案，该方案根据特定的药动学/药效学曲线获得所需的药动学/药效学反应。参见，例如，WO00/67776。在这点上，用于任何病征的剂量方案可使用本文在实施例6中所描述的方法和模型(被修改以用于所感兴趣的特定细胞)来确定。

具体而言，在数周的过程中，所述制剂每周给药至少一次。在一种实施方式中，所述制剂在数周至数月的过程中每周给药至少一次。

更具体地，制剂可至少每天给药一次，并且持续约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天。或者，所述制剂可约每隔一天、约每隔2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天或更长时间给药一次。

可选地，所述制剂可约每隔一周、约每隔2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周或更长时间给药一次。或者，所述制剂可每周给药至少一次，并持续约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周或更长时间。

可选地，所述制剂可约每隔一月、约每隔2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长时间给药一次。

所述制剂可按单个日剂量给药，或按总日剂量每日分成2次、3次或4次给药。

在给药前给予小细胞的方法中，可在给予小细胞后的数分钟到数个小时的任何时间给药。或者，可在给予小细胞后的数个小时到数天，可能为数个星期直至到数个月的任何时间给药。

更具体而言，可在给药前至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个小时给予包裹有功能性核酸的小细胞。而且，可在给药前至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天给予小细胞。在另一种实施方式中，可在给药前至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周或更长时间给予小细胞。在另一种实施方式中，可在给药前至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月给予小细胞。

在另一种实施方式中，在给药后给予小细胞。可在给药后数分钟到数个小时的任何时间给予小细胞。或者，可在给药后数个小时到数天，可能是数个星期直至数个月的任何时间给予小细胞。

以下实施例仅是说明性的，而非限制性的，其提供本发明的更完全的理解。

实施例

1.在体外将调节性RNA直接包裹进完整的小细胞

如在公布的美国申请第US2004/0265994号所述制备并纯化细菌衍生的完整小细胞。获得了Cy3标记的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)siRNA，该物质的最大激发波长(λ_max)为547nm，最大发射波长(λ_max)为563nm，它是Ambion(Austin，TexasUSA)的产品，并在无核酸酶的水中复原至最终浓度50μM。

约10⁷个小细胞被重悬在1×磷酸缓冲液(PBS)(Gibco)中，并且与1μM的Cy3-标记的GAPDHsiRNA共培育。培育在37℃进行2个小时，并伴随温和的混合。通过仅与1×PBS培育来模拟装载对照小细胞。装载后小细胞通过以16200×g离心10分钟而形成小球并使用1×PBS洗涤两次。在荧光DMLB显微镜下观察实验小细胞和对照小细胞，该显微镜是Leica(Germany)的产品，带有D70照相机(OlympusMicroscopes(Germany)的产品)。使用100×油浸镜头获得图像。

上述共培育实验也在不同的实验条件下进行，例如在室温下、在37℃和4℃培育。另外，共培育时间是变化的，分别包括1小时、2小时、4小时和12小时。

如图1B所示，完整的siRNA分子快速扩散进入小细胞。在37℃的2个小时的培育足以获得相当大量的小细胞的包裹。

为了确定siRNA分子是位于小细胞内还是粘附在小细胞表面上，将具有Cy3-荧光标记的siRNA小细胞与核酸外切酶培育过夜，随后重复荧光显微镜检术。结果与图1B所示的相同，显示siRNA被小细胞内化，并非粘附在小细胞表面上。

2.使用包裹RNA的、双特异性抗体靶定的小细胞体外转染人乳癌细胞

为证实携带调节性RNA的小细胞在体外的血清中是稳定，且为证实它们可被特异性靶定的哺乳动物细胞内化，进行了以下的实验。

使用靶标序列5′-GGTGGATGTGTGGTCCATTTT-3′合成导向polo激酶1(Plk1)的siRNA，并使用荧光标记物(AlexaFluor488)标记该siRNA。Polo激酶在进入有丝***期间、中心体成熟期间、两极纺锤体形成期间、染色体分离期间和胞质***期间有多种功能，且特别重要的是，在检查点控制的保真性监控中有多种功能(Glover等，1998；Barr等，2004；vandeWeerdt和Medema2006)。在人类中，Plk1是此家族中特性描述最充分的成员。Plk1与肿瘤发生有关，且属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族，该家族是新型化学疗法的有吸引力的靶标。因此，Plk1被视为抗癌药开发的有前景的靶标(Strebhardt和Ullrich，2006)。

如在实施例1中所描述的，纯化小细胞并将10⁹个小细胞与抗^AF488Plk1siRNA一起包裹。制备携带抗鼠伤寒沙门氏菌O-抗原特异性和抗人EGFR特异性的双特异性抗体(BsAb)，并将该双特异性抗体附着至如PCT公布申请WO05/056749中所描述的小细胞_{AF488-Plk1-siRNA}。所产生的小细胞被命名为^EGFR小细胞_{AF488-Plk1-siRNA}。在组织培养液中，以10000个小细胞：1个肿瘤细胞的密度，将这些小细胞(10⁹)与人乳癌细胞一起培育。培育进行1个小时、2个小时、4个小时和24个小时。在每个时间点，收集细胞并用DAPI(核染剂，蓝色荧光)染色。使用IX81共焦显微镜(Olympus)和CellR软件观察细胞。

经1个小时，发荧光的、携带siRNA的小细胞已粘附至MDA-MB-468细胞(见图2)。这种附着被认为是由于结合至附着在小细胞上的BsAb引起的，该BsAb靶定MDA-MB-468细胞上的EGF受体，因为使用非靶定的小细胞_{AF488-Plk1-siRNA}的对照培育被洗掉，且未显示出与MDA-MB-468细胞有关的任何绿色荧光。经2个小时的后培育，^EGFR小细胞_{AF488-Plk1-siRNA}被内化进入MDA-MB-468细胞，且显示出强烈的绿色荧光。经24个小时，大多数绿色荧光消失，表明内化的小细胞已被分解(大概被在吞噬溶酶体中分解)。

3.从完整小细胞中提取和量化siRNA

因为siRNA不会在细菌细胞或细菌衍生的小细胞中自然出现，不存在已确定的用于从这种粒子中提取siRNA的方法也不足为怪。因此，根据本发明，发明人开发出一种定量提取被包裹在完整小细胞内的siRNA的方法。

纺锤体驱动蛋白(KSP)(也称作“驱动蛋白-5”和“Eg5”)是微管驱动蛋白。它对于有丝***期间两极纺锤体的形成以及姐妹染色单体的适当分离是必要的(Enos和Morris，1990；Blangy等，1995；Sawin和Mitchison，1995；Dagenbach和Endow，2004)。KSP的抑制导致单极有丝***纺锤体的形成，激活纺锤体组装检查点并使细胞停留在有丝***期，导致后续的细胞死亡(Blangy等，1995；Caner等，1999；Kapoor等，2000；Tao等，2005)。

选择抗KSP的siRNA用于包裹在小细胞中，以显示(inform)本发明的从小细胞提取siRNA的最优化条件(optimization)。更具体地，KSP-1-siRNA双链寡核苷酸序列(正义链：5′-AACTGGATCGTAAGAAGGCAG-3′)被合成并根据前述实施例1中的程序包裹进小细胞。

使用许多商业上可获得的核酸提取试剂盒，处理小细胞_siRNA-KSP(10¹⁰)和相当量的对照空小细胞。结果显示，mirVanamiRNA分离试剂盒(Ambion)提供从完整小细胞中定量提取siRNA-KSP。程序根据制造商的说明书进行。

被纯化的siRNA首先用超敏荧光核酸染料RiboGreen^TM(MolecularProbesInc.(Eugene，OregonUSA)的产品)染色，随后使用NanoDropND-3300荧光分光光度计(NanoDropTechnologiesInc.(Wilmington，DelawareUSA)的产品)定量(同样根据制造商的说明书进行)。RNA结合的RiboGreen^TM的最大激发波长为～500nm，最大发射波长为～525nm。

结果显示，小细胞能够携带siRNA。10¹⁰个空小细胞携带～1.4μgRNA，大概是内源性形成的细菌RNA的背景水平。相同数目的小细胞_siRNA-KSP携带～2.7μgRNA，包含内源性细菌RNA和外源性包裹的siRNA-KSP。因此，这些数据证实，10¹⁰个小细胞可包裹至少～1.3μg的外源性包裹的siRNA。

4.包裹有调节性RNA的小细胞所达到的抗肿瘤效果的体内证实

进行了以下研究，以显示包裹有调节性RNA的小细胞可以以治疗上有效浓度将完整的调节性RNA递送至体内的肿瘤细胞。

如实施例3中所描述的抗KSP的siRNA被选择用来依照本发明包裹在小细胞中。如实施例1所描述的，纯化小细胞并将10⁹个小细胞与抗KSPsiRNA一起包裹。如实施例2所描述，还制备了BsAb并将其附着至小细胞siRNA-KSP，以产生^EGFR小细胞_siRNA-KSP。

用在此实施例中的小鼠是从AnimalResourcesCentre(Perth，WA，Australia)购买的，且所有动物实验都遵循实验动物饲养管理及使用规范且获得动物伦理委员会批准。试验在EnGeneICPtyLtd(Sydney，NSW，Australia)的经NSW农业部批准的小动物设备上进行。

在补充有GIBCO-BRL5％小牛血清(InvitrogenCorporation(Carlsbad，CaliforniaUSA)的产品)和谷酰胺(Invitrogen)的RPMI1640培养基中，在95％空气和5％CO₂的潮湿气氛中，在37℃时以组织培养的方式培养人乳癌细胞(MDA-MB-468，ATCC)。将在50μl无血清培养基中的1×10⁶个细胞与50μl生长因子减少的基质胶(BDBiosciences(FranklinLakes，NewJerseyUSA)的产品)混合在一起。通过使用23G针，将细胞皮下注射至每个小鼠的肩胛之间。使用电子数字测径器(精确至0.001，Mitutoyo(Japan)的产品)每周测量两次肿瘤，使用下式计算平均肿瘤体积长度(mm)×宽度²(mm)×0.5＝体积(mm³)。

当肿瘤体积达到170mm³至200mm³之间时，开始各种治疗，将小鼠随机分成两个不同的组，每组8只。对照组1接受无菌生理盐水，而实验组2接受^EGFR小细胞_siRNA-KSP(10⁹)，每周四次。

如图3所示，^EGFR小细胞_siRNA-KSP与生理盐水对照相比提供了高度显著的抗肿瘤效果。结果证实，(a)siRNA在体内小细胞内是稳定的，(b)完整的且完全有功能的siRNA被递送至体内的肿瘤细胞，和(c)小细胞将治疗上有意义浓度的siRNA递送至体内肿瘤细胞。

5.通过使用包裹有调节性RNA的小细胞治疗、随后用包裹有药物的小细胞治 疗来证实定制(tailor-made)癌症疗法

大多数抗癌疗法都伴随抗药性。调节性RNA治疗也是这样，因为如果靶标基因在被调节性RNA靶定的序列内突变的话，肿瘤细胞中的基因突变可使调节性RNA失效。

之前没有解决在癌症患者体内的抗药性的有效策略。取而代之的是，必须服用新药物以避开突变。但是，这种方法面临严重困难，因为多数抗癌药是高度有毒的，而组合疗法增大了该毒性，导致当患者不再能对抗毒性时限制治疗的剂量和经常发生放弃治疗。进行以下研究是为了评估包裹有调节性RNA的小细胞在解决这种抗药性方面的功效。

如上所述，纯化小细胞并包裹(10⁹)抗KSP或抗Plk1siRNA。同样如前所述，制备双特异性抗体(携带抗鼠伤寒沙门O-抗原特异性和抗人EGFR特异性)，并将其附着至小细胞_siRNA-KSP以产生^EGFR小细胞_siRNA-KSP。

如在实施例3中所述，在裸鼠中建立人结肠癌(HCT116；ATCC)异种移植物，并在体内按如下方式处理：组1小鼠接受无菌生理盐水，组2、组3和组4小鼠的最初10次剂量(见图4)分别使用10⁹个^EGFR小细胞_siRNA-Plk1、^EGFR小细胞_siRNA-KSP-1和^EGFR小细胞_siRNA-KSP-2来处理。Plk1序列和KSP-1序列显示在以上实施例中。siRNA-KSP-2(正义链：5′CTGAAGACCTGAAGACAAT3′)靶定KSPmRNA的不同片段。第33天后，组2、组3和组4的小鼠使用两份剂量的^EGFR小细胞_碳铂处理。

结果显示(图4)，第26天后，肿瘤变得对siRNA治疗有抗性。因此，组2、组3和组4小鼠的后续四次剂量使用以相等数量组合的所有三份剂量(^EGFR小细胞_siRNA-Plk1+^EGFR小细胞_siRNA-KSP-1+^EGFR小细胞_siRNA-KSP-2)处理(即，每种小细胞类型为～3×10⁸个)。另外，至第33天，肿瘤对所有siRNA都具有高度抗性(图4)。服用^EGFR小细胞_碳铂后，组3和组4小鼠的肿瘤生长显著放缓。服用^EGFR小细胞_碳铂后，组3小鼠显示出肿瘤体积的显著退化。

这些数据显示，根据本发明，抗药性肿瘤细胞可在体内被有效地的处理。特别地，(1)连续服用携带被设计用来显著减小肿瘤重量(burden)的调节性RNA序列的靶定小细胞后，当肿瘤细胞对siRNA介导的抗肿瘤效果变得有抗性时，(2)服用携带的药物的靶定小细胞，该药物并不作用于由调节性RNA靶定的相同蛋白质。

6.靶向递送被包裹在完整小细胞内的治疗有效量的调节性RNA后，肿瘤细胞 靶定蛋白质击倒和所导致的细胞生长停滞的证实

为证实本发明的方法将治疗上有效量的调节性RNA包裹在完整的小细胞中，需要证实双特异性抗体靶定的、包裹有调节性RNA的小细胞可以有效率地且有效地引起肿瘤细胞生长停滞和诱导凋亡性细胞死亡。

在95％空气和5％CO₂的潮湿气氛中，在37℃，在补充有5％小牛血清和谷酰胺的RPMI1640培养基中，以组织培养的方式培养人结肠上皮癌细胞(HCT116)。如上所述，纯化小细胞并使用抗Plk1或KSP的siRNA包裹，并将其附着至携带抗鼠伤寒沙门O-抗原特异性和抗人EGFR特异性的BsAb上。因此，由小细胞_siRNA-KSP、小细胞_siRNA-Plk1和小细胞(对照)产生了^EGFR小细胞_siRNA-KSP、^EGFR小细胞_siRNA-Plk1和^EGFR小细胞。HCT116细胞被接种在6孔平板中，以5000个小细胞：1个HCT116细胞的比率转染实验组和对照组。该实施例还包括额外的只有细胞的对照组。

在用小细胞培育2个小时后，使用新鲜的PBS将孔洗涤三次。在转染后的4小时、8小时、16小时、24小时、32小时和48小时的时候收集孔内细胞，将细胞在冷的70％乙醇中固定，并在4℃培育30分钟。在磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液(pH7.8)中将细胞洗涤两次，并使用100mg/ml的RNA酶处理，以保证只有DNA被染色。使用碘化丙啶(核酸染料)染色细胞，随后使用FACSCalibur^TM流式细胞仪(BectonDickinson(FranklinLakes，NewJerseyUSA)的产品，MacquarieUniversity(Sydney，Australia))和CELLQuest获得和分析软件(同样是BectonDickinson产品)分析。

细胞的FACS分析显示，转染后4小时和8小时(图5A)，使用^EGFR小细胞_siRNA-KSP或^EGFR小细胞_siRNA-Plk1处理的细胞的特点在于强健的(robust)G2细胞周期停滞。对照细胞(只有细胞或使用^EGFR小细胞处理的细胞)未显示出不利效果。这些细胞显示出细胞周期的正常G1期、S期和G2期。至16小时和24小时，实验细胞不仅显示出强健的G2停滞，还显示出大量的凋亡细胞(图6)。至32小时和48小时，实验组的大多数细胞凋亡且已变成细胞残骸(参见，特别是图7中的括号处)。

这些结果证实，被靶定的完整小细胞被包裹有治疗上有效量的调节性RNA，并且本发明的小细胞在肿瘤细胞中的靶定蛋白质击倒方面高度有效率且显著有效，导致凋亡性细胞死亡。

引用的公开文献

Barr，F.A.，Sillje，H.H.，andNigg，E.A.Pololikekinasesandtheorchestrationofcelldivision.Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.5：429-40(2004).

Batra，R.K.，Wang-Johanning，F.，Wagner，E.，Garver，R.I.Jr.，Curiel，D.T.Receptor-mediatedgenedeliveryemployinglectin-bindingspecificity.GeneTher.1：255-260(1994).

Becker，CM.，Farnebo，F.A.，Iordanescu，I.，Behonick，D.J.，Shih，M.C，Dunning，P.，Christofferson，R.，Mulligan，R.C.，Taylor，G.A.，Kuo，CJ.，Zetter，B.R.GenetherapyofprostatecancerwiththesolublevascularendothelialgrowthfactorreceptorFIk1.CancerBiol.Ther.1：548-553(2002).

Bertrand，J-R.，Pottier，M.，Vekris，A.，Opolon，P.，Maksimenko，A.，Malvy，C.ComparisonofantisenseoligonucleotidesandsiRNAsincellcultureandinvivo.Biochem.Biophys.Res.Commun.296：1000-1004(2002).

Blangy，A.，Lane，H.A.，d′Herin，P.，Harper，M.，Kress，M.，Nigg，E.A.Phosphorylationbyp34cdc2regulatesspindleassociationofhumanEg5，akinesin-relatedmotoressentialforbipolarspindleformationinvivo.Cell83：1159-1169(1995).

Borst，P.andElferink，R.O.MammalianABCtransportersinhealthanddisease.Annu.Rev.Biochem.71：537-592(2002).

Bredel，M.Anticancerdrugresistanceinprimaryhumanbraintumors.BrainRes.Rev.35：161-204(2001).

Britton，R.A.，Lin，D.C，Grossman，A.D.CharacterizationofaprokaryoticSMCproteininvolvedinchromosomepartitioning.GenesDev.12：1254-1259(1998).Caplen，N.J.RNAiasagenetherapyapproach.ExpertOpin.Biol.Ther.3：575-586(2003).

Carter，P.Improvingtheefficacyofantibody-basedcancertherapies.Nat.Rev.Cancer1：118-129(2001).

Check，E.Genetherapyputonholdasthirdchilddevelopscancer.Nature，433：561(2005).

Chen，Z.S.etal.Reversalofdrugresistancemediatedbymultidrugresistanceprotein(MRP)1bydualeffectsofagosterolAonMRPlfunction.Int.J.Cancer93：107-113(2001).

Chiu，Y-L.，Rana，T.M.siRNAfunctioninRNAi：achemicalmodificationanalysis.RNA9：1034-1048(2003).

Choung，S.，Kim，Y.J.，Kim，S.，Park，H.O.，Choi，Y.C.ChemicalmodificationofsiRNAstoimproveserumstabilitywithoutlossofefficacy.Biochem.Biophys.Res.Commun.342：919-927(2006).

Conner，S.D.andSchmid，S.L.Regulatedportalsofentryintothecel.Nature422：37-44(2003).

Czauderna，F.，Fechtner，M.，Dames，S.，Aygun，H.，Klippel，A.，Pronk，G.J.，Giese，K.，Kaufmann，J.StructuralvariationsandstabilisingmodificationsofsyntheticsiRNAsinmammaliancells.NucleicAcidsRes.31：2705-2716(2003).

Dagenbach，E.M.，andEndow，S.A.Anewkinesintree.J.CellSci117：3-7(2004).

Dash，P.R.，Read，M.L.，Barrett，L.B.，Wolfert，M.A.Seymour，L.W.Factorsaffectingbloodclearanceandinvivodistributionofpolyelectrolytecomplexesforgenedelivery.Gene.Ther.6：643-650(1999).

deBoer，P.A.，Crossley，R.E.，Rothfield，L.I.RolesofMinCandMinDinthesite-specificseptationblockmediatedbytheMinCDEsystemofEscherichiacoli.J.Bacteriol.174：63-70(1992).

deHaard，H.J.etal.Alargenon-immunizedhumanFabfragmentphagelibrarythatpermitsrapidisolationandkineticanalysisofhighaffinityantibodies.J，Biol.Chem.274：18218-18230(1999).

Devroe，E.andP.A.SilverTherapeuticpotentialofretroviralRNAivectors.

ExpertOpn.BiologicalTherapy4：319(2004).

Doige，CA.andAmes，G.F.ATP-dependenttransportsystemsinbacteriaandhumans：relevancetocysticfibrosisandmultidrugresistance.Annu.Rev.Microbiol.47：291-319(1993).

Dubel，S.，Breitling，F.，Kontermann，R.，Schmidt，T.，Skerra，A.，Little，M.Bifunctionalandmultimericcomplexesofstreptavidinfusedtosinglechainantibodies(scFv).J.Immunol.Methods178：201-209(1995).

Dykxhoorn，D.M.andLieberman，J.Thesilentrevolution：RNAinterferenceasbasicbiology，researchtool，andtherapeutic.Annu.Rev.Med.56：401-423(2005).

Dykxhoorn，D.M.，Palliser，D.，Lieberman，J.Thesilenttreatment：siRNAsassmallmoleculedrugs.GeneTher.13：541-552(2006).

Elmén，J.，Thonberg，H.，Ljungberg，K.，Frieden，M.，Westergaard，M.，Xu，Y.，Wahren，B.，Liang，Z.，Φrum，H.，Koch，T.andothers.Lockednucleicacid(LNA)mediatedimprovementsinsiRNAstabilityandfunctionality.NucleicAcidsRes.33：439-447(2005).

Enos，A.P.，andMorris，N.R.Mutationofagenethatencodesakinesin-likeproteinblocksnucleardivisioninA.nidulans.Cell60：1019-1027(1990).

Glennie，MJ.，McBride，H.M.，Worth，A.T.，Stevenson，G.T.PreparionandperformanceofF(ab′gamma)2antibodycontainingthioether-linkedFab′gammafragments.J.Immunol.39：2367-2375(1987).

Glover，D.M.，Hagan，I.M.，andTavares，A.A.Polo-likekinasesateamthatplaysthroughoutmitosis.GenesDev.12：3777-3787(1998).

Gosselin，M.A.andLee，RJ.Folatereceptor-targetedliposomesasvectorsfortherapeuticagents.BiotechnolAnnu.Rev.8：103-131(2002).

Gottesman，M.，Fojo，T.andBates，S.Multidrugresistanceincancer：roleofATP-dependenttransporters.NatureRev.Cancer2：48-58(2002).

Griffiths，A.D.etal.Isolationofhighaffinityhumanantibodiesdirectlyfromlargesyntheticrepertoires.EMBOJ.13：3245-3260(1994).

Grishok，A.，Tabara，H.，Mello，CC.GeneticrequirementsforinheritanceofRNAiinC.elegans.Science287：2494-2497(2000).

-Takada，C，Gardiner，K.，Marsh，T.，Pace，N.，Altman，S.TheRNAmoietyofribonucleasePisthecatalyticsubunitoftheenzyme.Cell35：849-857(1983).

Hacein-Bey-Abina，S.，VonKalle，C，Schmidt，M.，McCormack，M.P.，Wulffraat，N.，Leboulch，P.，Lim，A.，Osborne，C.S.，Pawliuk，R.，Morillon，E.etal.LMO2-associatedclonalTcellproliferationintwopatientsaftergenetherapyforSCID-Xl.Science，302：415-419(2003).

Hampel，A.andTritz，R.RNAcatalyticpropertiesoftheminimum(-)sTRSVsequence.Biochem.28：4929-4933(1989).

Hampel，A.，Tritz，R.，Hicks，M.，Cruz，P.′Hairpin′catalyticRNAmodel：evidenceforhelicesandsequencerequirementforsubstrateRNA.NucleicAcidsRes.18：299-304(1990).

Hanada，M.，Aime-Sempe，C，Sato，T.，Reed，J.C.StructurefunctionanalysisofBcl-2protein.IdentificationofconserveddomainsimportantforhomodimerizationwithBcl-2andheterodimerizationwithBax.J.Biol，Chem.270：11962-11969(1995).

Harry，E.J.Bacterialcelldivision：RegulatingZ-ringformation.Mol.Microbiol.40：795-803(2001).

Higgins，CF.ABCtransporters：physiology，structureandmechanism-anoverview.Res.Microbiol.152：205-210(2001).

Hiraga，S.，Niki，H.，Ogura，T.，Ichinose，C，Mori，H.，Ezaki，B.，Jaffe，A.ChromosomepartitioninginEscherichiacoll.novelmutantsproducinganucleatecells.J.Bacteriol.171：1496-1505(1989).

Hoshida，T.，Sunamura，M.，Duda，D.G.，Egawa，S.，Miyazaki，S.，Shineha，R.，Hamada，H.，Ohtani，H.，Satomi，S.，Matsuno，S.Genetherapyforpancreaticcancerusinganadenovirusvectorencodingsolublefit-1vascularendothelialgrowthfactorreceptor.Pancreas25：111-121(2002).

Hu，Z.andLutkenhaus，J.TopologicalregulationofcelldivisioninEscherichiacoliinvolvesrapidpoletopoleoscillationofthedivisioninhibitorMinCunderthecontrolofMinDandMinE.Mol.Microbiol.34：82-90(1999).

Hudson，P.J.andSouriau，C.Recombinantantibodiesforcancerdiagnosisandtherapy.ExpertOpin.Biol.Ther.1：845-855(2001).

Hung，M.C，Hortobagyi，G.N.，Ueno，N.T.DevelopmentofclinicaltrialofElAgenetherapytargetingHER-2/neu-overexpressingbreastandovariancancer.Adv.Exp.Med.Biol.465：171-180(2000).

Ireton，K.，Gunther，N.W.4^th.，Grossman，A.D.spoOJisrequiredfornormalchromosomesegregationaswellastheinitiationofsporulationinBacillussubtilis.J，Bacteriol.176：5320-5329(1994).

Karpovsky，B.，Titus，J.A.，Stephany，D.A.，Segal，D.M.Productionoftarget-specificeffectorcellsusinghetero-cross-linkedaggregatescontaininganti-targetcellandanti-Fcgammareceptorantibodies.J.Exp.Med.160：1686-1701(1984).

Knappik，A.etal.Fullysynthetichumancombinatorialantibodylibraries(HuCAL)basedonmodularconsensusframeworksandCDRsrandomizedwithtrinucleotides.J.MoI.Biol.296：57-86(2000).

Jones，P.T.，Dear，P.H.，Foote，J.，Neuberger，M.S.，Winter，G.Replacingthecomplementarity-determiningregionsinahumanantibodywiththosefromamouse.Nature321：522-525(1986).

Kaetzel，C.S.，Blanch，VJ.，Hempen，P.M.，Phillips，K.M.，Piskurich，J.F.，Youngman，K.R.Thepolymericimmunoglobulinreceptor：structureandsynthesis.Biochem.Soc.Trans.25：475-480(1997).

Kapoor，T.M.，Caner，T.U.，Coughlin，M.L.，Mitchison，T.J.2000.Probingspindleassemblymechanismswithmonastrol，asmallmoleculeinhibitorofthemitotickinesin，Eg5.J.CellBiol.150：975-988(2000).

Kleeff，J.，Fukahi，K.，Lopez，M.E.，Friess，H.，Buchler，M.W.，Sosnowski，B.A.，Korc，M.TargetingofsuicidegenedeliveryinpancreaticcancercellsviaFGFreceptors.CancerGeneTher.9：522-532(2002).

Kootstra，N.A.andVerma，I.M.(2003)Genetherapywithviralvectors.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol43：413-439(2003).

Kostelny，S.A.，Cole，M.S.，Tso，J.Y.Formationofabispecificantibodybytheuseofleucinezippers.J.Immunol.148：1547-1553(1992).

Kruh，G.D.andBelinsky，M.G.TheMRPfamilyofdrugeffluxpumps.Oncogene22：7537-7552(2003).

Layzer，J.M.，McCaffrey，A.P.，Tanner，A.K.，Huang，Z.，Kay，M.A.，Sullenger，B.A.Invivoactivityofnuclease-resistantsiRNAs.RNA10：766-771(2004).

Lee，R.C，Feinbaum，R.L.，Ambros，V.TheC.elegansheterochronicgenelin-4encodessmallRNAswithantisensecomplementaritytolin-14.Cell75：843-854(1993).

Marshall，J.Carcinoembryonicantigen-basedvaccines.Semin.Oncol.30：30-36(2003).

Caner，T.U.，Kapoor，T.M.，Haggarty，S.J.，King，R.W.，Schreiber，S.L.，Mitchison，TJ.Smallmoleculeinhibitorofmitoticspindlebipolarityidentifiedinaphenotype-basedscreen.Science286：971-974(1999).

McManus，M.T.andSharp，P.A.GenesilencinginmammalsbysmallinterferingRNAs.Nat.Rev.Genet.3：737-747(2002).

Miller，J.F.Bacterialtransformationbyelectroporation.MethodsEnzymol235：375-385(1994).

Modok，S.，Mellor，H.R.，Callaghan，R.Modulationofmultidrugresistanceeffluxpumpactivitytoovercomechemoresistanceincancer.Curr.Opin.Pharmacol.6：350-354(2006).

Monia，B.P.，Johnston，J.F.，Sasmor，H.，Cummins，L.L.NucleaseresistanceandantisenseactivityofmodifiedoligonucleotidestargetedtoHa-ras.J.Biol.Chem.271：14533-14540(1996).

Morrissey，D.V.，Blanchard，K.，Shaw，L.，Jensen，K.，Lockridge，J.A.，Dickinson，B.，McSwiggen，J.A.，Vargeese，C，Bowman，K.，Shaffer，CS.andothers.ActivityofstabilizedshortinterferingRNAinamousemodelofhepatitisBvirusreplication.Hepatology41：1349-1356(2005).

Nicholson，R.I.，Gee，J.M.，Harper，M.E.EGFRandcancerprognosis.Eur.J.Cancer37：S9-S15(2001).

Nikaido，H.Preventionofdrugaccesstobacterialtargets：permeabilitybarriersandactiveefflux.Science264：382-388.(1994).

Okada，Y.，Wachi，M.，Hirata，A.，Suzuki，K.，Nagai，K.，Matsuhashi，M.CytoplasmicaxialfilamentsinEscherichiacolicells：possiblefunctioninthemechanismofchromosomesegregationandcelldivision.J.Bacteriol.176：917-922(1994).

Opalinska，J.B.andGewirtz，A.M.Nucleic-acidtherapeutics：basicprinciplesandrecentapplications.Nat.Rev.DrugDiscov.1：503-514(2002).

Osbourn，J.，Jermutus，L.，Duncan，A.Currentmethodsforthegenerationofhumanantibodiesforthetreatmentofautoimmunediseases.DrugDel.Tech.8：845-851(2003).

Pack，P.andPluckthun，A.Miniantibodies：useofamphipathichelicestoproducefunctional，flexiblylinkeddimericFvfragmentswithhighavidityinEscherichiacoli.Biochemistry31：1579-1584(1992).

Paddison，P.J.，A.Caudy，E.Bernstein，G.J.Harmon，D.C.ConklinShorthairpinRNAs(shRNAs)inducesequence-specificsilencinginmammaliancells.Genes&Development16：948-958(2002).

Perrotta，A.T.andBeen，M.D.CleavageofoligoribonucleotidesbyaribozymederivedfromthehepatitisdeltavirusRNAsequence.Biochem.31：16-21(1992).

Pikaar，J.C.，Voorhout，W.F.，vanGolde，L.M.，Verhoef，J.，VanStrijp，J.A.，vanIwaarden，J.F.OpsonicactivitiesofsurfactantproteinsAandDinphagocytosisofgram-negativebacteriabyalveolarmacrophages.J.Infect.Dis.172：481-489(1995).

Raper，S.E.，Chirmule，N.，Lee，F.S.，Wivel，N.A.，Bagg，A.，Gao，G.P.，Wilson，J.M.andBatshaw，M.L.Fatalsystemicinflammatoryresponsesyndromeinaornithinetranscarbamylasedeficientpatientfollowingadenoviralgenetransfer.Mol.Genet.Metab.80：148-158(2003).

Raskin，D.M.anddeBoer，P.A.MinDE-dependentpole-to-poleoscillationofdivisioninhibitorMinCinEscherichiacoli.J.Bacteriol.181：6419-6424(1999).

Reeve，J.N.andCornett，J.B.BacteriophageSPOl-inducedmacromolecularsynthesisinminicellsofBacillussubtilis.J.Virol.15：1308-1316(1975).

Ridgway，J.B.，Presta，L.G.，Carter，P.′Knobs-into-holes′engineeringofantibodyCH3domainsforheavychainheterodimerization.ProteinEng.9：617-621(1996).

Riechmann，L.，Clark，M.，Waldmann，H.，Winter，G.Reshapinghumanantibodiesfortherapy.Nature332：323-327(1988).

Riezman，H.Threeclathrin-dependentbuddingstepsandcellpolarity.TrendsinCellBiol..3：330-332(1993).

Rossi，J.J.，Elkins，D.，Zaia，J.A.Sullivan，S.Ribozymesasanti-HIV-1therapeuticagents：principles，applications，andproblems.AidsRes.HumanRetroviruses8：183-189(1992).

Salomon，D.S.，Brandt，R.，Ciardiello，F.，Normanno，N.Epidermalgrowthfactor-relatedpeptidesandtheirreceptorsinhumanmalignancies.Crit.Rev.Oncol.Hematol.19：183-232(1995).

Sandvig，K.andDeurs，B.Endocytosiswithoutclathrin.TrendsinCellBiol.4：275-277(1994).Sawin，K.E.andMitchison，T.J.Mutationsinthekinesin-likeproteinEg5disruptinglocalizationtothemitoticspindle.Proc.Natl.Acad.SciUSA92：4289-4293(1995).

Saville，BJ.andCollins，R.A.Asite-specificself-cleavagereactionperformedbyanovelRNAinNeurosporamitochondria.Cell61：685-696(1990).

Saville，B.J.andCollins，R.A.RNA-mediatedligationofself-cleavageproductsofaNeurosporamitochondrialplasmidtranscript.PNAS(USA)88：8826-8830(1991).

Sellers，W.R.andFisher，D.E.Apoptosisincancerdrugtargeting.J.Clin.Invest.104：1655-1661(1999).

Sheets，M.D.etal.Efficientconstructionofalargenonimmunephageantibodylibrary：theproductionofhigh-affinityhumansingle-chainantibodiestoproteinantigens.Proc.NatlAcad.SciUSA95：6157-6162(1998).

Singh，M.TransferrinAsAtargetingligandforliposomesandanticancerdrugs.Curr.Pharm.Des.5：443-451(1999).

Sioud，M.TherapeuticsiRNAs.TrendsPharmacol.Sci25：22-28(2004).

Speert，D.P.，Wright，S.D.，Silverstein，S.C，Mah，B.FunctionalcharacterizationofmacrophagereceptorsforIn-vitrophagocytosisofunopsonizedpseudomonas-aeruginosa.J.CHn.Invesst.82：872-879(1988).

Stewart，P.S.andD′Ari，R.GeneticandmorphologicalcharacterizationofanEscherichiacolichromosomesegregationmutant.J.Bacteriol.174：4513-4516(1992).

Stockert，R.J.Theasialoglycoproteinreceptor：relationshipsbetweenstructure，function，andexpression.Physiol.Rev.75：591-609(1995).

Strebhardt，K.，aridUllrich，A.TargetingPololikekinase1forcancertherapy.Nat.Rev.Cancer6：321-330(2006).

Sunetal.OverexpressionofBcl-2blocksTNF-relatedapoptosis-inducingligand(TRAIL)-inducedapoptosisinhumanlungcancercells.Biochem.Biophys.Res.Commun.，280：788(2001).

Tao，W.，South，V.J.，Zhang，Y.，Davide，J.P.，Farrell，L.，Kohl，N.E.，Sepp-Lorenzino，L.，Lobell，R.B.InductionofapoptosisbyaninhibitorofthemitotickinesinKSPrequiresbothactivationofthespindleassemblycheckpointandmitoticslippage.CancerCell8：49-59(2005).

Thurnher，M.，Wagner，E.，Clausen，H.，Mechtler，K.，Rusconi，S.，Dinter，A.，Birnstiel，M.L.，Berger，E.G.，Cotton，M.Carbohydratereceptor-mediatedgenetransfertohumanTleukaemiccells.Glycobiology4：429-435(1994).

Todorovska，A.etal.Designandapplicationofdiabodies，triabodiesandtetrabodiesforcancertargeting.J.Immunol.Methods248：47-66(2001).

Tomlinson，I.andHolliger，P.Methodsforgeneratingmultivalentandbispecificantibodyfragments.MethodsEnzymol.326：461-479(2000).vandeWeerdt，B.C，andMedema，R.H.Polo-likekinases：ateamincontrolofthedivision.CellCycle5：853-864(2006).

Vaughan，T.J.，Osbourn，J.K.，Tempest，P.R.Humanantibodiesbydesign.NatureBiotechnol.16：535-539(1998).

Verhoeyen，M.，Milstein，C，Winter，G.Reshapinghumanantibodies：graftinganantilysozymeactivity.Science239：1534-1536(1988).

Verma，I.M.andWeitzman，M.D.Genetherapy：twenty-firstcenturymedicine.Annu.Rev.Biochem.74：711-738(2005).

Vickers，T.A.，Koo，S.，Bennett，C.F.，Crooke，S.T.，Dean，N.M.，Baker，B.F.EfficientReductionofTargetRNAsbySmallInterferingRNAandRNaseH-dependentAntisenseAgents.ACOMPARATIVEANALYSISJBiol.Chem.278：7108-7118(2003).

Wachi，M.，Doi，M.，Okada，Y.，Matsuhashi，M.NewmregenesmreCandmreD，responsibleforformationoftherodshapeofEscherichiacolicells.JBacteriol.171：6511-6516(1989).

Wang，C.Y.，Cusack，J.C.Jr.，Liu，R.，Baldwin，A.S.Jr.Controlofinduciblechemoresistance：Enhancedanti-tumortherapythroughincreasedapoptosisbyinhibitionofNF-κB.Nat.Med.5：412-417(1999).

White，M.K.，andMcCubrey，J.A.Suppressionofapoptosis：roleincellgrowthandneoplasia.Leukemia15：1011-1021(2001).

Wright，S.D.，Detmers，P.A.，Jong，M.T.，Meyer，B.C.Interferon-gamadepressesbindingofligandbyc3bandc3bireceptorsonculturedhumanmonocytes，aneffectreversedbyfibronectin.J.Exp.Med.163：1245-1259(1986).

Wu，H.，Hait，W.N.，Yang，J.M.SmallinterferingRNA-inducedsuppressionofMDRl(P-glycoprotein)restoressensitivitytomultidrug-resistantcancercells.CancerRes.63：1515-1519(2003).

Yague，E.，Higgins，C.F.，Raguz，S.CompletereversalofmultidrugresistancebystableexpressionofsmallinterferingRNAstargetingMDRl.GeneTher.11：1170-1174(2004).

Zamore，P.D.，Tuschl，T.，Sharp，P.A.，Bartel，D.P.RNAi：double-strandedRNAdirectstheATP-dependentcleavageofmRNAat21to23nucleotideintervals.Cell101：25-33(2000).

Zamore，P.D.AncientpathwaysprogrammedbysmallRNAs.Science296：1265-1269(2002).

Ziady，A.G.，Perales，J.C.，Ferkol，T.，Gerken，T.，Beegen，H.，Perlmutter，D.H.，Davis，P.B.Genetransferintohepatomacelllinesviatheserpinenzymecomplexreceptor.Am.J.Physiol273：G545-G552(1997).

Claims (25)

1.一种组合物，所述组合物包括：

(a)多个完整的、源自细菌的无核形式的小细胞，其中所述多个完整的、源自细菌的小细胞中的每个小细胞包含调节性RNA，和

(b)用于小细胞的药学上可接受的载体，

其中：(1)所述小细胞不含用于所述调节性RNA的原位表达的构建体，(2)所述调节性RNA通过与所述小细胞在没有所述构建体的条件下共培养而被直接包裹进所述小细胞内，(3)所述调节性RNA选自：siRNA、miRNA和shRNA，并且(4)所述多个完整的、源自细菌的无核形式的小细胞含有治疗上有效量的所述调节性RNA。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述调节性RNA靶定编码介导抗药性、抗凋亡性或瘤生成的蛋白质的RNA转录体。

3.如权利要求1所述的组合物，其中，所述调节性RNA靶定P-糖蛋白、MDR-2或MDR-3的转录体。

4.如权利要求1所述的组合物，其中，所述调节性RNA靶定MRP2、BCR-ABL、介导STI-571耐药性的蛋白、肺耐药相关蛋白LRP、环氧酶-2、核因子κ、XRCC1、ERCC1、GSTP1、突变的β-微管蛋白或生长因子的转录体。

5.如权利要求1所述的组合物，其中，所述调节性RNA靶定Bcl-2、Bcl-XL、A1/Bfl1、黏着斑激酶或p53蛋白的转录体。

6.如权利要求1所述的组合物，其中，所述调节性RNA靶定β-联蛋白、PKC-α、C-RAF、K-Ras、DP97Dead框RNA解旋酶、cdk1、DNMT1、FLIP、C-Sfc、53BPI、聚梳家族蛋白EZH2、ErbB1、HPV-16E5和E7、Fortilin&MCI1P、KSP、DIP13α、MBD2、p21、KLF4、tpt/TCTP、SPK1&SPK2、P300、PLK1、Trp53、Ras、ErbB1、VEGF或BAG-1的转录体。

7.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含药物。

8.如权利要求7所述的组合物，其中，所述调节性RNA靶定编码介导对所述药物的耐药性的蛋白质的转录体。

9.如权利要求8所述的组合物，其中，所述药物被包裹在完整的、源自细菌的无核形式的小细胞内。

10.如权利要求9所述的组合物，其中，所述调节性RNA和所述药物被包裹在相同的小细胞内。

11.如权利要求1所述的组合物，其进一步包含双特异性配体。

12.如权利要求11所述的组合物，其中，所述双特异性配体包含携带对小细胞表面结构特异性的第一个臂和携带对非噬菌性哺乳动物细胞表面受体特异性的第二个臂。

13.如权利要求12所述的组合物，其中，所述哺乳动物细胞表面受体能够激活所述小细胞的受体介导的内吞作用。

14.如权利要求11所述的组合物，其中，所述双特异性配体包含抗体或抗体片段。

15.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物中每10⁹个小细胞含有约1个污染性亲代细菌细胞或者更少。

16.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物中每10¹⁰个小细胞含有约1个污染性亲代细菌细胞或者更少。

17.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物中每10¹¹个小细胞含有个小细胞含有约1个污染性亲代细菌细胞或者更少。

18.如权利要求1所述的组合物，其作为药剂使用。

19.如权利要求18所述的组合物，其中，所述调节性RNA是shRNA。

20.如权利要求18所述的组合物，其中，所述调节性RNA是siRNA。

21.如权利要求18所述的组合物，其用于抗药性、抗凋亡性或瘤生成的治疗。

22.如权利要求18至20中任一项所述的组合物，其中，所述药剂用于与药物结合使用，其中，所述调节性RNA靶定介导对所述药物的耐药性的蛋白质的转录体。

23.如权利要求22所述的组合物，其中，所述药物被包裹在完整的、源自细菌的无核形式的小细胞内。

24.如权利要求23所述的组合物，其中，所述调节性RNA和所述药物被包裹在相同的小细胞内。

25.一种配制如权利要求1至22中任一项所述的组合物的小细胞的方法，所述方法包括将多个完整的、源自细菌的无核形式的小细胞与无质粒的调节性RNA在盐缓冲液中共培育而将所述调节性RNA直接包裹进入完整的小细胞，其中，所述调节性RNA选自siRNA、miRNA和shRNA。