CN101712961A - 一种铁氢化酶基因及其编码的氨基酸序列和异源表达*** - Google Patents

一种铁氢化酶基因及其编码的氨基酸序列和异源表达*** Download PDF

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CN101712961A CN200910073445A CN200910073445A CN101712961A CN 101712961 A CN101712961 A CN 101712961A CN 200910073445 A CN200910073445 A CN 200910073445A CN 200910073445 A CN200910073445 A CN 200910073445A CN 101712961 A CN101712961 A CN 101712961A
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Abstract

一种铁氢化酶基因及其编码的氨基酸序列和异源表达***，它涉及一种氢化酶基因及其编码的氨基酸序列和异源表达***。本发明铁氢化酶基因序列如SEQ ID NO：1所示。本发明铁氢化酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。铁氢化酶基因异源表达***按以下步骤构建：一、提取总DNA；二、PCR扩增；三、酶切；四、酶切载体；五、连接；六、转化感受态细胞；七、重组子重组质粒转化入感受态细胞。本发明铁氢化酶基因无需基因改造可直接与原核表达载体pET28a构建异源表达***，含重组子pET28a-hydA的E.coliBL21菌液经IPTG诱导，经SDS-PAGE检测能表达分子量为63KD左右的一条外源蛋白，培养24小时后产生可明显检测的H2。

Description

一种铁氢化酶基因及其编码的氨基酸序列和异源表达***
技术领域
本发明涉及一种氢化酶基因及其编码的氨基酸序列和异源表达***。
背景技术
微生物所产生的分子H2是通过氢化酶将微生物体内代谢产生的H+与电子结合释放到体外。
Figure G2009100734451D00011
自从1931年Stephenson和Stickland第一次在大肠杆菌中发现了氢化酶，越来越多的研究关注于此。特别是最近20～30年，随着矿产能源的不断枯竭和价格飚升，生物制氢技术以其清洁环保、可持续性和对传统能源的可替代性又再度掀起热潮，氢化酶作为代谢氢的关键酶也再度成为关注热点。氢化酶(Hydrogenase，H2ase)是氢代谢中的关键酶，根据氢化酶中金属离子组成可将其分为3种：Ni-Fe氢化酶、Fe氢化酶和不含金属离子的氢化酶。它作为氢代谢的末端酶可逆性催化分子氢氧化，在微生物能量和产氢代谢中起着重要的作用。
目前可用于生物工程的氢化酶基因资源较少，而且都存在异源表达缺陷，所以实际工业化生产中需要对氢化酶基因进行密码子偏爱性改造，导致技术要求高、生产成本提升。
发明内容
本发明为了解决目前可用于生物工程的氢化酶基因资源少、都存在异源表达缺陷，需要进行密码子偏爱性改造，技术要求、生产成本高的问题；而提供了一种铁氢化酶基因及其编码的氨基酸序列和异源表达***，为实现大规模高效生物产氢提供了物质基础。
本发明铁氢化酶基因序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的铁氢化酶基因开放阅读框全长为1743bp，其中A、C、G、T分别为344(19.74％)、518(29.72％)、570(32.70％)、311(17.84％)。起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。
本发明铁氢化酶基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明铁氢化酶基因编码的氨基酸有580个氨基酸残基，分子量为63.19KD，理论等电点pI为5.33，理论疏水性为-0.157。
铁氢化酶基因异源表达***按以下步骤构建：
一、提取哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3(Ethanoligenens harbinense YUAN-3)基因组总DNA；
二、以哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3基因组总DNA为模板进行PCR扩增，正向引物为hydA-HEF：5′-CGGGAGGTCTGACATATGGTAAACGTGA-3′，反向引物为hydA-HER：5′-GGTGTGTCCGTTTTGGAATTCTTTTTTCGCGG-3′；PCR反应条件：95℃预变性5min，然后35个循环的降落PCR，95℃变性35s、退火温度由68℃开始、每个循环退火温度降低0.1℃、每个循环退火35s、72℃延伸90s，最后72℃延伸
Figure G2009100734451D00021
三、步骤二扩增得到的片段用Nde I和EcoR I双酶切，酶切体系为50μl由5μl10×H Buffer、2μl限制性内切酶Nde I、2μl限制性内切酶EcoR I、30μl PCR扩增产物和余量的ddH2O组成，37℃恒温酶切3h，并用酶切产物胶回收；
四、原核表达载体pET 28a用Nde I和EcoR I双酶切，酶切体系为50μl由5μl10×H Buffer、2μl限制性内切酶Nde I、2μl限制性内切酶EcoR I、30μl原核表达载体pET 28a和余量的ddH2O组成，37℃恒温酶切3h，并用酶切产物胶回收；
五、将步骤三酶切的***DNA片段与步骤四酶切的载体片段用T4DNA连接酶连接，酶连体系为20μl由2μl 10×Buffer、1μl T4DNA连接酶、1μl载体片段、5μl***DNA片段和余量的ddH2O组成，16℃过夜连接；
六、将步骤五获得的连接产物42℃热击转化入E.Coli DH5α感受态细胞，然后在含有卡那霉素的LB筛选平板上进行筛选，挑取白色菌落进行菌落PCR鉴定阳性重组子；
七、抽提阳性重组子重组质粒42℃热击转化入E.Coli BL21感受态细胞，经菌落PCR鉴定，重组子为pET28a-hydA，即获得铁氢化酶基因异源表达***。
本发明铁氢化酶基因无需基因改造可直接与原核表达载体pET 28a构建异源表达***，含重组子pET28a-hydA的E.coli BL21菌液经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导6小时后，抽提蛋白经SDS-PAGE电泳检测获得目标蛋白条带，并使用Western-Blot方法鉴定条带确实为目标外源蛋白(分子量约为63KD)，然后对诱导后抽提的蛋白进行收集纯化，再经复性后采用还原甲基紫晶检测释放氢气的方法对该氢化酶蛋白进行活性分析，明显检测得到H2产生。不能释放氢气的大肠杆菌E.coli BL21当被转入重组子后，37℃震荡培养24小时加入IPTG诱导后可明显检测到H2产生；并经检测确定本发明铁氢化酶活性为515μM H2/μg protein，证明本发明铁氢化酶基因异源表达成功。
附图说明
图1是具体实施方式二中铁氢化酶蛋白质三级结构预测模拟图。图2是具体实施方式二中铁氢化酶蛋白质三级结构预测模拟图。图3是具体实施方式三中原核表达载体pET 28a的结构图谱。图4是具体实施方式三中原核表达载体pET 28a的克隆表达区结构图。图5是具体实施方式三中铁氢化酶重组蛋白在不同诱导时间下的SDS-PAGE电泳图，图5中“M”泳道标样为Marker，“1”泳道标样为未经诱导的菌体蛋白，“2”泳道标样为经1小时诱导的菌体蛋白，“3”泳道标样为经2小时诱导的菌体蛋白，“4”泳道标样为经3小时诱导的菌体蛋白，“5”泳道标样为经4小时诱导的菌体蛋白，“6”泳道标样为经5小时诱导的菌体蛋白，“7”泳道标样为经6小时诱导的菌体蛋白。图6是具体实施方式三中铁氢化酶Western-blot电泳图。图7是具体实施方式三中对铁氢化酶超量表达蛋白纯化图，图6中“1”泳道标样为纯化后的蛋白，“2”泳道标样为空白，“3”泳道标样为蛋白分子量Marker，“4”泳道标样为空白，“5”泳道标样为诱导5小时的菌体蛋白，“6”泳道标样为未经诱导的菌体蛋白。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式铁氢化酶基因序列如下：
ATGGTAAACGTGACGATCAACGGCACCCCCGTGCAGGCGGGCGAAGAC
ACCACCATTCTGGAAGCGGCGGCTTCGGCGGGCATTCATATCCCCACGCT
CTGCTACCTGAAGGGCCTCAATGAGATCGGCGCCTGCCGGGTTTGCCTG
GTGGAGATTGAGGGCATTGAGAAGTTGGTGACGGCCTGCGGCAACAAG
GTGGCGGAAGGCATGGTCATTTCCACCAACAGCCCGCGCGTGCGCGAGG
CACGGCGCACCAATGTGGAGCTCATCCTCTCGCAGCACGACTGTTATTGC
GCCAGTTGCGCGCGCAGCGGCAACTGCAACCTTCAGTCGCTTTCCAACG
ACCTCGGTATTCTCGATCTGCCCTACCGGCGGGAAATGCCGGTCTCTGAA
TGGAACAAGTCGTTTCCGCTCATCCGCGATTTTTCCAAGTGCATCAAGTG
CATGCGTTGCGTGCAGGTTTGTGACAAGATCCAGGATATGAACATCTGGG
ACATTGCCAACACCGGCTCGCGCACCACGGTGGACGTGTCGCAGAACCG
CAAAATGGAGGAATCGGACTGTACGCTCTGCGGCCAGTGCATCACGCAC
TGCCCGGTGGGCGCGCTGCGCGAGCGGGACGACACCGACAAGGCGTTT
GCCGCGCTGGCCGATCCGGATACGATCACCGTGGTGCAGATCGCGCCCG
CCGTGCGCGCCGCGTGGGGCGAATCACTTGGTCTGCCGCGGGAGCAGGC
GACCGCCAAACGGCTGGTGGCCGCGCTGCGCAAGATCGGGTTCCGTTAT
ATCTTCGACACTACGTTCAGCGCCGATCTCACCATCATGGAGGAGGGAA
GTGAGTTCCTCGCAAAGCTCCGGAACCGGGAAAACGAAACGTTCCCCAT
GTTCACTTCCTGCTGTCCCGGTTGGGTGCGCTTTCTGAAATCGCAGTATC
CGGACATGGTGCGCCAGCTTTCCACTGCGAAATCACCGCAGCAGATGTT
CGGCGCCATCACGAAAAGCTATTATGCCAAGCTGTTGGATGTGGAGCCG
GAACGCATCTGCTCCATTTCCGTCATGCCGTGCCTGGCTAAAAAACAGG
AAGCCGCCTTGCCCACCATGGACACAGCGGGAGCGGGGCCGGATGTGG
ACATCGTGCTCACGACGCGGGAGATCGACCGCATGATCCGCGCGGAGGA
TATCCACCCGGGGGAGCTGCCGGAGGAGGAGTTCGACCAGCCGCTTGGC
GTGGGCAGCGGCGCGGGCGTGATTTTCGGCGCCACGGGCGGCGTGATGG
AAGCGGCCCTGCGCTCGGCCTACTATCTGGTCACCGGAAAAAATCCGGA
GCCCGACGCGTTTGGAAACGTGCGGGGAATGGACGGCTGGAAGGAAGC
GGCCATCGACATCGCGGGCACCACGGTGCGTGTAGCGGTGGCCAGTGGT
CTGGGCAACGCCCGTCGGCTGGTGGAAGCCTTGCGCAAAGGCGATGTGC
AGTACGATTTCGTGGAGATCATGGCCTGCCCCGGCGGCTGCTCAGGCGG
CGGGGGGCAGCCCATCGCCGAGGGCGAGGAGCGGGCGGGCGTCCGCGC
GGAGACCCTCTACGGGCTGGATAATATCAGCGCGCTGCGGTTTTCACATG
AAAACCCGTCCATCGTGCAGGTGTACCGTGACTATCTGGACAAACCGCT
CTCGCATCGCGCACATGAGCTGCTCCATACGGCGCATGACGCCTGGGAA
ATGCCCGGCGCCGCCGCGAAAAAATAA。
本实施方式铁氢化酶基因按以下步骤获得：
1、铁氢化酶基因的克隆：
(1)提取哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3(Ethanoligenens harbinenseYUAN-3)的基因组总DNA：
取哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3(Ethanoligenens harbinense YUAN-3)菌液5mL，用上海华舜生物工程有限公司生产的华舜小量细菌基因组DNA抽提试剂盒提取Ethanoligenens harbinense YUAN-3基因组总DNA；
(2)铁氢化酶基因保守区域PCR扩增：
用氢化酶兼并引物hydF1和hydR进行PCR扩增，正向引物为hydF1：5’-GCCGACCTKACMATMATGGA-3’，反向引物为hydR1：5’-ATRCARCCRCCSGGRCAGGCCAT-3’；PCR扩增反应中退火温度为50～55℃，扩增循环数为30～35；PCR扩增的反应体系如表1所示：
表1
  10×PCR Buffer(Mg2+)   5μL
  dNTPs(10mmol/L)   2μL
  正向引物(10μmol/L)   1μL
  反向引物(10μmol/L)   1μL
  Taq E(2.5U/μL)   0.2μL
  Ethanoligenens harbinense YUAN-3基因组总DNA(50μg/L)   2μL
  补足dH2O   至50μL
(3)PCR产物的克隆：
PCR产物用上海华舜生物工程有限公司生产的柱式小量胶回收试剂盒进行回收，回收产物与pMD19-T克隆载体在16℃连接过夜，连接体系为10μl：pMD19-T载体1μl(50ng)、PCR纯化产物2μl(100～200ng)、Solution I 5μl、加ddH2O至10μl；连接产物转化入E.Coli DH5α感受态细胞中，在含有氨苄青霉素、IPTG和X-gal的LB筛选平板上进行蓝白斑筛选，并挑取白色菌落进行菌落PCR以鉴定阳性重组子；
其中：A、采用CaCl2法制备E.Coli DH5α感受态细胞：
1)E.Coli DH5α在LB平板上划线培养16h，挑取单菌落接入LB液体培养基中，37℃震荡过夜培养；
2)取过夜活化的E.Coli DH5α菌液1ml置于100ml新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600值约为0.3；
3)将菌液分装于两个预冷的50ml无菌离心管中，冰浴30min；
4)4℃、4000r/min、离心10min，弃上清；
5)加入10ml冰冷的0.1M CaCl2，重悬菌液，冰浴30min；
6)4℃、4000r/min、离心10min，弃上清；
7)加入2ml冰冷的0.1M CaCl2，重悬菌液；
B、热击法转化E.Coli DH5α感受态细胞：
1)取200μl感受态细胞，置于冰上，加入10μl连接产物，轻轻旋转混匀内容物；
2)冰浴30min；
3)42℃水浴中热击90s，勿摇动；
4)冰浴3min；
5)加入无抗生素的LB液体培养基补足1ml，混匀，37℃200～250r/min摇床振荡培养3小时；
6)取100μl菌液涂布在加有50mg/L Amp、20μl IPTG和40μl X-gal的LB培养基上；
7)待菌液被培养基吸收后，倒置平板37℃培养过夜；
C、阳性重组子的筛选及鉴定：
1)蓝白斑反应筛选阳性重组子：根据α-互补反应原理，在加有X-gal和IPTG的筛选培养基上产生的白色菌落为带有重组质粒的菌落，蓝色菌落为带有重新环化载体的菌落，因此白色菌落可初步鉴定为阳性重组子；
2)阳性重组子的菌落PCR鉴定：挑取白斑菌落，利用通用引物RV-M(5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’)和M13-47(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)进行PCR，PCR条件为95℃预变性10min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸90s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存；进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，若电泳显示出与目标DNA(700bp)大小的条带，则证明质粒重组正确，是阳性重组子。
本实施方式中采用的pMD19-T是一种常用的克隆载体，大小为2692bp，具有Amp抗性基因，带有一段大肠杆菌lacZ的调控序列和N-端146个氨基酸的编码信息，此编码区***了多克隆位点，若无外源基因***，载体会与大肠杆菌lacZ的C-端序列功能互补，即α互补，产生有完整活性的β-半乳糖苷酶；若有外源基因***，则破坏了其读码框，产生无α互补能力的肽段，因此，在加有X-gal和IPTG的筛选培养基上白色菌落为带有重组质粒的细菌，蓝色菌落为带有重新环化载体的细菌。
(4)DNA序列测定与分析：
阳性重组子选用Jinsite金思特科技(南京)有限公司自动序列分析仪进行序列测定，序列同源性比较在http://www.ncbi.nlm.gov网站上用BLAST程序进行；
(5)克隆铁氢化酶基因部分片段两侧序列Cassette PCR的引物设计：
采用TaKaRa LA PCRTM in vitro Cloning Kit试剂盒克隆铁氢化酶基因片段两侧序列；以已经克隆得到的基因片段序列为基础，设计与试剂盒中Cassetteprimer C1和Cassette primer C2引物分别匹配的上游引物hydA-FS1、hydA-FS2和下游引物hydA-RS1、hydA-RS2具体序列见表2：
表2扩增铁氢化酶基因部分片段两侧序列的Cassette PCR引物
  引物名称   引物序列
  Cassette primer C1   5’-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA-3’
  Cassette primer C2   5’-CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3’
  hydA-FS1   5’-TCCATTTCCGTCATGCCGTGCCTGGCTAAA-3’
  hydA-FS2   5’-AAAGCTATTATGCCAAGCTGTTGGATGTGGA-3’
  hydA-RS1   5’-GCTTCCTTCCAGCCGTCCATTCCCCGCAC-3’
  hydA-RS2   5’-GATCTCCACGAAATCGTACTGCACATCGCCTTT-3’
采用Cassette PCR原理设计引物，由于Cassette的5’末端没有磷酸基，所以Target DNA的3’末端和Cassette的5’末端的连接部位形成缺口；在第一次PCR反应的第一个循环时，从Primer C1开始的延伸反应在连接部位终止，限制了Primer C1和Primer C1同一引物之间的扩增，从而控制了非特异性PCR扩增；只有从Primer FS1或Primer RS1开始延伸合成的DNA链才能成为PrimerC1的模板，进行DNA的特异性扩增反应；再用内侧Primer(Primer C2，PrimerFS2或RS2)进行第二次PCR反应。
本实施方式可高效特异性地扩增目的DNA。
(6)克隆铁氢化酶基因部分片段两侧序列的Cassette PCR扩增：
具体过程如下：铁氢化酶下游序列的扩增：选用EcoR I限制性内切酶酶切YUAN-3基因组DNA，酶切后的基因组DNA和EcoR I接头16℃连接3h；铁氢化酶上游序列的扩增：选用Pst I酶切YUAN-3基因组DNA，酶切后的基因组DNA与Pst I接头于16℃连接3h；Cassette PCR反应体系和反应条件如下：
A、DNA的限制酶酶切反应：反应体系见表3。
表3
  基因组DNA   5μg
  EcoR I限制酶   40U
  10×限制酶Buffer   5μl
  灭菌蒸馏水   up to 50μl
B、连接反应：
①按照下列组分配置连接反应液(表4)
表4
  EcoR I酶切基因组DNA片段   5μl
  EcoR I Cassette接头   2.5μl
  Ligation Solution I   15μl
  Ligation Solution II   7.5μl
②16℃反应3h；
③反应结束后，进行乙醇沉淀回收DNA；
④溶解于5μl的灭菌蒸馏水中；
C、PCR扩增：
①将(6)B-④DNA溶液1μl加入到33.5μl灭菌蒸馏水中，94℃加热10分钟；
②按下列组分配制第一次(1st)PCR反应液(表5)。
表5
  C-①的DNA溶液   34.5μl
  10×LA PCR Buffer II(Mg2+plus)   5μl
  TaKaRa LA Taq   0.5μl
  dNTP Mixture   8μl
  Primer C1   1μl
  Primer FS1或RS1   1μl
③按以下条件进行1st PCR反应：
94℃30s，55℃2min，72℃1min，共30个循环；
④用灭菌水将(6)B-③的PCR反应液稀释(稀释1～10000倍)，再取1μl进行(第二次)2nd PCR反应，2nd PCR反应液组分如表6：
表6
  B-④的1st PCR反应稀释液   1μl
  10×LA PCR Buffer II(Mg2+plus)   5μl
  TaKaRa LA Taq   0.5μl
  B-④的1st PCR反应稀释液   1μl
  dNTP Mixture   8μl
  Primer C2   1μl
  Primer FS2或RS2   1μl
  灭菌蒸馏水   up to 50μl
⑤按以下条件进行2nd PCR反应：
94℃30s，55℃2min，72℃1min，共30个循环；
⑥反应结束后，取PCR反应液(5～10μl)进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收可以得到扩增到得PCR片段。
本实施方式步骤(6)用铁氢化酶基因序列中不含有的限制性内切酶，而TaKaRa LA PCRTM in vitro Cloning Kit试剂盒中有该酶接头的限制性内切酶进行酶切。
(7)铁氢化酶基因全长的PCR扩增、克隆和测序：
根据已经拼接的序列设计了全长验证引物hydA-F(5’-TCAAAGGCGGGAGGTCTGAAAGATGGTAAACGT-3’)、hydA-R(5’-CGGTGTGTCCGTTTTGTATTTATTTTTTCGCG-3’)，以Ethanoligenensharbinense YUAN-3基因组总DNA为模板扩增全长铁氢化酶基因，PCR反应体系为94℃5min，94℃30s、63℃30s(每个循环退火温度降落0.2℃)、72℃90sec，共35个循环，72℃延伸10min。
本实施方式中所用到的哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3(Ethanoligenensharbinense YUAN-3)已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No.1152；并且在我国2005年6月8日公开的发明专利(公开号CN 1624109A)“自絮凝产氢细菌及其筛选方法”中公布。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂盒使用操作手册。
本实施方式铁氢化酶基因开放阅读框全长1743bp(开放阅读框编码580个氨基酸残基)，其中A、C、G、T分别为344(19.74％)，518(29.72％)，570(32.70％)，311(17.84％)。起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。
具体实施方式二：具体实施方式一中铁氢化酶基因编码的氨基酸序列如下：
MVNVTINGTPVQAGEDTTILEAAASAGIHIPTLCYLKGLNEIGACRVCLVEIE
GIEKLVTACGNKVAEGMVISTNSPRVREARRTNVELILSQHDCYCASCARSG
NCNLQSLSNDLGILDLPYRREMPVSEWNKSFPLIRDFSKCIKCMRCVQVCD
KIQDMNIWDIANTGSRTTVDVSQNRKMEESDCTLCGQCITHCPVGALRERD
DTDKAFAALADPDTITVVQIAPAVRAAWGESLGLPREQATAKRLVAALRKIG
FRYIFDTTFSADLTIMEEGSEFLAKLRNRENETFPMFTSCCPGWVRFLKSQY
PDMVRQLSTAKSPQQMFGAITKSYYAKLLDVEPERICSISVMPCLAKKQEA
ALPTMDTAGAGPDVDIVLTTREIDRMIRAEDIHPGELPEEEFDQPLGVGSGA
GVIFGATGGVMEAALRSAYYLVTGKNPEPDAFGNVRGMDGWKEAAIDIAG
TTVRVAVASGLGNARRLVEALRKGDVQYDFVEIMACPGGCSGGGGQPIAEG
EERAGVRAETLYGLDNISALRFSHENPSIVQVYRDYLDKPLSHRAHELLHTA
HDAWEMPGAAAKK。
生物信息学软件模拟分析：
对铁氢化酶氨基酸序列的分析使用了ExPASy(Expert Protein AnalysisSystem)在线分析软件。二级结构分析使用在线软件PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/psiform.html)和Swiss model。3D结构预测使用在线结构预测软件：ESyPred3D Web Server(http://www.fundp.ac.be/sciences/biologie/urbm/bioinfo/esypred/)。通过在线软件预测二级结构和三级结构发现，其含有H-Bond为256个，α-Helices为21个，β-Stand为14个，Turn为41个。本实施方式铁氢化酶蛋白质三级结构如图1和图2所示。
通过GenBank氨基酸序列比对分析，表明与已经注册的氢化酶同源性最高的菌株是Clostridium botulinum E3 str.Alaska E43(YP 001921030.1)，相似性为82％，同源性66％；第二位的是Oribacterium sinus F0268(ZP 03990781.1)，相似性为77％，同源性62％，证明是一个新的氢化酶基因。
具体实施方式三：本实施方式铁氢化酶基因异源表达***按以下步骤构建：
一、提取哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3(Ethanoligenens harbinense YUAN-3)基因组总DNA；
二、以哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3基因组总DNA为模板进行PCR扩增，正向引物为hydA-HEF：5′-CGGGAGGTCTGACATATGGTAAACGTGA-3′，反向引物为hydA-HER：5′-GGTGTGTCCGTTTTGGAATTCTTTTTTCGCGG-3′；下划线部分为设计的酶切位点(CATATG为Nde I酶切位点，GAATTC为EcoRI酶切)；PCR反应条件：95℃预变性5min，然后35个循环的降落PCR，95℃变性35s、退火温度由68℃开始、每个循环退火温度降低0.1℃、每个循环退火35s、72℃延伸90s，最后72℃延伸10min；
三、步骤二扩增得到的片段用Nde I和EcoR I双酶切，酶切体系为50μl由5μl 10×H Buffer、2μl限制性内切酶Nde I、2μl限制性内切酶EcoR I、30μl PCR扩增产物和余量的ddH2O组成，37℃恒温酶切3h，并用酶切产物胶回收；
四、原核表达载体pET 28a用Nde I和EcoR I双酶切，酶切体系为50μl由5μl 10×H Buffer、2μl限制性内切酶Nde I、2μl限制性内切酶EcoR I、30μl原核表达载体pET 28a和余量的ddH2O组成，37℃恒温酶切3h，并用酶切产物胶回收；
五、将步骤三酶切的***DNA片段与步骤四酶切的载体片段用T4DNA连接酶连接，酶连体系为20μl由2μl 10×Buffer、1μl T4 DNA连接酶、1μl载体片段、5μl***DNA片段和余量的ddH2O组成，16℃过夜连接；
六、将步骤五获得的连接产物42℃热击转化入E.Coli DH5α感受态细胞，然后在含有卡那霉素的LB筛选平板上进行筛选，挑取白色菌落进行菌落PCR鉴定阳性重组子；
七、抽提阳性重组子重组质粒42℃热击转化入E.Coli BL21感受态细胞，经菌落PCR鉴定，重组子为pET28a-hydA，即获得铁氢化酶基因异源表达***。
原核表达载体pET 28a购自于Novagene公司，原核表达载体pET 28a的结构图谱如图3所示，原核表达载体pET 28a的克隆表达区结构图如图4所示。本实施方式使用限制性内切酶Nde I和EcoR I对其上的对应酶切位点进行酶切，将环状质粒酶切为线性。本实施方式中酶切体系与***片段相同。
本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均容易购得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。本实施方式中的操作步骤参见试剂盒使用操作手册。
将本实施方式获得的铁氢化酶基因异源表达***(含重组子pET28a-hydA的E.Coli BL21)按1∶100稀释加入到200ml含卡那霉素50μg/ml的LB液体培养基中，振荡培养3小时，其OD600值约为0.6，然后加入IPTG至终浓度为100μg/ml，并诱导培养6小时。分别取未诱导的样品、诱导1小时至6小时的重组表达菌样品。离心收集菌体，超声波破碎菌体，加入上样缓冲液(50mMTris-HCl(pH6.8)，2％SDS，0.1％BPB，10％甘油，1％β-巯基乙醇)，热处理变性，使用12％的SDS-PAGE垂直板电泳分析不同时间融合蛋白的表达量，检测结果如图5所示。从图5中可以看出，诱导1h、2h、3h、4h、5h的重组表达菌样品较未经诱导的E.coli BL21菌株的总蛋白中均出现一个很明显的诱导蛋白条带，蛋白分子量大概在63KDa左右。还可以看出融合蛋白的表达量随着诱导时间的增加而增加，在IPTG诱导6小时左右，表达量达到最大值。
Western-Blotting蛋白特异性印迹检测(采用半干式转移)：
①凝胶处理
电泳结束后切割胶条，再用转膜缓冲液(SDS 0.037％，甘氨酸39mM，甲醇20％(v/v)，Tris 48mM)平衡，5min×3次；
②膜处理
预先裁好与胶条同样大小的PVDF膜置于甲醇中浸泡15min，然后将膜、裁好的滤纸条浸入转膜缓冲液中15min；
③转膜
转膜装置从下至上依次按阳极板、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、阴极板的顺序放好，滤纸、凝胶、PVDF膜精确对齐，每一步去除气泡。接通电源，恒定电流为1mA/cm2，转移1.5h；转膜结束后，断开电源将膜取出，取待测膜条做免疫印迹；
④免疫前处理
转移后的PVDF膜去离子水清洗一次，加入10ml的封闭液缓冲液(BSA 5％(V/V)，Tween20 0.05％(V/V)，Tris-HCl(pH8.0)20mM，NaCl 150mM)室温缓慢摇动30min；然后加入10ml的洗膜缓冲液(Tween20 0.05％(V/V)，Tris-HCl(pH8.0)20mM，NaCl 150mM)清洗PVDF膜，5min×3次；
⑤免疫反应
加入10ml的封闭液，把1μl的一抗His-Taq Mab加入其中，振荡1h，使一抗与目的蛋白的组氨酸标签发生免疫反应结合；再加入10ml的洗膜缓冲液清洗，5min×3次；然后加入10ml的封闭液，把2μl的二抗Anti-Mouse IgG加入其中，振荡1h使二抗与一抗充分结合；之后加入10ml的洗膜缓冲液清洗，5min×3次；
⑥显色
超纯水清洗膜一次，然后取超纯水5ml加入BCIP/NBT(1ml～1.5ml)，轻摇(避光)，逐渐显色，显色后PVDF膜用超纯水洗2次，自然晾干(避光)，扫描结果如图6所示。
超量表达蛋白的收集及包涵体溶解：
将本实施方式获得的铁氢化酶基因异源表达***(含重组子pET28a-hydA的E.coli BL21)按1∶100稀释加入到200ml含卡那霉素50μg/ml的LB液体培养基中，振荡培养3小时，其OD600值约为0.6，然后加入IPTG至终浓度为100μg/ml，并诱导培养6小时。12000r/min离心收集菌体，按照1∶10的比例加入PBS液体，在冰浴中超声波破碎菌体，加入包涵体溶解液(Bio-Dev公司)在4℃中过夜孵化；12小时后，20000r/min离心，上清液为包涵体溶解液。
本实施方式铁氢化酶蛋白纯化：
由于在原核表达载体pET28a的C端我们保留了His-Tag标签，因此在细菌中表达的融合蛋白C端含有连续6个组氨酸标签。利用金属Ni2+与His-Tag标签螯合的原理，采用申能***NTA-Ni树脂纯化试剂盒纯化融合蛋白。蛋白包涵体溶解在不同浓度的NTA洗脱液中的分布是不相同的，分别选用20mM，100mM和200mM，1000mM咪唑浓度的洗脱缓冲液冲洗NTA-Ni柱，收集的样品进行SDS-PAGE电泳(分析结果如图7所示)。结果表明，目的蛋白是在100mM咪唑洗脱缓冲液冲浓度下被大量洗脱下来的，经透析袋透析纯化得到浓度较高的纯化蛋白。
纯化蛋白的活性分析：
纯化后的蛋白使用蛋白复性液(Bio-Dev公司)在4℃厌氧条件进行蛋白复性。对复性后的蛋白溶解液使用Bradford试剂盒(Tiangen公司)进行浓度检测。铁氢化酶蛋白活性分析使用还原甲基紫晶的方法：在15ml的厌氧小管中，在pH 7.5条件下50μM Hepes中加入50μM甲基紫晶，N2吹脱5分钟，加入75μM的亚硫代硫酸钠。加入1ml的铁氢化酶蛋白(1383.97μg/ml)室温反应5分钟后使用气相色谱质谱联用仪检测氢气产量，氢气产量为11.5ml。
氢化酶活性单位定义为：每分钟释放单位氢气所需的酶的单位。微量的活性分析定义为每分钟释放每mmolH2所需的mg蛋白。
重组质粒在E.coli BL-21活体中的活性分析
将阳性克隆的E.coli BL-21菌转接到厌氧的LB培养基中，37℃、摇床震荡培养24小时，取500μl气体用气相色谱检测；并使用不含重组质粒的E.coliBL-21菌作为空白对照。结果发现，含有重组质粒的阳性克隆在培养24小时后产生了可以明显检测的H2，而在空白对照中检测不到；经检测确定本实施方式铁氢化酶的活性为515μM H2/μg protein。
由于E.Coli BL21感受态细胞转化效率相对较低，本实施方式采用两步法进行转化，虽然时间较长，但可以大大提高转化效率(98％以上)，降低成本。经本实施方式构建的表达载体，在大肠杆菌中实现异源表达，超量表达的氢化酶蛋白经纯化和复性后可以释放氢气，并且含有阳性克隆子的大肠杆菌可以直接释放出氢气。
序列表
<110>哈尔滨工业大学
<120>一种铁氢化酶基因及其编码的氨基酸序列和异源表达***
<160>16
<210>1
<211>1743
<212>DNA
<213>产氢细菌(Ethanoligenens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1743)
<400>1
ATG GTA AAC GTG ACG ATC AAC GGC ACC CCC GTG CAG GCG GGC GAA GAC 48
Met Val Asn Val Thr Ile Asn Gly Thr Pro Val Gln Ala Gly Glu Asp
1               5                   10                  15
ACC ACC ATT CTG GAA GCG GCG GCT TCG GCG GGC ATT CAT ATC CCC ACG 96
Thr Thr Ile Leu Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ile His Ile Pro Thr
            20                  25                  30
CTC TGC TAC CTG AAG GGC CTC AAT GAG ATC GGC GCC TGC CGG GTT TGC 144
Leu Cys Tyr Leu Lys Gly Leu Asn Glu Ile Gly Ala Cys Arg Val Cys
        35                  40                  45
CTG GTG GAG ATT GAG GGC ATT GAG AAG TTG GTG ACG GCC TGC GGC AAC 192
Leu Val Glu Ile Glu Gly Ile Glu Lys Leu Val Thr Ala Cys Gly Asn
    50                  55                  60
AAG GTG GCG GAA GGC ATG GTC ATT TCC ACC AAC AGC CCG CGC GTG CGC 240
Lys Val Ala Glu Gly Met Val Ile Ser Thr Asn Ser Pro Arg Val Arg
65                  70                  75                  80
GAG GCA CGG CGC ACC AAT GTG GAG CTC ATC CTC TCG CAG CAC GAC TGT 288
Glu Ala Arg Arg Thr Asn Val Glu Leu Ile Leu Ser Gln His Asp Cys
                85                  90                  95
TAT TGC GCC AGT TGC GCG CGC AGC GGC AAC TGC AAC CTT CAG TCG CTT 336
Tyr Cys Ala Ser Cys Ala Arg Ser Gly Asn Cys Asn Leu Gln Ser Leu
            100                 105                 110
TCC AAC GAC CTC GGT ATT CTC GAT CTG CCC TAC CGG CGG GAA ATG CCG 384
Ser Asn Asp Leu Gly Ile Leu Asp Leu Pro Tyr Arg Arg Glu Met Pro
        115                 120                 125
GTC TCT GAA TGG AAC AAG TCG TTT CCG CTC ATC CGC GAT TTT TCC AAG 432
Val Ser Glu Trp Asn Lys Ser Phe Pro Leu Ile Arg Asp Phe Ser Lys
    130                 135                 140
TGC ATC AAG TGC ATG CGT TGC GTG CAG GTT TGT GAC AAG ATC CAG GAT 480
Cys Ile Lys Cys Met Arg Cys Val Gln Val Cys Asp Lys Ile Gln Asp
145                 150                 155                 160
ATG AAC ATC TGG GAC ATT GCC AAC ACC GGC TCG CGC ACC ACG GTG GAC 528
Met Asn Ile Trp Asp Ile Ala Asn Thr Gly Ser Arg Thr Thr Val Asp
                165                 170                 175
GTG TCG CAG AAC CGC AAA ATG GAG GAA TCG GAC TGT ACG CTC TGC GGC 576
Val Ser Gln Asn Arg Lys Met Glu Glu Ser Asp Cys Thr Leu Cys Gly
            180                 185                 190
CAG TGC ATC ACG CAC TGC CCG GTG GGC GCG CTG CGC GAG CGG GAC GAC 624
Gln Cys Ile Thr His Cys Pro Val Gly Ala Leu Arg Glu Arg Asp Asp
        195                 200                 205
ACC GAC AAG GCG TTT GCC GCG CTG GCC GAT CCG GAT ACG ATC ACC GTG 672
Thr Asp Lys Ala Phe Ala Ala Leu Ala Asp Pro Asp Thr Ile Thr Val
    210                 215                 220
GTG CAG ATC GCG CCC GCC GTG CGC GCC GCG TGG GGC GAA TCA CTT GGT 720
Val Gln Ile Ala Pro Ala Val Arg Ala Ala Trp Gly Glu Ser Leu Gly
225                 230                 235                 240
CTG CCG CGG GAG CAG GCG ACC GCC AAA CGG CTG GTG GCC GCG CTG CGC 768
Leu Pro Arg Glu Gln Ala Thr Ala Lys Arg Leu Val Ala Ala Leu Arg
                245                 250                 255
AAG ATC GGG TTC CGT TAT ATC TTC GAC ACT ACG TTC AGC GCC GAT CTC 816
Lys Ile Gly Phe Arg Tyr Ile Phe Asp Thr Thr Phe Ser Ala Asp Leu
            260                 265                 270
ACC ATC ATG GAG GAG GGA AGT GAG TTC CTC GCA AAG CTC CGG AAC CGG 864
Thr Ile Met Glu Glu Gly Ser Glu Phe Leu Ala Lys Leu Arg Asn Arg
        275                 280                 285
GAA AAC GAA ACG TTC CCC ATG TTC ACT TCC TGC TGT CCC GGT TGG GTG 912
Glu Asn Glu Thr Phe Pro Met Phe Thr Ser Cys Cys Pro Gly Trp Val
    290                 295                 300
CGC TTT CTG AAA TCG CAG TAT CCG GAC ATG GTG CGC CAG CTT TCC ACT 960
Arg Phe Leu Lys Ser Gln Tyr Pro Asp Met Val Arg Gln Leu Ser Thr
305                 310                 315                 320
GCG AAA TCA CCG CAG CAG ATG TTC GGC GCC ATC ACG AAA AGC TAT TAT 1008
Ala Lys Ser Pro Gln Gln Met Phe Gly Ala Ile Thr Lys Ser Tyr Tyr
                325                 330                 335
GCC AAG CTG TTG GAT GTG GAG CCG GAA CGC ATC TGC TCC ATT TCC GTC 1056
Ala Lys Leu Leu Asp Val Glu Pro Glu Arg Ile Cys Ser Ile Ser Val
            340                 345                 350
ATG CCG TGC CTG GCT AAA AAA CAG GAA GCC GCC TTG CCC ACC ATG GAC 1104
Met Pro Cys Leu Ala Lys Lys Gln Glu Ala Ala Leu Pro Thr Met Asp
        355                 360                 365
ACA GCG GGA GCG GGG CCG GAT GTG GAC ATC GTG CTC ACG ACG CGG GAG 1152
Thr Ala Gly Ala Gly Pro Asp Val Asp Ile Val Leu Thr Thr Arg Glu
    370                 375                 380
ATC GAC CGC ATG ATC CGC GCG GAG GAT ATC CAC CCG GGG GAG CTG CCG 1200
Ile Asp Arg Met Ile Arg Ala Glu Asp Ile His Pro Gly Glu Leu Pro
385                 390                 395                 400
GAG GAG GAG TTC GAC CAG CCG CTT GGC GTG GGC AGC GGC GCG GGC GTG 1248
Glu Glu Glu Phe Asp Gln Pro Leu Gly Val Gly Ser Gly Ala Gly Val
                405                 410                 415
ATT TTC GGC GCC ACG GGC GGC GTG ATG GAA GCG GCC CTG CGC TCG GCC 1296
Tyr Tyr Leu Val Thr Gly Lys Asn Pro Glu Pro Asp Ala Phe Gly Asn
            435                 440                 445
TAC TAT CTG GTC ACC GGA AAA AAT CCG GAG CCC GAC GCG TTT GGA AAC 1344
Ile Phe Gly Ala Thr Gly Gly Val Met Glu Ala Ala Leu Arg Ser Ala
        420                 425                 430
GTG CGG GGA ATG GAC GGC TGG AAG GAA GCG GCC ATC GAC ATC GCG GGC 1392
Val Arg Gly Met Asp Gly Trp Lys Glu Ala Ala Ile Asp Ile Ala Gly
    450                 455                 460
ACC ACG GTG CGT GTA GCG GTG GCC AGT GGT CTG GGC AAC GCC CGT CGG 1440
Thr Thr Val Arg Val Ala Val Ala Ser Gly Leu Gly Asn Ala Arg Arg
465                 470                 475                 480
CTG GTG GAA GCC TTG CGC AAA GGC GAT GTG CAG TAC GAT TTC GTG GAG 1488
Leu Val Glu Ala Leu Arg Lys Gly Asp Val Gln Tyr Asp Phe Val Glu
                485                 490                 495
ATC ATG GCC TGC CCC GGC GGC TGC TCA GGC GGC GGG GGG CAG CCC ATC 1536
Ile Met Ala Cys Pro Gly Gly Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro Ile
            500                 505                 510
GCC GAG GGC GAG GAG CGG GCG GGC GTC CGC GCG GAG ACC CTC TAC GGG 1584
Ala Glu Gly Glu Glu Arg Ala Gly Val Arg Ala Glu Thr Leu Tyr Gly
        515                 520                 525
CTG GAT AAT ATC AGC GCG CTG CGG TTT TCA CAT GAA AAC CCG TCC ATC 1632
Leu Asp Asn Ile Ser Ala Leu Arg Phe Ser His Glu Asn Pro Ser Ile
    530                 535                 540
GTG CAG GTG TAC CGT GAC TAT CTG GAC AAA CCG CTC TCG CAT CGC GCA 1680
Val Gln Val Tyr Arg Asp Tyr Leu Asp Lys Pro Leu Ser His Arg Ala
545                 550                 555                 560
CAT GAG CTG CTC CAT ACG GCG CAT GAC GCC TGG GAA ATG CCC GGC GCC 1728
His Glu Leu Leu His Thr Ala His Asp Ala Trp Glu Met Pro Gly Ala
                565                 570                 575
GCC GCG AAA AAA TAA 1743
Ala Ala Lys Lys
            580
<210>2
<211>580
<212>PRT
<213>产氢细菌(Ethanoligenens)
<400>2
Met Val Asn Val Thr Ile Asn Gly Thr Pro Val Gln Ala Gly Glu Asp
1               5                   10                  15
Thr Thr Ile Leu Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ile His Ile Pro Thr
            20                  25                  30
Leu Cys Tyr Leu Lys Gly Leu Asn Glu Ile Gly Ala Cys Arg Val Cys
        35                  40                  45
Leu Val Glu Ile Glu Gly Ile Glu Lys Leu Val Thr Ala Cys Gly Asn
    50                  55                  60
Lys Val Ala Glu Gly Met Val Ile Ser Thr Asn Ser Pro Arg Val Arg
65                  70                  75                  80
Glu Ala Arg Arg Thr Asn Val Glu Leu Ile Leu Ser Gln His Asp Cys
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Ser Cys Ala Arg Ser Gly Asn Cys Asn Leu Gln Ser Leu
            100                 105                 110
Ser Asn Asp Leu Gly Ile Leu Asp Leu Pro Tyr Arg Arg Glu Met Pro
        115                 120                 125
Val Ser Glu Trp Asn Lys Ser Phe Pro Leu Ile Arg Asp Phe Ser Lys
    130                 135                 140
Cys Ile Lys Cys Met Arg Cys Val Gln Val Cys Asp Lys Ile Gln Asp
145                 150                 155                 160
Met Asn Ile Trp Asp Ile Ala Asn Thr Gly Ser Arg Thr Thr Val Asp
                165                 170                 175
Val Ser Gln Asn Arg Lys Met Glu Glu Ser Asp Cys Thr Leu Cys Gly
            180                 185                 190
Gln Cys Ile Thr His Cys Pro Val Gly Ala Leu Arg Glu Arg Asp Asp
        195                 200                 205
Thr Asp Lys Ala Phe Ala Ala Leu Ala Asp Pro Asp Thr Ile Thr Val
    210                 215                 220
Val Gln Ile Ala Pro Ala Val Arg Ala Ala Trp Gly Glu Ser Leu Gly
225                 230                 235                 240
Leu Pro Arg Glu Gln Ala Thr Ala Lys Arg Leu Val Ala Ala Leu Arg
                245                 250                 255
Lys Ile Gly Phe Arg Tyr Ile Phe Asp Thr Thr Phe Ser Ala Asp Leu
            260                 265                 270
Thr Ile Met Glu Glu Gly Ser Glu Phe Leu Ala Lys Leu Arg Asn Arg
        275                 280                 285
Glu Asn Glu Thr Phe Pro Met Phe Thr Ser Cys Cys Pro Gly Trp Val
    290                 295                 300
Arg Phe Leu Lys Ser Gln Tyr Pro Asp Met Val Arg Gln Leu Ser Thr
305                 310                 315                 320
Ala Lys Ser Pro Gln Gln Met Phe Gly Ala Ile Thr Lys Ser Tyr Tyr
                325                 330                 335
Ala Lys Leu Leu Asp Val Glu Pro Glu Arg Ile Cys Ser Ile Ser Val
            340                 345                 350
Met Pro Cys Leu Ala Lys Lys Gln Glu Ala Ala Leu Pro Thr Met Asp
        355                 360                 365
Thr Ala Gly Ala Gly Pro Asp Val Asp Ile Val Leu Thr Thr Arg Glu
    370                 375                 380
Ile Asp Arg Met Ile Arg Ala Glu Asp Ile His Pro Gly Glu Leu Pro
385                 390                 395                 400
Glu Glu Glu Phe Asp Gln Pro Leu Gly Val Gly Ser Gly Ala Gly Val
                405                 410                 415
Ile Phe Gly Ala Thr Gly Gly Val Met Glu Ala Ala Leu Arg Ser Ala
            420                 425                 430
Tyr Tyr Leu Val Thr Gly Lys Asn Pro Glu Pro Asp Ala Phe Gly Asn
        435                 440                 445
Val Arg Gly Met Asp Gly Trp Lys Glu Ala Ala Ile Asp Ile Ala Gly
    450                 455                 460
Thr Thr Val Arg Val Ala Val Ala Ser Gly Leu Gly Asn Ala Arg Arg
465                 470                 475                 480
Leu Val Glu Ala Leu Arg Lys Gly Asp Val Gln Tyr Asp Phe Val Glu
                485                 490                 495
Ile Met Ala Cys Pro Gly Gly Cys Ser Gly Gly Gly Gly Gln Pro Ile
            500                 505                 510
Ala Glu Gly Glu Glu Arg Ala Gly Val Arg Ala Glu Thr Leu Tyr Gly
        515                 520                 525
Leu Asp Asn Ile Ser Ala Leu Arg Phe Ser His Glu Asn Pro Ser Ile
    530                 535                 540
Val Gln Val Tyr Arg Asp Tyr Leu Asp Lys Pro Leu Ser His Arg Ala
545                 550                 555                 560
His Glu Leu Leu His Thr Ala His Asp Ala Trp Glu Met Pro Gly Ala
                565                 570                 575
Ala Ala Lys Lys
            580
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3基因组总DNA为模板PCR扩增的正向引物hydA-HEF。
<400>3
CGGGAGGTCT GACATATGGT AAACGTGA 28
<210>4
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>以哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3基因组总DNA为模板PCR扩增的反向引物hydA-HER。
<400>4
GGTGTGTCCG TTTTGGAATT CTTTTTTCGC GG 32
<210>5
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>铁氢化酶基因全长的PCR扩增全长验证引物hydA-F。
<400>5
TCAAAGGCGG GAGGTCTGAA AGATGGTAAA CGT 33
<210>6
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>铁氢化酶基因全长的PCR扩增全长验证引物hydA-R。
<400>6
CGGTGTGTCC GTTTTGTATT TATTTTTTCG CG 32
<210>7
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>TaKaRa LA PCRTM in vitro Cloning Kit试剂盒引物Cassette primer C1。
<400>7
GTACATATTG TCGTTAGAAC GCGTAATACG ACTCA 35
<210>8
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>TaKaRa LA PCRTM in vitro Cloning Kit试剂盒引物Cassette primer C2。
<400>8
CGTTAGAACG CGTAATACGA CTCACTATAG GGAGA 35
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与TaKaRa LAPCRTM in vitro Cloning Kit试剂盒引物匹配的上游引物hydA-FS1。
<400>9
TCCATTTCCG TCATGCCGTG CCTGGCTAAA 30
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与TaKaRa LA PCRTM in vitro Cloning Kit试剂盒引物匹配的上游引物hydA-FS2。
<400>10
AAAGCTATTA TGCCAAGCTG TTGGATGTGG A 31
<210>11
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与TaKaRa LA PCRTM in vitro Cloning Kit试剂盒引物匹配的下游引物hydA-RS1。
<400>11
GCTTCCTTCC AGCCGTCCAT TCCCCGCAC 29
<210>12
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>与TaKaRa LA PCRTM in vitro Cloning Kit试剂盒引物匹配的下游引物hydA-RS2。
<400>12
GATCTCCACG AAATCGTACT GCACATCGCC TTT 33
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>通用引物RV-M。
<400>13
GAGCGGATAA CAATTTCACA CAGG 24
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>通用引物M13-47。
<400>14
CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGAC 24
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(9，12，15)
<223>K＝G或T/U，M＝A或C。
<220>
<223>铁氢化酶基因保守区域PCR扩增正向引物hydF1。
<400>15
GCCGACCTKA CMATMATGGA 20
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(3，6，9，12，15)
<223>R＝G或A，S＝G或C。
<220>
<223>铁氢化酶基因保守区域PCR扩增反向引物hydR1。
<400>16
ATRCARCCRC CSGGRCAGGC CAT 23

Claims (3)

1.一种铁氢化酶基因，其特征在于铁氢化酶基因序列如下：
ATGGTAAACGTGACGATCAACGGCACCCCCGTGCAGGCGGGCGAAGAC
ACCACCATTCTGGAAGCGGCGGCTTCGGCGGGCATTCATATCCCCACGCT
CTGCTACCTGAAGGGCCTCAATGAGATCGGCGCCTGCCGGGTTTGCCTG
GTGGAGATTGAGGGCATTGAGAAGTTGGTGACGGCCTGCGGCAACAAG
GTGGCGGAAGGCATGGTCATTTCCACCAACAGCCCGCGCGTGCGCGAGG
CACGGCGCACCAATGTGGAGCTCATCCTCTCGCAGCACGACTGTTATTGC
GCCAGTTGCGCGCGCAGCGGCAACTGCAACCTTCAGTCGCTTTCCAACG
ACCTCGGTATTCTCGATCTGCCCTACCGGCGGGAAATGCCGGTCTCTGAA
TGGAACAAGTCGTTTCCGCTCATCCGCGATTTTTCCAAGTGCATCAAGTG
CATGCGTTGCGTGCAGGTTTGTGACAAGATCCAGGATATGAACATCTGGG
ACATTGCCAACACCGGCTCGCGCACCACGGTGGACGTGTCGCAGAACCG
CAAAATGGAGGAATCGGACTGTACGCTCTGCGGCCAGTGCATCACGCAC
TGCCCGGTGGGCGCGCTGCGCGAGCGGGACGACACCGACAAGGCGTTT
GCCGCGCTGGCCGATCCGGATACGATCACCGTGGTGCAGATCGCGCCCG
CCGTGCGCGCCGCGTGGGGCGAATCACTTGGTCTGCCGCGGGAGCAGGC
GACCGCCAAACGGCTGGTGGCCGCGCTGCGCAAGATCGGGTTCCGTTAT
ATCTTCGACACTACGTTCAGCGCCGATCTCACCATCATGGAGGAGGGAA
GTGAGTTCCTCGCAAAGCTCCGGAACCGGGAAAACGAAACGTTCCCCAT
GTTCACTTCCTGCTGTCCCGGTTGGGTGCGCTTTCTGAAATCGCAGTATC
CGGACATGGTGCGCCAGCTTTCCACTGCGAAATCACCGCAGCAGATGTT
CGGCGCCATCACGAAAAGCTATTATGCCAAGCTGTTGGATGTGGAGCCG
GAACGCATCTGCTCCATTTCCGTCATGCCGTGCCTGGCTAAAAAACAGG
AAGCCGCCTTGCCCACCATGGACACAGCGGGAGCGGGGCCGGATGTGG
ACATCGTGCTCACGACGCGGGAGATCGACCGCATGATCCGCGCGGAGGA
TATCCACCCGGGGGAGCTGCCGGAGGAGGAGTTCGACCAGCCGCTTGGC
GTGGGCAGCGGCGCGGGCGTGATTTTCGGCGCCACGGGCGGCGTGATGG
AAGCGGCCCTGCGCTCGGCCTACTATCTGGTCACCGGAAAAAATCCGGA
GCCCGACGCGTTTGGAAACGTGCGGGGAATGGACGGCTGGAAGGAAGC
GGCCATCGACATCGCGGGCACCACGGTGCGTGTAGCGGTGGCCAGTGGT
CTGGGCAACGCCCGTCGGCTGGTGGAAGCCTTGCGCAAAGGCGATGTGC
AGTACGATTTCGTGGAGATCATGGCCTGCCCCGGCGGCTGCTCAGGCGG
CGGGGGGCAGCCCATCGCCGAGGGCGAGGAGCGGGCGGGCGTCCGCGC
GGAGACCCTCTACGGGCTGGATAATATCAGCGCGCTGCGGTTTTCACATG
AAAACCCGTCCATCGTGCAGGTGTACCGTGACTATCTGGACAAACCGCT
CTCGCATCGCGCACATGAGCTGCTCCATACGGCGCATGACGCCTGGGAA
ATGCCCGGCGCCGCCGCGAAAAAATAA。
2.权利要求1所述铁氢化酶基因编码的氨基酸序列，其特征在于铁氢化酶基因编码的氨基酸序列如下：
MVNVTINGTPVQAGEDTTILEAAASAGIHIPTLCYLKGLNEIGACRVCLVEIE
GIEKLVTACGNKVAEGMVISTNSPRVREARRTNVELILSQHDCYCASCARSG
NCNLQSLSNDLGILDLPYRREMPVSEWNKSFPLIRDFSKCIKCMRCVQVCD
KIQDMNIWDIANTGSRTTVDVSQNRKMEESDCTLCGQCITHCPVGALRERD
DTDKAFAALADPDTITVVQIAPAVRAAWGESLGLPREQATAKRLVAALRKIG
FRYIFDTTFSADLTIMEEGSEFLAKLRNRENETFPMFTSCCPGWVRFLKSQY
PDMVRQLSTAKSPQQMFGAITKSYYAKLLDVEPERICSISVMPCLAKKQEA
ALPTMDTAGAGPDVDIVLTTREIDRMIRAEDIHPGELPEEEFDQPLGVGSGA
GVIFGATGGVMEAALRSAYYLVTGKNPEPDAFGNVRGMDGWKEAAIDIAG
TTVRVAVASGLGNARRLVEALRKGDVQYDFVEIMACPGGCSGGGGQPIAEG
EERAGVRAETLYGLDNISALRFSHENPSIVQVYRDYLDKPLSHRAHELLHTA
HDAWEMPGAAAKK。
3.权利要求1所述铁氢化酶基因异源表达***，其特征在于铁氢化酶基因异源表达***按以下步骤构建：
一、提取哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3基因组总DNA；
二、以哈尔滨产乙醇杆菌YUAN-3基因组总DNA为模板进行PCR扩增，正向引物为hydA-HEF：5′-CGGGAGGTCTGACATATGGTAAACGTGA-3′，反向引物为hydA-HER：5′-GGTGTGTCCGTTTTGGAATTCTTTTTTCGCGG-3′；PCR反应条件：95℃预变性5min，然后35个循环的降落PCR，95℃变性35s、退火温度由68℃开始、每个循环退火温度降低0.1℃、每个循环退火35s、72℃延伸90s，最后72℃延伸10min；
三、步骤二扩增得到的片段用Nde I和EcoR I双酶切，酶切体系为50μl由5μl 10×H Buffer、2μl限制性内切酶Nde I、2μl限制性内切酶EcoR I、30μl PCR扩增产物和余量的ddH2O组成，37℃恒温酶切3h，并用酶切产物胶回收；
四、原核表达载体pET 28a用Nde I和EcoR I双酶切，酶切体系为50μl由5μl 10×H Buffer、2μl限制性内切酶Nde I、2μl限制性内切酶EcoR I、30μl原核表达载体pET 28a和余量的ddH2O组成，37℃恒温酶切3h，并用酶切产物胶回收；
五、将步骤三酶切的***DNA片段与步骤四酶切的载体片段用T4 DNA连接酶连接，酶连体系为20μl由2μl 10×Buffer、1μl T4 DNA连接酶、lμl载体片段、5μl***DNA片段和余量的ddH2O组成，16℃过夜连接；
六、将步骤五获得的连接产物42℃热击转化入E.Coli DH5α感受态细胞，然后在含有卡那霉素的LB筛选平板上进行筛选，挑取白色菌落进行菌落PCR鉴定阳性重组子；
七、抽提阳性重组子重组质粒42℃热击转化入E.Coli BL21感受态细胞，经菌落PCR鉴定，重组子为pET28a-hydA，即获得铁氢化酶基因异源表达***。
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