CN101705286B - 一对扩增硫化杆菌属16S rRNA基因的引物以及实时PCR定量检测环境中硫化杆菌属的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一对扩增硫化杆菌属16S rRNA基因的引物以及实时PCR定量检测环境中硫化杆菌属(Sulfobacillus)的方法。所述的引物对包括：正向引物的序列是5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物的序列是5’-TTCGTCCCGACAGACAGAG-3’。与传统方法相比，本方法具有时间短、通量大、工作量小、可靠性高的优点，从样品的处理到定量检测环境中硫化杆菌属(Sulfobacillus)的时间缩短至4小时，而且由于是一种起始检测法，检测结果更加准确。

Description

一对扩增硫化杆菌属16S rRNA基因的引物以及实时PCR定量检测环境中硫化杆菌属的方法

技术领域

本发明涉及一对扩增硫化杆菌属16S rRNA基因的引物以及实时PCR定量检测环境中硫化杆菌属(Sulfobacillus)的方法。

背景技术

生物冶金技术是利用微生物、空气和水等天然物质从矿石中直接提取有价金属，而无需选矿及火法炼制的短流程清洁生产工艺，通过微生物氧化矿石产生硫酸高铁和硫酸等浸出剂，浸出过程基本不消耗除矿石、水、空气以外的其它资源，没有二氧化硫排放，资源消耗低，对环境友好。生物冶金新技术使浮选一火法冶炼工艺不能利用的低品位及偏远地区铜资源得以大规模开发，并使过去长年堆存的表外矿即使含铜0.1％以下亦有经济利用价值。生物冶金技术被认为是二十一世纪矿产资源加工的战略性技术。

生物冶金过程是一个化学过程，微生物的作用主要是氧化铁和还原态硫，以及提供溶解反应发生的空间(胞外聚合层)，但是细菌的作用是不能忽视的。浸矿环境中的细菌可以分为两种：一种就是可以氧化铁或(和)硫的细菌，如At.ferrooxidans，氧化Fe²⁺的速度是溶解氧氧化速度的5×10⁵～1×10⁶倍，产生的Fe³⁺通过化学作用氧化硫化矿，氧化硫产生的硫酸也可溶解一部分硫化矿；还有一种菌就是异养菌，它们通过代谢自养菌产生的有机物获得能量，一方面可以消除有机物对自养菌的毒害作用，另一方面可以在低氧压条件下异养生长，以Fe³⁺为电子受体，可以产生Fe²⁺供铁氧化菌利用，如Acidiphilium acidophilum。

生物浸矿过程是一个复杂的过程，其中涉及多种因素(生物、化学、物理)的相互作用，微生物群落会随着浸矿环境中温度、pH、溶解氧浓度、CO₂浓度、Fe³⁺/Fe²⁺、硫酸盐浓度和金属离子浓度等的变化而变化，而微生物群落的变化就会影响到浸矿的效率。现有的浸矿微生物检测的方法多是基于PCR扩增后，再对所扩增的PCR产物进行检测，这种终点法的检测往往不能真实的反应浸矿环境中的微生物组成。在PCR基础上发展起来的real-time PCR技术，实现了环境中微生物组成的起点检测，省去了电泳检测的时间，使得检测的时间大大缩短，同时提高了检测的准确性，并能够检测低至几个拷贝的分子。

因此，real-time PCR技术的应用能够解决快速定量检测浸矿微生物的要求。

发明内容

本发明提供一对扩增硫化杆菌属(Sulfobacillus)16S rRNA基因的引物以及实时PCR定量检测硫化杆菌属的方法，该方法实现了环境中微生物组成的起点检测，省去了电泳检测的时间，使得检测的时间大大缩短，同时提高了检测的准确性，并能够检测低至几个拷贝的分子。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

本发明提供的用于检测硫化杆菌属(Sulfobacillus)的引物对包括：正向引物(F)(5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物(R)(5’-TTCGTCCCGACAGACAGAG-3’)(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。

这种利用权利要求1所述引物对的实时PCR的定量检测硫化杆菌属的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)、选择阳性克隆，提取该克隆的16S rDNA，以该DNA为模板用上述引物进行PCR扩增，切胶纯化，以纯化后的基因组DNA为模板用上述引物进行PCR扩增，测定产物的吸光度值，并将吸光度值转化成DNA浓度，再将DNA产物的质量转化为拷贝数；纯化的PCR产物定量后，进行梯度稀释，并以PCR产物为模板，数据构建标准曲线；

(2)、在实时定量PCR仪中扩增环境中硫化杆菌的16S rDNA基因，通过仪器检测扩增过程中相应的荧光信号，然后利用(1)中已建好的标准曲线将荧光信号转换到起始反应的核酸分子拷贝数。

由于细菌在进化过程中基因存在一定的突变，因此在引物设计时在Genbank中选取某种细菌及相似细菌的16S rDNA序列进行比对，挑取该种细菌不同于别的细菌的序列作为设计引物的基础(用Promega 3)。

本发明提供的用于检测硫化杆菌属(Sulfobacillus)的方法为：以上面提供的引物对在实时定量PCR仪中扩增环境中硫化杆菌属(Sulfobacillus)的16S rDNA基因。通过仪器检测扩增过程中相应的荧光信号，然后利用已建好的标准曲线将荧光信号转换到起始反应的核酸分子拷贝数，从而达到定量检测环境样品中硫化杆菌属(Sulfobacillus)的数量。

附图说明

图1为硫化杆菌属(Sulfobacillus)的标准曲线

图2为3种样品的荧光变化曲线图

具体实施方式

实施例1

挑取本实验室保存的与Sulfobacillus sp.(该标准菌株Sulfobacillus sp.可从中国典型培氧物保藏中心购买(武汉)，Sulfobacillus sp的特点是嗜酸，生存在pH1-5之间，该属细菌为功能浸矿菌，部分种可以氧化铁、硫，某些种则只氧化硫)具有99％相似性的阳性克隆，提取该克隆的16S rDNA，以该DNA为模板用上述引物进行PCR扩增，采用Applied Biosystems的GeneAmp PCR System 2700型基因扩增仪。50μl的反应体系组成为：5×buffer 10μl，25mM Mg²⁺3μl，10mM dNTP 1μl，正向引物(F)0.5μl，反向引物(R)0.5μl，模板1μl，GoTaq DNA聚合酶0.25μl，无菌去离子水33.75μl，每个样品做3个重复。反应条件为：95℃预变性2min，然后为30个循环的95℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。反应结束后将所得PCR产物按照Promega的Wizard SV Gel and PCRClean-Up System操作说明进行切胶纯化。纯化后的PCR产物采用Optizen2120紫外分光光度计(Mecasys Co.，Ltd.)在260nm测定产物的吸光度值。然后根据公式(浓度＝OD260×50μg/ml×稀释倍数)将吸光度值转化成DNA浓度。再根据下面的公式将DNA产物的质量转化为拷贝数：

对于双链DNA，采用660g/摩尔/碱基。10^-9g的400bp的PCR产物相当于2.51×10⁹个拷贝。

纯化的PCR产物定量后，进行梯度稀释，使得PCR产物的拷贝数为10⁷-10¹。以此PCR产物为模板，利用Corbett Research的Rotor-Gene 6000实时定量PCR仪进行扩增。25μl的反应体系组成为：12.5μl的含有SYBRGreen I染色剂、AmpliTaq

DNA聚合酶、dNTPs和缓冲溶液的SYBRGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems，为进口的一种试剂名称)，正向引物(F)6.25pmol，反向引物(R)6.25pmol，模板1μl，无菌去离子水6.5μl，每个样品做3个重复。反应条件为：95℃预变性5min，然后为45个循环的95℃变性15s，60℃延伸1min。反应结束后，将温度由65℃缓慢升至95℃进行溶解曲线分析，检测反应的特异性。

反应结束后，将温度缓慢升高，此时双链DNA解链成为单链，内参的荧光染料会被释放出来，荧光信号逐渐减弱。基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。随着产物的解链就可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行微分可以计算出溶解峰。溶解峰可以反映反应中扩增到的产物，因此用溶解曲线就可以对反应的特异性进行监督了。如果溶解曲线只有一个峰，说明反应的特异性很好，如果出现多个峰，说明有非特异性产物生成，结果就不可信。

反应结束后，利用软件(软件为Rotor-Gene 6000 series software version1.7(Build 3))将反应中的数据构建标准曲线(如图1)。R表示所构建标准曲线的相关系数，R^2表示标准曲线相关系数的平方，M表示标准曲线的斜率，B表示标准曲线的截距，Efficiency表示反应的扩增效率。通常好的标准曲线R＞0.99，R^2＞0.97。

实施例2

分别提取3种环境样品(摇瓶浸出、柱浸和生物堆浸)中的微生物基因组DNA，用Promega的基因组DNA纯化试剂盒(Promega，USA)，按照操作说明将DNA粗提液纯化。以纯化后的基因组DNA作为模板，利用Corbett Research的Rotor-Gene 6000实时定量PCR仪，采用特异性扩增硫化杆菌属(Sulfobacillus)、引物对进行扩增。25μl的反应体系组成为：12.5μl的含有SYBR Green I染色剂、AmpliTaq

DNA聚合酶、dNTPs和缓冲溶液的SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)，正向引物(F)6.25pmol，反向引物(R)6.25pmol，模板1μl，无菌去离子水6.5μl，每个样品做3个重复。反应条件为：95℃预变性5min，然后为45个循环的95℃变性15s，60℃延伸1min。反应结束后，将温度由65℃缓慢升至95℃进行溶解曲线分析，检测反应的特异性。然后导入已建立的标准曲线利用荧光定量PCR仪自带的软件计算Ct值，之后将Ct值转化为核酸分子的拷贝数。然后根据转化系数(Sulfobacillus sp.为6)将拷贝数转化为细胞数。(由于细菌通常存在多个拷贝的16S rRNA基因，因此需要一个转化系数，

将拷贝数转化为细菌数，这个转化系数在Zammit，C.M.，Mutch，L.A.，Watling，H.R.and Watkin，E.L.J.，2008.Evaluation of quantitative real-time polymerase chain reaction forenumeration of biomining microorganisms in culture Hydrometallurgy 94(1-4)：185-189.中可以查阅。)

经计算硫化杆菌属(Sulfobacillus)在3种样品中的数量分别为4.5×10²/mL、69.7/mL、1.2×10⁴/g。

申请人采用本方法检测过多种其他菌种(包括大肠杆菌、假单胞菌，以及四种待检测细菌互相进行引物验证)，结果发现反应特异性很好，非待测菌株曲线不起飞，没有信号。

本发明的检测限为10个拷贝，检测在10-10^7(10-10⁷)个拷贝间。

序列表

<110>北京有色金属研究总院

<120>一对扩增硫化杆菌属16S rRNA基因的引物以及实时PCR定量检测环境中硫化杆菌属的方法

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

gagtttgatc ctggctcag    19

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

ttcgtcccga cagacagag    19

Claims (5)

1.一对扩增硫化杆菌属16S rRNA基因的引物，其特征在于：所述的引物对包括：正向引物和反向引物，所述的正向引物的序列是5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物的序列是5’-TTCGTCCCGACAGACAGAG-3’。

2.一种利用权利要求1所述引物对的实时PCR的定量检测硫化杆菌属的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(1)、选择阳性克隆，提取该克隆的16S rDNA，以该DNA为模板用上述引物进行PCR扩增，切胶纯化，以纯化后的基因组DNA为模板用上述引物进行PCR扩增，测定产物的吸光度值，并将吸光度值转化成DNA浓度，再将DNA产物的质量转化为拷贝数；纯化的PCR产物定量后，进行梯度稀释，并以PCR产物为模板，数据构建标准曲线；

(2)、在实时定量PCR仪中扩增环境中硫化杆菌的16S rDNA基因，通过仪器检测扩增过程中相应的荧光信号，然后利用(1)中已建好的标准曲线将荧光信号转换到起始反应的核酸分子拷贝数。

3.根据权利要求2所述的实时PCR的定量检测硫化杆菌属的方法，其特征在于：所用的反应体系组成为12.5μl的含有SYBR Green I染色剂、

DNA聚合酶、dNTPs和缓冲溶液的SYBR Green PCRMaster Mix，正向引物(F)6.25pmol，反向引物(R)6.25pmol，模板1μl，无菌去离子水6.5μl，每个样品做3个重复。

4.根据权利要求2所述实时PCR的定量检测硫化杆菌属的方法，其特征在于：所用的反应条件为95℃预变性5min，然后为45个循环的95℃变性15s，60℃延伸1min。

5.根据权利要求2所述实时PCR的定量检测硫化杆菌属的方法，其特征在于：所述的环境为生物浸出液或酸性矿坑水。

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