CN101704729A - 一种葡萄籽中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的一种葡萄籽中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取方法。即利用乙醇作为提取溶剂，用超声波法从葡萄籽中提取白藜芦醇工艺进行了研究。本发明以葡萄籽为原料，利用超声波对其中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取方法，极大克服了传统方法中的提取时间长和能耗高等问题，本发明的方法由于浸提效率高和能耗低等原因，所以具有安全、方便、有效、低成本等生产特点。并且利用葡萄酒厂下脚料，从而解决葡萄籽废物利用的问题，其必将有效带动葡萄酒产业的发展，大大促进我国葡萄主产区葡萄酒产业的整体升级。

Description

一种葡萄籽中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取方法

技术领域

本发明涉及一种葡萄籽中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取方法。

背景技术

白藜芦醇及白藜芦醇苷在食品、药品及化妆品方面具有极大的应用价值。

葡萄籽是葡萄酒厂的下脚料。葡萄籽中含有白藜芦醇、原花青素、酚类物质和丰富的蛋白质、粗脂肪、各种氨基酸、维生素、矿物质及大量的亚油酸等。世界每年都有上百万吨的葡萄籽产生，将葡萄籽加以合理利用，不仅可以避免环境污染，而且会增加葡萄酒行业的附加值，提高经济效益。

白藜芦醇(resveratrol)，化学名称为反式-3，4′，5-三羟基-1，2-二苯乙烯(3，4′，5-trihydrolystilbene)，含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物，其分子式为C₁₄H₁₂O₃，相对分子量为228.25，为无色针状结晶，熔点：256℃～257℃，升华温度：261℃，易溶于***、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。在自然界中主要存在于葡萄、虎杖、花生、桑椹、买麻藤，朝鲜槐等植物中，主要以反式存在。

白藜芦醇苷(Polydatin，PD)是游离态白藜芦醇和糖苷的结合态，通常与葡萄糖结合以苷的形式存在，含量一般高于其苷元白藜芦醇的含量。在人体中苷能很快被水解为苷元。

白藜芦醇具有多种药理作用。研究显示，白藜芦醇对人肝癌HepG2′细胞的生成有明显的抑制作用，并诱导肿瘤细胞固缩、核染色质碎裂而发生凋亡；也是对降低血小板聚集，预防、治疗动脉粥样硬化，心脑血管疾病的化学预防剂；可作为新型的植物性***，为更年期妇女补充***的安全替代品；新型神经***保护剂；改善忧郁症；促进胶原蛋白合成；减少骨质疏松的机率，促进新骨形成；有助于稳定情绪；还可以调整肝脏星形细胞和星状细胞的功能，抵御肝损伤。

由此，白藜芦醇及白藜芦醇苷在食品工业中的应用也越来越广。在日本，已将含白藜芦醇植物提取物作为食品添加剂使用；在我国，也有将白藜芦醇提取物制成降脂、美容、减肥和抗癌天然保健食品及胶囊。

目前，国内外大多采用葡萄皮、葡萄籽和虎杖等植物为原料提取白藜芦醇。先将原料粉碎，采用有机溶剂(如甲醇、乙醇、乙酸乙酯等)进行提取，经过滤后将滤液浓缩，即得白藜芦醇粗品。有机溶剂提取方法主要分为回流法、浸渍法、索氏抽提法等，多数采用有机溶剂加热提取，耗时费事，成本高，工艺复杂，难以扩大化，生产实用性差。因此探索新的提取工艺技术，提高提取效率，以有利于工业化实施尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种葡萄籽中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取方法。

本发明的技术原理

主要利用超声波提取技术提取葡萄籽中的功能性成分白藜芦醇和白藜芦醇苷，同时通过固相萃取(SPE)技术对浓缩液进行前处理，得本发明的葡萄籽中白藜芦醇和白藜芦醇苷样品溶液.再采用HPLC中的外标法对提取液中的白藜芦醇及白藜芦醇苷两种功能性成分进行定量.

固相萃取是利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法分离原理。较常用的方法是使液体样品通过一吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当的强度溶剂——甲醇冲去杂质，然后用少量甲醇溶剂洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出；或同时吸附杂质和被测物质，再使用合适的溶剂选择性洗脱被测物质。

本发明的技术方案

一种葡萄籽中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取方法，包括如下步骤：

(1)、原料的预处理

将于60℃干燥过的葡萄籽原料粉碎后，过60～80目筛，得葡萄籽粗粉；

(2)、原料的乙醇提取工艺

称取步骤(1)所得的葡萄籽粗粉置于容器中，后加入乙醇溶剂，将容器放入温度为70℃的恒温水浴锅内浸提，控制浸提时间90min，得葡萄籽粗提液；

其中葡萄籽粗粉与浓度为50％的乙醇溶剂按葡萄籽粗粉∶浓度为50％的乙醇溶剂为1kg∶30L；

(3)、超声提取

将步骤(2)经浸提处理过的葡萄籽粗提液取出后用频率为50Hz的超声细胞破碎仪超声6min后，料液再经过离心机离心和定量滤纸过滤后，提取液用旋转蒸发器浓缩，控制浓缩过程的温度为40℃、时间为30min，即得到本发明的白藜芦醇和白藜芦醇苷浓缩液；

所述定量滤纸为中速202型，Φ15cm；

(4)、浓缩液的前处理

在固相萃取小柱内注入甲醇、水进行活化，再加入本发明步骤(3)获得的超声波提取获得的白藜芦醇和白藜芦醇苷的浓缩液，甲醇、水及本发明步骤(3)获得的超声波提取获得的白藜芦醇和白藜芦醇苷的浓缩液按体积比为1∶1∶2，由活塞推动上述混合液经萃取柱过滤，再用去离子水进行淋洗；去离子水的量为所注入乙醇体积的0.5倍，最后用前述2.5倍体积的甲醇洗脱，最终得到本发明的葡萄籽中白藜芦醇和白藜芦醇苷样品溶液。

本发明的超声波提取工艺路线如图1所示。

本发明的有益效果

本发明以葡萄籽为原料，利用超声波对其中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取方法，极大克服了传统方法中的极大克服了传统方法中的提取时间长和能耗高等问题，本发明的方法由于浸提效率高和能耗低等原因，所以具有安全、方便、有效、低成本等生产特点。并且利用葡萄酒厂下脚料，从而解决葡萄籽废物利用的问题，其必将有效带动葡萄酒产业的发展，大大促进我国葡萄主产区葡萄酒产业的整体升级。

附图说明

图1，本发明的超声波提取工艺路线

图2，白藜芦醇标准品的HPLC色谱图

图3，HPLC外标法绘制的白藜芦醇标准曲线

图4，超声波法提取样品中白藜芦醇的HPLC色谱图

图5，白藜芦醇苷标准品的HPLC色谱图

图6，HPLC外标法绘制的白藜芦醇苷标准曲线

图7，超声波法提取样品中白藜芦醇苷的HPLC色谱图

具体实施方式

下面通过实施例并结合附图对本发明进一步说明，但并不限制本发明。

(一)、本发明所用设备：

VC-750型超声波破碎仪；

WX-4000型微波快速消解***；

TGL-16G型台式离心机

P/N：PE0603Cleanert PEP

(二)、本发明所用仪器：

Anglient1100型色谱柱型号：AK952505-L 4.6mm×250mm，5μm

(三)、白藜芦醇标准品的液相色谱检测条件：

乙腈-水(26∶74)，流速为1mL/min，λ为303nm，柱温为35℃。所得结果如图2所示。

白藜芦醇HPLC标准曲线的绘制：

准确称取标准样品白藜芦醇8.2mg，置于10mL容量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别吸取此溶液20μL、40μL、80μL、160μL、200μL于50mL容量瓶中，加乙醇稀释定容至刻度，摇匀，配制成0.328μg/ml、0.656μg/mL、1.312μg/mL、2.624μg/mL、3.28μg/mL5个不同浓度的溶液，每次进样5uL白藜芦醇标准溶液。所得结果如图3所示。

样品测定：

将经过固相萃取处理的葡萄籽样品溶液用微孔滤膜(φ0.22μm)过滤，取该滤液10μL进样，记录峰面积。所得结果如图4所示。

浓缩液中白藜芦醇质量的计算：

测定方法如下：

记录葡萄样品溶液经过固相微萃取后的溶液体积并记录；HPLC的峰面积代入标准曲线回归方程中得到相应溶液中白藜芦醇的浓度。

计算公式如下：

白藜芦醇质量＝C×V            (1.1)

式中：C-葡萄籽样品溶液浓度，μg/mL；V-固相萃取后滤液体积，mL。

(四)、白藜芦醇苷的液相色谱检测条件：

标准品：色谱柱为(AK952505-L 4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈-水(5∶95～80∶20)梯度洗脱，流速为0.5mL/min，λ为303nm，柱温为35℃，数据处理为外标法峰面积定量。所得结果如图5所示。

样品：色谱柱为(AK952505-L 4.6mm ×250mm，5μm)，流动相为乙腈-水(25∶75～80∶20)梯度洗脱，流速为0.5mL/min，λ为303nm，柱温为35℃。

白藜芦醇苷HPLC标准曲线的绘制：

准确称取标准样品白藜芦醇苷8.5mg，置于25mL容量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别吸取此溶液15μL、25μL、35μL、100μL、125μL于50mL容量瓶中，加乙醇稀释定容至刻度，摇匀，配制成0.102μg/ml、0.170μg/mL、0.238μg/mL、0.680μg/mL、0.850g/mL5个不同浓度的溶液，每次进样10uL白藜芦醇苷标准系列。所得结果如图6所示。

样品测定：

将经过固相萃取处理的葡萄籽样品溶液用微孔滤膜(φ0.22μm)过滤，取该滤液10μL进样，记录峰面积。所得结果如图7所示。

白藜芦醇苷质量的计算：

测定方法如下：

记录葡萄样品溶液经过固相微萃取后的溶液体积并记录；HPLC的峰面积代入标准曲线回归方程中得到其白藜芦醇苷的浓度。

计算公式如下：

白藜芦醇苷质量＝C×V                (1.2)

式中：C-葡萄籽样品溶液浓度，μg/mL；V-固相萃取后滤液体积，mL。

实施例1

超声波提取葡萄籽白藜芦醇及白藜芦醇苷

取葡萄籽粗粉10.00g，按照料液比1∶30加入50％乙醇溶液300mL，在70℃下热水浸提1.5h，超声频率50Hz提取6min。

所得粗提液经SPE柱前处理后，再利用HPLC检测其中的白藜芦醇及白藜芦醇苷的含量，所得结果如图4和图7所示。从图4中可以看出，超声波提取葡萄籽中白藜芦醇的峰面积为36.8615，代入标准曲线得到白藜芦醇浓度为0.706μg/mL。计算得4mL超声波提取液中，白藜芦醇的量为3.530μg。从图7中可以看出，超声波提取葡萄籽中白藜芦醇苷的峰面积为28.2069，代入标准曲线得到白藜芦醇苷浓度为0.1845μg/mL。计算得4mL超声波提取液中，白藜芦醇苷的量为0.923μg。

最终结果表明，4mL超声波浓缩液中有3.530μg白藜芦醇和0.923μg白藜芦醇苷。

Claims (1)

1.一种葡萄籽中白藜芦醇和白藜芦醇苷的提取方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)、原料的预处理

将于60℃干燥过的葡萄籽原料粉碎后，过60～80目筛，得葡萄籽粗粉；

(2)、原料的乙醇提取工艺

称取步骤(1)所得的葡萄籽粗粉置于容器中，后加入乙醇溶剂，将容器放入温度为70℃的恒温水浴锅内浸提，控制浸提时间90min，得葡萄籽粗提液；

其中葡萄籽粗粉与浓度为50％的乙醇溶剂按葡萄籽粗粉∶浓度为50％的乙醇溶剂为1kg∶30L；

(3)、超声提取

将步骤(2)经浸提处理过的葡萄籽粗提液取出后用频率为50Hz的超声细胞破碎仪超声6min后，料液再经过离心机离心和定量滤纸过滤后，提取液用旋转蒸发器浓缩，控制浓缩过程的温度为40℃、时间为30min，即得到本发明的白藜芦醇和白藜芦醇苷浓缩液；

所述定量滤纸为中速202型，Φ15cm；

(4)、浓缩液的前处理

在固相萃取小柱内注入甲醇、水进行活化，再加入本发明步骤(3)获得的超声波提取获得的白藜芦醇和白藜芦醇苷的浓缩液，甲醇、水及本发明步骤(3)获得的超声波提取获得的白藜芦醇和白藜芦醇苷的浓缩液按体积比为1∶1∶2，由活塞推动上述混合液经萃取柱过滤，再用去离子水进行淋洗；去离子水的量为所注入乙醇体积的0.5倍，最后用前述2.5倍体积的甲醇洗脱，最终得到本发明的葡萄籽中白藜芦醇和白藜芦醇苷样品溶液。

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