CN101698034B - 一种加味藿香正气丸的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种加味藿香正气丸的检测方法，在原有质量标准的基础上增订了厚朴和广藿香、白芷的薄层色谱鉴别以及陈皮中橙皮苷的含量测定，本发明提高了加味藿香正气丸的质量标准，具有较强的专属性与良好的重现性，有利于实现对加味藿香正气丸成品的含量的有效控制。

Description

一种加味藿香正气丸的检测方法

技术领域

本发明涉及一种加味藿香正气丸的检测方法。

背景技术

加味藿香正气丸(藿香正气丸)收载于《中华人民共和国***药品标准》中药成方制剂第十四册，标准号为WS₃-B-2682-97。加味藿香正气丸由广藿香、紫苏叶等十一味药制成，具有解表化湿，理气和中的作用，是一种用于治疗外感风寒，内伤湿滞，头痛昏重，胸膈痞闷，脘腹胀痛，呕吐泄泻的中药。加味藿香正气丸原标准只有显微鉴别，难以有效控制成品的质量。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种能对加味藿香正气丸成品的质量进行有效控制的加味藿香正气丸的检测方法。

为实现上述目的，本发明采取了以下的技术方案：

一种加味藿香正气丸的检测方法，其特征在于：采用以下鉴别和含量测定项目中的一项或多项进行检测：

(1)厚朴和广藿香的薄层鉴别：取加味藿香正气丸成品4-8g，研细，加***20-30ml，振摇，浸渍过夜，滤过，滤液挥干，残渣加乙醇1-3ml使溶解，作为供试品溶液；另取厚朴对照药材0.5-1.5g，同法制成对照药材溶液；再取百秋李醇对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含1.5-2.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照药材溶液各10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶薄层板上，以体积比为80-90∶10-20∶1-3的60～90℃石油醚-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展至约15cm，取出，晾干，置波长为254nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与厚朴对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光淬灭斑点；喷以5％香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与百秋李醇对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(2)白芷的薄层鉴别：取加味藿香正气丸成品15-20g，研细，加水100-200ml煎煮，放冷，离心取上清液，用盐酸调pH至1～2，用三氯甲烷提取2-3次，每次15-25ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加三氯甲烷1-2ml使溶解，作为供试品溶液；另取白芷对照药材0.5-1.5g，同法制成对照药材溶液；照中国药典2005版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl、对照药材溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为8-12∶0.5-15的三氯甲烷-甲醇为展开剂，置展开缸中预饱和15-25分钟，展至约15cm，取出，晾干，置波长为365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(3)高效液相色谱法测定陈皮中橙皮苷的含量，包括以下步骤：

1)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为20-24∶76-80的乙腈-0.2％磷酸溶液为流动相，检测波长为283nm，理论板数按橙皮苷峰计算应不低于2000；

2)对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1-0.2mg的溶液，即得对照品溶液；

3)供试品溶液的制备：取加味藿香正气丸成品适量，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，水浴加热回流，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；按照加味藿香正气丸成品计算，每克加味藿香正气丸含陈皮以橙皮苷计，不少于设定值为合格。

每克加味藿香正气丸含陈皮以橙皮苷计，设定值为3.2mg。

上述质量检测方法并不需要按照先后顺序进行，而且同时还可以进行常规检测，如形状的观察和显微鉴别，即：取加味藿香正气丸成品，置显微镜下观察：不规则颗粒状团块及分枝状团块无色，遇水合氯醛液渐溶化；菌丝无色或淡棕色，细长，稍弯曲，有分枝，直径3～8μm(茯苓)。草酸钙方晶成片存在于薄壁细胞中(陈皮)。草酸钙针晶细小，长10～32μm，存在于薄壁细胞中(白术)。草酸钙针晶束存在于黏液细胞中，或散在，针晶长20～144μm(半夏)。纤维成束，周围薄壁细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维(甘草)。石细胞类方形、椭圆形、卵圆形或不规则分枝状，有时可见层纹(厚朴)。该成品还应符合中国药典丸剂项下有关的各项规定。

符合以上条件的加味藿香正气丸成品为合格。

本发明在原有质量标准的基础上增订了厚朴和广藿香、白芷的薄层色谱鉴别以及陈皮中橙皮苷的含量测定，本发明提高了加味藿香正气丸的质量标准，具有较强的专属性与良好的重现性，有利于实现对加味藿香正气丸成品的质量的有效控制。

具体实施方式

下面结合实施例详细说明本发明。

实施例1：

本实施例检测方法选用广州中一药业有限公司生产的加味藿香正气丸为供试品，本品为青黄色至棕黄色的浓缩水丸；气芳香，味甘、微苦。

该加味藿香正气丸的检测方法包括以下鉴别和含量测定：

A、鉴别

(1)厚朴和广藿香的鉴别：取加味藿香正气丸成品6g，研细，加***25ml，振摇，浸渍过夜，滤过，滤液挥干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取厚朴对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取百秋李醇对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005版一部附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液及对照药材溶液各10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-甲酸(85∶15∶2)为展开剂，展至约15cm，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视，供试品色谱中，在与厚朴对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光淬灭斑点；喷以5％香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点清晰。供试品色谱中，在与百秋李醇对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

(2)白芷的鉴别：取加味藿香正气丸成品18g，研细，加水150ml煎煮30分钟，放冷，离心(1500转/分钟)10分钟，取上清液，用盐酸调pH至1～2，用三氯甲烷提取2次，每次20ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加三氯甲烷1ml使溶解，作为供试品溶液。另取白芷对照药材1g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2005版一部附录VIB)试验，吸取供试品溶液10μl、对照药材溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇(10∶1)为展开剂，置展开缸中预饱和20分钟，展至约15cm，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

B、含量测定

照中国药典2005年版一部附录ⅥD高效液相色谱法测定陈皮中橙皮苷的含量。测定步骤包括：

(1)色谱条件与***适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.2％磷酸溶液(22∶78)为流动相；检测波长为283nm。理论板数按橙皮苷峰计算应不低于2000。

(2)对照品溶液的制备取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，即得。

(3)供试品溶液的制备取本品适量，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，水浴加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(4)测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本品每1g含陈皮以橙皮苷(C₂₈H₃₄O₁₅)计，不得少于3.2mg。

上述质量检测方法并不需要按照先后顺序进行，而且同时还可以进行常规检测，如形状的观察和显微鉴别，该成品还应符合中国药典2005年版一部附录I A丸剂项下有关的各项规定。

符合以上条件的加味藿香正气丸成品为合格。

以下对本发明质量检测方法的方法学进行考察：

A、厚朴和广藿香鉴别的方法学验证

1.专属性考察

吸取供试品溶液、厚朴对照药材(中国药品生物制品检定所提供，批号：121285-200301)溶液10μl、厚朴阴性对照溶液10μl、百秋李醇对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号：110772-200404)溶液5μl、广藿香阴性对照溶液10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，按本发明鉴别方法进行试验。结果未见厚朴阴性对照对厚朴的薄层色谱及广藿香阴性对照对百秋李醇的薄层色谱鉴别有干扰。

2.耐用性考察

2.1不同薄层板的比较

取手铺的硅胶GF₂₅₄薄层板与预制硅胶GF₂₅₄薄层板，分别按本发明鉴别方法进行试验，结果显示自制手工铺板与预制板的分离效果基本一致。

2.2温度考察

取点样后的薄层板，按按本发明鉴别方法分别在4℃和35℃中展开。结果显示在4℃～35℃温度范围内试验，温度对该鉴别无明显影响。

2.3湿度考察

取点样后的薄层板，按本发明鉴别方法分别在正常湿度65％和用硫酸调节相对湿度20％中展开。结果显示在20％～65％相对湿度范围内试验对鉴别无明显的影响。

经上述方法学验证试验，结果表明薄层板、温湿度变化对展开效果影响不大，因此，认为厚朴和广藿香鉴别方法的耐用性良好。

B、白芷鉴别的方法学验证

1.专属性考察

吸取供试品溶液及阴性对照溶液各10μl、对照药材溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，按本发明鉴别方法试验。结果未见白芷阴性对照对白芷的薄层色谱鉴别有干扰。

2.耐用性考察

2.1不同薄层板的比较

取手铺的硅胶G薄层板与预制硅胶G薄层板，分别按本发明鉴别方法实验。结果，预制板的分离效果优于手工铺板。

2.2温度考察

取点样后的薄层板，按本发明鉴别方法分别在35℃和4℃中展开。结果显示在4℃～35℃温度范围内试验，对结果没有明显的影响。

2.3湿度考察

取点样后的薄层板，按本发明鉴别方法分别在正常湿度(65％)和用硫酸调节相对湿度(20％)中展开。结果显示在20％～65％相对湿度范围内试验对鉴别无明显的影响。

经上述方法学验证试验，结果表明白芷鉴别方法的耐用性良好。

C、陈皮中橙皮苷含量测定的方法学

所用仪器为SHIMADZU LC-2010A高效液相色谱仪；数据处理软件***：SHIMADZULCsolution；超声仪：KQ-300DA：紫外光谱仪：UV-2450。

1色谱条件与***适应性试验

1.1流动相的选择

流动相参考文献“高效液相色谱法测定藿香正气口服液中橙皮苷含量”并稍作改动，选用乙腈-0.2％磷酸溶液(22∶78)为流动相。

1.2测定波长的选择

精密称取橙皮苷对照品(批号：110721-200612，含量测定用，中国药品生物制品检定所)10.36mg，置250ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，在200～380nm波长范围内扫描，结果表明，橙皮苷在283nm处有最大吸收，与中国药典2005年一部药材陈皮项下所采用的检测波长(283nm)一致。故选定283nm作为本品的测定波长。

1.3色谱柱

参照《中国药典》2005版一部“陈皮”[含量测定]的方法，选用反向高效液相色谱-紫外检测器法进行测定，选用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱。

2方法学验证

2.1准确度

2.1.1加样回收用的对照品贮备液制备

精密称取橙皮苷对照品10.50mg，置50ml量瓶中，加甲醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液(0.2100mg/ml)。

2.1.2加样回收供试品溶液的制备

取同一批号的浓缩丸(广州中一药业有限公司生产，批号K00123，含橙皮苷8.46mg/g)粉末共6份，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入上述加样回收用的对照品贮备液20ml，再精密加入甲醇30ml，称定重量，水浴加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得(表1)。

表1准确度试验结果

2.2精密度(重复性试验)

取同一批号的浓缩丸(广州中一药业有限公司生产，批号K00123)粉末共6份，取约1g，精密称定，按供试品溶液制备方法制备，测定，即得。结果重复性良好(表2)。

表2重复性试验结果

2.3专属性

精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，按含量测定方法测定，结果阴性对照溶液在与橙皮苷对照品色谱保留时间相应的位置上无干扰。

2.4线性

精密称取橙皮苷对照品19.32mg，置20ml量瓶中，加甲醇使溶解，稀释至刻度，摇匀，作为贮备液(0.9660mg/ml)，精密吸取贮备液1ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为贮备液A(0.09660mg/ml)；精密吸取贮备液2ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为贮备液B(0.1932mg/ml)；精密吸取贮备液3ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为贮备液C(0.2898mg/ml)。精密吸取贮备液A(0.09660mg/ml)3μl、10μl，贮备液B(0.1932mg/ml)10μl、12μl，贮备液C(0.2898mg/ml)10μl、15μl分别注入液相色谱仪。以峰面积为纵坐标、橙皮苷含量(μg)为横坐标，得到回归方程为：y＝1757874.6832x+73713.5567，r＝0.9999。实验结果表明，橙皮苷在0.2898μg～4.347μg的范围内与峰面积呈良好的线性关系(表3)。

表3线性考察结果

2.5范围

2.5.1范围-范围实验设计

拟定[含量测定]项下每1g含陈皮以橙皮苷(C₂₈H₃₄O₁₅)计，不得少于3mg。范围的考察可按(表4)设计实验。

表4范围实验设计

2.5.2范围-准确度用对照品贮备液制备

精密称取橙皮苷对照品10.90mg，置50ml量瓶中，加甲醇适量使溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液(0.2180mg/ml)。

2.5.3范围-准确度用供试品贮备液制备

取同一批号的浓缩丸(广州中一药业有限公司生产，批号K00123，含橙皮苷8.46mg/g)粉末共6份，取约0.12g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入对照品贮备液5ml，再精密加入甲醇45ml，按含量测定方法测定。实验表明：本次分析方法的考察范围在供试品含量为2mg/g～8.46mg/g均具有良好的准确度(见表5)。

表5范围-准确度试验测定结果

2.6耐用性

2.6.1稳定性试验

取同一供试品溶液，自制备后，每隔2.5小时，按含量测定方法测定。结果供试品溶液在19小时内稳定。结果见表6。

表6稳定性试验结果

2.6.2提取方法的考察

取同一批号(广州中一药业有限公司生产，K00123)样品粉末两份，每份约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，分别采用超声处理(功率300W，频率40kHz)与水浴加热回流的方式，提取时间均为30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，测定样品中橙皮苷的含量。试验表明，水浴加热回流效果明显比超声处理好，故选用水浴加热回流作为提取方法，结果见表7。

表7不同提取方式的比较

2.6.3是否采用石油醚去杂的选择

取同一批号(广州中一药业有限公司生产，K00123)样品粉末两份，每份约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别采用(1)精密加入石油醚(60～90℃)50ml，水浴加热回流30分钟，弃去石油醚液，药渣挥干石油醚，再精密加入甲醇50ml，称定重量，水浴加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；(2)直接精密加入甲醇50ml，称定重量，水浴加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，测定样品中橙皮苷含量。结果表明两种方法处理后的杂质峰数量无显著差异，故选用直接加甲醇水浴加热回流(表8)。

表8是否采用石油醚去杂的结果

2.6.4回流提取时间的选择

取同一批号(广州中一药业有限公司生产，K00123)样品粉末三份，每份约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，分别加热回流30、45、60分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，测定样品中橙皮苷含量。试验表明，不同提取时间测定结果相差不大，将提取时间定为30分钟(见表9)。

表9不同提取时间的比较

2.6.5提取溶剂用量的考察

取同一批号(广州中一药业有限公司生产，K00123)样品粉末共三份，每份约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇25、50、75ml，称定重量，水浴加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，测定样品中橙皮苷含量。试验表明，用量25ml的测定结果较50ml、75ml的测定结果低，而50ml、75ml测定的结果相差不大，故提取溶剂的用量选择为50ml(表10)。

表10不同提取溶剂量的比较

2.6.6不同规格色谱柱的比较

取同一对照品溶液、供试品溶液(广州中一药业有限公司生产，批号：K00009)，按含量测定方法操作，考察不同色谱柱对橙皮苷含量测定结果的影响程度，试验表明，使用不同生产商的色谱柱进行分析，所得结果无显著性差别(表11)。

表11不同色谱柱的测定结果

备注：A.Agilent Eclipse XDB-C18(4.6*150mm*5μm)；B.Diamonsil钻石C18(4.6*200mm*5μm)；

C.Waters SymmetryShield RP-C18(4.6*150mm*5μm)

3试品含量测定

取不同生产批号(广州中一药业有限公司生产)的浓缩丸，按含量测定方法操作，测定，结果见表12。

表12十批含量测定结果

4含量限度的确定

上述10批平均含量为8.86mg/g。由于在该10批样品中，厂家投料所选用陈皮的橙皮苷含量极高，故以此作为含量测定的限度依据不合适。考虑到合格原料、合理的工艺生产出来的样品为合格品，故以药典规定的陈皮中橙皮苷的最低含量确定限度较合理。

按药典规定陈皮以干燥品计算，橙皮苷含量不得低于3.5％(水分不得过13％，即陈皮含橙皮苷不应低于3.045％)，粉末投料丸剂转移率不应低于90％计算，折算以药典规定最低橙皮苷含量的陈皮投料，加味藿香正气丸中橙皮苷含量为3.2mg/g，以此为据，拟定本品含陈皮以橙皮苷(C₂₈H₃₄O₁₅)计，不得少于3.2mg/g。

Claims (2)

1.一种加味藿香正气丸的检测方法，其特征在于：所述检测方法采用以下鉴别和含量测定项目中的一项或多项：

(1)厚朴和广藿香的薄层鉴别：取加味藿香正气丸成品4-8g，研细，加***20-30ml，振摇，浸渍过夜，滤过，滤液挥干，残渣加乙醇1-3ml使溶解，作为供试品溶液；另取厚朴对照药材0.5-1.5g，同法制成对照药材溶液；再取百秋李醇对照品，加乙酸乙酯制成每1ml含1.5-2.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照药材溶液各10μl、对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶薄层板上，以体积比为80-90∶10-20∶1-3的60～90℃石油醚-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展至约15cm，取出，晾干，置波长为254nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与厚朴对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光淬灭斑点；喷以5％香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与百秋李醇对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；

(2)白芷的薄层鉴别：取加味藿香正气丸成品15-20g，研细，加水100-200ml煎煮，放冷，离心取上清液，用盐酸调pH至1～2，用三氯甲烷提取2-3次，每次15-25ml，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加三氯甲烷1-2ml使溶解，作为供试品溶液；另取白芷对照药材0.5-1.5g，同法制成对照药材溶液；照中国药典2005版一部附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl、对照药材溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为8-12∶0.5-1.5的三氯甲烷-甲醇为展开剂，置展开缸中预饱和15-25分钟，展至约15cm，取出，晾干，置波长为365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(3)高效液相色谱法测定陈皮中橙皮苷的含量：包括以下步骤：1)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为20-24∶76-80的乙腈-0.2％磷酸溶液为流动相，检测波长为283nm，理论板数按橙皮苷峰计算应不低于2000；2)对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1-0.2mg的溶液，即得对照品溶液；3)供试品溶液的制备：取加味藿香正气丸成品适量，研细，取约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，水浴加热回流，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；4)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

2.根据权利要求1所述的加味藿香正气丸的检测方法，其特征在于：按照加味藿香正气丸成品计算，每克加味藿香正气丸含陈皮以橙皮苷计，含量大于等于3.2mg。