CN101687900A - 双链锁核酸组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了免疫刺激剂，包括具有一个或多个锁核酸(LNA)核苷的核酸。所述核酸还可包含CpG基序。该核酸可以是双链的，并可包含dsRNA。

Description

双链锁核酸组合物
本申请要求编号为60/905,461和60/950/271的美国临时申请的权益，它们均以参考方式整体并入本文。
技术领域
本发明涉及免疫学领域和免疫刺激剂。更具体地，本发明涉及双链锁核酸组合物。所述核酸可包括dsRNA。
背景技术
先天免疫***既具有针对入侵病原体的第一道防线的作用，又有对适应性免疫应答的支持作用。Toll样受体(toll-like receptor，TLR)是对先天和适应性免疫应答的起始都具有关键作用的一类受体。TLR各自应答于不同的传染原标记，例如，TLR4特异性应答于脂多糖，TLR9偏好性地应答于甲基化的核酸(如含有CpG基序的核酸)，而dsRNA是TLR3的优选激动剂。
双链RNA(dsRNA)是病毒感染的一种常见的复制中间体。当宿主中发生病毒复制或者宿主暴露于病毒复制模拟物(如polyIC双链RNA)时，TLR3起始非特异性先天免疫应答。TLR3的刺激导致NF-kB的激活及其后炎性细胞因子(包括干扰素)的产生，所述细胞因子进而通过刺激I类和II类MHC的表达提高来增强适应性免疫应答。
dsRNA的免疫刺激特性对癌症疗法的开发具有意义。polyIC作为佐剂并与治疗剂组合使用的用途是众所周知的。此外，polyIC dsRNA已与其他制剂组合来提高稳定性。美国专利4,346,538描述了polyIC复合物(″polyICLC″)以及所述组合物的制备和使用方法，所述组合物中含有相对高分子量的polyI:C、分子量范围在13-35 kDa的聚L-赖氨酸(一种多聚阳离子的多肽)和羧甲基纤维素。还曾提出用polyICLC作为治疗剂来治疗一些癌症和病毒性疾病(如HIV或埃博拉病毒)以及多发性硬化症(美国专利公开2006/0223742)。
还证明了另一些dsRNA也具有作为癌症治疗剂的潜力。例如，已描述dsRNA与淋巴因子的组合在作为治疗黑素瘤的治疗剂时具有协同效应(EP0281380)。还描述了TLR3激动剂(包括polyIC和polyAU)用于癌症治疗的改进方法(US 2006/0110746)。
Zhu等(J.Translational Medicine 20075：10doi：10.1186/1479-5876-5-10)描述了polyICLC(肌内施用)和特异性肿瘤免疫原(与IFA组合于皮下施用)的组合为患CNS神经胶质瘤的小鼠的一种有效治疗方法。
一些PolyI:C组合物已用于治疗慢性疲劳综合征、与抗病毒剂组合用于治疗HIV感染变体(Thompson等，Eur J Clin Microbiol Infect Dis.1996Jul；15(7)：580-7；Gillespie等，In Vivo.1994May-Jun；8(3)：375-81；Strayer等，Clin Infect Dis 1994Jan；18Suppl 1：S88-95)。
还鉴定出另一些特异性寡核苷酸基序具有免疫刺激效应，例如CpG二核苷酸。DNA中一些未甲基化的CpG基序是TLR9的激动剂，已建议作为癌症疗法(Krieg AM.2007J.Clin Invest 117：1184-94)。US 7,148,191描述了一种与小(6-20个氨基酸)抗原组合使用的抗原性组合物，所述抗原组合物包含多聚阳离子的多肽以及含有肌苷和胞嘧啶的核酸。WO 01/93905描述了不含CpG基序的免疫刺激性寡脱氧核苷酸，提到了副作用(如高***性的TNF-α)以及缺乏特异性。
治疗性的核酸(包含RNA)可被其刺激引发的免疫应答所降解，所述降解过程是先天病毒防御应答的一部分。US 6,194,388(及其中的参考文献)指出，将核酸组合物中的核糖核苷换成脱氧核糖核苷不能有效提高稳定性，因为特定形式的核糖看来是免疫激活所必需的。提高剂量也不能规避稳定性问题，因为毒性是剂量依赖性的。
期望得到稳定性改良的佐剂，该佐剂适合与至少一种治疗剂(例如但不仅限于病毒性免疫原)组合共同施用，并能够增强病毒性免疫原的免疫刺激活性。
发明概述
本发明涉及免疫刺激剂，并提供双链锁核酸(locked nucleic acid，LNA)组合物。所述核酸可包括dsRNA。
本发明的另一目标是提供一种改进的包含dsRNA的化合物。
本发明还提供下式的化合物：
Figure A20088001414400101
          式II
其中：
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V、W、Z和Q是任意核苷；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-其中V、S、W、Z、D和Q中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
本发明还提供一种如上文定义的化合物，其中B为肌苷，D为胞嘧啶。
本发明涉及一种组合物，所述组合物包含如上文定义的化合物、多聚阳离子多肽(如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸)和羧甲基纤维素。
本发明还提供包含任何上文所定义化合物和免疫原(如HspE7)的组合物。
本发明还提供下式的化合物
Figure A20088001414400111
式IIa
其中：
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V、W、Z和Q可以独立地为通过核苷间连接基团连接的任意核糖核苷，其中V能与Z成键，W能与Q成键；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地是通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核苷，或者R可以不存在。例如，在一些实施方案中，第一链的5′R核糖核苷能够与第二链的3′R核糖核苷成键；此外，
-其中V、S、D、Z、Q、R和W中的一个或多个包含一个或多个LNA单体。
式IIa代表一种双链RNA分子，该分子具有5′、3′的突出碱基或者同时具有5′和3′的突出碱基，还具有互补核苷成键(用单横线代表)的第一链Rk-Vn-(Sm)-Wp-Rk和第二链Rk-Zn-(Dm)-Qp-Rk。第一链以5′到3′方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3′到5′)表示。
本发明还涉及治疗受试者中的癌症、与细菌性或病毒性病原体相关的疾病或病症的方法，该方法包括对该受试者施用下式的化合物：
Figure A20088001414400121
式II
其中：
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V、W、Z和Q是任意核苷；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷或肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞苷或胞嘧啶类似物核苷、尿苷或尿苷类似物核苷；
-其中V、W、S、Z、D和Q中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
本发明还涉及上文的方法，其中S是肌苷、D是胞嘧啶。此外，所述化合物可以与免疫原(如HspE7)一起施用。
根据本发明的另一方面，提供增强受试者中针对免疫原之免疫应答的方法，该方法包括对该受试者施用含有免疫原和dsRNA(含有LNA)的组合物。免疫原可以是灭活的完整生物体、蛋白质、肽、融合蛋白、融合肽、重组蛋白或重组肽。免疫原可以是HspE7。含有LNA的dsRNA实例包括但不限于本发明的式II-VII。
本发明含有dsRNA的分子中包含一个或多个LNA。这些含LNA的dsRNA表现出稳定性提高的特性，同时保留了dsRNA的活性。LNA能与单链和双链核酸形成核苷碱基特异性双链体和三链体。这些复合物表现出比由普通核酸形成的相应复合物更高的热稳定性。
本发明还提供下式的化合物
Vn-(Sm)-Wp
式IVa
其中：
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V和W是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-其中V、S和W中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
本发明还提供下式的组合物
Qp-(Dm)-Zn
式IVb
其中：
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-Z和Q是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶、或尿嘧啶类似物核苷；
-其中Z、D和Q中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
本发明还提供制备下式化合物的方法
Figure A20088001414400141
式II
其中：
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V、W、Z和Q是任意核苷；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷或肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞苷或胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-其中V、S、W、Z、D和Q中的一个或多个包含一个或多个LNA单体，所述方法包括：
将符合式Vn-(Sm)-Wp化合物的第一寡聚体和符合式Qp-(Dm)-Zn化合物的第二寡聚体以约0.5-1.0到约1.0-0.5的摩尔比混合，并使所述第一和第二寡聚体退火形成双链核酸。
本发明提供一种下式的化合物
Rk1-Vn-(Sm)-Wp-Rk2
式IVc
其中：
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V和W是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-k1和k2可独立地是0到10的任意整数，或者其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核苷，或者R可以不存在。例如，在一些实施方案中，第一链的5′R核糖核苷能够与第二链的3′R核糖核苷成键，其中V、S、R和W中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
本发明提供下式的化合物
Rk4-Qp-(Dm)-Zn-Rk3
式IVd
其中：
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-Z和Q是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶、或尿嘧啶类似物核苷；
-k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或者其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核苷，或者R可以不存在。在一些实施方案中，例如，第一链的5′R核糖核苷能够与第二链的3′R核糖核苷成键，其中R、Z、D和Q中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
本发明提供制备下式化合物的方法
Figure A20088001414400171
式IIa
其中：
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V、W、Z和Q是任意核苷；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核苷，或者R可以不存在，所述方法包括将符合式Rk-Vn-(Sn)-Wp-Rk化合物的第一寡聚体和符合式Rk-Qp-(Dm)-Zn-Rk化合物的第二寡聚体以约0.5-1.0到约1.0-0.5的摩尔比混合，并使所述第一和第二寡聚体退火形成双链核酸。
本发明提供下式的化合物：
VIa：
Figure A20088001414400181
VIb：
Figure A20088001414400182
VIc：
Figure A20088001414400183
VId：
Figure A20088001414400184
其中
-ELNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、C、G中的一个或多个是LNA；
-FLNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、C、G中的一个或多个是LNA；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷。
本发明还提供下式中任一个的化合物：
VIIa：Rk3-(Sm)-(ELNA)
VIIb：Rk2-(Dm)-(FLNA)
VIIc：Rk3-(Dm)-(ELNA)
VIId：Rk1-(Sm)-(FLNA)
VIIe：(ELNA)-(Sm)-Rk3
VIIf：(FLNA)-(Dm)-Rk1
VIIg：(ELNA)-(Dm)-Rk2
VIIh：(FLNA)-(Sm)-Rk1
其中
-ELNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、C、G中的一个或多个是LNA；
-FLNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、C、G中的一个或多个是LNA；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷。
根据本发明的一些方面，
-ELNA是SEQ ID NO：23，
-FLNA是SEQ ID NO：24。
本发明还提供下式中任一个的化合物：
VIe：
Figure A20088001414400201
VIf：
Figure A20088001414400202
VIg：
Figure A20088001414400203
VIh：
其中
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷。
本发明还提供下式中任一个的化合物：
VIi：Rk1-(Sm)-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-(Dm)-Rk2
VIj：Rk3-(Dm)-CLNA ALNA GLNA CLNA ALNA ALNA-(Sm)-Rk4
VIk：Rk1-(Dm)-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-(Sm)-Rk2
VIl：Rk3-(Sm)-CLNA ALNA GLNA CLNA ALNA ALNA-(Dm)-Rk4
VIlm：Rk1-(Sm)-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-(Sm)-Rk2
VIn：Rk3-(Dm)-CLNA ALNA GLNA CLNA ALNA ALNA-(Dm)-Rk4
VIo：Rk1-(Dm)-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-(Dm)-Rk2
VIp：Rk3-(Sm)-CLNA ALNA GLNA CLNA ALNA ALNA-(Sm)-Rk4
其中
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷。
本发明提供制备下式化合物的方法(A)
VIe：
Figure A20088001414400221
其中
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷。
所述方法包括：
将符合式VIi化合物的第一寡聚体和符合式VIj化合物的第二寡聚体以从约0.5∶1.0到约1.0∶0.5的摩尔比混合，并使所述第一和第二寡聚体退火形成双链核酸。
VIi：Rk1-(Sm)-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-(Dm)-Rk2
VIj：Rk3-(Dm)-CLNA ALNA GLNA CLNA ALNA ALNA-(Sm)-Rk4，
本发明提供制备下式化合物的方法(B)
VIf：
Figure A20088001414400231
其中
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷
所述方法包括：
将符合式VIk化合物的第一寡聚体和符合式VIl化合物的第二寡聚体以从约0.5∶1.0到约1.0∶0.5的摩尔比混合，并使所述第一和第二寡聚体退火形成双链核酸。
VIk：Rk1-(Dm)-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-(Sm)-Rk2
VIl：Rk3-(Sm)-CLNA ALNA GLNA CLNA ALNA ALNA-(Dm)-Rk4
本发明提供制备下式化合物的方法(C)
VIg：
Figure A20088001414400241
其中
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷
所述方法包括：
将符合式VIm化合物的第一寡聚体和符合式VIn化合物的第二寡聚体以从约0.5∶1.0到约1.0∶0.5的摩尔比混合，并使所述第一和第二寡聚体退火形成双链核酸。
VIm：Rk1-(Sm)-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-(Sm)-Rk2
VIn：Rk3-(Dm)-CLNA ALNA GLNA CLNA ALNA ALNA-(Dm)-Rk4
本发明提供制备下式化合物的方法(D)
VIh：
Figure A20088001414400251
其中
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷
所述方法包括：
将符合式VIo化合物的第一寡聚体和符合式VIp化合物的第二寡聚体以从约0.5∶1.0到约1.0∶0.5的摩尔比混合，并使所述第一和第二寡聚体退火形成双链核酸。
VIo：Rk1-(Dm)-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-(Dm)-Rk2
VIp：Rk3-(Sm)-CLNA ALNA GLNA CLNA ALNA ALNA-(Sm)-Rk4
本发明还提供下式的化合物：
Figure A20088001414400252
式IIIa
本发明还提供制备式IIIa化合物的方法，该方法包括将各为SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2的寡聚体相组合，并使所述寡聚体退火以提供式IIIa的双链化合物。
本发明还提供下式的化合物：
Figure A20088001414400261
式Va
Figure A20088001414400262
式Vb
Figure A20088001414400263
式Vc
本发明还提供制备式Va、Vb和Vc的化合物的方法，该方法包括将SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4、或SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、或SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的寡聚体相组合，并使所述寡聚体退火以分别提供式Va、Vb和Vc的双链核酸化合物。
(I15)-G-TLNA-GLNA-A-TLNA-A-TLNA-GLNA    (SEQ ID NO：3)
(C15)-CLNA-A-TLNA-A-TLNA-C-ALNA-CLNA    (SEQ ID NO：4)
GLNA-(I15)-G-TLNA-GLNA-A-TLNA-A-TLNA    (SEQ ID NO：5)
CLNA-(C15)-CLNA-A-TLNA-A-U-CLNA-ALNA    (SEQ ID NO：6)
TLNA-GLNA-(I15)-TLNA-TLNA-A-TLNA-ALNA   (SEQ ID NO：7)
ALNA-CLNA-(C15)-CLNA-A-TLNA-A-TLNA-CLNA (SEQ ID NO：8)
本发明还提供具有3’未配对末端的双链寡聚体。本发明还提供制备具有3’未配对末端的双链寡聚体的方法，该方法包括将SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12、或SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：25的寡聚体相组合，所述寡聚体可被组合并退火以分别提供式为Vd和Ve的双链核酸化合物。
GLNA-GLNA-(I)15-(A)15    (SEQ ID NO：9)
(C)15-CLNA-CLNA-(U)15    (SEQ ID NO：10)
GLNA-GLNA-(I)10-(A)10    (SEQ ID NO：11)
(U)10-CLNA-CLNA-(C)10    (SEQ ID NO：12)
(C)10-CLNA-CLNA-(U)10    (SEQ ID NO：25)
本发明还提供含有CpG基序的双链寡聚体。本发明还提供制备双链寡聚体的方法，该方法包括将SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14、或SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16、或SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18、或SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20、或SEQ ID NO：21和SEQ IDNO：22的寡聚体相组合，并使所述寡聚体退火以分别提供式VIg、VIh、VIi、VIj和VIk的dsRNA化合物。
GLNA-GLNA-(I)15-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-(I)15-GLNA-GLNA   (SEQ ID NO：13)
CLNA-CLNA-(C)15-ALNA-ALNA-CLNA-GLNA-ALNA-CLNA-(C)15-CLNA-CLNA   (SEQ ID NO：14)
GLNA-GLNA-(I)15-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-                  (SEQ ID NO：15)
ALNA-ALNA-CLNA-GLNA-ALNA-CLNA-(C)15-CLNA-CLNA                   (SEQ ID NO：16)
(I)15-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA                             (SEQ ID NO：17)
(C)15-ALNA-ALNA-CLNA-GLNA-ALNA-CLNA                             (SEQ ID NO：18)
GLNA-(I)15-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-         (SEQ ID NO：19)
CLNA-(C)15-ALNA-ALNA-CLNA-GLNA-ALNA-CLNA          (SEQ ID NO：20)
CLNA-GLNA-(I)15-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA     (SEQ ID NO：21)
GLNA-CLNA-(C)15-ALNA-ALNA-CLNA-GLNA-ALNA-CLNA     (SEQ ID NO：22)
如前述的本发明化合物包含具有一个或多个LNA的CpG基序。这些含LNA的核酸表现出稳定性提高的特性，同时保留了CpG相关的活性。LNA能与单链和双链核酸形成核苷碱基特异性双链体和三链体。这些复合物表现出比由普通核酸形成的相应复合物更高的热稳定性。
根据本发明的一些方面，在式VIa至式VId、式VIIa至式VIIh、或式VIIIa至式VIIIh中任一个所定义的化合物中，
-ELNA是SEQ ID NO：23，
-FLNA是SEQ ID NO：24。
根据本发明的一些方面，在式II、式IIa至式IIe、式IVa至式IVd、式VIa至式VId、式VIe至式VIh、式VIi至式VIp、式VIIa至式VIIh、式VIIIa至式VIIIh中任一个所定义的化合物中，在上述定义的化合物中S是肌苷、D是胞嘧啶。
根据本发明的一些方面，在上述式II、式IIa至式IIe、式III、式IIIa至式IIId、式IVa至式IVd、式Va至式Vc、式VIa至式VId、式VIe至式VIh、式VIi至式VIp、式VIIa至式VIIh、式VIIIa至式VIIIh中任一个所定义的化合物中还可含有多聚阳离子多肽(包括聚赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸)。
本发明还提供包含上述定义化合物(式II、式IIa至式IIe、式III、式IIIa至式IIId、式IVa至式IVd、式Va至式Vc、式VIa至式VId、式VIe至式VIh、式VIi至式VIp、式VIIa至式VIIh、式VIIIa至式VIIIh)和免疫原(例如HspE7)的组合物。本发明还提供治疗受试者的方法，该方法包括对该受试者施用药用可接受剂量的所述组合物。
根据本发明的另一方面，提供增强受试者对免疫原的免疫应答的方法，该方法包括对受试者施用含有免疫原和上述定义化合物的组合物，所述化合物定义为式II、式IIa至IIe、式III、式IIIa至式IIId、式IVa至式IVd、式Va至式Vc、式VIa至式VId、式VIe至式VIh、式VIi至式VIp、式VIIa至式VIIh、式VIIIa至式VIIIh的任一个。免疫原可以是灭活的完整生物体、蛋白质、肽、融合蛋白、融合肽、重组蛋白或重组肽。免疫原可以是HspE7。
根据本发明的另一方面，提供了化合物，该化合物包含：含有1至500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷与胞嘧啶核糖核苷之组合以及1至10个锁核酸残基的第一单链核苷酸多聚体；和含有1至500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷与胞嘧啶核糖核苷之组合以及1至10个锁核酸残基的第二单链核苷酸多聚体；其中第一单链核苷酸多聚体和第二单链核苷酸多聚体通过氢键键合而形成双链核酸，该双链核酸包含双链polyIC区和含有锁核酸残基的双链区。
本发明还提供一种化合物，该化合物包含：含有1至500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷与胞嘧啶核糖核苷之组合以及SEQ ID NO：23核酸序列的第一单链核苷酸多聚体；和含有1至500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷与胞嘧啶核糖核苷之组合以及SEQ ID NO：24核酸序列的第二单链核苷酸多聚体；其中第一单链核苷酸多聚体和第二单链核苷酸多聚体通过氢键键合而形成双链核酸，该双链核酸包含双链polyIC区和含有锁核酸残基的双链区。
本发明还提供佐剂或佐剂组合物，所述佐剂或佐剂组合物包含：含有1至500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷和胞嘧啶核糖核苷之组合以及SEQID NO：23核酸序列的第一单链核苷酸多聚体；和含有1至500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷和胞嘧啶核糖核苷之组合以及SEQ ID NO：24核酸序列的第二单链核苷酸多聚体；其中第一单链核苷酸多聚体和第二单链核苷酸多聚体通过氢键键合而形成双链核酸，该双链核酸包含双链polyIC区和含有锁核酸残基的双链区。
本发明还提供佐剂或佐剂组合物，所述佐剂或佐剂组合物包含：含有1至500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷与胞嘧啶核糖核苷之组合以及1至10个锁核酸残基的第一单链核苷酸多聚体；和含有1至500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷与胞嘧啶核糖核苷之组合以及1至10个锁核酸残基的第二单链核苷酸多聚体；其中第一单链核苷酸多聚体和第二单链核苷酸多聚体通过氢键键合而形成双链核酸，该双链核酸包含双链polyIC区和含有锁核酸残基的双链区。
本发明还提供具有针对TLR3和TLR9受体的双受体激动剂活性的佐剂或佐剂组合物，所述佐剂或佐剂组合物包含：含有1至500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷和胞嘧啶核糖核苷之组合以及SEQ ID NO：23核酸序列的第一单链核苷酸多聚体；和含有1至500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷和胞嘧啶核糖核苷之组合以及SEQ ID NO：24核酸序列的第二单链核苷酸多聚体；其中第一单链核苷酸多聚体和第二单链核苷酸多聚体通过氢键键合而形成双链核酸，该双链核酸包含双链polyIC区和含有锁核酸残基的双链区。
本发明概述未必描述了本发明的所有特征。在仔细阅读下文对本发明具体实施方案的描述之后，本发明的其他方面和特征对本领域普通技术人员来说将是很明显的。
附图简述
在下文参考附图进行的描述中，本发明的上述特征和其他特征会更加显而易见，在附图中：
图1显示，根据本发明的一个实施方案，式Vd和Ve的双链核酸化合物。
图2显示，根据本发明的一个实施方案，式VIg至VIk的双链核酸。
图3显示，根据本发明的一个实施方案，含有polyA和polyU区的双链核酸。
发明详述
本发明涉及免疫刺激剂，并提供双链锁核酸(LNA)组合物。所述核酸可包括dsRNA。
说明书中所用实施例(包括术语实例)仅用于说明，并不旨在限制本发明实施方案的范围和意义。
本发明提供含有polyI和polyC或者polyA和polyU寡核苷酸多聚体的组合物，其中每个寡核苷酸多聚体中含有至少一个锁核酸(LNA)残基。所述dsRNA可包含大致等摩尔量的polyI和polyC寡核苷酸多聚体(polyI:C)，或者大致等摩尔量的polyA和polyU寡核苷酸多聚体(polyA:U)。
本发明还提供包含成对寡核苷酸多聚体的组合物，所述寡核苷酸多聚体各自含有I(肌苷)和C(胞嘧啶)核苷的混合物，其中所述寡核苷酸多聚体对中的I和C核苷排列成使得该寡核苷酸多聚体对能杂交形成双链分子。
本发明还提供含有polyI和polyC或者polyA和polyU寡核苷酸多聚体的组合物，其中每个寡核苷酸多聚体中含有至少一个CpG基序和至少一个锁核酸(LNA)残基。所述CpG基序可包含至少一个LNA残基。所述dsRNA可包含大致等摩尔量的polyI和polyC寡核苷酸多聚体(polyI:C)，或者大致等摩尔量的polyA和polyU寡核苷酸多聚体(polyA:U)。
本发明还提供含有寡核苷酸多聚体的组合物，所述寡核苷酸多聚体含有至少一个CpG基序和至少一个LNA残基，以及I与C残基的组合或A与U残基的组合。所述寡核苷酸多聚体可以杂交形成双链分子，例如双链RNA(dsRNA)。例如，包含CpG基序和一个或多个LNA的dsRNA可以是含有一个或多个LNA的polyI:C化合物。所述dsRNA可能含有大致等摩尔量的polyI和polyC寡核苷酸多聚体(polyI:C)，或者大致等摩尔量的polyA和polyU寡核苷酸多聚体(polyA:U)。在另一个实施例中，寡核苷酸多聚体可包含含有一个或多个LNA的CpG基序以及I与C核苷的混合物或A与U核苷的混合物，其中该对中每一寡核苷酸中的CpG基序以及I和C核苷排列成杂交而形成双链分子。
含有至少一个CpG基序和一个或多个LNA的本发明dsRNA可以用于多种目的，例如但不仅限于用作佐剂或免疫刺激剂或治疗剂。例如，含有至少一个CpG基序和一个或多个LNA的dsRNA可以是含一个或多个LNA的polyI:C化合物。
免疫刺激剂是起始免疫应答或在起始免疫应答中提供催化作用的化合物或组合物。所述免疫应答可以完全是先天(或非适应性)免疫应答，如诱导细胞因子(例如干扰素、白细胞介素、集落刺激因子等)的产生和分泌，所述细胞因子继而刺激巨噬细胞迁移，非特异性消化外来免疫原并呈递能为适应性免疫***所识别的免疫原。或者，所述免疫应答可以是适应性免疫应答，其对特定免疫原(如由巨噬细胞(也称作抗原呈递细胞)所呈递的免疫原)的存在产生应答。
无数词修饰的名词均包含单数及复数的含义。
佐剂是一种免疫刺激剂，其本身不具有特异性免疫原性作用，而是刺激免疫***提高或增强对特异性免疫原或免疫原组的应答。免疫原诱导先天或适应性免疫***应答的能力被称为免疫原的“生物活性”。佐剂可以介导、增强或刺激免疫原的生物活性。在一些实例中，缺少佐剂时免疫原可能只有极低或可忽略的生物活性。
免疫原的生物活性可以通过本领域所熟知的任何测定方法来测定。例如，对抗原特异性CD8+T淋巴细胞的诱导可以通过使用ELISPOT测定法(Asai等2000Clin.Diag.Lab Immunol 7：145-154)来定量。其他形式的ELISPOT测定法可用于其他细胞因子，参看如Kalyzhny等2005.Methods MoI Biol 302：15-31；Ott等J.Immunol.Methods.2004Feb15；285(2)：223-35；Forsthuber等Science，271：1728-1730。可用于监测针对免疫原之应答的其他T细胞测定方法包括胞内细胞因子流式细胞术、增殖测定法、抗体微阵列等。参看如Nagorsen等2004.Expert OpinBiol Ther 4：1677-84，或Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷，D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑，1986，Blackwell ScientificPublications。干扰素α和β可以用干扰素ELISA试剂盒(Kim等2004.Nature Biotechnology 22：321-325)来定量。多重测定法例如基于珠子的***(Luminex、Panomics等)能够同时定量多种细胞因子。细胞因子的实例包括IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IFNα、IFNβ、IFNγ、GM-CSF、TNFα、G-CSF、MIP-1α、MlP-1β、MCP-1、EOTAXIN、RANTES、FGF-basic、VEGF等。为明确起见，术语“细胞因子”包括替代性术语如淋巴因子、白细胞介素、趋化因子。
术语“受试者”和“患者”可替换使用。“受试者”是指动物或哺乳动物，包括但不仅限于小鼠、大鼠、狗、猫、猪或灵长类(包括但不仅限于猴、猩猩或人)。受试者可以之前未接触过特定免疫原或免疫原组的，或者受试者可以之前接触过特定免疫原或免疫原组。之前的接触可由以下原因所致：以特定免疫原或免疫原组有意进行的免疫、接触含有特定免疫原或免疫原组的传染原、或对第一免疫原或免疫原组的交叉反应性接触(引发对第二免疫原或免疫原组的免疫应答)。所述第二免疫原或免疫原组可以与第一免疫原或免疫原组相似、相同或不同。
本文所用的术语“LNA修饰的寡核苷酸”包括以一个或多个LNA单体全部或部分修饰的任意寡核苷酸。因此，LNA修饰的寡核苷酸可以完全由LNA单体组成，或者LNA修饰的寡核苷酸可以包含一个LNA单体。
术语“DNA单体”是指与含氮碱基键合的脱氧核糖，而术语“RNA单体”是指与含氮碱基键合的核糖。可构成本发明多种实施方案的组合物的DNA单体实例包括但不仅限于脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、脱氧尿苷、脱氧胞苷、脱氧肌苷等。可构成本发明多种实施方案的组合物的RNA单体实例包括但不仅限于腺苷、鸟苷、5-甲基尿苷、尿苷、胞苷、肌苷等。根据本发明多种实施方案的其他DNA或RNA单体可含有本领域已知的其他含氮碱基。
本文所用术语“LNA单体”一般指具有如US 6,268,490、US 6,794,499和US 7,034,133(均通过参考并入本文)描述的2′-4′环状连接的核苷。与未修饰的寡核苷酸相比，双环核苷(见下文)可对寡核苷酸提供构象上的限制，并提供多种杂交或稳定模式。
术语“核苷”是指通过糖环上的1号碳原子与含氮碱基键合的核糖或脱氧核糖。含氮碱基的实例包括嘌呤(如腺嘌呤、鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤)和嘧啶(如胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶)。嘌呤核苷的实例包括腺苷(A)、鸟苷(G)、肌苷(I)、2’-O-甲基肌苷、2’-O-甲基腺苷、2’-O-甲基鸟嘌呤、2-氯脱氧腺苷、7-卤代-7-脱氮腺苷、7-卤代-7-脱氮-鸟嘌呤、7-丙炔基-7-脱氮-腺苷、7-丙炔基-7-脱氮-鸟嘌呤、2-氨基-腺苷、7-脱氮肌苷、7-硫代-7，9-双脱氮肌苷、间型霉素B、8-氮杂肌苷、9-脱氮肌苷、别嘌呤醇核苷、8-溴肌苷、8-氯肌苷、7-脱氮-2-脱氧-黄苷、7-脱氮-8-氮杂腺苷、7-脱氮-8-氮杂鸟苷、7-脱氮-8-氮杂脱氧腺苷、7-脱氮-8-氮杂脱氧鸟苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、7-脱氮脱氧腺苷、7-脱氮脱氧鸟苷、8-氨基腺苷、8-氨基脱氧腺苷、8-氨基鸟苷、8-氨基脱氧鸟苷、3-脱氮脱氧腺苷、3-脱氮腺苷、6-巯脱氧鸟苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、2-甲硫基N6-异戊烯基腺苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基-2-甲基巯嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基氨甲酰基)苏氨酸、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨甲酰基)苏氨酸、wybutosine、wybutoxosine等，以及在Freier等1997(Nucleic Acids Res.25：4429-4443，通过参考并入本文)中描述的其他嘌呤核苷。
嘧啶核苷的实例包括脱氧尿苷(dU)、尿苷(U)、胞苷(C)、脱氧胞苷(dC)、胸苷(T)、脱氧胸苷(dT)、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、2′-O-甲基尿苷、2′-O-甲基胞苷、5-碘尿嘧啶、5-甲氧基-乙氧基-甲基尿嘧啶、5-丙炔基脱氧尿苷、假异胞苷、5-氮杂胞苷、5-(1-丙炔基)胞苷、2′-脱氧假尿苷、4-硫代脱氧胸苷、4-硫代脱氧尿苷、4-乙酰胞苷、5-(羧基羟甲基)尿苷)2′-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、二氢尿苷、2′-O-甲基假尿苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、5-甲氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-胸苷、5-甲氧基羧基甲基-2-胸苷、5-甲氧基羧基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、尿苷-5-氧乙酸甲酯、尿苷-5-氧乙酸、假尿苷、2-硫代胸苷、5-甲基-2-胸苷、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、5-甲基尿苷、2′-O-甲基-5-甲基尿苷、2′-O-甲基尿苷、3-(3-氨基-3-羧基-丙基)尿苷等，以及在Freier等1997(Nucleic Acids Res.25：4429-4443)中公开的其他取代嘧啶。
嘌呤或嘧啶核苷还包括用标准方法进行的寡核苷酸合成中所用的亚磷酰胺衍生物。
术语核苷还包括式(I)的双环核苷类似物，在例如US 6268490(通过参考并入本文)中描述：
Figure A20088001414400351
(式I)
-B可以是任意含氮碱基，例如嘧啶或嘌呤核酸碱基，或其类似物。
-X和Y可以相同或不同，也可以是任意核苷间连接基团。
这种双环核苷类似物也可称作“锁核酸单体”或“锁核苷单体”或“LNA单体”或“LNA残基”。含有LNA单体之核酸多聚体的合成和聚合方法描述于例如WO 99/14226、WO 00/56746、WO 00/56748、WO01/25248、WO 0148190、WO 02/28875、WO 03/006475、WO 03/09547、WO 2004/083430、US 6,268,490、US 6,794,499、US 7,034,133(均通过参考并入本文)。
核苷类似物的其他实例(如WO 01/048190(其通过参考并入本文)所公开的实例)包括非LNA双环核苷，例如但不仅限于：
-含有额外的C-3′，C-5′-乙氧桥(ethanobridge)的双环[3.3.0]核苷；
-含有额外的C-1′，C-6′-或C-6′，C-4′甲氧桥(methano bridge)的双碳环[3.1.0]核苷；
-含有额外的C-2′，C-3′-二氧戊环(dioxalane)的双环[3.3.0]和[4.3.0]核苷，所述二氧戊环以含有未修饰核苷的二聚体形式合成，其中额外的环是取代天然磷酸二酯键的核苷间连接的一部分；所述二聚体包含具有C-2′，C-3′-甲醇桥的双环[3.1.0]核苷，上述甲醇桥是酰胺和磺酰胺型核苷间连接的一部分；
-通过formacetal核苷间连接掺入三链体中间的双环[3.3.0]葡萄糖衍生核苷类似物；
-由两个五元环和一个三元环构成骨架的三环DNA；
-1，5-失水己糖醇核酸；以及
-具有额外的C-2′，C-3′-连接的六元环和五元环的双环[3.3.0]和[4.3.0]核苷。
“核苷”还包括具有取代核糖(双环或其他方式)的核苷。取代核糖的实例描述于例如Freier等1997(Nucleic Acids Res.25：4429-4443)中，所述文献通过参考并入本文。
“核苷酸”是指具有通过糖环上5号碳键合的核苷间连接基团的核苷。例如，在天然核酸中，寡核苷酸“骨架”是指通过相邻糖分子的5号和3号碳共价键合的交替的核糖/磷酸链，该链由多个核苷酸聚合而成。此聚合过程可包括本领域所知的化学合成方法。参看，如Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，M.J.Gait编辑，1984，IRL Press，Oxford中的Gait第1-22页、Atkinson等第35-81页、Sproat等第83-115页和Wu等第135-151页，或Molecular Cloning：aLaboratory Manual第三版.Sambrook和Russell.CSHL Press，ColdSpring Harbour，New York(均通过参考并入本文)。
聚合过程也可以是酶促的。LNA核苷三磷酸也可以用作本发明一些实施方案的核酸化合物或组合物的酶促聚合底物。LNA核苷可在PCR反应或引物延伸测定中由聚合酶(如DNA或RNA聚合酶)掺入延伸的核酸多聚体中。合适聚合酶的实例包括但不仅限于PhusionTM高保真DNA聚合酶(Finnzymes)或9°Nm TM DNA聚合酶。酶促掺入LNA核苷的方法描述于例如Veedu RN等2007.Nucleic Acids Symposium51：29-30、Veedu RN等2007.ChemBioChem 8：490-492和Veedu等2007.Nucleosides，Nucleotides and Nucleic Acids 26：1207-1210；均通过参考并入本文。
核苷间连接基团是指能够作为寡核苷酸骨架的一部分连接两个核苷的基团。核苷间连接基团的实例描述于Praseuth等(Biochimica etBiophysica Acta 1489：181-206，通过参考并入本文)，包括磷酸二酯(PO4-)、硫代磷酸酯(PO3S-)、氨基磷酸酯(N3′-P5′)(PO3NH)和甲基磷酸酯(PO3CH3)、肽键(″PNA″)等。
术语“核苷酸多聚体”、“寡核苷酸”、“寡核苷酸多聚体”、“寡核苷酸”、“核酸”、“寡聚体”或“核酸多聚体”可互换使用，是指含有至少两个核苷酸的多聚体。核苷酸多聚体可包含单一种类的DNA单体、RNA单体，或可包含任意组合的两种或多种DNA单体、RNA单体。核酸可以是单链或双链，例如，双链核酸分子可包含通过互补碱基配对而杂交的两条单链核酸。
寡核苷酸“polyI”主要包含肌苷、肌苷类似物核苷或其组合。肌苷类似物核苷包括如7-脱氮肌苷、2′-O-甲基肌苷、7-硫代-7，9-双脱氮肌苷、间型霉素B、8-氮杂肌苷、9-脱氮肌苷、别嘌呤醇核苷、8-溴肌苷、8-氯肌苷等。
寡核苷酸“polyC”主要包含胞苷、胞苷类似物核苷或其组合。胞苷类似物核苷包括如5-甲基胞苷、2′-O-甲基胞苷、5-(1-丙基)胞苷等。
寡核苷酸“polyA”主要包含腺苷、腺苷类似物核苷或其组合。腺苷类似物核苷包括如2-氨基腺苷、2′-O-甲基腺苷、2-氨基-脱氧腺苷、7-脱氮-2′-腺苷、7-脱氮-2′-脱氧腺苷等。
寡核苷酸“polyU”主要包含尿苷、尿苷类似物核苷或其组合。尿苷类似物核苷包括如脱氧尿苷(dU)、胞苷(C)、脱氧胞苷(dC)、胸苷(T)、脱氧胸苷(dT)、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、2′-O-甲基尿苷、5-碘尿嘧啶、5-甲氧基-乙氧基-甲基尿嘧啶、5-丙炔基脱氧尿苷等。
“CpG基序”或“CpG元件”或“CpG位点”是指核酸中含有与鸟苷相邻的胞苷的核苷酸基序。核苷C和G被以常规5′-3′核苷键连接它们的磷酸酯隔开。CpG基序一般可描述为XnCpGXn，其中X是任意核苷，n是从1到约500的任意数字或其间的任意数值，例如，从约1到约300或其间的任意数值，从约1到约250或其间的任意数值，从约1到约200或其间的任意数值，从约1到约150或其间的任意数值，1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、250、275、400、425、250、475、500或其间的任意数值。如本文所描述，优选CpG基序中一个或多个核苷、C、G是LNA。
双链核酸(包括dsRNA)分子中的链通过氢键(也称作“Watson-Crick”碱基配对)以有序方式相互作用。也可通过非常规的氢键(包括Hoogsteen碱基配对)发生改变的碱基配对。在一些热力学、离子或pH条件下可能出现三螺旋，尤其是对于核糖核酸而言。上述或其他改变的氢键或碱基配对为本领域所知，并可见于例如Lehninger-Principles of Biochemistry第三版(Nelson和Cox编辑.Worth Publishers，New York；通过参考并入本文)。
在合适温度、离子和pH条件下，本发明多个实施方案的polyI和polyC或者polyA和polyU寡核苷酸可通过“Watson-Crick”氢键形成双链复合体。本领域技术人员能够了解适于形成上述复合体的具体温度、离子和pH条件为本领域技术人员所知，获知上述条件的方法、计算、技术等的实施例可见于例如Freier(1997，Nucleic Acids Res.25：4429-4443；通过参考并入本文)。这种双链复合物的形成也可称作“杂交”。
根据本发明多个实施方案的含有至少一个LNA的双链RNA(dsRNA)分子一般描述为式II：
Figure A20088001414400381
式II
式II表示具有第一链Vn-(Sm)-Wp和第二链Zn-(Dm)-Qp的双链RNA分子，互补核苷之间的键以单横线表示。第一链以5′到3′方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3′到5′)表示。
其中：
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V、W、Z和Q是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m可以是从1到500或10到50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷或肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶或胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-其中V、S、W、Z、D和Q中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
根据本发明多个实施方案的含有至少一个LNA并且还含有R的双链RNA(dsRNA)分子一般描述为式IIa：
Figure A20088001414400391
式IIa
式IIa表示具有5′、3′或者同时具有5′和3′突出碱基、并具有第一链Rk1-Vn-(Sm)-Wp-Rk2和第二链Rk3-Zn-(Dm)-Qp-Rk4的双链RNA分子，互补核苷之间的键以单横线表示。第一链以5′到3′方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3′到5′)表示。
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V、W、Z和Q可以独立地为通过核苷间连接基团连接的任意核糖核苷，其中V能与Z成键，W能与Q成键；
-m可以是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷或肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶或胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地是通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核苷，或者R可以不存在。在一些实施方案中，例如，第一链的5′R核糖核苷能够与第二链的3′R核糖核苷成键；并且，
-其中R、V、S、W、Z、D和Q中的一个或多个包含一个或多个LNA单体。
含有polyI：C的核酸
本发明还提供式II(其中S和D是I和C)的dsRNA化合物(式IIb)：
Figure A20088001414400401
式IIb
式IIb表示具有第一链Vn-(Im)-Wp和第二链Zn-(Cm)-Qp的双链RNA分子，互补核苷之间的键以单横线表示。第一链以5′到3′方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3′到5′)表示。
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V、W、Z和Q可以独立地为通过核苷间连接基团连接的任意核苷，其中V能与Z成键，W能与Q成键；
-m可以是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-I是肌苷或任意肌苷类似物核苷，其通过核苷间连接基团连接到V、W和相应的肌苷或肌苷类似物核苷；
-C是胞嘧啶或任意胞嘧啶类似物核苷，其通过核苷间连接基团连接到V、W和相应的胞苷或任意胞苷类似物核苷；并且，
-其中V、I、W、Z、C和Q中的一个或多个包含一个或多个LNA单体。
本发明的另一些dsRNA分子包括式II(其中S和D是I和C，并含有R的化合物)，其定义如下(式IIc)：
式IIc
式IIc表示具有5′、3′或者同时具有5′和3′突出碱基、并具有第一链Rk-Vn-(Im)-Wp-Rk和第二链Rk-Zn-(Cm)-Qp-Rk的双链RNA分子，互补核苷之间的键以单横线表示。第一链以5′到3′方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3′到5′)表示。
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V、W、Z和Q可以独立地为通过核苷间连接基团连接的任意核糖核苷，其中V能与Z成键，W能与Q成键；
-m可以是1到500或10到50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-I可以是肌苷或任意肌苷类似物核苷，其通过核苷间连接基团连接到V、W和相应的肌苷或肌苷类似物核苷；
-C可以是胞嘧啶或任意胞嘧啶类似物核糖核苷，其通过核苷间连接基团连接到V、W和相应的胞苷或任意胞苷类似物；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地是通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核苷，或者R可以不存在。在一些实施方案中，例如，第一链的5′R核糖核苷能够与第二链的3′R核糖核苷成键；此外，
-其中R、V、I、W、Z、C和Q中的一个或多个包含一个或多个LNA单体。
含有至少一个LNA的双链RNA(dsRNA)分子包括式II(其中S和D是A和U)的化合物，其定义如下(式IId)：一般也描述为式IId：
Figure A20088001414400421
式IId
式IId表示具有第一链Vn-(Am)-Wp和第二链Zn-(Um)-Qp的双链RNA分子，互补核苷之间的键以单横线表示。第一链以5′到3′方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3′到5′)表示。
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V、W、Z和Q可以独立地为通过核苷间连接基团连接的任意核苷，其中V能与Z成键，W能与Q成键；
-m可以是1到500或10到50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-A可以是腺苷或任意腺苷类似物核苷，其通过核苷间连接基团连接到V、W和相应的腺苷或腺苷类似物；
-U可以是尿嘧啶或任意尿嘧啶类似物核苷，其通过核苷间连接基团连接到V、W和相应的尿苷或任意尿苷类似物；并且，
-其中R、V、A、W、Z、U和Q中的一个或多个包含一个或多个LNA单体。
本发明的另一些dsRNA分子包括式II(其中S和D是A和U，并含有R)的化合物，其定义如下(式IIe)：其中该dsRNA的至少一个核苷是LNA
式IIe
式IIe表示具有5′、3′或者同时具有5′和3′突出碱基、并具有第一链Rk1-Vn-(Im)-Wp-Rk2和第二链Rk4-Zn-(Cm)-Qp-Rk3的双链RNA分子，互补核苷之间的键以单横线表示。第一链以5′到3′方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3′到5′)表示。
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V、W、Z和Q可以独立地为通过核苷间连接基团连接的任意核苷，其中V能与Z成键，W能与Q成键；
-m可以是1到500或10到50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-A可以是腺苷或任意腺苷类似物核苷，其通过核苷间连接基团连接到V、W和相应的腺苷或腺苷类似物；
-U可以是尿嘧啶或任意尿嘧啶类似物核苷，其通过核苷间连接基团连接到V、W和相应的尿苷或任意尿苷类似物；并且，
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地是通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核苷，或者R可以不存在。在一些实施方案中，例如，第一链的5′R核苷能够与第二链的3′R核苷成键；此外，
-其中R、V、A、W、Z、U和Q中的一个或多个包含一个或多个LNA单体。
根据式II、IIa、IIb、IIc、IId、IIe的化合物可在R、V、W、Z、Q中的一个或多个中包含一个或多个LNA分子。例如，一个或多个LNA分子可以位于式II、IIa、IIb、IIc、IId或IIe的5’端的V、Q或者V和Q中，一个或多个LNA分子可以位于式II、IIa、IIb、IIc、IId或IIe的3’端的Z、W或者Z和W中，或者一个或多个LNA分子可以位于式II、IIa、IIb、IIc、IId或IIe的5’和3’端的V、W、Z、Q或其组合中。
本发明还提供根据式II、IIa、IIb、IIc、IId或IIe的化合物，其中V和W是LNA核苷(分别为VLNA、WLNA)，Z和Q是LNA核苷(分别为ZLNA、QLNA)，I是肌苷，C是胞苷，n和p为2，m如上述定义，可以是从1到500或其间的任意数值(例如m是从约10到约50或其间的任意数值，例如m是约1、2、5、7、10、12、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、35、40、45、50、60、70、80、90、100或其间的任意数值，例如m可以是18、19、20、21、22、23、24、25)，其间的核苷间连接基团是磷酸二酯。这种化合物的非限制性实例表示为式III：
Figure A20088001414400451
式III
本发明dsRNA的非限制性实例也可以表示为式IIIa、IIIb、IIIc或IIId中的任一个，其中G是鸟嘌呤核苷、C是胞嘧啶核苷、m是22：
式IIIa
Figure A20088001414400453
式IIIb
Figure A20088001414400454
式IIIc
Figure A20088001414400455
式IIId
根据本发明多个实施方案的含有至少一个LNA的单链核酸分子或单链RNA(ssRNA)分子一般描述为式IVa：
Vn-(Sm)-Wp
式IVa
式IVa表示具有Vn-(Sm)-Wp构造(从左到右以5′到3′方向表示)的单链核酸分子
其中：
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V和W是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m可以是1到500或10到50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；此外，
-其中V、S和W中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
根据本发明多个实施方案的含有至少一个LNA的单链核酸分子或单链RNA(ssRNA)分子一般描述为式IVb：
Qp-(Dm)-Zn
式IVb
式IVb表示具有第一链Qp-(Dm)-Zn(从左到右以5′到3′方向表示)的单链RNA分子。
其中：
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-Z和Q是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m是从1到500的任意整数，或其间的任一数值；
-D是胞嘧啶或胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；并且，
-其中Z、D和Q中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
在本发明的一些实施方案中，组合物可能以不同摩尔比含有式IVa或式IVb或者同时含有式IVa和式IVb的单链RNA分子。例如，在一些实施方案中，式IVa和式IVb的单链RNA分子可以大致约等摩尔比相组合。式IVa和式IVb的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVa的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式IVb的单链RNA分子组合到组合物中。式IVa或式IVb的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVb的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式IVa的单链RNA分子组合到组合物中。式IVa或式IVb的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
根据本发明多个实施方案的含有至少一个LNA的单链核酸分子或单链RNA(ssRNA)分子一般描述为式IVc：
Rk1-Vn-(Sm)-Wp-Rk2
式IVc
式IVc表示具有Rk1-Vn-(Sm)-Wp-Rk2构造(从左到右以5′到3′方向表示)的单链RNA分子。
其中：
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V和W是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m可以是1到500或10到50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷或肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-k1和k2可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地是通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核苷，或者R可以不存在。在一些实施方案中，例如，第一链的5′R核糖核苷能够与第二链的3′R核糖核苷成键，并且；
-其中V、S、R和W中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
根据本发明多个实施方案的含有至少一个LNA的单链核酸分子或单链RNA(ssRNA)分子一般描述为式IVd：
Rk3-Qp-(Dm)-Zn-Rk4
式IVd
式IVd表示具有Rk3-Qp-(Dm)-Zn-Rk4构造(从左到右以5′到3′方向表示)的单链RNA分子
其中：
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-Z和Q是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m可以是1到500或10到50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-D是胞嘧啶或胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地是通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核苷，或者R可以不存在。在一些实施方案中，例如，第一链的5′R核糖核苷能够与第二链的3′R核糖核苷成键；此外，
-其中R、Z、D和Q中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
在本发明的一些实施方案中，组合物可以以不同摩尔比含有式IVc或式IVd或者式IVc和式IVd的单链RNA分子。例如，在一些实施方案中，式IVc和式IVd的单链RNA分子可以以大致等摩尔比相组合。式IVc和式IVd的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，根据式IVc的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式IVd的单链RNA分子组合到组合物中。式IVc或式IVd的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVd的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式IVc的单链RNA分子组合到组合物中。根据式IVc或式IVd的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
本发明单链核酸的非限制性实例可以表示为式IVe、IVf、IVg、IVh、IVi或IVj中的任一个(从左到右以5′到3′方向表示)，其中I是2′-O-甲基肌苷，C是2′-O-甲基胞苷，G是2′-O-甲基鸟苷，T是2′-O′甲基胸苷，A是2′-O-甲基腺苷，U是2′-O-甲基尿苷，TLNA是带有LNA核糖的胸苷，GLNA是带有LNA核糖的鸟苷，CLNA是带有LNA核糖的胞苷，ALNA是一个LNA核糖的腺苷，m为15：
(I15)-G-TLNA-GLNA-A-TLNA-A-TLNA-GLNA
式IVe
(C15)-CLNA-A-TLNA-A-TLNA-C-ALNA-CLNA
式IVf
GLNA-(I15)-G-TLNA-GLNA-A-TLNA-A-TLNA
式IVg
CLNA-(C15)-CLNA-A-TLNA-A-U-CLNA-ALNA
式IVh
TLNA-GLNA-(I15)-TLNA-TLNA-A-TLNA-ALNA
式IVi
ALNA-CLNA-(C15)-CLNA-A-TLNA-A-TLNA-CLNA
式IVj
在本发明的一些实施方案中，组合物可以以不同摩尔比含有式IVe或式IVf或者式IVe和式IVf的单链RNA分子。例如，在一些实施方案中，式IVe和式IVf的单链RNA分子可以以大致等摩尔比相组合。式IVe和式IVf的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVe的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式IVf的单链RNA分子组合到组合物中。式IVe或式IVf的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVf的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式IVe的单链RNA分子组合到组合物中。式IVe或式IVf的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在本发明的一些实施方案中，组合物可能以不同摩尔比含有根据式IVg或式IVh或者式IVg和式IVh的单链RNA分子。例如，在一些实施方案中，式IVg和式IVh的单链RNA分子可以以大致等摩尔比相组合。式IVg和式IVh的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVg的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式IVh的单链RNA分子组合到组合物中。式IVg或式IVh的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVh的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式IVg的单链RNA分子组合到组合物中。式IVg或式IVh的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在本发明的一些实施方案中，组合物可能以不同摩尔比含有根据式IVi或式IVj或者式IVi和式IVj的单链RNA分子。例如，在一些实施方案中，式IVi和式IVj的单链RNA分子可以以大致等摩尔比相组合。式IVi和式IVj的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVi的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式IVj的单链RNA分子组合到组合物中。式IVi或式IVj的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式IVj的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式IVi的单链RNA分子组合到组合物中。式IVi或式IVj的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在一些实施方案中，单链核酸对(如式IVe和IVf、式IVg和IVh或者式IVi和IVj)可在一定热力学、离子或pH条件下杂交和/或串联。含有CpG基序的核酸
根据本发明多个实施方案的含有CpG基序的双链核酸分子(其中CpG基序含有至少一个LNA)一般描述为式VIa-VId：
式VIa
式VIa表示具有第一链Rk1-(Sm)-(ELNA)-(Dm)-Rk2和第二链Rk3-(Dm)-(FLNA)-(Sm)-Rk4的双链核酸分子，互补核苷杂交的键以单横线表示。第一链以5′到3′方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3′到5′)表示。
Figure A20088001414400532
式VIb
式VIb表示具有第一链Rk1-(Dm)-(ELNA)-(Sm)-Rk2和第二链Rk3-(Sm)-(FLNA)-(Dm)-Rk4的双链核酸分子，互补核苷杂交的键以单横线表示。第一链以5′到3′方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3′到5′)表示。
Figure A20088001414400533
式VIc
式VIc表示具有第一链Rk1-(Sm)-(ELNA)-(Sm)-Rk2和第二链Rk3-(Dm)-(FLNA)-(Dm)-Rk4的双链核酸分子，互补核苷杂交的键以单横线表示。第一链以5′到3′方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3′到5′)表示。
Figure A20088001414400541
式VId
式VId表示具有第一链Rk1-(Dm)-(ELNA)-(Dm)-Rk2和第二链Rk3-(Sm)-(FLNA)-(Sm)-Rk4的双链核酸分子，互补核苷杂交的键以单横线表示。第一链以5′到3′方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3′到5′)表示。
对式VIa-VId中的每一个而言：
-ELNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、C、G中的一个或多个是LNA；
-FLNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、C、G中的一个或多个是LNA；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷或肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶或胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷。
在不应认为以任何方式进行限制的一些本发明实施方案中，CpG基序可以包含LNA核苷的两条六聚体序列：
ELNA＝5′-GLNA TLNA CLNA GLNA TLNA TLNA-3′(SEQ ID NO：23)；和
FLNA＝5′-ALNA ALNA CLNA GLNA ALNA CLNA-3′(SEQ ID NO：24)。
这些序列的非限制性实例一般描述为式VIe到VIh：
Figure A20088001414400551
式VIe
式VIe表示具有第一链VIi和第二链VIj的双链核酸分子，互补核苷杂交的键以单横线表示。
VIi：Rk1-(Sm)-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-(Dm)-Rk2
VIj：Rk3-(Dm)-CLNA-ALNA-GLNA-CLNA-ALNA-ALNA-(Sm)-Rk4
第一链以5′到3′方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3′到5′)表示。
Figure A20088001414400552
式VIf
式VIf表示具有第一链VIk和第二链VIl的双链核酸分子，互补核苷杂交的键以单横线表示。
VIk：Rk1-(Dm)-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-(Sm)-Rk2
VIl：Rk3-(Sm)-CLNA-ALNA-GLNA-CLNA-ALNA-ALNA-(Dm)-Rk4
第一链以5′到3′方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3′到5′)表示。
Figure A20088001414400553
式VIg
式VIg表示具有第一链VIm和第二链VIn的双链核酸分子，互补核苷杂交的键以单横线表示。
VIm：Rk1-(Sm)-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-(Sm)-Rk2
VIn：Rk3-(Dm)-CLNA-ALNA-GLNA-CLNA-ALNA-ALNA-(Dm)-Rk4
第一链以5′到3′方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3′到5′)表示。
Figure A20088001414400561
式VIh
式VIh表示具有第一链VIo和第二链VIp的双链核酸分子，互补核苷杂交的键以单横线表示。
VIo：Rk1-(Dm)-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-(Dm)-Rk2
VIp：Rk3-(Sm)-CLNA-ALNA-GLNA-CLNA-ALNA-ALNA-(Sm)-Rk4
第一链以5′到3′方向(从左到右)表示，而第二链以与第一链反向平行的方向(从左到右显示为3′到5′)表示。
对式VIe-VIh和VIi-VIp中的每一个而言：
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷。
串联组合
在本发明的一些实施方案中，含有至少一个CpG基序(其含有至少一个LNA核苷)的双链核酸可以含有未配对的核苷，形成“粘末端”，并可形成串联体。式VIIa-VIIh(下文以5′到3′方向显示，从左到右)表示根据序列互补性杂交而形成双链核酸(如上述式VIa-VIh所述)的单链核酸。根据本发明的一些实施方案，含有“粘末端”的双链核酸也可称作串联多聚体的单体。下文显示式VIIa-VIIh，其后为含有式VIIa-VIIh的核酸组合的实例。
Rk1-(Sm)-(ELNA)          式VIIa
Rk2(Dm)-(FLNA)           式VIIb
Rk3-(Dm)-(ELNA)          式VIIc
Rk4-(Sm)-(FLNA)          式VIId
(ELNA)-(Sm)-Rk1          式VIIe
(FLNA)-(Dm)-Rk2          式VIIf
(ELNA)-(Dm)-Rk2          式VIIg
(FLNA)-(Sm)-Rk2          式VIIh
对式VIIa-VIIh中的每一个而言：
-ELNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、C、G中的一个或多个是LNA；
-FLNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、C、G中的一个或多个是LNA；
-m是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷。
在本发明的一些实施方案中，组合物中可以含有式VIIa-VIIh中一种或多种核酸的单链RNA分子，或者以多种摩尔比含有式VIIa-VIIh中至少两种或更多种核酸的组合。例如，在一些实施方案中，式VIIa和式VIIb的单链RNA分子可以以大致等摩尔比相组合。式VIIc、式VIId、式VIIe、式VIIf、式VIIg或式VIIh的一些或所有单链RNA分子可以与另一条互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIa的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式VIIb的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIa或式VIIb的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIc的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式VIId的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIc或式VIId的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIe的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式VIIf的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIe或式VIIf的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIg的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式VIIh的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIg或式VIIh的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIg的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式VIId的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIg或式VIId的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIa的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式VIIf的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIa或式VIIf的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIe的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式VIIb的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIe或式VIIb的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIc的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式VIIh的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIc或式VIIh的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
示例性碱基配对排列图示如下。本发明多个实施方案中双链核酸的其他配对和排列对本领域的技术人员而言是很明显的。对图示如下的每个示例性配对方式而言，根据本领域的常规从左到右，第一链以5′到3′方向提供，第二链以3′到5′方向提供。
Figure A20088001414400601
式VIIa-VIIh的替代性配对方式，其中k1，2，3，4＝0：
上述单体可以串联形成更长的或环状的双链核酸多聚体。
在本发明一些实施方案中，式VIIa-VIIh的单链核酸分子可碱基配对，以形成平末端的双链核酸分子。示例性碱基配对排列图示如下。
在上述实例中，k1，2，3，4是从1到10的(非零)整数，R可以是如前述定义的任意核苷或核苷组，其中第一和第二链中的各至少一个核苷形成氢键碱基配对。
在一些实施方案中，单链核酸对(如式VIIa和VIIb、或式VIIc和VIId、或式VIIe和VIIf、或式VIIg和VIIh、或式VIIg和VIId、或式VIIa和VIIf、或式VIIe和VIIb、或式VIIc和VIIh)在一定热力学、离子或pH条件下可发生串联。
在本发明的一些实施方案中，含有至少一个CpG基序(其含有至少一个LNA核苷)的双链核酸可含有未配对的核苷，形成“粘末端”，还可以形成串联体。式VIIIa-VIIIh(以5′到3′方向如下表示，从左到右)表示根据序列互补性杂交而形成双链核酸(例如上述式VIa-VIh所述)的单链核酸，如上述式VIIa-VIIh所述。根据本发明的一些实施方案，含有“粘末端”的双链核酸也可称作串联多聚体的单体。式VIIIa-VIIIh如下表示，其后为含有式VIIIa-VIIIh的核酸组合的实施例。
(Sm)-Rk1-(ELNA)    式VIIIa
(Dm)-Rk2-(FLNA)    式VIIIb
(Dm)-Rk3-(ELNA)    式VIIIc
(Sm)-Rk4-(FLNA)    式VIIId
(ELNA)-Rk1-(Sm)    式VIIIe
(FLNA)-Rk2(Dm)     式VIIIf
(ELNA)-Rk2-(Dm)    式VIIIg
(FLNA)-Rk2-(Sm)    式VIIIh
对于式VIIIa-VIIIh中的每一个：
-ELNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、C、G中的一个或多个是LNA；
-FLNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、C、G中的一个或多个是LNA；
-m可以是从1到500或10-50的任意整数，或其间的任意整数，包括5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或100；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷。
在本发明的一些实施方案中，组合物可含有式VIIIa-VIIIh中一种或多种核酸的单链RNA分子，或者以多种摩尔比含有式VIIIa-VIIIh中至少两种或更多种以上核酸的组合。例如，在一些实施方案中，式VIIIa和式VIIIb的单链RNA分子可以以大致等摩尔比相组合。式VIIIc、式VIIId、式VIIIe、式VIIIf、式VIIIg或式VIIIh的一些或所有单链RNA分子可以与另一条互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIIa的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式VIIIb的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIIa或式VIIIb的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIIc的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式VIIId的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIIc或式VIIId的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIIe的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式VIIIf的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIIe或式VIIIf的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIIg的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式VIIIh的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIIg或式VIIIh的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIIg的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式VIIId的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIIg或式VIIId的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIIa的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式VIIIf的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIIa或式VIIIf的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIIe的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式VIIIb的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIIe或式VIIIb的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
在另一些实施方案中，式VIIIc的单链RNA分子可以约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的摩尔过量或以约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍的倍数过量与式VIIIh的单链RNA分子组合到组合物中。式VIIIc或式VIIIh的一些或所有单链RNA分子可以与另一互补的单链RNA分子杂交形成双链RNA分子，或者可以不杂交。
示例性碱基配对排列图示如下。根据本发明多个实施方案的双链核酸的其他配对和排列对本领域的技术人员而言是很明显的。对图示如下的每个示例性配对方式，根据本领域的常规从左到右，第一链以5′到3′方向提供，第二链以3′到5′方向提供。
式VIIIa-VIIIh的替代性配对方式：
Figure A20088001414400652
这些单体可串联形成更长的或环状的双链核酸多聚体。
在本发明一些实施方案中，式VIIIa-VIIIh的单链核酸分子可碱基配对形成平末端的双链核酸分子。示例性碱基配对排列图示如下。
Figure A20088001414400661
在上述实例中，k1，2，3，4可为0到10的整数，R可以是如前述定义的任意核苷或核苷组。在k大于0的一些实施方案中，第一和第二链中各至少一个核苷R形成氢键碱基配对。
在一些实施方案中，单链核酸对(如式VIIIa和VIIIb、或式VIIIc和VIIId、或式VIIIe和VIIIf、或式VIIIg和VIIIh、或式VIIIg和VIIId、或式VIIIa和VIIIf、或式VIIIe和VIIIb、或式VIIIc和VIIIh)在一定热力学、离子或pH条件下可发生串联。
根据本发明多个实施方案的佐剂或佐剂组合物包含本文所述的一个或多个核酸种类。所述核酸种类可以是单链或双链。佐剂或佐剂组合物中可存在单链与双链种类的组合。
佐剂或佐剂组合物可以是TLR3或TLR9的选择性激动剂。在本发明一些实施方案中，佐剂或佐剂组合物是TLR3和TLR9两者的激动剂。含有TLR3和TLR9二者的双链核酸的实例包括含有两个或多个式VIIa-h、或式VIIIa-h、或式VIIa-h和式VIIIa-h的核酸。
根据本发明一些实施方案的双链核酸(如包括含两个或多个式VIIa-h、或式VIIIa-h的核酸)可包含于佐剂或佐剂组合物中，以提供具有TLR3和TLR9两者之激动剂活性的佐剂或佐剂组合物。TLR3和TLR9两者的激动剂活性可以由单个双链核酸种类提供。
可使用IP-10测定来评估佐剂组合物提供TLR-3激动剂活性的能力。由于TLR-3激动剂的刺激，人HT29细胞向培养上清液中分泌IP-10。培养上清液中的IP-10可以通过例如ELISA来定量。作为另一个实例，由于TLR-3激动剂的刺激，外周血单核细胞(PBMC)向上清液中分泌细胞因子。所分泌的细胞因子，例如干扰素-α、-β和/或-γ可以通过例如ELISA来定量。作为另一个实例，可以评估免疫效应细胞(如树突细胞)的成熟。
还可使用体外测定方法来评估佐剂组合物提供TLR9激动剂活性的能力。例如，双链核酸组合物的活性可通过B细胞增殖测定或者巨噬细胞或树突细胞的细胞因子产生来评估。上述测定的实例描述于例如Jiang W等2006.Methods Mol Med 127：55-70。
根据本发明多个实施方案的组合物(包括佐剂组合物)可以以约0.1ug/kg到约20mg/kg核酸(根据受试者的体重)或其间任意量的剂量施用，例如，每毫升约1ug到约2000ug核酸或其间的任意量，约10ug到约1000ug核酸或其间的任意量，约30ug到约1000ug核酸或其间的任意量。例如，可使用约0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、50.0、60.0、70.0、80.0、90.0、100、120、140、160 180、200、250、500、750、1000、1500、2000、5000、10000、20000ug核酸的剂量。
本文中使用的佐剂“有效量”是指与免疫原(所述免疫原证实具有生物活性)共同施用时具有免疫刺激效应所需的佐剂量。免疫原可以以约0.1ug/ml到约20mg/ml或其间任意量或者1ug/ml到约2000ug/ml或其间任意量存在。佐剂可以以约0.1ug/ml到约20mg/ml或其间任意量或者1ug/ml到约2000ug/ml或其间任意量存在。免疫原可以是灭活的完整生物体、蛋白质、肽、融合蛋白、融合肽、重组蛋白或重组肽。免疫原可以是HspE7。
根据本发明多个实施方案的佐剂可以与多种可药用赋形剂中的任一种配制在一起，通常配制在含水介质中，如注射用水、乳酸林格液、等渗生理盐水等)中。可药用赋形剂包括如盐、缓冲剂、抗氧化剂、络合剂、张度剂、冷冻保护剂、冻干保护剂、助悬剂、乳化剂、抗微生物剂、防腐剂、螯合剂、粘合剂、表面活性剂、润湿剂、非水载体如不挥发油或者用于持续和控制释放的聚合物。参看如Berge等(1977.J.Pharm Sci.66：1-19)、或Remington-The Science and Practice of Pharmacy，21st edition.Gennaro等编辑.Lippincott Williams & Wilkins Philadelphia(所述文献都通过参考并入本文)。
赋形剂也可以是羧甲基纤维素或多聚阳离子多聚体。多聚阳离子多聚体的实例包括但不仅限于聚L-赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸或者主要含阳性氨基酸的多肽。这些赋形剂的分子量、浓度和制备方法可见于例如US 4,349,538(通过参考并入本文)。
包含本发明多个实施方案之佐剂的组合物可以通过多种途径中的任一种施用，所述途径包括例如皮下注射、腹膜内注射、肌内注射、静脉注射、表皮或透皮给药、粘膜给药、经口、经鼻、直肠或***给药。参看，例如Remington-The Science and Practice of Pharmacy，第二十一版Gennaro等编辑Lippincott Williams & Wilkins Philadelphia。可根据施用途径来选择或修饰载体配方。
根据本发明多个实施方案的组合物可以以单位剂量形式或者适于在使用时配制和稀释的大量形式提供。
根据本发明多个实施方案的组合物可以以单剂量或者按时间施用的多剂量施用于受试者。给药方案可取决于例如受试者的状况、年龄、性别、体重、施用途径、配方或一般健康状况。用于人受试者的给药方案可以通过测定受试者中的吸收、分布、代谢、***和毒性来计算，或者可以通过对实验动物(例如兔或鼠)的测定来外推。剂量和治疗方案的优化讨论于例如Goodman & Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics第十一版.2006.LL Brunton编辑.McGraw-Hill，New York，或Remington-The Science and Practice of Pharmacy，第二十一版.Gennaro等编辑.Lippincott Williams & Wilkins Philadelphia。
在本发明的上下文中，本文使用的术语“治疗”、“处理”、“治疗用途”或“治疗方案”可以互换使用，意在涵盖本发明组合物的预防、缓解和治疗模式，并包括权利要求所述组合物的任何及所有以下用途，其用于治疗由基于炎症的病状、癌症、感染性疾病、***反应、过免疫反应或其他待治疗疾病或紊乱所引起的疾病状态、病症、症状、体征或紊乱，或用于预防、阻碍、延迟或逆转上述疾病相关的症状、体征、病症或紊乱。因此，本发明涵盖对不期望的疾病状态、症状、病症、体征或紊乱(与基于炎症的病状或其他疾病或紊乱相关)或者受益于机体免疫应答刺激的其他疾病或病症进行的任何预防、改善、缓和、逆转或完全消除。治疗可包括以单独或与免疫原组合施用有效量的本文所述组合物。
根据本发明多个实施方案的组合物还可包含一种或多种免疫原，例如病毒或细菌(“病原体”)免疫原。免疫原可以由灭活的完整生物体(“灭活疫苗”)制备，或者可由病原体的特异性蛋白质、肽或其他结构制备。或者，免疫原可以是融合蛋白，该融合蛋白含有来自病原体的完整或部分蛋白质或肽，其与另一非病原体蛋白质或肽(例如“组氨酸标签”或其他可用于纯化该免疫原的部分)相融合。特异性蛋白质或肽可以用分子生物学技术或方法(“重组”蛋白质或肽)生产。重组分子生物学中的常用技术和方法描述于例如Molecular Cloning：a Laboratory Manual第三版.Sambrook和Russell.C SHL Press，Cold Spring Harbour，New York；Current Protocols in Molecular Biology，2007Ausubel等编辑.WileyInterScience，New York；Current Protocols in Immunology，2006 Coliganet al editors.Wiley InterScience，New York。
免疫原的实例包括但不仅限于包含热激蛋白、来自细菌、真菌或病毒病原体之抗原的蛋白质，或者包含来自细菌、真菌或病毒病原体之抗原的热激蛋白融合蛋白(例如但不仅限于HspE7，WO 99/07860，US7,157,089，二者都通过参考并入本文)。细菌、真菌或病毒病原体的实例包括但不仅限于如下疾病的致病因子：***状瘤、生殖器疣、流行性感冒、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、巨细胞病毒、EB病毒、AIDS、AIDS相关复合体、水痘、普通感冒、巨细胞病毒感染、科罗拉多壁虱热-登革热、埃博拉出血热、手足口病、肝炎、单纯疱疹、带状疱疹、HPV、流行性感冒(流感)、拉沙热、麻疹、马尔堡出血热、感染性单核细胞增多症、腮腺炎、脊髓灰质炎、进行性多灶性脑白质病、狂犬病、风疹、SARS、天花(痘症)、病毒性脑炎、病毒性肠胃炎、病毒性脑膜炎、病毒性肺炎、西尼罗病、黄热病、炭疽、细菌性脑膜炎、肉毒中毒、普鲁氏菌病、弯曲菌病、猫抓病、霍乱、白喉、流行性斑疹伤寒病、淋病、脓疱病、军团杆菌病、麻疯病、细螺旋体病、李斯特菌病、莱姆病、类鼻疽、MRSA感染、诺卡菌病、百日咳、鼠疫、大叶性肺炎、鹦鹉热、Q热、落基山斑疹热(RMSF)、沙门氏菌病、猩红热、志贺氏菌病、梅毒、破伤风、沙眼、结核病、野兔病、伤寒症、斑疹伤寒症、***、曲霉病、蛙粪霉病、念珠菌病、隐球菌病、球孢子菌病、脚癣、癣菌病、组织胞浆菌病、真菌血症、副球孢子菌病、肺孢子虫性肺炎等。重组免疫原可以用重组表达***(例如细菌、酵母、杆状病毒、哺乳动物细胞或植物表达***)来表达。
在本发明一些实施方案中，根据本发明多个实施方案的组合物可用于治疗与细菌或病毒病原体相关的疾病或紊乱。与细菌或病毒病原体相关的疾病或紊乱包括但不仅限于细菌或病毒病原体的活跃性或潜伏性感染、与细菌或病毒病原体的活跃性或潜伏性感染一起发生或之后发生的自身免疫应答、与细菌或病毒病原体的活跃性或潜伏性感染一起发生或之后发生的副作用。
在本发明一些实施方案中，免疫原可以是肿瘤抗原或者癌症相关抗原。
术语“癌症”有许多种定义。根据American Cancer Society，癌症是特征在于异常细胞失控生长(并有时扩散)的一组疾病。尽管经常被称作单个疾病，但实际上它包含了多于200种不同疾病。癌的生长能杀死(当上述细胞阻止生命必需器官的正常功能时)机体或在整个机体中传播，损伤基本***。本发明的组合物可用于治疗动物或受试者中易感赘生物的方法中，所述方法包括对有此需要的动物或受试者施用有效量的本发明化合物或组合物。
本发明化合物可作为其有效治疗剂的不同类型癌症的非限制性实例包括：癌，如中枢神经***赘生物，包括多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤、室管膜和脉络丛肿瘤、松果体瘤、神经元瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤和髓膜肉瘤；眼部赘生物，包括基底细胞瘤、鳞状细胞瘤、黑素瘤、横纹肌肉瘤和视网膜神经胶质瘤；内分泌腺赘生物，包括垂体赘生物、甲状腺赘生物、肾上腺赘生物、神经内分泌***赘生物、胃肠胰内分泌***赘生物和生殖腺赘生物；头颈部赘生物，包括头颈癌、口腔及咽喉部赘生物和牙原性肿瘤；胸部赘生物，包括大细胞肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、恶性间皮瘤、胸腺瘤和胸腔原始生殖细胞瘤；消化道赘生物，包括食道、胃、肝、胆囊、外分泌胰腺、小肠、阑尾和腹膜的赘生物、结直肠腺癌和***赘生物；泌尿生殖道赘生物，包括肾细胞癌、骨盆、输尿管、膀胱、尿道、***、***、睾丸的赘生物；以及女性生殖器官，包括外阴和***、宫颈的赘生物、子宫内膜癌、卵巢癌、妇科肉瘤和乳腺赘生物；皮肤赘生物，包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、皮肤纤维肉瘤、Merkel细胞瘤和恶性黑素癌；骨骼和软组织赘生物，包括骨源性肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤、原始神经外胚叶瘤和血管肉瘤；造血***赘生物，包括骨骼增生异常综合征、急性髓细胞样白血病、慢性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、HTLV-1和5、T细胞白血病/淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞性白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤和肥大细胞白血病；以及儿童赘生物，包括急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、成神经细胞瘤、骨瘤、横纹肌肉瘤、淋巴瘤、肾瘤等。
在本发明一些实施方案中，免疫原可以是变应原。变应原是当受试者暴露于该变应原时诱导受试者中的***反应的物质。在吸入变应原引发的变应性和哮喘病症中观察到的慢性炎症很大程度上是由于嗜酸性粒细胞的局部组织渗透和组织对变应原的高反应性所导致的。可以通过使用皮质类固醇和/或支气管扩张剂来减轻炎症，但这些不能治疗根源原因。如WO 99/07860讨论的，变应原特异性T淋巴细胞选择性富集于高反应组织，这一敏感性可能取决于童年或婴儿期的早期抗原接触。
在对吸入免疫原的个体免疫应答中的特异性Th1及Th2样记忆细胞的选择发生在从气道引出的局部***中。这种选择可以由抗原特异性CD4+和CD8+T细胞所产生的多种细胞因子来调节。这种T细胞选择过程可被传染原所影响：呼吸道粘膜的感染可以动员和激活局部组织(肺泡)巨噬细胞，所述巨噬细胞移动到该局部***并分泌Th2抑制性细胞因子(如IL-12和α-干扰素)。此外，它们可通过激活自然杀伤细胞而提高周围环境中的γ-干扰素水平。净结果是产生CTL(主要是CD8+细胞)。γ-干扰素抑制Th2细胞的产生，因而抑制IL-4和IL-5、体液(IgE)和细胞(嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞)***反应的关键性细胞因子的产生(Anderson，G.P.和Coyle，A.J.，Trends Pharmacol.Sci，15：324-332(1995)；Stam，W.B.，van Oosterhout，A.J.and Nijkamp，F.P.，Life Sci，53：1921-1934(1993))。
在哺乳动物中，应激蛋白已经显示诱导体液和细胞免疫应答。当与应激蛋白混合、化学缀合或融合的可溶性抗原施用于哺乳动物时，细胞介导的溶细胞免疫应答被显著增强。这些应答主要是由于CD8+T细胞所致。因此，对CD4+细胞针对抗原自身以及针对与混合或偶联应激蛋白之抗原的应答进行的比较给出了预测的模式：与应激蛋白混合或连接的可溶性抗原产生高比例的CTL(主要为CD8+T细胞)，这是前述刺激Th1途径的一种度量，因为这些CTL由于对Th1型抗原特异性T细胞的诱导而产生。这些Th1细胞产生抑制Th2细胞的γ-干扰素。因此，Th2细胞因子IL-4和IL-5不再能支持IgE和嗜酸性粒细胞的产生。IgE效价降低时，肥大细胞和嗜碱性粒细胞的直接抗原性刺激会下降。此外，IL-5产生的减少将导致嗜酸性粒细胞产生、分化和激活的减少。这种模式会导致相关组织炎症的减少，并导致高反应(哮喘)时间减少。
因此，施用混合物可以影响特应性患者中Th1与Th2的比值，恢复更为正常的平衡并导致变应性或哮喘反应降低，所述混合物中含有与以下制剂相组合的已知变应性抗原(变应原)或应激蛋白或组合物(其含有与应激蛋白化学连接或融合的变应原)：式II和IIa-e、式III和IIIa-d、式IVa-j，以及式IVa-j、式Va到Vc、式VIa到VIh、式VIj到VIo、式VIIa到VIIh、式VIIIa到VIIIh中至少两种的多种摩尔比的组合。
因此，本发明提供TLR3激动剂或TLR9激动剂或者作为TLR3和TLR9双激动剂的组合物，以及含有TLR3激动剂或TLR9激动剂或者作为TLR3和TLR9双激动剂的组合物的佐剂或佐剂组合物。
在本发明一些实施方案中，免疫原包括HspE7。生产HspE7融合蛋白的方法描述于WO 99/07860和US 60/803,606，所述两个文献都通过参考并入本文。
序列
对于SEQ ID NO：1的序列，残基G1、G2、G25和G26是LNA残基；3到24位残基是肌苷核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：2的序列，残基C1、C2、C25和C26是LNA残基；残基C3到C24是核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：3的序列，残基T17、G18、T20、T22和G23是LNA残基；1到15位残基是肌苷核糖核苷酸；残基G16、A19和A21可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：4的序列，残基C16、T18、T20、A22和C23是LNA残基；残基C1到C15是核糖核苷酸；残基A17、A19和C21可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：5的序列，残基G1、T18、T19、T21和T23是LNA残基；1到17位残基是肌苷核糖核苷酸；残基G17、A20和A22可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：6的序列，残基C1、C17、T19、C22和C23是LNA残基；残基C2到C16是核糖核苷酸；残基A18、A20和U21可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：7的序列，残基T1、T2、T18、T19、T21和A22是LNA残基；3到17位残基是肌苷核糖核苷酸；残基A19和A21可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：8的序列，残基A1、C2、C18、T20、T22和C23是LNA残基；残基C3到C17是核糖核苷酸；残基A19和A21可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：9的序列，残基G1和G2是LNA残基；2到17位残基是肌苷核糖核苷酸，A18到A32是核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：10的序列，残基C16和C17是LNA残基；残基C1到C15、U18到U32是核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：11的序列，残基G1和G2是LNA残基；3到12位残基是肌苷核糖核苷酸，A13到A22是核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：12的序列，残基C11和C12是LNA残基；残基U1到U10和C13到C22是核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：13的序列，残基G1、G2、G18、T19、C20、G21、T11、T23、G39和G40是LNA残基；3到17位和24到38位残基是肌苷核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：14的序列，残基C1、C2、A18、A19、C20、G21、A22、C23、C39、C40和C23是LNA残基；残基C3到C17、C24到C38是核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：15的序列，残基G1、G2、G18、T19、C20、G21、T22和T23是LNA残基；3到17位残基是肌苷核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：16的序列，残基A1、A2、C3、G4、A5、C6、C22和C23是LNA残基；残基C7到C21是核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：17的序列，残基G16、T17、C18、G19、T20和T21是LNA残基；1到15位残基是肌苷核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：18的序列，残基A16、A17、C18、G19、A20和C21是LNA残基；残基C1到C15是核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：19的序列，残基G1、G17、T18、C19、G20、T21和T22是LNA残基；2到16位残基是肌苷核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：20的序列，残基C1、A17、A18、C19、G20、A21和C22是LNA残基；残基C2到C16是核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：21的序列，残基C1、G2、G18、T19、C20、G21、T22和T23是LNA残基；3到17位残基是肌苷核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：22的序列，残基G1、C2、A18、A19、C20、G21、A22和C23是LNA残基；残基C3到C17是核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：23的序列，全部六个残基都是LNA残基。
对于SEQ ID NO：24的序列，全部六个残基都是LNA残基。
对于SEQ ID NO：25的序列，残基C2和C3是LNA残基；残基C1到C10和U13到U23是核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：26的序列，残基G1和G2是锁核酸残基；C3、G4、T5、C6、G7、T8、T9、A10、T26、G27、T28、C29、G30、T31、T32、G33是脱氧核糖核苷酸；A11到A25是核糖核苷酸。
对于SEQ ID NO：27的序列，U1到U15的残基是核糖核苷酸；残基T16、A17、A18、C19、G20、A21、C22、G23、C26、A27、A28、C29、G30、A31、C32和A33是脱氧核糖核苷酸；C24和C25是锁核酸残基。
与单字母碱基名称(A、C、G、T、U、I)组合的“LNA”下标表示相关核苷酸是含有前述2′-4′的锁核酸残基。
实施例1：制备双链寡聚体：GCLNA-polyIC-GCLNA
按照生产商的方案(Glen Research，Sterling VA)，使用2′-OMe-I-CE亚磷酰胺、2′-OMe-C-CE亚磷酰胺、5-Me-Bz-C-LNA-CE亚磷酰胺和dmf-G-LNA-CE亚磷酰胺根据标准技术合成SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2的寡聚体。
GLNA-GLNA-(I22)-GLNA-GLNA(SEQ ID NO：1)
和
CLNA-CLNA-(C22)-CLNA-CLNA(SEQ ID NO：2).
将各等摩尔量的第一和第二寡聚体相组合，并使其退火产生dsRNA化合物GCLNA-polyIC-GCLNA，表示为式IIIa：
Figure A20088001414400751
式IIIa
实施例2：制备具有未配对3’端的双链寡聚体
可以按照生产商的方案(Glen Research，Sterling VA)，使用5-Me-Bz-C-LNA-CE亚磷酰胺、Bz-A-LNA-CE亚磷酰胺、dmf-G-LNA-CE亚磷酰胺、T-LNA-CE亚磷酰胺、2′-OMe-I-CE亚磷酰胺、2′-OMe-C-CE亚磷酰胺、2′-OMe-A-CE亚磷酰胺、2′-OMe-G-CE亚磷酰胺和2′-OMe-U-CE亚磷酰胺根据标准技术合成SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的寡聚体。
(I15)-G-TLNA-GLNA-A-TLNA-A-TLNA-GLNA      (SEQ ID NO：3)
(C15)-CLNA-A-TLNA-A-TLNA-C-ALNA-CLNA      (SEQ ID NO：4)
GLNA-(I15)-G-TLNA-GLNA-A-TLNA-A-TLNA      (SEQ ID NO：5)
CLNA-(C15)-CLNA-A-TLNA-A-U-CLNA-ALNA      (SEQ ID NO：6)
TLNA-GLNA-(I15)-TLNA-TLNA-A-TLNA-ALNA     (SEQ ID NO：7)
ALNA-CLNA-(C15)-CLNA-A-TLNA-A-TLNA-CLNA   (SEQ ID NO：8)
可将各等摩尔SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4或者SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6或者SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8相组合，并使其退火产生双链核酸化合物，分别表示为式Va、Vb、Vc：
Figure A20088001414400761
式Va
Figure A20088001414400762
式Vb
式Vc
实施例3：制备具有未配对3’端的双链寡聚体
可以按照生产商的方案(Glen Research，Sterling VA)，使用5-Me-Bz-C-LNA-CE亚磷酰胺、Bz-A-LNA-CE亚磷酰胺、dmf-G-LNA-CE亚磷酰胺、T-LNA-CE亚磷酰胺、2′-OMe-I-CE亚磷酰胺、2′-OMe-C-CE亚磷酰胺、2′-OMe-A-CE亚磷酰胺、2′-OMe-G-CE亚磷酰胺和2′-OMe-U-CE亚磷酰胺根据标准技术合成SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的寡聚体。
GLNA-GLNA-(I)15-(A)15    (SEQ ID NO：9)
(C)15-CLNA-CLNA-(U)15    (SEQ ID NO：10)
GLNA-GLNA-(I)10-(A)10    (SEQ ID NO：11)
(U)10-CLNA-CLNA-(C)10    (SEQ ID NO：12)
(C)10-CLNA-CLNA-(U)10    (SEQ ID NO：25)
可将各等摩尔SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10或者SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12或者SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：25相组合，并使其退火产生双链核酸化合物，分别表示为式Vd和Ve(图1)。
实施例4：与免疫原组合的dsRNA的体外生物活性
可对根据US 60/803,606(通过参考并入本文)的方法生产的含有HspE7的组合物以及根据上述实施例1生产的GCLNA-polyIC-GCLNA测试其体外生物活性。
可在GCLNA-polyIC-GCLNA存在下测定HspE7诱导E7特异性CD8+T淋巴细胞(作为示例性抗病毒治疗途径)能力的增强。可对初次接受实验的C57B1/6小鼠皮下注射单独的HspE7或者HspE7加GCLNA-polyIC-GCLNA。一段时间(例如5天)之后，从小鼠中摘除脾脏并通过ELISPOT测定E7特异性脾细胞的数目，例如用E7特异性I类MHC结合肽E749-57(RAHYNIVTF；Dalton Chemical Laboratories)或对照肽HBCAg93-100(MGLKFRQL；Dalton Chemical Laboratories)作为记忆抗原。
实施例5：与免疫原组合的dsRNA的体内生物活性
可对根据PCT公开WO 2007/137427(通过参考并入本文)的方法生产的含有HspE7的组合物以及根据上述实施例1生产的GCLNA-polyIC-GCLNA测试其体内生物活性。
在癌症治疗的一个示例性方法中，首先在初次接受实验的C57B1/6小鼠中建立TC-1肿瘤。将6×104个TC-1肿瘤细胞注射入鼠的侧腹部。在第七天时，可对带有TC-1肿瘤的小鼠在后颈部皮下注射稀释剂、单独的纯化HspE7，或者与不同剂量GCLNA-polyIC-GCLNA混合的纯化HspE7分级剂量。在额外的时间(如42天)对小鼠的肿瘤生长进行跟踪--在此实施例中，在肿瘤植入时间之后49天无肿瘤的小鼠可认为是无肿瘤的。
实施例6：制备含有CpG基序的双链寡聚体
按照生产商的方案(Glen Research，Sterling VA)，使用2′-OMe-I-CE亚磷酰胺、2′-OMe-C-CE亚磷酰胺、5-Me-Bz-C-LNA-CE亚磷酰胺和dmf-G-LNA-CE亚磷酰胺根据标准技术合成SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的寡聚体。
GLNA-GLNA-(I)15-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-(I)15-GLNA-GLNA    (SEQ ID NO：13)
CLNA-CLNA-(C)15-ALNA-ALNA-CLNA-GLNA-ALNA-CLNA-(C)15-CLNA-CLNA    (SEQ ID NO：14)
GLNA-GLNA-(I)15-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-                   (SEQ ID NO：15)
ALNA-ALNA-CLNA-GLNA-ALNA-CLNA-(C)15-CLNA-CLNA                    (SEQ ID NO：16)
(I)15-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA                              (SEQ ID NO：17)
(C)15-ALNA-ALNA-CLNA-GLNA-ALNA-CLNA                              (SEQ ID NO：18)
GLNA-(I)15-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA-                        (SEQ ID NO：19)
CLNA-(C)15-ALNA-ALNA-CLNA-GLNA-ALNA-CLNA                         (SEQ ID NO：20)
CLNA-GLNA-(I)15-GLNA-TLNA-CLNA-GLNA-TLNA-TLNA                    (SEQ ID NO：21)
GLNA-CLNA-(C)15-ALNA-ALNA-CLNA-GLNA-ALNA-CLNA                    (SEQ ID NO：22)
将各等摩尔的SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14、或者SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16、或者SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18、或者SEQID NO：19和SEQ ID NO：20、或者SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22相组合，并使其退火产生式VIg、VIh、VIi、VIj和VIk(图2)的dsRNA化合物。
实施例7：制备含有CpG和poly A：U基序的双链寡聚体
按照生产商的方案(Eurogentec North America)，使用2′-OMe-A-CE亚磷酰胺、2′-OMe-U-CE亚磷酰胺、DMT-dA-亚磷酰胺、DMT-dC-磷酰胺、DMT-dG-亚磷酰胺、DMT-dT-磷酰胺、5-Me-Bz-C-LNA-CE亚磷酰胺和dmf-G-LNA-CE亚磷酰胺根据标准技术合成根据SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27的寡聚体。
GLNA-GLNA-dC-dG-dT-dC-dG-dT-dT-dA-(rA)15-dT-dG-dT-dC-dG-dT-dT-dG(SEQ ID NO：26)
(rU)15-dT-dA-dA-dC-dG-dA-dC-dG-CLNA-CLNA-dC-dA-dA-dC-dG-dA-dC-dA(SEQ ID NO：27)
可将各等摩尔的SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27相组合，并使其退火产生在任一末端具有一段未配对核苷的双链核酸化合物(示于图3)。所述未配对核苷可允许进行混合物的串联。
所有引文均通过参考并入本文。
已通过实施例描述了一个或多个目前优选的实施方案。对本领域技术人员而言很明显的是，可以对本发明进行许多变更和修改，而不脱离在权利要求中定义的本发明范围。
序列表
<110>Nventa Biopharmaceuticals Corporation
Emtage，Peter
<120>双链锁核酸组合物
<130>V81019WO
<150>60/905,461
<151>2007-03-07
<150>60/950,271
<151>2007-07-17
<160>27
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>26
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(2)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(3)..(24)
<223>I
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(25)..(26)
<223>2′-4′环状连接
<400>1
ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagg    26
<210>2
<211>26
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(2)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(25)..(26)
<223>2′-4′环状连接
<400>2
cccccccccc cccccccccc cccccc    26
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(15)
<223>I
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(17)..(18)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(20)..(20)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(22)..(23)
<223>2′-4′环状连接
<400>3
aaaaaaaaaa aaaaagtgat atg    23
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(16)..(16)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(18)..(18)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(20)..(20)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(22)..(23)
<223>2′-4′环状连接
<400>4
cccccccccc ccccccatat cac    23
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(1)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(2)..(16)
<223>I
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(18)..(19)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(21)..(21)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(23)..(23)
<223>2′-4′环状连接
<400>5
gaaaaaaaaa aaaaaagtgatat    23
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(1)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(17)..(17)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(19)..(19)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(22)..(23)
<223>2′-4′环状连接
<400>6
cccccccccc cccccccata uca   23
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(2)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(3)..(17)
<223>I
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(18)..(19)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(21)..(22)
<223>2′-4′环状连接
<400>7
tgaaaaaaaa aaaaaaatta ta    22
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(2)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(18)..(18)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(20)..(20)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(22)..(23)
<223>2′-4′环状连接
<400>8
accccccccc ccccccccat atc    23
<210>9
<211>32
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(2)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(3)..(17)
<223>I
<400>9
ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa    32
<210>10
<211>32
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(16)..(17)
<223>2′-4′环状连接
<400>10
cccccccccc cccccccuuu uuuuuuuuuu uu    32
<210>11
<211>22
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(2)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(3)..(13)
<223>I
<400>11
ggaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa                22
<210>12
<211>22
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(11)..(12)
<223>2′-4′环状连接
<400>12
uuuuuuuuuu cccccccccc cc                         22
<210>13
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(2)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(3)..(17)
<223>I
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(18)..(23)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(24)..(38)
<223>I
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(39)..(40)
<223>2′-4′环状连接
<400>13
ggaaaaaaaa aaaaaaagtc gttaaaaaaa aaaaaaaagg     40
<210>14
<211>40
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(2)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(18)..(23)
<223>2′-4′环状连接
<221>修饰的碱基
<222>(39)..(40)
<223>2′-4′环状连接
<400>14
cccccccccc cccccccaac gacccccccc cccccccccc    40
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(2)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(3)..(17)
<223>I
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(18)..(23)
<223>2′-4′环状连接
<400>15
ggaaaaaaaa aaaaaaagtc gtt                      23
<210>16
<211>23
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(6)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(22)..(23)
<223>2′-4′环状连接
<400>16
aacgaccccc cccccccccc ccc                      23
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(15)
<223>I
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(16)..(21)
<223>2′-4′环状连接
<400>17
aaaaaaaaaa aaaaagtcgtt     21
<210>18
<211>21
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(16)..(21)
<223>2′-4′环状连接
<400>18
cccccccccc cccccaacga c    21
<210>19
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(1)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(2)..(16)
<223>I
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(17)..(22)
<223>2′-4′环状连接
<400>19
gaaaaaaaaa aaaaaagtcgtt    22
<210>20
<211>22
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(1)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(17)..(22)
<223>2′-4′环状连接
<400>20
cccccccccc ccccccaacg ac    22
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(2)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(3)..(17)
<223>I
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(18)..(23)
<223>2′-4′环状连接
<400>21
cgaaaaaaaa aaaaaaagtc gtt    23
<210>22
<211>23
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(2)
<223>2′-4′环状连接
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(18)..(23)
<223>2′-4′环状连接
<400>22
gccccccccc cccccccaac gac  23
<210>23
<211>6
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(6)
<223>2′-4′环状连接
<400>23
gtcgtt                      6
<210>24
<211>6
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(1)..(6)
<223>2′-4′环状连接
<400>24
aacgac                      6
<210>25
<211>22
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(12)
<223>2′-4′环状连接
<400>25
cccccccccc ccuuuuuuuu uu    22
<210>26
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(2)
<223>2′-4′环状连接
<400>26
ggcgtcgtta aaaaaaaaaa aaaaatgtcg ttg    33
<210>27
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(24)..(25)
<223>2′-4′环状连接
<400>27
uuuuuuuuuu uuuuutaacg acgcccaacg aca     33

Claims (15)

1.下式的化合物
Figure A2008800141440002C1
式IIa
其中：
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V、Z、Q和W是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m是从1到500的任意整数，或其间的任意数值；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核苷，或者R可以不存在；并且
-其中V、S、D、Z、Q、R和W中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
2.下式的化合物
Rk1-Vn-(Sm)-Wp-Rk2
式IVc
其中：
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V和W是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m是从1到500的任意整数，或其间的任意数值；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-k1和k2可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核苷，或者R可以不存在；并且
-其中V、S、R和W中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
3.下式的化合物
Rk4-Qp-(Dm)-Zn-Rk3
式IVd
其中：
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-Z和Q是任意核苷、核糖核苷、脱氧核糖核苷、核苷类似物、核糖核苷类似物或脱氧核糖核苷类似物；
-m是从1到500的任意整数，或其间的任意数值；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核苷，或者R可以不存在，在一些实施方案中，例如，第一链的5′R核糖核苷能够与第二链的3′R核糖核苷成键，并且；
-其中R、Z、D和Q中的一个或多个包含一个或多个锁核酸(LNA)单体。
4.制备下式化合物的方法，
Figure A2008800141440004C1
式IIa
其中
-n是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果n＝0则p＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-p是从0到10的任意整数，或其间的任意数值，条件是如果p＝0则n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
-V、W、Z和Q是任意核苷；
-m是从1到500的任意整数；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接基团连接到相应核苷的任意核糖核苷，或者R可以不存在，在一些实施方案中，例如，第一链的5′R核糖核苷能够与第二链的3′R核糖核苷成键，并且；
-其中V、S、W、Z、D和Q中的一个或多个包含一个或多个LNA单体，
所述方法包括：
以约0.5-1.0到约1.0-0.5的摩尔比将根据权利要求2之化合物的寡聚体与根据权利要求3之化合物的寡聚体相混合，并使所述第一和第二寡聚体退火形成双链化合物。
5.权利要求1-3中任一项的化合物，其中S是肌苷且D是胞嘧啶。
6.含有权利要求5的化合物、聚L-赖氨酸和羧甲基纤维素的组合物。
7.含有权利要求5的化合物和免疫原的组合物。
8.下式的化合物，
Figure A2008800141440005C1
式VIa
Figure A2008800141440005C2
式VIb
Figure A2008800141440005C3
式VIc
或
式VId
其中：
-ELNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、C、G中的一个或多个是LNA；
-FLNA是CpG或CpG基序，其中组成该CpG或CpG基序的核苷、C、G中的一个或多个是LNA；
-m是从1到500的任意整数，或其间的任意数值；
-S是肌苷、肌苷类似物核苷、腺嘌呤或腺嘌呤类似物核苷；
-D是胞嘧啶、胞嘧啶类似物核苷、尿嘧啶或尿嘧啶类似物核苷；
-k1、k2、k3和k4可独立地是0到10的任意整数，或其间的任意整数；
-R可以独立地为通过核苷间连接相连的任意核糖核苷。
9.根据权利要求8的式VIa、VIb、VIc或VId的化合物，其中S是肌苷且D是胞嘧啶。
10.含有权利要求9的化合物和免疫原的组合物。
11.一种化合物，其包含：
第一单链核苷酸多聚体，其包含1到500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷与胞嘧啶核糖核苷的组合，以及1到10个锁核酸残基；和
第二单链核苷酸多聚体，其包含1到500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷与胞嘧啶核糖核苷的组合，以及1到10个锁核酸残基；
其中所述第一单链核苷酸多聚体与所述第二单链核苷酸多聚体通过氢键键合而形成双链核酸，该双链核酸包含双链polyIC区以及含有锁核酸残基的双链区。
12.一种化合物，其包含：
第一单链核苷酸多聚体，其包含1到500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷与胞嘧啶核糖核苷的组合，以及根据SEQ ID NO：23的核酸序列；和
第二单链核苷酸多聚体，其由1到500个肌苷、胞嘧啶或者肌苷与胞嘧啶核糖核苷的组合，以及根据SEQ ID NO：24的核酸序列；
其中所述第一单链核苷酸多聚体与所述第二单链核苷酸多聚体通过氢键键合而形成双链核酸，该双链核酸包含双链polyIC区以及含有锁核酸残基的双链区。
13.含有权利要求11之化合物的佐剂组合物。
14.含有权利要求12之化合物的佐剂组合物。
15.含有权利要求12之化合物的TLR3和TLR9激动剂。
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