CN101686716B - 益生元 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含以下组分的组合物：-不含唾液酸寡糖的寡糖，和-游离唾液酸。
Description
技术领域
本发明涉及制备新颖的益生元组合物的方法。
背景技术
益生元
益生元(prebiotic)是一种不可消化的食物成分，其通过选择性地刺激结肠中有限量细菌之一的生长和/或活性而有益地影响宿主，并因此促进健康。通常，哺乳动物(优选人)可利用益生元。益生元主要是以有益的方式改变肠微生物区系(microflora)组成或代谢的短链碳水化合物。短链碳水化合物也可以称作寡糖，并通常含有3到10个糖基元或单糖。消耗寡糖时，未消耗的部分作为肠微生物区系的食物发挥作用。根据寡糖的类型，不同的细菌群被刺激或抑制。
被制备用于食品工业的寡糖不是单一的组分而是混合物，所述混合物含有具有不同寡聚化程度的寡糖，有时包括亲本二糖和单糖(Prapulla et al.(2000)Adv Appl microbial 47，299-343)。多种类型的寡糖作为天然组分存在于许多常见的食物(包括水果、蔬菜、乳和蜂蜜)中。寡糖的例子为半乳糖-寡糖(galacto-oligosaccharide)、乳果糖、乳蔗糖(lactosucrose)、果糖寡糖(fructooligosaccharides)、帕拉金糖(palatinose)或异麦芽糖寡糖、糖基蔗糖、麦芽糖寡糖(maltooligosaccharides)、异麦芽糖寡糖(isomaltooligosaccharides)、环糊精、龙胆二糖寡糖(gentiooligosaccharides)、大豆寡糖和木糖寡糖(xylooligosaccharides)(Prapulla et al.(2000)Adv Appl microbial 47，299-343)。
已作为潜在的益生元被研究过的候选的寡糖来自于发芽的大麦、葡聚糖、果胶、多聚半乳糖醛酸(polygalacturonan)、鼠李半乳糖醛酸、甘露聚糖、半纤维素、***半乳聚糖、***聚糖、***木聚糖、抗性淀 粉、蜜二糖、壳聚糖、琼脂糖、藻酸盐(Van Loo，2005，Food Science andTechnology Bulletin：Functional Foods 2：83-100；Van Laere et al.，2000，JAgric Food Chem 48，1644-1652；Lee et al.2002，Anaerobe 8，319-324；Hu etal，2006，Anaerobe 12，260-266；Wang et al，2006，Nutrition Research 26，597-603)。所有这些寡糖使用酶方法生产，所述酶方法涉及多糖的水解，或者涉及使用转糖基反应从更小的碳水化合物开始的合成。在一些情况下，应用处理或自动水解来解聚寡木质纤维素材料例如木聚糖(Vazquez et al，2006，Industrial Crops and Products，24，152-159)。
三种益生元——寡聚果糖(菊粉)、转半乳糖-寡糖和乳果糖通过增加Bifidobacteria和Lactobacillus数明显地改变大肠小型生物群(microbiota)的平衡(A.Singh et al：The future aspects of prebiotics on human health，Areview.www.pharmainfo.net；van Loon Food Sci Technol Bull：FunctionalFoods 2，83-100)。菊粉、果糖寡糖(FOS)、半乳糖寡糖和乳果糖在饮食中以相对小量(5-20g/天)被食用时，在人研究中清楚地显示出能刺激属于Bifidobacterium和Lactobacillus属的促进健康的物种生长。除了在母乳喂养的婴儿中以外，这些是肠中常规的但并非最大量的生物(A.Singh et al：The future aspects of prebiotics on human health，A review. www.pharmainfo.net及其中引用的参考文献)。推测通过益生元对Bifidobacteria和Lactobacilli的该选择性生长刺激要付出肠中其它细菌(例如Bacteroides、Clostridia、eubacteria、enterobacteria、enterococci等)生长的代价，尽管迄今为止对这些作用尚无严格的量化。
人肠道的小型生物群在健康中起重要作用，尤其是通过介导饮食对肠健康的许多影响来起作用。人大肠寄居了主要由厌氧细菌组成的稠密和复杂的群落。这些生物的活动通过提供养分、转化代谢产物和与宿主细胞相互作用，对宿主的营养和健康具有重大的影响。支持大肠微生物群落的能量来源是在上肠道中抗降解的饮食组分以及内源产物如粘蛋白。结肠中微生物群落的厌氧代谢产物与二氧化碳、氢和甲烷一起产生短链脂肪酸(Flintet al，Env Microbiol(2007)9，1101-1111)。这些作为能量来源、基因表达调节器、细胞分化剂和消炎剂对肠环境和宿主具有显著的影响。越来越多的 证据表明大肠中的细菌种群响应饮食中的改变，尤其是响应饮食碳水化合物的种类和数量。(Flint et al，Env Microbiol(2007)9，1101-1111)。人饮食中不可消化的碳水化合物类型和数量的改变既影响胃肠道下部区域中形成的代谢产物，又影响粪便中检测到的细菌种群。不可消化的碳水化合物例如菊粉、果糖寡糖和半乳糖寡糖目前被广泛用作益生元，从而操控肠小型生物群的组成。多种其它天然存在的寡糖以及合成产物具有体外选择效应(Manderson et al，2005，Appl Environ Microbiol 71，8383-8389)。益生元效应很可能被底物的许多特征影响，包括溶解度、链长度的分布、分支和取代基(Rossi et al，2005，Appl Environ Microbiol 71，6150-6158)。经分离的细菌体外利用经纯化的碳水化合物的能力测试能够提供混合的生态***(例如肠)中底物偏好的初步指征。预期对益生元的应答会取决于饮食背景和肠环境，并且会受到个体之间物种组成和定居的肠小型生物群变化的影响。
益生元寡糖显示具有多种促进健康的效应。尽管它们中不是所有都被完全证实，但是已推测了以下的有益效应(Swennen et al，Crit.Rev.Food SciNutr.2006，46，459-471)：减轻便秘、促进矿物质吸收、调节脂质代谢、降低结肠癌风险、有益于肝性脑病的治疗、对糖血症/胰岛素血症有积极作用和调控肠免疫***。从未证明益生元寡糖对学习能力、记忆形成和脑发育具有积极作用。
寡糖的生产
文献中已描述寡糖的生产。因为众所周知寡聚糖的化学合成是困难的，所以通常使用酶制备寡糖。例外是可以使用异构化反应的情况，例如乳果糖生产的情况。可以以游离形式使用酶，而不限制其在反应混合物中的移动。或者可以将酶固定在合适的运载体上，限制它们在反应体系中的移动。可以通过酶与运载体基质的共价偶联，或者通过酶在例如凝胶基质中的物理包埋获得固定化。固定酶的方法是本领域技术人员已知的；针对该议题存在综述文章(见例如Mateo et al 2007，Enz.Micr.Technol.40，1451-1463)。也可以将酶交联形成大聚集物，所述聚集物能够通过过滤容易地从反应成熟物中分离(综述见例如Margolin et al，2001，Angew.Chem. Int.Ed.40，2204-2222)。
使用β-半乳糖苷酶的半乳糖基转移酶活性，从乳糖商业生产半乳糖寡糖，所述活性在高乳糖浓度下支配乳糖水解。该方法已被详细描述，关于该议题有非常好的综述文章(见例如Mahoney，1998，Food Chem.63，147-154；Zarate et al 1990，J Food protection 53，262-268)。已描述了可用于寡聚化过程的多种β-半乳糖苷酶，并且在若干情况下也描述了反应产物(见例如Burvall et al 1979，Food Chem 4，243-249；Asp et al 1980，Food Chem 5，147-153)。
乳果糖通过碱性异构化过程产生，所述过程将乳糖中的葡萄糖基元转化为果糖残基。
乳蔗糖使用β-呋喃果糖苷酶的果糖基转移酶活性，用乳糖和蔗糖的混合物制造。
果糖寡糖通过两种不同的方法制造。一种是使用β-呋喃果糖苷酶的果糖基转移酶活性用二糖蔗糖制造，另一种是使用菊粉酶通过菊粉的受控酶水解制造。
帕拉金糖或异麦芽糖寡糖使用固定的异麦芽糖合酶用蔗糖生产。
糖基蔗糖使用环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶，用麦芽糖和蔗糖制造。
麦芽糖寡糖通过脱支酶(例如支链淀粉酶和异淀粉酶)与多种α-淀粉酶水解组合的作用从淀粉生产而来。
用于生产异麦芽糖寡糖、环糊精、龙胆二糖寡糖、大豆寡糖利木糖寡糖的方法也已被开发(参考文献见Prapulla et al.(2000)Adv Appl Microbial47，299-343及其中引用的参考文献)。
唾液酸表示N-乙酰基神经氨酸(Neu5Ac或NANA)。游离唾液酸表示与另一化合物结合或是另一化合物部分的唾液酸。
唾液酸寡糖
完全母乳喂养的新生儿的小型生物群含有按比例计更多的Bifidobacteria，这被认为是婴儿对病原性微生物防御的一部分，并且可能是婴儿免疫***的重要基础。该小型生物群由母乳中的寡糖提供营养，所述寡糖可以被认为是原始的益生元。特别感兴趣的是母乳含有相对高水平 的唾液酸寡糖。在经常被用于制备婴儿营养物的牛乳中这类寡糖的浓度明显更低。若干专利描述了如何提高牛乳中这类唾液酸寡糖的水平(例如US 6,706,497；US 5,374,541；US 5,409,817)。唾液酸乳糖(Sialyllactose)已被描述为能中和多种致病微生物的肠毒素，所述致病微生物包括Escherichia coli、Vibrio cholerae和Salmonella(US 5,330,975)。含唾液酸的寡糖对肠种群的其它有益影响已被描述，包括通过Helicobacter pylori建群来干涉(见例如US 5,514,660；US 5,164,374)。因此这些含唾液酸的碳水化合物也可以被归类为益生元，因为它们通过选择性地影响肠小微生物群有益地影响宿主。“唾液酸寡糖”的同义词是“富含唾液酸的寡糖”或“与寡糖结合的唾液酸”。
唾液酸
唾液酸包含约40个九碳糖神经氨酸衍生物的家族。其为pKa 2.2左右的强有机酸。自然界中不存在未取代形式的神经氨酸。氨基通常被乙酰化，得到N-乙酰基神经氨酸，其为最普遍的唾液酸形式，但是同样也存在其它形式(Traving et al Cell Mol Life Sci(1998)54，1330-1349)。已在动物界发现了唾液酸，从棘皮动物向上到人，但是没有迹象表明在原口目谱系的低等动物或植物中存在唾液酸。唯一已知的例外是在昆虫Drosophila的幼虫中存在多聚唾液酸。另外，在一些原生动物、病毒和细菌中存在唾液酸。唾液酸糖缀合物(sialoglycoconjugates)存在于细胞表面以及细胞内膜上。在高等动物中，它们也是血清和粘膜物质的重要组分。
唾液酸具有多种生物功能。唾液酸由于其负电荷而涉及带正电的分子(例如钙离子)的结合和转运，以及细胞和分子之间的吸引和排斥现象。除了它们的大小和负电荷以外，它们在碳水化合物链中暴露的末端位置使其针对分子或细胞的亚末端部分发挥防护屏的功能。它们可以例如防止糖蛋白被蛋白酶降解，或防止呼吸***的粘膜层受细菌感染。一种有趣的现象是含唾液酸分子上展示的蔓延效应，这归因于它们负电荷之间起作用的排斥力。这有助于稳定酶或膜(糖)蛋白的正确构象，并且对粘膜物质(例如在眼表面上或粘膜上皮上)的粘膜特性和由此导致的滑动和防护功能而言是重要的(Traving et al Cell Mol Life Sci(1998)54，1330-1349)。
唾液酸参与细胞和分子之间的多个识别过程。因此，免疫***可以根据它们的唾液酸模式在自身结构和非自身结构之间区别。糖代表抗原决定簇，例如血型物质，并且是许多内源物质(例如激素和细胞因子)受体的必需组分。另外，许多致病剂例如毒素(例如霍乱毒素)、病毒(例如流感)、细菌(例如Escherichia coli，Helicobacter pylori)和原生动物(例如Trypanosome cruzi)也通过含唾液酸的受体结合宿主细胞。另一类重要的唾液酸识别分子属于凝集素，其通常是来自植物、动物和无脊椎动物的，结合特异糖残基的寡聚糖蛋白。例子是小麦胚凝集素、Limulus polyphemus凝集素、Sambucus nigra凝集素和Maackia amurensis凝集素。这些外源凝集素似乎帮助植物防御含唾液酸的微生物或食用植物的哺乳动物。外源凝集素的哺乳动物复本包括选择蛋白(selectin)和涎免凝集素(siglec)(Travinget al Cell Mol Life Sci(1998)54，1330-1349)，并且具有多种生理作用。唾液酸也可以参与细胞和分子的掩蔽。红细胞被致密的唾液酸分子层覆盖，所述分子层在血细胞的生存周期中被逐步去除。代表降解信号的次末端半乳糖残基随后变得可以感知，暴露的血细胞随后与巨噬细胞结合并被吞噬。这类掩蔽策略的若干种其它例子是已知的。掩蔽也可具有有害作用，如从以下可以看出：一些肿瘤被唾液酸化的程度比相应组织的程度高得多。因此，被掩蔽的细胞是免疫防御体系不能感知的，高唾液酸含量也可以在进一步细胞生长抑制的缺乏中和蔓延中起作用。唾液酸的掩蔽效果也帮助隐藏寄生虫细胞上的抗原位点，使它们不被***感知。微生物物种例如某些E coli菌株和脑膜炎奈瑟菌(Neisneria gonorrhoeae)就是这种情况。
作为新兴益生元的唾液酸
来自糖巨肽(GMP)的基于唾液酸的寡糖关于预防感染的重要性体现在使用其作为新兴益生元的情况下(K.M.Tuohy G.C.M.Rouzaud CurrentPharmaceutical Design，2005，11，75-90)。另外，据报道来自人乳的含唾液酸的GMP是对双歧杆菌的有效生长促进因子，并且具有若干抗-致病性的属性(W.M.Bruck FEMS Microbial Ecol 2002；41：231-7)。在一个最近的综述文章(Sakaki Ken et al，Food Style 21(2002)，6(1)，64-67)中，描述了来自蛋的唾液酸和唾液酸寡糖的特征和应用。从文献数据中可以得出结论，与适当 寡糖组合的唾液酸可以被用作成功的益生元。所述制剂始终是唾液酸和含唾液酸的寡糖的混合物。据我们所知，含有游离唾液酸和未唾液酸化寡糖的制剂尚未被描述。
唾液酸的另一种非常重要的特性是其在动物研究中对脑发育、学习能力和记忆形成的影响。据报道，配方乳中唾液酸含量的变化清楚地影响早期学习行为和涉及唾液酸代谢的酶的基因表达(B.Wang et al Am.J.ClinNutr，2007，85，561-569)。同时，脑神经节苷脂(ganclicoside)和糖蛋白中唾液酸的浓度与喂养给大鼠仔的游离唾液酸量直接相关(S.E.Carlson，S.G.House The Jornal of nutrition，1986，881-886)。
人乳是唾液酸的富集来源，并且从人研究中发现，母乳喂养的婴儿的脑额皮质(frontal cortex)中唾液酸的浓度与配方喂养的婴儿相比显著更高(B.Wang et al Am.J.Clin Nutr，2003，78，1024-1029)。母乳喂养的婴儿的唾液中唾液酸的含量也是配方喂养的婴儿的两倍(H.T.Tram et al Arch.Dis.Child..1997，77，315-318)。
生产唾液酸化的寡糖
针对唾液酸生产的工业应用所开发的最大量并被授予专利的一类方法之一是生产含有唾液酸的多糖。存在使用不同的转唾液酸酶或唾液酸转移酶来酶促生产唾液酸化的寡糖的多种方法，其中大部分使用奶来源。美国专利No 5374541描述了生产唾液酸寡糖的方法。根据该方法，在存在CMP-唾液酸时使用β-半乳糖苷酶形成β-半乳糖苷，和使用α(2-3)-或α(2-6)-CMP-唾液酸转移酶形成唾液酸化的寡糖。美国专利No 5409817公开了用于生产α(2-3)-唾液酸半乳糖苷的三种酶方法。根据该方法，CMP-唾液酸转移酶将来自CMP-唾液酸的唾液酸转移至受体分子，这些受体分子成为Trypanosoma cruzi α(2-3)转唾液酸酶的供体分子，并且通过CMP-唾液酸合成酶与所添加的游离唾液酸的作用，在体系中再生CMP-唾液酸。美国专利No 5409817中所述方法特别要求添加游离唾液酸。游离唾液酸被CMP-唾液酸合成酶转化为CMP-唾液酸，并且唾液酸基元被CMP-唾液酸转移酶转移至受体分子上。根据公开内容，需要这些唾液酸化的受体分子的形成来驱动α(2-3)转唾液酸酶反应向前进行。除了游离唾液酸以外，该 方法还需要存在三种酶，包括CMP-唾液酸合成酶和CMP-唾液酸转移酶。另外，奶来源和乳酪加工废液不含有CMP-唾液酸合成酶。
加拿大专利No 2096923中描述了使用转唾液酸酶合成α(2-3)-唾液酸化的缀合物的更容易的方法。
美国专利No 6323008和美国专利No 6706497涉及在奶来源或乳酪加工废液中生产α(2-3)唾液酸寡糖的方法，所述方法通过将奶来源或乳酪加工废液与催化量的至少一种α(2-3)转唾液酸酶接触完成。在优选的实施方案中，该发明的方法被用于在奶来源或乳酪加工废液中生产α(2-3)-唾液酸乳糖。还提供了用于分离根据本发明方法生产的α(2-3)唾液酸寡糖的方法。
美国专利No 5908766描述了生产含有唾液酸的糖类的方法，其中β-半乳糖苷-α2，6-唾液酸转移酶被用于将唾液酸连接至糖缀合物糖链中半乳糖残基的6-位上，或游离糖链中半乳糖残基的6-位上，或下述单糖的6-位上，所述单糖在6-位碳上具有羟基并且能够形成寡糖或糖缀合物。
生产含唾液酸的寡糖的另一类重要的方法包括不同的唾液酸缀合物来源，以及涉及的其它类型的酶反应。
例如，α(2-3)-唾液酸乳糖典型地在转唾液酸酶催化的反应中被用作唾液酸供体。然而，由于例如可逆性和成本的限制，需要替代性的唾液酸供体。S.G Lee et al(Enzyme and Microbial Technology，2002，31(6)742-746)显示胎球蛋白可以在转唾液酸酶催化的反应中被用作唾液酸供体，所述胎球蛋白在其寡糖末端含有丰富的唾液酸。在几毫克胎球蛋白中166nmol的总唾液酸中，转唾液酸酶反应消耗125nmol唾液酸。使用胎球蛋白的转唾液酸酶反应是可逆的。胎球蛋白到Galβ(1，4)GlcNAc的唾液酸转移率与α(2-3)-唾液酸乳糖的相似，并且是4-甲基伞形基-α-(唾液酸(4-methylumbelliferryl-α-sialic acid)转移率的约30-40倍。转唾液酸酶反应使用200mg胎球蛋白和34mg乳糖分别作为供体和受体进行，并通过凝胶过滤柱纯化8mg产物，即α(2-3)-唾液酸乳糖。为了简化纯化步骤，如下进行转唾液酸酶反应：将含有胎球蛋白和转唾液酸酶的透析袋浸入乳糖溶液中并搅拌。
另外，可以获得使用蛋黄作为唾液酸来源的大量专利。
美国专利No 5233033涉及生产粗制唾液酸的方法，包括水解脱脂的蛋黄，还涉及生产高纯度唾液酸的方法，包括对可通过水解脱脂蛋黄获得的含唾液酸的溶液脱盐，将唾液酸吸附至阴离子交换树脂上，然后洗脱所述唾液酸。
在日本专利No 08266255中，通过用蛋白酶水解，从鸡蛋黄中获得含唾液酸的寡糖衍生物。蛋白酶处理显然释放寡糖；不清楚是否所有氨基酸从寡糖上被去除，或者残余的氨基酸是否仍然存在。
另一日本专利No 06245784介绍了含唾液酸及其衍生物的组合物的酶促生产。这些组合物如下制造：用酶(例如蛋白酶)处理脱脂的蛋黄，通过对水溶性级分进行超滤去除聚合物成分，并对化合物脱盐。将蛋黄粉与EtOH一起搅拌，得到脱脂的蛋黄。在50℃下在H2O中用蛋白酶A(蛋白酶)将1吨脱脂蛋黄处理8小时，然后超滤并脱盐，得到300kg组合物，所述组合物含有游离唾液酸7.5，肽25，唾液酸寡糖75％。
美围专利No 1523031涉及工业规模提取和生产乳血清唾液酸的方法，所述方法包括以下步骤：水解步骤，使用乳血清粉和水去除蛋白质，调节pH值，然后加热并过滤；超滤去除杂质的步骤，使用捕获分子量为6000-8000的膜进行过滤；离子交换步骤，使用5-15L碱性树脂按照1-3m的线性速度吸收滤液，用水洗涤后，使用pH梯度进行洗脱；和浓缩结晶步骤，收集浓缩物，结晶，干燥或冷冻干燥以获得发明产物。
日本专利No 11180993描述了从乳糖结晶后的母液或乳清制备唾液酸化合物。如下制备唾液酸化合物：将乳糖结晶后的母液或乳清经过弱碱性阴离子交换树脂柱，然后洗脱吸附的唾液酸。用阴离子交换树脂处理之前，乳清或母液可以经过阳离子交换树脂。可例如通过电透析预先将乳清或母液的盐强度调节为电导率≤3.0mS/cm。通过电透析器将乳酪乳消(固体含量6％)脱盐至电导率1.25mS/cm，并通过IR 120B强酸性阳离子交换柱，然后通过Diaion WA 10弱碱性阳离子交换柱。用水性AcONa溶液处理阴离子交换柱，得到含1.3g/L唾液酸的洗脱液(唾液酸乳糖中0.5g/L，配糖巨肽中0.4g/L)。
全面加工和使用家禽蛋的方法展示于中国专利No 1511465中，并涉及用家禽蛋生产多种制品例如唾液酸、蛋清蛋白质、蛋黄氨基酸、卵磷脂、溶菌酶等的技术。该发明描述了将家禽蛋洗涤、弄碎并分离，获得蛋壳、蛋清和蛋黄；通过与水混合、调节pH、水解、离子交换、喷雾干燥、相分离和其它步骤，将蛋黄生产成唾液酸和卵磷脂；并通过pH调节、阳离子交换和其它步骤将蛋清生产成溶菌酶和蛋清蛋白质。
从乳清中提取糖蛋白和唾液酸的另一种方法描述于带有少许不同的两个专利中：美国专利No 4042576和美国专利No 4042575。其包括下述方法的开发，所述方法用于从奶或酪蛋白工厂乳清中分离唾液酸和糖蛋白。通过热处理使蛋白质絮凝，将上清液超滤并通过水解处理超滤渗余物(retentate)，然后从水解上清液中提取唾液酸。
唾液酸的生产
通常可以通过酶促合成和化学合成二者供应唾液酸。化学合成不是容易的工作，这清楚地从可商业获得的合成生产的唾液酸的价格中反映出来。因为Neu5Ac代表牛乳中约95％的总唾液酸，并且显然是人乳中最丰富的唾液酸，所以对其特别感兴趣。另外，文献中描述的对唾液酸的大部分研究使用Neu5Ac完成。
唾液酸的生物合成通过N-乙酰甘露糖胺或甘露糖和丙酮酸的羟醛缩合进行(F.Kimio，Trends in Glycoscience and Glycotechnology，2004，16(89)143-169，K.Viswanathan，S.Lawrence，S.Hinderlich，K.J.Yarema，Y.C.Lee，M.J.Betenbaugh，Biochemistry，42(51)，15215-15225，2003)。已证明昆虫细胞可以被改造为生产唾液酸化底物，尤其可以被用于生产唾液酸，例如Neu5Ac。通过改变特定的通路基因以及涉及的底物，确定了具体的加工步骤能够限制唾液酸的生产。另外，可以使用底物补料替代方案和多种基因表达的合适组合来控制唾液酸水平以及形成的唾液酸类型。据报道在存在外源补料的ManNAc时，被带有唾液酸-9磷酸合成酶基因的杆状病毒转染的Sf9细胞能够合成Neu5Ac和KDN。观察到补充ManNAc提高Neu5Ac水平，直至补充20mM ManNAc为止。Neu5Ac生产的该提高清楚地表明Sf9细胞中Neu5Ac合成可用的ManNAc的限制作用。然而，与使用20 mM ManNAc获得的水平相比，50mM ManNAc的添加仅给出Neu5Ac合成的12％的提高。因此，昆虫细胞中存在唾液酸通路中的瓶颈，从而将培养基中存在的ManNAc水平提高至高于20mM不引起产生的Neu5Ac量的显著增强。该瓶颈可存在于涉及ManNAc转运进入细胞的步骤中，或者存在于ManNAc成为底物的代谢转化中，所述底物可被唾液酸合成酶利用。然而，与对照培养物裂解物相比，被AcSAS-感染的裂解物中细胞内Neu5Ac仍然超过100倍。然而，对照培养物中存在可检测的Neu5Ac表明，昆虫细胞可含有非常低的内源水平的唾液酸合成酶。事实上在Drosophila melanogaster中检测到过唾液酸合成的基因，尽管在SchneiderS2细胞系中不能检测到内源酶活性。也在AcSAS转染后产生替代性的唾液酸KDN。在ManNAc补料后，由于Neu5Ac合成的快速提高，KDN与Neu5Ac的比例可观地降低，表明ManNAc-6-P是优选的SAS底物。尽管清楚地表明能通过昆虫细胞生产NeuAc，但是据我们所知，该方法未被商业使用。这可能是由于过高的加工成本引起的。
生产含唾液酸的化合物的一些方法不使用酶促反应而是使用化学方法。这些方法中的一些描述于专利文献中。美国专利No 5270462涉及制造含唾液酸的组合物的方法。该方法包括步骤：(a)将乳酪乳清或粗制凝乳酶乳清调节至pH 2-5；(b)将乳清与阳离子交换器接触，产生通过交换器的溶液；(c)将通过交换器的溶液的pH调节至4或更低；和之后(d)将通过交换器的溶液浓缩和/或脱盐。提出了生产具有大量唾液酸的组合物的可能性。
唾液酸酶
唾液酸酶(神经氨酸酶，EC 3.2.1.18)能水解糖蛋白、糖脂、神经节苷脂、多糖和合成分子中的末端非还原性唾液酸键。一些唾液酸酶(称作转唾液酸酶)也能够进行转移反应，其中所述唾液酸酶将唾液酸残基从一个分子转移至另一个分子。唾液酸酶在后口动物谱系(棘皮动物到哺乳动物)的动物中是常见的，在多种微生物中也是常见的，所述微生物主要作为动物共生体或病原体存在。唾液酸酶及其唾液酸底物似乎不存在于植物和大部分其它后生动物中。即使在细菌中唾液酸酶也是不规则存在的，从 而相关的物种或甚至同一物种的菌株在这一特性上不同。唾液酸酶还存在于病毒和原生动物中(Traving et al Cell Mol Life Sci(1998)54，1330-1349)，并且还在真菌中发现唾液酸酶活性(Uchida et al 1974，Biochim Biophys Acta350，425-431)。含有唾液酸酶的微生物通常与作为宿主的高等动物接触生存，例如作为寄生虫生存。此处它们具有下述营养功能，所述功能使得它们的拥有者清除宿主唾液酸作为碳源使用。对一些微生物病原体而言，相信唾液酸酶发挥致病因子的作用。然而，唾液酸酶作为发病机制中因子的作用是有争论的。一方面，它们证实了致病微生物物种如Clostridiumperfringens的影响。另一方面，这些酶是许多非致病性物种(包括高等动物)的碳水化合物代谢中常见的因子。然而，它们不展示直接的毒效应(Traving et al Cell Mol Life Sci(1998)54，1330-1349)。取而代之，它们的有害效应取决于在非生理条件下被宿主唾液酸诱导后与其它有毒因子一起被释放进宿主中的酶总量。
哺乳动物唾液酸酶的大小通常约40-45kDa。尚末报道将哺乳动物唾液酸酶过表达和生产至工业上感兴趣的量的尝试。人唾液酸酶可以是与溶酶体、胞质或膜结合的酶(Achyuthan and Achyuthan(2001)Comp.Biochem.Phys.Part B，129，29-64)。溶酶体唾液酸酶是糖基化的酶。唾液酸酶含有保守的基序。最突出的保守基序是所谓的Asp-盒，其为通式-S-X-D-X-G-X-T-W-的氨基酸区段，其中X代表可变的残基。该基序在所有微生物的整个序列中出现四到五次，例外是病毒唾液酸酶，其中该基序仅存在一次或两次或甚至不存在。第三种Asp-盒比Asp-盒2和4更强有力地保守。在不同的一级结构之间，两个相继的Asp-盒之间的间隔也是保守的(Traving et alCell Mol Life Sci(1998)54，1330-1349)。Asp-盒可能具有结构作用，并且可能不涉及催化。与Asp-盒相反，FRIP-基序位于氨基酸序列的N-端部分。其包括氨基酸-X-R-X-P-，其中精氨酸和脯氨酸残基绝对保守。精氨酸通过与底物分子结合而直接涉及催化。对催化作用而言，asp-盒3和4之间富含谷氨酸的区域以及另外两个精氨酸残基也是重要的(Traving et al CellMol Life Sci(1998)54，1330-1349)。
微生物唾液酸酶可以根据其大小被分类两类：约42kDa的小型蛋白 质，和60-70kDa的大型蛋白质。大型唾液酸酶的一级结构在N-端和第二Asp-盒之间以及第五Asp-盒与C-端之间含有额外的氨基酸区段。相信它们有助于大型唾液酸酶更广泛的底物特异性。与哺乳动物唾液酸酶相似，细菌复本含有F/YRIP基序和若干个Asp-盒。细菌唾液酸酶通常涉及粘膜感染和毒力。因此，更大的细菌唾液酸酶不被认为适合用作食物或药物应用中的加工助剂。如上文所述，已在细菌中鉴定出了小型唾液酸酶(与哺乳动物唾液酸酶大小相同)。即Clostridium perfringens含有大小为约40kDa的小型唾液酸酶，不含有其它细菌中唾液酸酶常见的延伸。然而该Clostridium唾液酸酶不由细菌分泌，因此也涉及毒力(Roggentin et al.(1995)Biol Chem Hoppe Seyler 376，569-575)。吸引人的是推测只有具有额外延伸的细菌唾液酸酶涉及致病性。细菌唾液酸酶在E.coli中的过表达通常导致低生产力；在E.coli中小型Clostridium唾液酸酶仅能作为细胞内蛋白质被生产至1mg/l(Kruse et al.(1996)Protein Expr Purif.7，415-422)。因此在食物和药物应用中，对良好生产的小型无毒唾液酸酶存在清楚的需要。
发明内容
本发明涉及包含以下的组合物：
-寡糖，
-唾液酸寡糖，其含量为存在的寡糖总量的0到1wt％、优选地少于0.1wt％，
-游离唾液酸。
优选地，该组合物包含的唾液酸寡糖的量少于存在的寡糖总量的1wt％，优选地少于0.1wt％，最优选地基本不含唾液酸寡糖。
本发明的组合物包含的游离唾液酸的量优选地多于存在的寡糖和游离唾液酸总量的0.001wt％，优选地多于0.01wt％，进一步更优选地多于0.1wt％，最优选地多于1wt％。
本发明的组合物优选地包含少于0.5wt％(干物质)的岩澡糖，更优选地包含少于0.1wt％(干物质)的岩澡糖，最优选地包含少于0.01wt％(干物质)的岩澡糖。
该组合物有利地为适合人消耗的益生元组合物。
本发明的组合物可以在下述方法中生产，所述方法包括：
-对第一合适底物进行合适的酶处理，产生寡糖，和
-对第二合适底物进行唾液酸酶处理，产生游离的唾液酸。
本发明的方法可以以若干种方式完成，例如第一和第二底物可以是相同的，继而两个步骤可以在一个反应器中进行。在另一实施方案中，所述步骤会先后发生。还在另一实施方案中，所述步骤单独发生，并将唾液酸和寡糖合并。
根据本发明的另一方面，公开了固定的唾液酸酶和生产唾液酸酶的方法，所述方法中所使用的唾液酸酶被固定。
本发明还涉及包含本发明组合物的食物(包括饮品)或饲料，或用本发明的方法生产的组合物。
本发明涉及使用新颖的唾液酸酶制备益生元组合物的酶促方法，所述益生元组合物含有益生元寡糖和游离唾液酸。益生元组合物的特征是以下组合物：
·其不含唾液酸寡糖(＜制剂中总寡糖的1.0wt％，优选地＜0.1wt％)
·游离唾液酸的量优选地大于益生元组合物中唾液酸和寡聚益生元总重量的0.001％，更优选地大于益生元组合物中唾液酸和寡聚益生元总重量的0.01％，进一步更优选地大于益生元组合物中唾液酸和寡聚益生元总重量的0.1％，最优选地大于益生元组合物中唾液酸和寡聚益生元总重量的1％。
所述方法包括将含有能够形成益生元寡糖的底物的溶液与能够释放唾液酸的底物组合接触。
用于益生元寡糖的底物可以是以下底物之一或其组合：奶组合物、乳糖、蔗糖、菊粉、麦芽糖、大豆、淀粉、葡萄糖浆或木聚糖，优选地为奶组合物。寡糖的生产是本领域已知的，并且可以使用例如本发明的背景技术部分中所述方法。
用于唾液酸的底物可以是以下底物之一或其组合：奶组合物、蛋黄或 脱脂蛋黄，优选奶组合物。
唾液酸的释放使用唾液酸酶进行，优选地使用本申请中所述酶进行。益生元寡糖的形成可以使用适用于所选底物的任何酶进行。
发明详述
本发明的益生元组合物在工业上是吸引人的，因为其结合了益生元寡糖与游离唾液酸的有益效应。与目前可用并描述过的唾液酸寡糖及其使用转唾液酸酶的制备方法相比，本发明的优点在于可以根据偏好选择游离唾液酸与益生元寡糖的比例。另外，可以将唾液酸与任何类型优选的益生元寡糖组合，而在唾液酸寡糖的制剂中，只能使用能够作为转唾液酸酶的底物发挥作用的寡糖。
本发明基于我们的下述发现：益生元组合物包含唾液酸以及寡糖。在现有技术中，唾液酸被构建在寡糖之内。这导致产生包含两种元件的唾液酸寡糖。尽管这些唾液酸寡糖是非常有用的制品，但是其生产除了复杂之外还非常昂贵，目前尚无已知的经济的吸引人的途径。根据本发明提供了一种便宜的替代方案，所述方案具有唾液酸寡糖的所有积极效果，并且可以通过简单并且经济上吸引人的方式生产。在所有情况下，现有技术中所述寡糖制剂原样被描述，或是作为游离唾液酸与含唾液酸的寡糖的组合被描述。在使用转唾液酸酶的一些情况下，所述方法似乎被优化为尽可能多地降低游离唾液酸的水平，以促进唾液酸寡糖中唾液酸的吸收。本发明基于下述见解：对人或其它哺乳动物而言，不含唾液酸寡糖的寡糖和游离唾液酸的组合与唾液酸寡糖具有相同的有益效果。
尽管在真菌中已证明了唾液酸酶活性(Uchida et al 1974，BiochimBiophys Act 350，425-431)，但是迄今为止在植物和真菌中尚无唾液酸酶在分子水平上被鉴定(即尚未描述氨基酸序列或基因序列)。
特别地，分泌型真菌唾液酸酶的发现是有益的，因为分泌型酶可以容易地从真菌培养物中大量过表达和纯化。这可观地降低了生产唾液酸酶的***格。另外，这会允许从例如奶组合物和蛋黄中低成本地生产唾液酸。这会打开生产新一代益生元组合物的通路，所述益生元组合物包含未 唾液酸化的益生元寡糖和游离唾液酸的组合。据我们所知，游离唾液酸和未唾液酸化的益生元寡糖的组合尚未被描述。
新颖的唾液酸酶
本发明涉及生产含有游离唾液酸和益生元寡糖的益生元组合物的方法，所述寡糖例如但不限于半乳糖寡糖、果糖寡糖和乳果糖。唾液酸的低成本的酶促生产需要获得良好生产的唾液酸。唾液酸仅可以小量地商业获得。Sigma公司以几mg量的酶 15.20到约 1500的价格提供唾液酸酶，这不允许从天然来源低成本地生产唾液酸。在本申请中，我们描述了新颖的真菌唾液酸酶的鉴定，所述唾液酸酶已在真菌Penicilliumchrysogenum中被鉴定。
本发明有利地满足了可以大量生产的唾液酸酶的需要。优选地，这样的唾液酸酶由宿主细胞分泌。活性分泌对经济的生产方法而言是至关重要的，因为其使得以几乎纯净的形式回收酶而不经历麻烦的纯化过程。食品级别的真菌宿主例如Aspergillus对这类活性分泌型唾液酸酶的过表达得到食品级别的酶和低成本的生产方法，因此是优选的。本文的分泌型唾液酸酶首次在丝状真菌中被发现。公开了通过食品级别生产宿主Aspergillusniger大量生产唾液酸酶的方法。
从经济学角度来看明显需要一种改进的手段，该于段与哺乳动物和细菌唾液酸酶的较差生产力相比以高数量和相对纯净的形式生产唾液酸酶。一种优选的方式是通过使用重组DNA技术过量生产这样的唾液酸酶来实现。一种尤其优选的方式是通过过量生产来自真菌的唾液酸酶来实现，最优选的方式是通过过量生产来自Penicillium的唾液酸酶来实现。为了能够进行后一生产途径，来自Penicillium的唾液酸酶的独特序列信息是必需的。更优选地，必须能够获得编码基因的完整核苷酸序列。我们已在Penicillium chrysogenum的基因组中鉴定了这类唾液酸酶。其氨基酸序列作为SEQ ID No 3给出，其相应的基因组核苷酸序列在SEQ ID No 1中给出，其编码序列在SEQ ID No 2中给出。新颖的酶在Aspergillus niger中被良好生产，并且具有唾液酸酶活性。
奶组合物
根据本发明的奶组合物可以是包含牛乳组分的任何组合物。牛乳组分可以是乳的任何组分(除水以外)，例如乳脂肪、乳蛋白质、酪蛋白、乳清蛋白和乳糖。乳级分可以是乳的任何级分，例如脱脂乳、酪乳、乳清、奶油、乳粉、全乳粉、脱脂乳粉。在本发明的一个优选的实施方案中，奶组合物包括乳、脱脂乳、酪乳、全乳、乳清、奶油或其任何组合。在一个更优选的实施方案中，奶组合物由乳组成，所述乳例如为脱脂乳、全乳、奶油或其任何组合。
在本发明的其它实施方案中，奶组合物全部或部分由干燥的乳级分制备，所述乳级分例如全乳粉、脱脂乳粉、酪蛋白、酪酸盐、全乳蛋白质或酪乳粉、或其任何组合。奶组合物还包括在乳酪制造中生产的乳清溶液。任何乳酪制造过程都会产生乳清溶液，并且该组合物随着乳酪制造方案而变化。
还在本发明的另一个实施方案中，奶组合物全部或部分由下述乳或乳级分制备，所述乳或乳级分已进行了蛋白水解降解来制备乳蛋白质水解产物。这些乳蛋白质水解产物可以与乳或乳级分组合形成奶组合物。
根据本发明，奶组合物包含牛乳和一种或多种牛乳级分。牛乳级分可以来自任何品种的牛(Bos Taurus(Bos taurus taurus)，Bos indicus(Bos indicustaurus)及其杂交种。在一个实施方案中，奶组合物包含来自两种或更多品种牛的牛乳和/或牛乳级分。奶组合物还包含来自用于乳酪制备的其它哺乳动物的乳，例如来自山羊、水牛或骆驼的乳。
可以通过去除任何生乳组分的全部或部分和/或通过添加额外量的这类组分，将用于生产乳酪的奶组合物标准化为期望的组合物。这可以通过例如在乳到达奶厂的时候将其分离为奶油和乳来实现。因此，可以如常规所进行的如下制备奶组合物：将乳分级并合并级分，从而获得期望的奶组合物的最终组成。分离可以在连续离心机中进行，得到具有非常低脂肪含量(即＜0.5％)的脱脂乳级分和含有例如＞35％脂肪的奶油。可以通过混合奶油和脱脂乳制备奶组合物。在另一实施方案中，可以通过使用超滤来标准化蛋白质和/或酪蛋白含量。奶组合物可具有任何下述总脂肪含量，所述总脂肪含量适用于要通过本发明方法生产的乳酪。
在本发明的一个实施方案中，向奶组合物中添加钙。可以在乳酪制造之前和/或期间的任何合适步骤中向奶组合物中添加钙，例如在添加初始培养物之前、同时或之后添加。在一个优选的实施方案中，在热处理之前和之后均添加钙。可以以任何合适的形式添加钙。在一个优选的实施方案中，作为钙盐例如CaCl2添加钙。可以向奶组合物中添加任何合适量的钙。添加的钙的浓度通常会在0.1-5.0mM的范围内，例如在1和3mM之间。如果向奶组合物中添加CaCl2，则该用量通常会在每100升奶组合物1-50g的范围内，例如在每1000升奶组合物5-30g的范围内，优选地在每100升奶组合物10-20g的范围内。
益生菌(probiotic)
本发明的组合物优选地还包含益生菌。
益生菌或益生菌组合物被定义为活微生物食物成分，其以充足的量被施用时对宿主赋予健康益处。益生菌或益生菌组合物的标准为：通过胃肠道时存活，无毒，无致病性，精确的分类学身份，在胃肠道中增殖和有代谢活性的能力，可证实的健康益处(例如免疫调控、促进胃肠道中的细菌平衡)，加工、储存和递送、生产期间的菌株稳定性，高细胞密度下的生存力。
固定化酶
固定化酶是与惰性、不溶材料结合的酶。
在食物或食物成分的加工中，酶具有优于化学催化剂的不同优点，其中最值得注意的是在温和的温度和pH条件下的底物特异性和活性。然而，使用可溶酶的成本是一个缺点。为此，人们对固定化酶的使用感兴趣。这些固定化酶被物理上限制或位于空间的某确定区域中并保留其催化活性，并且它们可以被重复和连续地使用。酶固定的优点包括：
·再使用或连续使用催化剂，从而降低主要和循环加工成本
·产物中不存在酶，因此潜在地允许使用比食物中通常允许的更广泛的酶
·易于终止反应而不需要猛烈的措施例如热变性或极端pH
·在一些情况下，更强的热稳定性和pH稳定性，防止自身被蛋白酶 消化，和稳定其三级结构，潜在地延长其有用寿命
·更少的产物抑制，和通过连续过程消耗更多底物，得到更快的转化
主要的缺点是生产固定化酶的成本，包括支持物的成本，和通常由扩散限制、pH移位和分隔所导致的改变的反应动力学。另外，不存在一种完美的、通用的固定方法；每种最终用途都需要根据下述标准评价各个步骤，所述标准例如固定的目的、活性、稳定性、简单性和经济可行性。
存在用于酶固定的许多不同方法，主要分类为针对不溶酶的方法和针对可溶酶的方法。针对不溶酶的方法的进一步分类是酶的结合或捕获。对这些方法中的每一种而言，存在不同的技术。对酶与运载体的结合而言，以下的技术是已知的：
·物理吸附：酶通过物理相互作用例如范德华力、氢键或亲水-疏水作用与支持物表面结合
·离子结合：结合力为离子-离子相互作用，其比单纯的物理吸附更强
·螯合物结合：过渡金属例如钛或锆的螯合特性被用于将酶和有机材料或无机支持物偶联
·生物特异性结合：酶和其它物类(例如外源凝集素或抗体)之间的生物特异性相互作用被用于结合酶
·共价结合：不溶于水的运载体可以通过氨基酸残基的反应性侧基(例如氨基、羟基、硫氢基或酚基)与酶共价结合，所述反应性侧基末与活性位点或底物结合位点结合
结合酶的其它技术是交联和酶共聚合。在交联中如下固定酶：将酶与其它酶分子或惰性蛋白质(例如白蛋白)交联并沉淀得到的聚集物。该方法也可以与运载体(例如膜)组合使用，其中经物理吸附的酶被交联在膜表面上。在酶共聚合中，酶与聚合物基质共聚合，例如用酰化或烷化单体将酶乙烯化并与其它单体共聚合。
酶的捕获可以被认为是酶在半渗透性基质中的物理限制，这对于要保持的酶而言必须足够紧密，但是必须允许底物和产物渗透。捕获技术为：
·凝胶捕获：游离的酶被捕获在交联的、不溶于水的聚合物凝胶(例 如藻酸盐、琼脂、κ-角叉菜胶)的间质空间中
·微囊化：通过将酶包封在可渗透底物和产物的膜中将其固定，通常在存在表面活性剂时制备有机相和含酶水性相的乳剂，然后向其中添加成膜聚合物，得到的微囊通常具有1到100μm的直径
·反胶束：在烃溶剂中，两亲型表面活性剂分子可以形成反胶束，酶被包含在胶团的水库(water pool)中，并且由于表面活性剂的保护而免受有机溶剂的影响。
用于固定可溶酶的方法具有以下优点：所述酶处于其天然状态和微环境中，这不会导致酶活性的降低。这可以如下实现：通过半渗透性的膜将酶溶液与底物和产物分离，所述膜允许底物和产物扩散并且物理上限制更大的酶分子。这可以通过平层超滤(flat sheet ultrafiltration)或微孔过滤膜或中空纤维膜来实现。在这种情况下，能够透过膜扩散的辅因子可以通过与更大的分子偶联而被保持在反应区内。最后一种固定方法是使用固定化酶在不同条件下的可变溶解度，称作可溶-不溶固定化酶。一个例子是固定在多聚(L-谷氨酸)上的纤维素酶，其在中性和碱性溶液中是可溶的，但是可以通过降低pH被沉淀而不丧失酶活性(Clemmings et al，1999，WileyEncyclopedia of Food Science and Technology(2nd edition)Volumes 1-4，JohnWiley&Sons，p 1342-1345；Prenosil et al，2007，Ullmann’s Encyclopedia ofIndustrial Chemistry(7th edition))。
制备含有游离唾液酸的益生元组合物
在本申请前文中已描述了酶催化制备益生元寡糖的方法。可以使用相同的技术，从与先前所述相同但补充一种或多种含唾液酸底物的初始材料开始，制备含有游离唾液酸的益生元组合物制剂。这类底物已在本申请的前文中描述，并且包括奶组合物和蛋蛋白质制剂。含游离唾液酸的益生元组合物优选地在一个步骤的方法中制备，其中将用于制备益生元寡糖的底物和唾液酸混合，并用酶组合处理，所述酶组合中的一种酶是唾液酸酶。在一个优选的实施方案中，使用β-半乳糖苷酶和唾液酸酶由奶组合物制备含有游离唾液酸的益生元组合物。可以向底物中添加酶，得到含有酶和底物二者的均相溶液。适当的反应时间后，当游离唾液酸和寡糖形成后，可 以使用例如热处理或本领域技术人员已知用于使酶失活的其它方法使酶失活。可以将含有游离唾液酸的益生元制剂进一步加工，以浓缩反应混合物或去除不想要的组分。合适的技术是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于超滤、喷雾干燥和色谱技术。
在另一个实施方案中，唾液酸的形成和酶寡糖的酶促形成可以是相继的反应。唾液酸的形成可以在寡糖形成之前，或者唾液酸可以仅在寡糖形成之后被解离。
固定化酶也可以被用于含游离唾液酸的益生元组合物的酶促制备。可以将固定化酶悬浮于反应混合物中，形成想要的益生元组合物。然后通过过滤容易地去除酶，之后所述酶可以被重复使用。或者可以将固定化酶填充在柱中，并将底物溶液泵过柱。可以调整底物在柱中的滞留时间，以形成想要的含游离唾液酸的益生元组合物。这样的方法已被描述例如用于生产半乳糖寡糖(见例如Ekhart et al，J Food Protection 53，262-268)。另外，在固定化酶的情况下，酶处理在时间上可以是分离的，如前文所述。
在一个优选的实施方案中，底物是含有益生元寡糖和唾液酸二者相关前体的混合物。在另一个实施方案中，用于寡糖形成利唾液酸形成的底物可以存在于单独的容器或管中。这允许单独进行寡糖和唾液酸的酶促生产，之后通过将两种反应产物混合，得到含有益生元寡糖与游离唾液酸的组合物。
附图说明
图1：称作pGBFINZJW的ZJW表达载体。
图2：与0.04u/ml唾液酸酶孵育后，来自乳清底物(方形)和乳底物(圆形)的唾液酸释放。虚线是相应的背景测量，其中添加milliQ水代替唾液酸酶。
实施例
实施例1
唾液酸酶基因ZJW的克隆和表达
在30℃下在PDB(马铃薯右旋糖发酵液，Difco)中将Penicilliumchrysogenum菌株CBS 455.95培养3天，并使用Q-Biogene试剂盒(产品目录号nr.6540-600；Omnilabo International BV，Breda，荷兰)，根据供应商的说明书从菌丝体中分离染色体DNA。使用该染色体DN A通过PCR扩增唾液酸酶基因的编码序列。
为了从Penicillium chrysogenum菌株CBS 455.95的染色体DNA中特异地扩增唾液酸酶基因ZJW，设计两种PCR引物。引物序列部分得自在Penicillium chrysogenum CBS 455.95的基因组DNA中发现的序列，并且在SEQ ID NO：1中展示。我们发现该序列与放线菌属(Actinomyces)和节杆菌属(Arthrobacter)的唾液酸酶序列具有同源性。然而，尚未描述过同源的真菌唾液酸酶。因此我们能够发现编码来自真菌的分泌型唾液酸酶的基因是令人惊讶的。我们在本文中第一次描述了分泌型真菌唾液酸酶的有效表达和表征。完整的唾液酸酶蛋白质的蛋白质序列在SEQ ID NO：3中展示，所述序列包括可能的前序列(pre-sequence)和原序列(pro-sequence)。真菌酶与细菌同源物相比的优点在于真菌酶可以容易地以适合在食品工业中应用的用量被过表达和分泌。
Zjw-dir 5′-CCCTTAATTAACTCATAGGCATCATGCTATCTTCATTGATGTATTT
Zjw-rev 5′-TTAGGCGCGCCGTACATACATGTACACATAGACC
第一个正向PCR引物(ZJW-dir)含有从ATG起始密码子处开始的23个核苷酸的ZJW编码序列，之前是包括PacI限制性位点的23个核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。第二个反向引物(ZJW-rev)含有与ZJW编码序列下游区域反向链互补的核苷酸，之前是AscI限制性位点(SEQ ID NO：5)。使用这些引物，我们能够用来自Penicillium chrysogenum菌株CBS 455.95的染色体DNA作为模板，扩增1.4kb大小的片段。分离由此获得的1.4kb大小的片段，将其用PacI和AscI消化并纯化。将包含ZJW编码序列的PacI/AscI 片段与来自pGBFIN-5(WO 99/32617)的PacI/AscI phyA片段交换。得到的质粒是称作pGBFINZJW的ZJW表达载体(见图1)。通过用NotI消化线性化表达载体pGBFINZJW，所述NotI消化从表达载体中去除所有来自E.coli的序列。使用苯酚∶氯仿∶异戊醇(24∶23∶1)萃取和乙醇沉淀来纯化经消化的DNA。使用这些载体转化Aspergillus niger CBS513.88。Aspergillusniger转化步骤详尽地描述于WO 98/46772中。其还描述了如何在含乙酰胺的琼脂平板上选择转化体，和如何选择定向的多拷贝整合体。优选地，选择含有多拷贝表达盒的A.niger转化体进一步生产样品材料。对pGBFINZJW表达载体而言，纯化了30个A.niger转化体；首先将个体转化体涂布在选择性培养基平板上，然后在PDA(马铃薯右旋糖琼脂：PDB+1.5％琼脂)平板上涂布单个菌落。在30℃下生长1周后收集个体转化体的孢子。将孢子冷冻储藏并用于接种液体培养基。
使用含多拷贝表达盒的A.niger菌株，通过在摇瓶培养中培养所述菌株来生产样品材料。培养A.niger菌株和从培养液中分离菌丝体的一种有用的方法描述于WO 98/46772中。培养基在CSM-MES(每升培养基中150g麦芽糖、60g Soytone(Difco)、15g(NH4)2SO4、1g NaH2PO4 ·H2O、lg MgSO4 ·7H2O、1g L-精氨酸、80mg Tween-80、20g MES pH6.2)中。在发酵的第4-8天取出5ml样品，在5000rpm下在Hereaus labofuge RF中离心10分钟，并将上清液储存于-20℃下直至进一步分析。
用SDS-PAGE分析时清楚显示，含有pGBFINZJW载体的转化体分泌表观分子量约为50kDa的蛋白质。因为这稍大于根据蛋白质序列预测的分子量，所以我们推测当Penicillium chrysogenum唾液酸酶ZJW从Aspergillus niger中分泌时，在去除信号序列后发生了一些糖基化。
当按比例放大发酵和下游加工时，所选择的菌落可用于更大量真菌唾液酸酶的分离和纯化。该酶可被用于进一步分析，和用于不同的工业应用中。
实施例2
唾液酸酶ZJW的纯化和表征
如实施例1中所述通过发酵生产唾液酸酶。使用Amplex Red神经氨酸酶测定试剂盒(得自Invitrogen)测量酶活性。用milliQ-水将培养物滤液(100ml)稀释至4.8mS/cm的电导率，并使用Biomax-10膜(得自Millipore)通过超滤浓缩至70ml。使用NaOH将pH调节至6.0，并将样品上样在5ml HiTrapQ离子交换柱(得自Amersham，5ml/分钟)上，所述离子交换柱在20mM柠檬酸钠(pH6.0)中平衡。收集经过柱的、含有唾液酸酶的流出物，针对25mM Tris，HCl(pH7.0)透析，并上样于在相同缓冲液中平衡的5ml HiTrap Q FF(5ml/分钟)上。唾液酸酶存在于流出级分中并被收集。然后将酶溶液针对30mM柠檬酸钠(pH 4.0，缓冲液A)透析，并上样于在缓冲液A中平衡的5ml HiTrap SP柱(得自Amersham，5ml/分钟)上。将酶上样后，用3倍柱体积的缓冲液A洗涤柱，并用20倍柱体积的从缓冲液A到缓冲液B的线性梯度洗脱(缓冲液B：30mM柠檬酸钠，pH 4.0，含1M NaCl)。鉴定并合并含唾液酸酶的级分。使用牛血清白蛋白作为参照蛋白质，用Bradford试剂(得自Sigma)测定蛋白质浓度。十二烷基钠聚丙烯酰胺凝胶电泳上不存在污染条带，由此判断蛋白质纯度＞95％。唾液酸酶移动至47kD的表观分子量，该表观分子量稍高于以预测的氨基酸序列为基础计算的42.7kD的分子量。酶制剂对一系列底物ZAAXpNA(Z＝苯甲酰基，A＝丙氨酸，X任意氨基酸残基，pNA＝对-硝基苯胺)未显示蛋白水解活性，表明不存在内切蛋白酶活性。
实施例3
从乳和乳清中释放游离唾液酸
可以如下分析游离唾液酸：通过反相HPLC，在用DMB化合物标记后使用在310nm处激发、448nm处发射的荧光检测。该方法最近在文献(M.J.Martin et al Anal.Bional.Chem，2007，387，2943-29-49)中描述，并允许快速和精确地测定样品中的游离唾液酸含量。
样品制备
通过使用NILAC低热脱脂乳粉(NIZO，荷兰)重新得到乳；乳清得自当地的切达干酪(cheddar)生产设备。如下处理乳和乳清：在室温(20- 21℃)下将乳和乳清单独地与唾液酸酶ZJW(0.4U/ml)孵育，并在不同的时间通过将样品在95℃水浴中加热5分钟终止反应。进行一系列若干种唾液酸酶ZJW的浓度和孵育时间的实验。用于HPLC分析的样品必须不含蛋白质。因此，使用14000g离心15分钟，将样品用Nanosep超滤Eppendorff(10KD)过滤。离心后收集游离的蛋白质上清液，并用milliQ水稀释100倍，从而测量适当浓度范围内的唾液酸(使用RP HPLC方法的测量范围为5fmol-5nmol唾液酸)。
标记步骤
通过将25μL稀释的上清液转移至Eppendorf管中并与100μL反应混合物(DMB∶偶联溶液∶milliQ＝1∶5∶4)混合，进行标记。在50℃下500rpm的持续混合下，将样品在热混合仪中避光孵育。通过冰上冷却终止反应。将10μL反应混合物注射进HPLC体系中用于分析。
HPLC体系
注射器：Waters 2690分离模块。检测器：Waters 474扫描荧光检测仪(激发：310nm，发射：448nm)。柱：来自TAKARA BIO INC的PALPAK Type R，尺寸(L×ID)250×4.6mm，流速：0.9ml/分钟。运行时间：30分钟。溶剂：乙腈/甲醇/milliQ＝9/7/84(v/v/v)注射体积：10μL。柱温度：40℃。
游离唾液酸水平随时间提高，在4小时后达到约220mg/L的浓度；在孵育20小时后，游离唾液酸水平达到250mg/ml，表明基本上所有唾液酸已被释放(参考文献见：Takeuchi et al，1985，Agric Biol Chem 49，2269-2276)。显然，唾液酸酶ZJW能够有效和快速地从乳中κ-酪蛋白以及乳清中GMP-蛋白质释放所有可用的唾液酸。
Claims (14)
1.生产组合物的方法，所述组合物包含：
-寡糖，
-0到1wt％的唾液酸寡糖，和
-游离唾液酸，
所述方法包括：
-对第一合适底物进行合适的酶处理，产生寡糖，和
-对第二合适底物进行唾液酸酶处理，产生游离的唾液酸，
其中所述唾液酸酶是采用从Penicillum chrysogenum菌株CBS455.95的染色体DNA中特异地扩增的唾液酸酶基因ZJW表达出的唾液酸酶。
2.权利要求1的方法，其中所述组合物以少于存在的寡糖总量0.1wt％的量包含唾液酸寡糖。
3.权利要求1的方法，其中所述组合物基本不含唾液酸寡糖。
4.根据权利要求1到3中任意一项的方法，其中所述组合物以多于存在的寡糖和游离唾液酸总量0.001wt％的量包含游离唾液酸。
5.根据权利要求1到3中任意一项的方法，其中所述组合物以多于存在的寡糖和游离唾液酸总量0.01wt％的量包含游离唾液酸。
6.根据权利要求1到3中任意一项的方法，其中所述组合物以多于存在的寡糖和游离唾液酸总量0.1wt％的量包含游离唾液酸。
7.根据权利要求1到3中任意一项的方法，其中所述组合物以多于存在的寡糖和游离唾液酸总量1wt％的量包含游离唾液酸。
8.根据权利要求1到3中任一项的方法，其中所述组合物包含少于0.5wt％的岩藻糖，以干物质计。
9.根据权利要求1到3中任一项的方法，其中所述组合物包含少于0.1wt％的岩藻糖，以干物质计。
10.根据权利要求1到3中任一项的方法，其中所述组合物包含少于0.01wt％的岩藻糖，以干物质计。
11.根据权利要求1到3中任一项的方法，其中所述第一和第二底物 是相同的。
12.根据权利要求1到3中任一项的方法，其中
-对第一合适底物进行合适的酶处理，产生寡糖，和
-对第二合适底物进行唾液酸酶处理，产生游离唾液酸
在一个反应器中进行。
13.根据权利要求1到3中任一项的方法，其中
-对第一合适底物进行合适的酶处理，产生寡糖，和
-对第二合适底物进行唾液酸酶处理，产生游离唾液酸
独立地进行，之后将所述寡糖和游离唾液酸合并。
14.根据权利要求1到3中任一项的方法，其中
-对第一合适底物进行合适的酶处理，产生寡糖，和
-对第二合适底物进行唾液酸酶处理，产生游离唾液酸
在一个反应器中相继发生。
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