CN101676384B - 一种同时高产谷胱甘肽和s-腺苷甲硫氨酸的方法 - Google Patents
一种同时高产谷胱甘肽和s-腺苷甲硫氨酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101676384B CN101676384B CN 200810042978 CN200810042978A CN101676384B CN 101676384 B CN101676384 B CN 101676384B CN 200810042978 CN200810042978 CN 200810042978 CN 200810042978 A CN200810042978 A CN 200810042978A CN 101676384 B CN101676384 B CN 101676384B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glutathione
- fragment
- plasmid
- sequence
- synthetase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种共表达谷胱甘肽合成酶系和腺苷甲硫氨酸合成酶的重组菌株,以及一种同时高产谷胱甘肽和腺苷甲硫氨酸的方法。本发明提供的重组菌株包含外源性的表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶或谷胱甘肽合成酶的片段和外源性的表达腺苷甲硫氨酸合成酶的片段,所述菌株能表达谷胱甘肽合成酶系和/或腺苷甲硫氨酸合成酶,进而用于发酵生产谷胱甘肽和腺苷甲硫氨酸。使用本发明提供的重组菌株不仅可以发酵获得同时高产的谷胱甘肽和腺苷甲硫氨酸,也可以发酵单独获得谷胱甘肽或腺苷甲硫氨酸。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域,具体地说,涉及一种同时高产谷胱甘肽和S-腺苷甲硫氨酸的方法。
背景技术
谷胱甘肽,即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸,简称GSH。它由前体物质L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH I,GSH1)和谷胱甘肽合成酶(GSH II,GSH2)催化合成,二者构成谷胱甘肽合成酶系,其中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶被认为是GSH合成途径中的限速酶。GSH能有效清除掉人体内的自由基,净化人体内的环境污染,增进人体健康,在临床医药、食品工业及相关生物研究领域都有着广泛的应用前景。其工业生产主要有萃取法、化学合成法、发酵法和酶法等,随着工艺及方法不断得到改进,采用发酵法生产GSH已经成为生产GSH最普遍的方法之一。
S-腺苷甲硫氨酸(S-腺苷-L-蛋氨酸,简称SAM-e或SAM)是一种生物细胞内广泛存在的重要的分子,它是由腺苷甲硫氨酸合成酶催化合成的。SAM是维护人体机能不可缺少的重要生命物质,对治疗肝病、治疗抑郁病、抗衰老等有较好的作用。它主要是以酵母发酵的方式生产制备。
由于谷胱甘肽和腺苷甲硫氨酸同属于含硫氨基酸衍生物,在生物体内的合成代谢过程紧密相连,而且二者都可以使用发酵法生产,因此,利用同一菌株发酵同时生产谷胱甘肽和腺苷甲硫氨酸具有一定的可能性。而且,刘惠等也曾报道利用酿酒酵母菌株zju1同时发酵谷胱甘肽和腺苷甲硫氨酸(H.Liu et al.Process Biochemistry39(2004),p1993-1997),但根据该文献的报道,其发酵获得的腺苷甲硫氨酸和谷胱甘肽分别为45mg/g干重和18mg/g干重,即1.35g/L和0.54g/L,产量较低,因此,有必要提供一种新的方法,以同时高产谷胱甘肽和S-腺苷甲硫氨酸。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种共表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和腺苷甲硫氨酸合成酶的重组菌株,以同时高表达谷胱甘肽合成酶系和腺苷甲硫氨酸合成酶。
本发明还有一个目的在于,提供一种共表达谷胱甘肽合成酶和腺苷甲硫氨酸合成酶重组菌株。
本发明还有一个目的在于,提供一种同时生产谷胱甘肽和腺苷甲硫氨酸的方法。
本发明提供的共表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和腺苷甲硫氨酸合成酶的重组菌株包含外源性的表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的片段和外源性的表达腺苷甲硫氨酸合成酶的片段。
根据本发明的一个优选实施例,本发明提供的菌株还包含外源性的表达谷胱甘肽合成酶的片段。
根据本发明的一个优选实施例,提供的外源性片段整合于染色体,或者存在于表达载体,所述载体为质粒或人工染色体。
根据本发明的一个优选实施例,提供的重组质粒中表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的片段包含编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的序列,以及所述序列上游的强启动子;表达腺苷甲硫氨酸合成酶的片段包含编码腺苷甲硫氨酸合成酶的序列,以及所述序列上游的强启动子。
根据本发明的一个优选实施例,提供的重组质粒中表达谷胱甘肽合成酶的片段包含编码谷胱甘肽合成酶的序列,以及所述序列上游的强启动子序列。
根据本发明的一个优选实施例,提供的菌株为毕赤酵母或酿酒酵母。
本发明提供的共表达谷胱甘肽合成酶和腺苷甲硫氨酸合成酶的重组菌株包含外源性的表达谷胱甘肽合成酶的片段和外源性表达腺苷甲硫氨酸合成酶的片段。
根据本发明的一个优选实施例,提供的外源性片段整合于染色体,或者存在于表达载体,所述载体为质粒或人工染色体。
根据本发明的一个优选实施例,提供的重组质粒中表达谷胱甘肽合成酶的片段包含编码谷胱甘肽合成酶的序列,以及所述序列上游的强启动子;所述表达腺苷甲硫氨酸合成酶的片段包含编码腺苷甲硫氨酸合成酶的序列,以及所述序列上游的强启动子。
本发明提供的生产谷胱甘肽和腺苷甲硫氨酸的方法,包括将上述的重组菌株发酵培养,生产谷胱甘肽和腺苷甲硫氨酸的步骤。
在使用本发明提供的共表达腺苷甲硫氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶系的菌株发酵获得的发酵液中,添加L-半胱氨酸和L-甲硫氨酸后,进一步发酵获得的发酵液中谷胱甘肽和S-腺苷甲硫氨酸的含量均显著高于现有报道中的联产发酵获得的谷胱甘肽和S-腺苷甲硫氨酸的含量,且单独添加L-半胱氨酸或L-甲硫氨酸,其发酵获得的谷胱甘肽和/或S-腺苷甲硫氨酸的含量也很高。
附图说明
图1是PCR扩增获得的GSH1和GSH2的检测结果,其中,泳道1为GSH1,泳道2为GSH2。
图2是质粒pGKG1G2的结构示意图。
图3是质粒pYESG1G2的结构示意图。
图4是质粒pSH62SAM的结构示意图。
图5是HZ111的凝胶电泳检测结果,其中,泳道1为使用检测GSH2的特异性引物GAP-50和GSH2R500进行PCR扩增获得的结果,泳道2为使用检测GSH1的特异性引物GAP-50和GSH1R650进行PCR扩增获得的结果,泳道3为使用检测SAM合成酶的特异性引物GAP-50和SAMR650进行PCR扩增获得的结果。
图6是HZ203的凝胶电泳检测结果,其中,泳道1为使用检测GSH2的特异性引物GAL-200和GSH2R500进行PCR扩增获得的结果,泳道2为使用检测GSH1的特异性引物GAL-200和GSH1R650进行PCR扩增获得的结果,泳道3为使用检测SAM合成酶的特异性引物GAL-200和SAMR650进行PCR扩增获得的结果。
菌株HZ111已于2008年7月11日提交位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏号为CCTCC M 208107,分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,如《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件或厂商提供的方案进行。
在本发明的下述实施例中,使用的胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。
在本发明的下述实施例中,克隆载体pMD18-T购自Takara;质粒pPIC3.5K、pGAPZB、pYES2购自Invitrogen,pSH47、pSH62、pUG6获取自EUROSCARF。
在本发明的下述实施例中,使用的T4DNA连接酶购自Takara;KOD DNA聚合酶购自Toyobo;T7DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Klenow酶、限制性内切酶BamHI,BglII,EcoRV,SmaI,Kpn2I,PvuII,SwaI等均购自Fermentas。
在本发明的下述实施例中,使用的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY4742获取自EUROSCARF;大肠杆菌DH5α购自Takara;毕赤酵母(Pichia pastoris)宿主菌GS115购自Invitrogen。
在本发明的下述实施例中,使用的培养基配方如下:
YPD培养基的配方为:1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%葡萄糖;
YPG培养基的配方为:1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%半乳糖;
BMGY培养基的配方为:1%酵母提取物,2%蛋白胨,100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0),1.34%酵母氮源(YNB),4×10-5%生物素,1%甘油;
MD培养基的配方为:1.34%酵母氮源,4×10-5%生物素,1%葡萄糖;
SD培养基的配方为:0.67%酵母氮源,1%葡萄糖,并根据需要补加所需的氨基酸和/或碱基等营养成分。
配置上述培养基的固体平板培养基时,在上述配方中添加2%琼脂即可。
在本发明的下述实施例中,毕赤酵母感受态细胞的制备和转化,均按照Invitrogen公司Pichia Expression Kit手册中提供的方法进行。酿酒酵母感受态细胞的制备和转化,参照:秦玉静、金建玲、鲍晓明、高东,影响酿酒酵母电击转化率的条件,山东大学学报(自然科学版),1999年02期。其中,电转杯为0.2mm,电转化仪使用bio-rad的Micropulser电转化仪,电转化参数为1.5kV,6ms。
在本发明的下述实施例中,采取HPLC法检测,具体的检测方法分别参照:
GSH产量的检测参照:王春、严伟民,注射用还原型谷胱甘肽质量标准分析方法——HPLC法的建立与验证,中国临床药学杂志2005年第14卷第3期。
SAM产量的检测参照:吴薇、张劲松、俞建生、姚黎栋、谢志鹏,高效液相色谱法测定1,4-丁烷二磺酸腺苷蛋氨酸原料及制剂中的有关物质,医药导报,2008年27卷第7期。
实施例1、共表达谷胱甘肽合成酶系和SAM合成酶的菌株的构建
在本实施例中,先分别构建了用于毕赤酵母或酿酒酵母的表达谷胱甘肽合成酶系和表达SAM合成酶的质粒,然后将已构建好的上述质粒分别转化到相应的毕赤酵母或酿酒酵母中,从而在毕赤酵母和酿酒酵母中构建获得可共表达谷胱甘肽合成酶系和SAM合成酶的菌株。
1.1、GSH1、GSH2、SAM片段扩增
在本实施例中,先设计了用于扩增的引物,抽提作为扩增模板的基因组,然后通过PCR分别扩增获得了GSH1、GSH2和SAM合成酶2的片段,具体如下:
根据Genebank报道的GSH1、GSH2序列(EF633694、EF633695),设计以下4条引物,用于克隆GSH1、GSH2序列:
GSH1UP:ATCGATACGATGGGACTCTTAGCTTTGGG;
GSH1DNM:CAATTGTTAACATTTGCTTTCTATTG;
GSH2UP:TTCGAAACGATGGCACACTATCCACCTTC;
GSH2DNE:GAATTCCTAGTAAAGAATAATACTGTC。
其中,GSH1UP和GSH1DNM用于扩增GSH1编码区;GSH2UP和GSH2DNE用于扩增GSH2编码区;GSH1UP和GSH2UP上的下划线标识的分别是在GSH1UP和GSH2UP上引入的AsuII酶切位点和ClaI酶切位点。
根据Genebank报道的SAM合成酶2序列(登录号M23368),设计以下2条引物,用于克隆SAM合成酶2序列:
SAMUP:TATTTCGAAACCATGGCCAAGAGCAAAACT
SAMDN:GCGGCCGCGAATTCAGCCTAGCATAAAGAAA
其中,SAMUP和SAMDN中的下划线分别标识的是在SAMUP和SAMDN上引入的NspV酶和EcoRI酶的酶切位点。
抽提获得酿酒酵母BY4742基因组。
以酿酒酵母BY4742基因组为模板,分别以引物GSH1UP和GSH1DNM以及引物GSH2UP和GSH2DNE为引物对,进行PCR扩增,然后将PCR扩增产物分别进行凝胶电泳检测,检测结果如图1所示。根据图1的结果,获得的产物的大小分别为1.5kb、2.0kb,符合GSH1、GSH2产物的预期大小。
使用胶回收试剂盒回收获得GSH1、GSH2片段。
以酿酒酵母BY4742基因组为模板,以SAMUP和SAMDNM为引物对,进行PCR扩增,然后将PCR扩增产物分别进行凝胶电泳检测。检测结果显示,获得的产物符合SAM合成酶产物的预期大小。
使用胶回收试剂盒回收获得SAM合成酶片段。
1.2、同时表达SAM合成酶和谷胱甘肽合成酶系的毕赤酵母菌株的构建
1.2.1、谷胱甘肽合成酶系表达载体构建
由于步骤1.1中PCR反应获得的GSH1、GSH2是平末端产物,不易进行亚克隆,因此,为便于亚克隆操作,使用Taq酶对GSH1、GSH2进行处理,为GSH1、GSH2末端加上一个突出的A,以和pMD18-T载体末端突出的T进行配对,从而使得后续的亚克隆步骤可以获得更高的连接克隆效率,具体步骤如下:
向胶回收试剂盒纯化获得的GSH1、GSH2片段中加入Taq酶,于72℃反应10min,反应体系如下:
10×Taq缓冲液5μl,2.5mM dATP4μl,25mM MgCl23μl,GSH1、GSH2平末端片段20uL,Taq DNA聚合酶0.2uL,加去离子水至体系总体积50uL。
反应结束后,使用胶回收试剂盒纯化回收反应产物。
将获得的纯化后的反应产物和pMD18-T载体,用T4DNA连接酶,于16℃连接过夜,反应体系如下:
5μL处理后的PCR产物,0.5μL pMD18-T载体,1μL T4DNA连接酶缓冲液,3μL无菌去离子水,0.5μL T4DNA连接酶。
连接产物转化大肠杆菌DH5α并涂布含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板,培养后选取转化子鉴定,根据鉴定结果,最终获得两个质粒pMDGSH1、pMDGSH2。
质粒pMDGSH1和pMDGSH2经测序验证,分别包含GSH1,GSH2编码区(GSH1,GSH2编码区序列分别如SEQ ID NO:1、2所示),而且编码区没有会导致氨基酸残基变化的突变。
分别用AsuII/SalI和ClaI/SalI从pMDGSH1、pMDGSH2中将GSH1和GSH2基因的编码区切出(AsuII和ClaI位点通过引物在PCR扩增时引入,SalI位点在pMD18-T载体上),分别连接入AsuII/XhoI酶切的表达载体pGAPZB中(购自Invitrogen,含有GAP启动子),获得两个质粒pGZG1、pGZG2。
质粒pGZG1和pGZG2经测序验证,分别包含GSH1,GSH2编码区(GSH1,GSH2编码区序列分别如SEQ ID NO:1、2所示),其中,GSH1、GSH2编码区分别置于GAP启动子下,而且编码区无氨基酸残基突变。
由于GAP启动子是组成型强启动子,因此,这两个质粒可以分别组成型表达GSH1和GSH2。
BamHI/BglII酶切pGZG2质粒,获得GSH2表达序列,然后将其连入使用BglII酶切的pGZG1质粒,获得pGZG1G2质粒。经检测,该质粒可以组成型共表达GSH1和GSH2。
由于pGZG1,pGZG2和pGZG1G2三个质粒转化毕赤酵母时,能与基因组发生重组的同源区都仅数百bp,整合效率较低,不便于操作,因此需要对这三个质粒进行优化改造。改造的方式是在此质粒中引入一段与宿主菌基因组同源的序列。较长的同源区可以获得较高的整合效率。
本实施例使用的菌株为GS115衍生菌,带有一个突变型的his4基因;因此,优化改造的方式是在共表达质粒中引入野生型的HIS4基因片断作为同源区。引入的野生型HIS4基因片段和宿主菌所带的突变型his4基因片段除了数个碱基对的差异外,几乎完全相同,同源区长达大约3kb,因此可以获得较高的整合效率。
而且,转化后最终得到的重组菌将获得野生型HIS4基因,因而可以具备组氨酸合成能力,表现为原养型;原养型菌株更便于下一步实施发酵生产。
具体优化改造过程如下:
EcoRV切质粒pPIC3.5K,获得大小为5.0kb的、包含了HIS4的片段,然后将该片段的平端连入使用SmaI单酶切的pGZG1G2,从而获得质粒pGKG1G2。将质粒pGKG1G2进行测序,并对测序结果进行分析获得pGKG1G2的结构示意图,结果如图2所示。该质粒中,GSH1和GSH2编码区分别置于两个GAP启动子下。根据图2及SDS-PAGE的检测结果,质粒pGKG1G2可以组成型共表达GSH1和GSH2。
同时也对pGZG1和pGZG2进行了同样的改造。同样使用EcoRV切质粒pPIC3.5K,获得大小为5.0kb的、包含了HIS4的片段,然后将该片段的平端连入使用SmaI单酶切的pGZG1和pGZG2,从而获得质粒pGKG1和pGKG2。
1.2.2、表达SAM合成酶的毕赤酵母的构建
参照CN02112087中的方法,使用AsuII/EcoRI酶切含有SAM合成酶2基因片段的PCR产物,连入同样AsuII/EcoRI酶切的pGAPZB载体。获得质粒pGZSAM。
质粒pGZSAM经测序验证,包含SAM合成酶编码区(SAM合成酶编码区序列如SEQID NO:3所示),而且编码区没有会导致氨基酸残基变化的突变。
pGZSAM质粒转化GS115,在含有浓度为100mg/L Zeocin的YPD平板上筛选转化子,从中筛选出产量较高的一株菌株,将该菌株命名为HZ102。
1.2.3、共表达SAM合成酶和谷胱甘肽合成酶系的毕赤酵母的构建
将抽提获得的pGKG1G2质粒,用Kpn2I酶切线性化,电转化转入HZ102,然后将转化产物涂布于MD平板,30℃培养至转化子长出。
任意选取若干转化子,摇瓶发酵培养,并检测发酵液中的GSH和SAM,然后,从中选取出一株产量较高者,将其命名为HZ111,该菌株已于2008年7月11日提交位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏号为CCTCC M208107。
设计特异引物用于检测共表达菌株,引物序列分别如下所示:
GAP-50:TGGTTTCTCCTGACCCAAAG
GSH2R500:GGCCTGCAAATGACACTGAC
GSH1R650:TCCTGATGGATGCTGTCAAG
SAMR500:CATCTGCCATAGCCATGTTC
其中,GAP-50和GSH1R650用于PCR检测GSH1的***;GAP-50和GSH2R500用于PCR检测GSH2的***;GAP-50和SAMR500用于检测SAM合成酶的***。
抽提HZ111的总DNA,分别使用引物GAP-50和GSH1R650、GAP-50和GSH2R500GAP-50和SAMR500作为引物对,进行PCR反应,将PCR扩增获得的产物经过琼脂糖凝胶电泳,结果如图5所示。根据图5的结果,获得了长度分别为0.7kb,0.5kb,0.5kb的片段,根据该结果,GSH1、GSH2、SAM合成酶表达序列均已正确***相应菌株。
将HZ111在含有YPD(1%酵母膏,2%蛋白胨,2%葡萄糖)的培养基中同时添加前体甲硫氨酸、半胱氨酸,摇瓶发酵3天后,检测发酵液,结果显示使用上述菌株发酵可以获得GSH和SAM的联合高产。
1.2.4、共表达SAM合成酶和谷胱甘肽合成酶系部分成员(即GSH1或GSH2)的毕赤酵母的构建
抽提获得的pGKG1与pGKG2质粒,分别用Kpn2I酶切线性化,并且分别电转化转入HZ102,然后将转化产物涂布于MD平板,30℃培养至转化子长出。
任意选取若干转化子,摇瓶发酵培养,并检测发酵液中的GSH和SAM,然后,从中分别选取出一株产量较高者,将其命名为HZ123和HZ124。
抽提HZ123的总DNA,分别使用引物GAP-50和GSH1R650、GAP-50和SAMR500作为引物对,进行PCR反应,将PCR扩增获得的产物经过琼脂糖凝胶电泳,结果如图5 所示。获得了长度分别为0.7kb,0.5kb的片段,根据该结果,GSH1、SAM合成酶表达框均已***。HZ123可以共表达SAM合成酶和GSH1。
抽提HZ124的总DNA,分别使用引物GAP-50和GSH2R500、GAP-50和SAMR500作为引物对,进行PCR反应,将PCR扩增获得的产物经过琼脂糖凝胶电泳,结果如图5所示,获得的片段的长度均为0.5kb,根据该结果,GSH1、SAM合成酶表达框均已***。HZ124可以共表达SAM合成酶和GSH2。
将HZ123、HZ124在含有YPD(1%酵母膏,2%蛋白胨,2%葡萄糖)的培养基中同时添加前体甲硫氨酸、半胱氨酸,摇瓶发酵3天后,检测发酵液,结果显示使用上述菌株发酵可以获得GSH和SAM的同时积累,且GSH产量均高于作为对照的HZ102。
HZ123、HZ124和HZ111均能高联合产GSH和SAM,但是相比而言HZ111的产量高于HZ123和HZ124,因此,在下述放大发酵实验中,只使用HZ111进行放大发酵实验。
1.3、共表达SAM合成酶和谷胱甘肽合成酶系的酿酒酵母菌株的构建
在本实施例中,分别构建了表达GSH1、GSH2的质粒和表达SAM合成酶的质粒,然后将其先后转入酿酒酵母宿主菌中,获得含有上述二质粒的酿酒酵母菌株,具体过程如下:
1.3.1、引物设计及PCR扩增GAL启动子
设计引物T7HpaI和T3NotI,序列如下:
T7HpaI:CGGTTAACTAATACGACTCACTATAGGG;
T3NotI:ATGCGGCCGCAATTAACCCTCACTAAAGGGAA。
抽提获得酿酒酵母表达载体pSH47质粒。
以引物T7HpaI和T3NotI为引物对,以酿酒酵母表达载体pSH47质粒作为模版,PCR扩增,并检测,然后使用胶回收试剂盒回收PCR产物,获得包含GAL启动子的片段。
1.3.2、共表达SAM合成酶和谷胱甘肽合成酶系的酿酒酵母菌株的构建
在本实施例中,首先构建了具有GAL启动子的质粒,以用于后续实验,具体如下:
将实施例1.3.1中获得的PCR回收产物克隆入pMD18-Tsimple中,获得质粒pMD-GAL;使用SalI酶切pUG6质粒,再使用Klenow酶将酶切后获得的片段的末端补平,并自连,以去除pUG6质粒的SalI位点。然后用NotI从去除了SalI位点的pUG6质粒中切出含有kanMX序列,并将获得的kanMX序列连入pMD-GAL质粒中,获得质粒pWP01。经检测,质粒pWP01具有GAL启动子,并且具有kanMX基因作为筛选标记。
然后,分别构建共表达GSH1和GSH2的质粒和表达SAM合成酶的质粒,具体如下:
将实施例1.1中获得的GSH2基因和GSH1基因分别克隆到质粒pWP01和pYES2中,获得重组质粒,将获得的重组质粒分别命名为pGALKGSH2和pYESGSH1。
质粒pGALKGSH2和pYESGSH1经测序验证,分别包含GSH1,GSH2编码区(GSH1,GSH2编码区序列分别如SEQ ID NO:1、2所示),而且编码区没有导致氨基酸残基变化的突变。
使用PvuII将pGALKGSH2中含有GAL启动子和GSH2编码区的片段切出,然后将获得的片段连入SwaI单切的pYESGSH1质粒中,获得的质粒命名为pYESG1G2。经检测,质粒pYESG1G2可以共表达GSH1和GSH2。
将实施例1.1中获得的SAM合成酶基因克隆入质粒pSH62中,获得重组质粒,将获得的质粒命名为pSH62SAM。
质粒pSH62SAM经测序验证,包含SAM合成酶编码区(SAM合成酶编码区序列如SEQ ID NO:3所示),而且编码区没有导致氨基酸残基变化的突变。
通过先转化质粒pYESG1G2,再转化质粒pSH62SAM的方法,构建共表达谷胱甘肽合成酶系和SAM合成酶的菌株,具体方法如下:
将质粒pYESG1G2电转化入酿酒酵母BY4742感受态细胞中,在不含有尿嘧啶的SD平板上筛选转化子,获得共表达GSH1和GSH2的菌株,从中选取出产量最高的一株菌株,命名为HZ201。
制备酿酒酵母HZ201电转化感受态细胞,然后将质粒pSH62SAM电转化入酿酒酵母HZ201中,在不含有尿嘧啶和组氨酸的SD平板上筛选转化子,获得共表达谷胱甘肽合成酶系和SAM合成酶的菌株,从中选取出表达量最高的一株菌株,命名为HZ204。
通过先转化质粒pSH62SAM,再转化质粒pYESG1G2的方法,构建共表达谷胱甘肽合成酶系和SAM合成酶的菌株,具体方法如下:
将质粒pSH62SAM转化到酿酒酵母BY4742的感受态细胞中,通过在不含有组氨酸的SD平板上筛选转化子,获得表达SAM合成酶的菌株,从中选取出表达量最高的一株菌株,命名为HZ202。
制备酿酒酵母HZ202电转化感受态细胞,然后将质粒pYESG1G2电转化入酿酒酵母HZ202中,不含有尿嘧啶和组氨酸的SD平板上筛选转化子,获得共表达谷胱甘肽合成酶系和SAM合成酶的菌株,从中选取出表达量最高的一株菌株,命名为HZ203。
设计引物用于检测共表达菌株,引物序列分别如下所示:
GAL-200:TGGTTTCTCCTGACCCAAAG
GSH2R500:GGCCTGCAAATGACACTGAC
GSH1R650:TCCTGATGGATGCTGTCAAG
SAMR500:CATCTGCCATAGCCATGTTC
其中,GAL-200和GSH1R650用于检测GSH1的***;GAL-200和GSH2R500用于检测GSH2的***;GAL-200和SAMR500用于检测SAM合成酶的***。
抽提HZ203、HZ204的总DNA,然后分别使用引物GAL-200和GSH1R650、GAL-200和GSH2R500、GAL-200和SAMR500作为引物对,进行PCR反应,将PCR扩增获得的产物经过琼脂糖凝胶电泳,结果显示获得了长度大小分别为0.9kb,0.7kb,0.7kb的片段,从而可以确证所述菌株HZ203、HZ204中都有GSH1、GSH2、SAM合成酶表达序列。
将HZ203、HZ204在含有YPG(1%酵母膏,2%蛋白胨,2%半乳糖)的培养基中同时添加前体甲硫氨酸、半胱氨酸,摇瓶发酵3天后,检测发酵液,结果显示使用上述2种菌株发酵均可以获得GSH和SAM的联合高产。
根据上述结果,在重组菌株中***外源性的GSH1和/或GSH2序列,以及SAM序列,可以有效的提高重组菌株中的GSH1和/或GSH2,以及SAM合成酶的表达量,进而在加入了前体物质之后,提高GSH和SAM的产量。
虽然在本发明的实施例1中,通过构建重组质粒,进而构建了联合高产GSH和SAM的重组菌株,但对本领域的技术人员而言,在本发明的基础上,通过构建人工染色体等其他方式,能够进而构建联合高产GSH和SAM的重组菌株,是显而易见的,因此也是本发明所要保护的内容。同时,根据本发明的内容和精神,将外源性的编码GSH1和/或GSH2和SAM的序列,转化进菌株,从而也能获得联合高产GSH和SAM的重组菌株,这对本领域的技术人员而言,也是显而易见的,因此,也是本发明所要保护的内容。同时,根据本发明的内容和精神,通过原位改造菌株原有的GSH1和/或GSH2和SAM的序列,将其上游原有的启动子改造为强启动子,也能获得联合高产GSH和SAM的重组菌株,这对本领域的技术人员而言,也是显而易见的,因此,也是本发明所要保护的内容。
由于HZ203和HZ204均能联合高产GSH和SAM,因此,在下述放大实验中,只使用HZ203进行放大发酵实验。
实施例2、HZ111发酵同时或分别生产谷胱甘肽和S-腺苷甲硫氨酸
选取生长三天的HZ111单菌落接种至30ml的YPD培养基,30℃,240rpm培养20h,然后接入320ml的YPD培养基,30℃,240rpm培养8h左右,接入3.15L的发酵培养基BMGY中(7.5L发酵罐),添加终浓度0.01%的消泡剂(聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚,即泡敌),进行发酵,温度控制在30℃,发酵过程中流加甘油,以满足细胞生长需要,通过流加氨水,pH控制在6.0。发酵到30h时添加总量为30克的L-半胱氨酸和总量为30克的L-甲硫氨酸,继续进行发酵,发酵到70h的进行检测,检测结果显示,发酵液中谷胱甘肽的含量为3.0g/L,S-腺苷甲硫氨酸的含量为3.5g/L。
在发酵到30h时分别单独添加总量为30g的L-半胱氨酸或单独添加总量为30克的L-甲硫氨酸,继续发酵至70h时放罐,并检测,检测结果显示,单独添加总量为30g的L-半胱氨酸时,发酵液中谷胱甘肽的产量为6.2g/L;单独添加总量为30克的L-甲硫氨酸时,发酵液中S-腺苷甲硫氨酸的产量为3.9g/L。
实施例3、HZ203发酵同时或分别生产谷胱甘肽和S-腺苷甲硫氨酸
本实施例中使用的培养基的配方如下(g/L):
半乳糖40,酵母膏20,蛋白胨40,硫酸铵2.0,尿素2.0,KH2PO41.5,MgSO4·7H2O0.5,ZnSO4·7H2O4.0×10-3,FeSO4·7H2O3.0×10-3,MnCl2·4H2O0.3×10-3,CuSO4·5H2O0.5×10-3,CaCl2·2H2O1.0×10-3。
挑取生长两天的HZ203单菌落接种至30ml的上述培养基中,30℃,240rpm培养20h,然后接入320ml的上述培养基,30℃,240rpm培养6h左右,接入3.15L的上述发酵培养基中(7.5L发酵罐),添加终浓度0.01%的消泡剂泡敌,进行发酵,温度控制在30℃,发酵过程中流加半乳糖,以满足细胞生长需要,通过流加氨水,pH控制在6.0。发酵到25h时添加总量为30克的L-半胱氨酸和总量为30克的L-甲硫氨酸,继续进行发酵,发酵到70h的时候检测,检测结果显示,发酵液中谷胱甘肽的含量为2.1g/L,S-腺苷甲硫氨酸的含量为2.9g/L。
发酵到25h时分别单独添加总量为30g的L-半胱氨酸或单独添加总量为30克的L-甲硫氨酸,然后继续发酵至70h时检测,检测结果显示,单独添加总量为30g的L-半胱氨酸时,发酵液中谷胱甘肽的产量为2.3g/L;单独添加总量为30克的L-甲硫氨酸时,发酵液中S-腺苷甲硫氨酸的产量为3.1g/L。
综上所述,在使用本发明提供的共表达SAM合成酶和谷胱甘肽合成酶系的菌株发酵后获得的发酵液中,添加L-半胱氨酸和L-甲硫氨酸后,进一步发酵获得的发酵液中谷胱甘肽和S-腺苷甲硫氨酸的含量均显著高于现有报道中的共表达发酵获得的谷胱甘肽和S-腺苷甲硫氨酸的含量,且单独添加L-半胱氨酸或L-甲硫氨酸,其发酵获得的谷胱甘肽和S-腺苷甲硫氨酸的含量也很高。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心
<120>一种同时高产谷胱甘肽和S-腺苷甲硫氨酸的方法
<130>P5081044
<160>3
<170>PatentIn version3.1
<210>1
<211>2087
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>1
<210>2
<211>1513
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>2
<210>3
<211>1821
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>2
Claims (4)
1.一种共表达谷胱甘肽合成酶系和腺苷甲硫氨酸合成酶的重组酵母菌株,其特征在于,所述谷胱甘肽合成酶系为γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶;
相应地,所述重组酵母菌株包含外源性的表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的片段和外源性的表达谷胱甘肽合成酶的片段以及外源性的表达腺苷甲硫氨酸合成酶的片段;
其中,所述表达腺苷甲硫氨酸合成酶的片段为酿酒酵母来源的编码腺苷甲硫氨酸合成酶的序列,和所述序列上游的强启动子序列;
所述表达γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的片段为酿酒酵母来源的编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的序列,和所述序列上游的强启动子序列;
所述表达谷胱甘肽合成酶的片段为酿酒酵母来源的编码谷胱甘肽合成酶的序列,和所述序列上游的强启动子序列。
2.如权利要求1所述的重组酵母菌株,其特征在于,所述强启动子为GAP启动子或GAL启动子。
3.如权利要求1所述的重组酵母菌株,其特征在于,所述酵母为毕赤酵母或酿酒酵母。
4.一种生产谷胱甘肽和腺苷甲硫氨酸的方法,其特征在于,所述方法将权利要求1-3中任一项所述的重组酵母菌株发酵培养,生产谷胱甘肽和腺苷甲硫氨酸。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200810042978 CN101676384B (zh) | 2008-09-16 | 2008-09-16 | 一种同时高产谷胱甘肽和s-腺苷甲硫氨酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200810042978 CN101676384B (zh) | 2008-09-16 | 2008-09-16 | 一种同时高产谷胱甘肽和s-腺苷甲硫氨酸的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101676384A CN101676384A (zh) | 2010-03-24 |
CN101676384B true CN101676384B (zh) | 2013-02-06 |
Family
ID=42029095
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 200810042978 Active CN101676384B (zh) | 2008-09-16 | 2008-09-16 | 一种同时高产谷胱甘肽和s-腺苷甲硫氨酸的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101676384B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101781625B (zh) * | 2010-01-04 | 2012-04-04 | 苏州大学 | 一株乙硫氨酸抗性产朊假丝酵母及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1357630A (zh) * | 2001-11-30 | 2002-07-10 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 一种生产腺苷甲硫氨酸的方法 |
CN1385537A (zh) * | 2002-06-14 | 2002-12-18 | 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 | 一种用代谢工程菌生产腺苷甲硫氨酸的方法 |
CN101225402A (zh) * | 2007-01-16 | 2008-07-23 | 上海医药工业研究院 | 生产谷胱甘肽的毕赤酵母基因工程菌及用于构建其的重组质粒 |
-
2008
- 2008-09-16 CN CN 200810042978 patent/CN101676384B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1357630A (zh) * | 2001-11-30 | 2002-07-10 | 中国科学院上海生物化学研究所 | 一种生产腺苷甲硫氨酸的方法 |
CN1385537A (zh) * | 2002-06-14 | 2002-12-18 | 中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 | 一种用代谢工程菌生产腺苷甲硫氨酸的方法 |
CN101225402A (zh) * | 2007-01-16 | 2008-07-23 | 上海医药工业研究院 | 生产谷胱甘肽的毕赤酵母基因工程菌及用于构建其的重组质粒 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
H.Liu等.Co-production of S-adenosyl-L-methionine and glutathione from spent brewer"s yeast cells.《Process Biochemistry》.2004,第39卷(第12期),全文. * |
Jian-Ping Lin等.An effective strategy for the co-production of S-adenosyl-L-methionine and glutathione by fed-batch fermentation.《Biochemical Engineering Journal》.2004,第21卷(第1期),全文. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101676384A (zh) | 2010-03-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2016361425B2 (en) | Genetically modified yeasts and fermentation processes using genetically modified yeasts | |
CN110117602A (zh) | 灰树花udp-葡萄糖焦磷酸化酶及其应用 | |
CN104630258A (zh) | 一种酿酒酵母基因表达***及其构建与应用 | |
CN100368524C (zh) | 巴士德毕赤酵母gs115/pfk-k5的高密度发酵方法 | |
CN111575310A (zh) | 表达小窝蛋白的重组酿酒酵母及其应用 | |
CN101613707B (zh) | 一种用代谢工程菌生产谷胱甘肽的方法 | |
CN104593407A (zh) | 树干毕赤酵母基因表达***及其构建与应用 | |
CN102433265A (zh) | 生产还原型谷胱甘肽的重组菌株及其制备方法 | |
CN116286421B (zh) | 一种用于生产麦角硫因的毕赤酵母菌株及其构建方法和应用 | |
CN101676384B (zh) | 一种同时高产谷胱甘肽和s-腺苷甲硫氨酸的方法 | |
CN102226154B (zh) | 具有双重筛选标记的多形汉逊酵母菌及其应用 | |
CN102559730B (zh) | 一种提高cp4-epsps在汉逊酵母中表达量的方法 | |
CN1191369C (zh) | 一种用代谢工程菌生产腺苷甲硫氨酸的方法 | |
CN107287197A (zh) | 组氨酸衰减子突变体和解决反馈阻遏的组氨酸操纵子以及它们的应用 | |
CN111484942A (zh) | 一种利用酿酒酵母生产己二酸的方法 | |
CN105861534A (zh) | 一种双质粒工程菌提高l-5-甲基四氢叶酸产量的生物方法 | |
CN102911960B (zh) | 一种减弱反馈抑制菌株生产谷胱甘肽的方法 | |
CN103087932A (zh) | 分泌生产谷胱甘肽的重组菌株及其制备方法 | |
CN103087934B (zh) | 高产s-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法 | |
CN115838645A (zh) | 一种高产乳清酸的酵母菌株及其应用 | |
CN107723300A (zh) | 过表达CgGsh1基因提高产甘油假丝酵母2‑苯乙醇耐受性及产量 | |
CN102120966A (zh) | Ura3缺陷型毕赤酵母x-33菌株的构建及应用 | |
CN102533841B (zh) | 一种提高Bt杀虫蛋白在汉逊酵母中表达量的方法 | |
CN111849790A (zh) | 重组顶头孢霉工程菌及其构建方法和应用 | |
CN104031959A (zh) | 一种通过调控基因表达来提高s-腺苷甲硫氨酸产量的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20171208 Address after: 313000 Zhejiang city of Huzhou province Deqing County Zhongguan town Hengtang Bridge No. 81 Patentee after: Zhejiang biok Biology Technology Co. Ltd. Address before: 313220 Deqing County bell Industrial Zone, Huzhou, Zhejiang Patentee before: Zhejiang Shenghua Biok Biology Co., Ltd. |
|
TR01 | Transfer of patent right |