CN101659950B - 水溶液中嗜热菌蛋白酶的稳定化 - Google Patents

水溶液中嗜热菌蛋白酶的稳定化 Download PDF

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Abstract

本发明涉及水溶液中嗜热菌蛋白酶的稳定化。本发明提供增强溶解的嗜热菌蛋白酶在水溶液中的稳定性的方法和组合物。使嗜热菌蛋白酶、粗嗜热菌蛋白酶或含有嗜热菌蛋白酶的冻干物以及一种或多种盐与具有低盐浓度的水性缓冲液接触并形成第一溶液。随后，添加另外的固体形式的盐并使其解离，从而形成包含稳定形式的嗜热菌蛋白酶的第二溶液。

Description

水溶液中嗜热菌蛋白酶的稳定化
技术领域
本发明涉及生物化学领域。本发明涉及在水溶液中趋于不稳定的蛋白水解酶嗜热菌蛋白酶(thermolysin)。本发明提供增强溶解的嗜热菌蛋白酶在水溶液中的稳定性的方法和组合物。使嗜热菌蛋白酶、粗嗜热菌蛋白酶或含有嗜热菌蛋白酶的冻干物以及一种或多种盐接触具有低盐浓度的水性缓冲液并形成第一溶液。随后，添加另外的固体形式的盐并使其解离(dissociated)，从而形成包含稳定形式的嗜热菌蛋白酶的第二溶液。
背景技术
嗜热菌蛋白酶[EC 3.4.24.27；CAS登记号9073-78-3]是一种在嗜热溶蛋白芽孢杆菌(Bacillus thermoproteolyticus)的培养肉汤中产生的热稳定的中性金属蛋白酶(在本文中还称为“中性蛋白酶”)(Endo，S.，J.，Ferment.Technol.40(1962)346-353；Matsubara，H.，Feder，J.，第三版；Boyer，P.，D.，(编辑)，The Enzymes，第三卷，Academic Press，New York，1971，第721-795页)。它需要一个锌离子用于酶活性以及4个钙离子用于结构稳定性(Latt，S.，A.，等人Biochem.Biophys.Res.Commun.37(1969)333-339；Feder，J.，等人Biochemistry 10(1971)4552-4556；Tajima，M.，等人Eur.J.Biochem.64(1976)243-247)，其特异性地催化含有疏水氨基酸残基的肽键水解(Morihara，K.，Tsuzuki，H.，Eur.J.Biochem.15(1970)374-380；Inouye，K.，等人Biochem.J.315(1996)133-138)。嗜热菌蛋白酶广泛用于通过水解的逆反应进行的肽键形成(Oyama，K.，等人，J.Chem.Soc.Perkin II(1981)356-360；Nakanishi，K.，等人Ann.N.Y.Acad.Sci.613(1990)652-655；Trusek-Holownia，A.，J.Biotechnol.102(2003)153-163)。编码嗜热菌蛋白酶的npr基因从嗜热溶蛋白芽孢杆菌(B.thermoproteolyticus)中分离(O’Donohue，M.，J.，等人，Biochem.J.300(1994)599-603)。序列分析显示嗜热菌蛋白酶是作为由信号肽(28个残基)、前序列(prosequence)(204个残基)和成熟序列(316个残基)构成的前体蛋白(pre-proprotein)合成的(O’Donohue，M.，J.，等人，见上文)。前序列用作分子内分子伴侣引起连接前序列和成熟序列的肽键自催化裂解(O’Donohue，M.，J.，等人，J.Biol.Chem.271(1996)26477-26481；Marie-Claire，C.，等人，J.Biol.Chem.273(1998)5697-5701；Marie-Claire，C.，等人，J.Mol.Biol.285(1999)1911-1915)。
水中完整的嗜热菌蛋白酶在280nm处的理论消光系数可以使用“ProtParam工具”计算，该工具可经由网络公共途径获得(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)。ProtParam是一种能够计算储存在Swiss-Prot或TrEMBL中的给定蛋白或用户输入序列的各种物理和化学参数的工具。计算的参数包括分子量、理论pI、氨基酸组成、原子组成、消光系数、估计的半衰期、不稳定指数、脂溶指数和总平均亲水性(grand averageof hydropathicity)。因此，可以计算出在280nm处水中的理论吸收值A(1mg/ml)为1.696。
嗜热菌蛋白酶的厂家(Daiwa Kasei K.K.，日本)参考Ohta，Y等人(J.Biol.Chem.241(1966)5919-5925)指出在280nm处在50mM TrisHCl，pH 7缓冲液中吸收值A(1mg/ml)为1.765。
Inouye，K.，等人(J.Biochem.123(1998)847-852)公开了在277nm和25℃下测得批号T8BA51的嗜热菌蛋白酶(Daiwa Kasei K.K.，Osaka，日本)在10mM CaCl2、40mM TrisHCl，pH 7.5中的吸收值A(1mg/ml)为1.83。
嗜热菌蛋白酶可以冻干物从商业供应商获得。Daiwa Kasei K.K.(日本)销售分子量为34,600Da(道尔顿)，最佳pH为pH8.0并且最佳温度在65℃至70℃的范围内的嗜热菌蛋白酶。根据厂家，该酶在ph 5.0至pH 8.5范围内的pH下是稳定的。还指出在稀(dilute)缓冲液中的溶解度为0.02％。两次结晶的嗜热菌蛋白酶可以冻干的无定形粉末购得，其中在干燥物中的酶蛋白为60％[w/w]或更高。干燥物还含有无水乙酸钙(约20％[w/w])和无水乙酸钠(约10％[w/w])。对于进一步结晶来说，厂家描述了一种方法，包括将冻干物以1％[w/v]至5％[w/v]的范围内的浓度悬浮在0.01M乙酸钙水溶液中。通过边搅拌边逐滴添加足以将水溶液的pH调节到值在pH11.0至pH11.4的范围内的0.2N氢氧化钠来溶解悬浮的物质。移除任何未溶解的残余物，然后用0.2N乙酸将溶液的pH调节至pH 6.0。结晶通常在约两天内完成。整个过程在约0℃至2℃范围内的温度下进行。
嗜热菌蛋白酶制剂还以商标名THERMOASE得自Daiwa Kasei K.K(日本)。
EP 0 640 687公开了7mM CaCl2和1.75M NaCl的水溶液，其中溶解了THERMOASE以至浓度为约36mg/ml。在干THERMOASE粉末中嗜热菌蛋白酶的纯度为约20％。考虑到纯度，嗜热菌蛋白酶在水溶液中的浓度为约7mg/ml。
Inouye，K.，等人(J.Biochem.123(1998)847-852)报道了嗜热菌蛋白酶是一种难溶解的蛋白。有人提出，该蛋白表面很大程度上是疏水的，嗜热菌蛋白酶可以借助疏水作用色谱法有效地纯化这一事实支持了这种观点(Inouye，K.，等人，Protein Expression and Purification 46(2006)248-255)。由于其低溶解度，在数小时之内，该酶很容易从新制备的溶液中沉淀。
Inouye，K.等人(J Biochem.见上文)还证明了，如果嗜热菌蛋白酶的冻干制剂在接触水性溶剂时，溶剂中溶解了某些中性盐，则嗜热菌蛋白酶在水性溶剂中的溶解度可增加。据显示该作用取决于(1)温度、(2)溶剂中所存在的具体的中性盐、和(3)各中性盐的浓度。在Inouye，K.等人(J Biochem.见上文)的文献中，图2公开了一系列实验的结果，其中过量的嗜热菌蛋白酶冻干粉末(三次结晶和冻干的嗜热菌蛋白酶制剂(Daiwa Kasei K.K.，Osaka，日本；批号T8BA51；不经进一步纯化使用)与“标准缓冲液”(10mM CaCl2、40mM TrisHCl，pH 7.5)混合，该标准缓冲液还含有预定浓度(在0.5M至5M的范围内)的盐。溶解的蛋白的浓度通过分光光度计使用277nm吸收值A(1mg/ml)1.83和分子量34.6kD来确定。
表1-4再现了表示在Inouye，K.等人(J Biochem.见上文)图2中图示出的在两个不同的温度(0℃和37℃)下溶解的蛋白浓度的大概数值。表中的蛋白浓度以mg/ml计。在各表中列出了溶解于标准缓冲液的盐及它们各自的浓度。
表1
0℃下在含有盐的标准缓冲液中可溶解的蛋白浓度(以[mg/ml]计)
Figure G200910166864XD00041
表2
0℃下在含有盐的标准缓冲液中可溶解的蛋白浓度(以[mg/ml]计)
Figure G200910166864XD00042
§在检测范围之外
表3
37℃下在含有盐的标准缓冲液中可溶解的蛋白浓度(以[mg/ml]计)
Figure G200910166864XD00043
表4
37℃下在含有盐的标准缓冲液中可溶解的蛋白浓度(以mg/ml计)
Figure G200910166864XD00051
因此，对于选择的盐，可溶解蛋白的最高浓度分别为约
8.8mg/ml      37℃下    存在    2.5M      NaCl，
12.2mg/ml     0℃下     存在    2M        NaCl，
4.2mg/ml      37℃下    存在    2M        KCl，
7.5mg/ml      0℃下     存在    1.5M      KCl，
22.3mg/ml     37℃下    存在    5M        LiCl，
26.3mg/ml     0℃下     存在    5M        LiCl，
33.1mg/ml     37℃下    存在    5M        NaBr，
40mg/ml       0℃下     存在    3M        NaBr，
38.6mg/ml     37℃下    存在    4.5M      NaJ，以及
＞45mg/ml     0℃下     存在    5M        NaJ
嗜热菌蛋白酶是一种活泼的蛋白酶，它在溶液中进行自体溶解(autoproteolytic)攻击。因此，嗜热菌蛋白酶的结晶和冻干制剂以及这些制剂的溶液均含有一定量的不同的嗜热菌蛋白酶自体溶解片段。
为限制自体溶解攻击，对含有嗜热菌蛋白酶的溶液施加低温。然而，在这种条件下，酶活性仅有所降低(即，仍存在一些蛋白水解活性)，但没有完全失活。在此方面，注意到Inouye，K.等人(J Biochem.见上文)在未进行任何纯化步骤的条件下测定了溶液的蛋白含量。因此所检测的蛋白浓度对应于完整的嗜热菌蛋白酶及其降解片段的混合物。
从本领域的状态来看，本发明的目的是提供在水溶液中具有稳定形式的嗜热菌蛋白酶的方法和组合物。通过提供稳定的形式，嗜热菌蛋白酶的沉淀趋势得到降低，并且酶溶液能在均质状态下保持较长的时间。
本发明的发明人意外地发现，通过首先将嗜热菌蛋白酶溶解在具有低离子浓度的缓冲液中，然后在已经含有嗜热菌蛋白酶的溶液中添加盐并溶解该盐，出乎意料地能够形成具有高浓度嗜热菌蛋白酶的溶液。同时，在根据本发明的这些条件下，解离的(dissociated)嗜热菌蛋白酶在溶液中是稳定的，即，溶液能在较长的时间内保持清澈，期间不形成沉淀。
当需要在溶液中保持一定量的嗜热菌蛋白酶以用于分配其等分样品或用于制备与其它酶制剂(如胶原酶)的共混物时，本发明能够提供显著的有益效果。此类蛋白水解酶的共混物尤其可用于解离器官组织以用于从组织分离细胞亚群。
发明内容
本发明的第一个方面是制备嗜热菌蛋白酶(EC 3.4.24.27)溶液的方法，该溶液中溶解的嗜热菌蛋白酶为稳定的形式，所述方法包括第一步骤(P)，将包含嗜热菌蛋白酶的固体制剂与水性溶剂混合并制备第一溶液，其中所述第一溶液包含(i)能够将pH维持在pH 4.5至pH 9的范围内的缓冲盐、(ii)一种或多种盐、和(iii)嗜热菌蛋白酶，并且在所述第一溶液中，包括(一种或多种)缓冲盐在内的一种或多种盐的合计(aggregate)浓度在约0.1mM至约150mM的范围内，其中所述方法还包括随后的步骤(Q)，量取一定量的另外的盐(a further salt)添加到所述第一溶液中，其中该盐选自NaCl、NaBr、NaNO3、NaJ、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2、和它们的混合物，并溶解所述另外的盐，从而制备第二溶液，其中所溶解的嗜热菌蛋白酶为稳定形式。
本发明的另一个方面是液体组合物，包含：水；解离(dissociated)形式的嗜热菌蛋白酶；解离的缓冲盐，能够将pH维持在pH 4.5至pH 9的范围内；以及选自NaCl、NaBr、NaNO3、NaJ、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2、和它们的混合物的解离的盐，其中所述组合物为均质溶液达5小时或更长时间，并且所述组合物含有浓度在约1mg/ml至约10mg/ml范围内的嗜热菌蛋白酶。
本发明的另一个方面是液体组合物，包含：水；解离形式的嗜热菌蛋白酶；解离的缓冲盐，能够将pH维持在pH 4.5至pH 9的范围内；以及选自NaCl、NaBr、NaNO3、NaJ、LiCl、MgCl2、CaCl2、和它们的混合物的解离的盐，其中所述组合物为均质溶液达5小时或更长时间，并且所述组合物含有浓度在约10mg/ml至约23mg/ml范围内的嗜热菌蛋白酶。
本发明的再一个方面是根据本发明的组合物用于储存、运输或分配解离形式的嗜热菌蛋白酶的用途。
附图说明
图1实施例8中所述的波长扫描的结果。纵坐标表示检测器在800nm处测得的任意单位(a.u.)的光强度。横坐标表示入射光的波长。(A)含有水性缓冲液的液体样品；(B)在水性缓冲液中含有嗜热菌蛋白酶胶体的液体样品。
图2含有THERMOASE冻干物的溶液的色谱分析的示例性结果，所述溶液由实施例2中所述的第一步骤获得，即，无进一步的渗滤步骤/在进一步渗滤步骤之前。THERMOASE冻干物溶解在含有2.3M NaCl、5mM CaCl2、20mM HEPES，pH 7.5的水性缓冲液中；溶液的蛋白含量为8.2mg/ml，如在280nm处用光度法测定。该图显示50μl均质溶液样品的HPLC色谱。标出了由(i)至(v)表示的5个峰区域。HPLC的条件和参数在实施例2中描述。纵坐标：mA.U.；横坐标：保留时间[min]。
图3含有THERMOASE冻干物的溶液的色谱分析的示例性结果，所述溶液由实施例2中所述的第二步骤获得，即，包括进一步的渗滤步骤/在进一步渗滤步骤之后。在渗滤之后，THERMOASE在含有170mM NaCl、5mM CaCl2、20mM HEPES、pH 7.5的水性缓冲液中；渗滤后溶液的蛋白含量为4.9mg/ml，如在280nm处用光度法测定。该图显示50μl均质溶液样品的HPLC色谱。标出了由(vi)至(viii)表示的3个峰区域。HPLC的条件和参数在实施例2中描述。纵坐标：mA.U.；横坐标：保留时间[min]。
具体实施方式
本发明的说明书中所用的某些术语具有特定意义，或者为首次定义。为了本发明的目的，所用术语由其领域所接受的定义(存在这些定义时)来定义，除非那些定义与下文所列的定义冲突或部分冲突。在定义冲突的情况下，术语的意义首先由下文所列的各种定义来定义。
本发明说明书和权利要求书中所用的术语“包括(或包含)”是指“包括，但不一定限于”。
本文所用的冠词“一个”和“一种”是指一个(或一种)或指多于一个(或一种)(即，指至少一个(或一种))的语法对象物品。举例来说，“一种化合物”指一种化合物或多于一种的化合物。
当指数值范围，例如但不限于浓度范围时，范围由第一个值n1和第二个值n2表示(例如，“n1至n2的范围”)。所指范围的下限应理解为等于或高于第一个值的值。所指范围的上限应理解为等于或低于第二个值的值。因此，在所指范围内的值x给定为n1≤x≤n2。当使用词语“之间”来表示范围时，上限和下限应理解为包括在该区间内。因此，表述“值x在n1和n2之间”应理解为n1≤x≤n2。
除非另外指明，否则术语“约”和符号“～”与数值n联用时(“约n”、“～n”)应理解为表示值x在该数值±该数值的5％所给定的区间内，即，n-0.05×n≤x≤n+0.05×n。除非另外指明，否则术语“约”或符号“～”与数值n联用描述本发明的优选实施方案时，n值是最优选的。
“混合物”是通过在不发生化学反应的条件下混合两种或更多种不同物质而制成的物质。在混合物中物体并不结合在一起。混合物通常可以分离回到其原始组分。混合物为如元素和化合物之类的化学物质机械共混或混合的产物，没有化学键合或其它化学变化，因此各成分物保持其自身的化学性质和组成(makeup)。尽管混合物中没有化学变化，但是混合物的物理性质，如其熔点，可能与其组分不同。混合物为均质的或异质的。
均质的混合物是具有明确的、恒定的性质的混合物。颗粒均质散布。例如，任何量的给定混合物都具有相同的组成(composition)和性质。均质的混合物为仅由一个相构成的均一混合物。为本发明的目的，一种或多种解离的盐的溶液为均质混合物的非限制性实例。
溶液为一种或多种物质(溶质)溶解(即，解离)于另一种物质(溶剂)的均质混合物。通常的实例为固体溶解于液体(即，盐或蛋白质溶解于水)。溶解度为化合物的性质。根据条件，能够在溶剂或溶液中溶解的物质的量可以变化。
非均质(异质)混合物的非限制性实例为胶体和悬浮液。在本发明的上下文中，悬浮液理解为异质流体，其含有的固体颗粒大到足以沉降。与胶体不同，如果静置，悬浮的颗粒会随时间沉淀下来。这将悬浮液与胶体区别开，在胶体中悬浮的颗粒更小并且不沉淀。
在溶液中，溶解的物质不以固体存在，并且溶质(一种或多种)和溶剂均匀地混合。术语溶液的“稳定性”是指溶解的物质保持在溶解状态的趋势。也就是说，该术语是指溶液在给定的时间间隔内保持均质的能力。因此，稳定性可以通过测定所述的时间间隔而以定量的方式表征。因此，在以稳定性较低为特征的第一溶液中，溶解的物质显示较高的沉淀趋势或形成胶体或悬浮液的趋势，这与特征在于稳定较高性的第二溶液相反，在该第二溶液中所述趋势较低。因此，在一定时间之后，所述第一溶液变为异质混合物，而所述第二溶液仍为均质混合物。
在某些条件下，溶液的稳定性可增加，也就是说溶解的物质沉淀的趋势降低。为本发明的目的，具有较低沉淀趋势的物质称为“稳定形式”。
浊度(turbidity)是由于悬浮液或胶体中存在颗粒而引起的水浑浊性的量度。有若干测定浊度的实践方法，最直接的是光穿过水样品柱时光衰减(即，强度降低)的某种测量。因此，测定浊度的一个方法是目测检查，即，用眼睛检查。
另一个测定方法是用光度计测量光衰减。在这个方面，术语“光密度”(还称为“OD”)表示在给定波长λ下光学元件对于给定长度的透光度的无单位量度：
ODλ＝log10O＝-log10T＝-log10(I/I0)
其中
O＝每单位的不透明度
T＝每单位的透光度
I0＝入射光束的强度
I＝透射光束的强度
光密度越高，则透光度越低。由于聚集在颗粒上的光束散射，所以与清澈的溶液相比，悬浮液或胶体的光密度增加。
测定浊度的优选方法是测量散射光。为此目的，通常使用光散射光度计。依据检测和定量光散射所根据的方向，本领域内已经知道几种类型的散射光光度计。原则上，所有这些散射光光度计都可以用于定量评估液体样品中的浊度。术语“光散射”总体上包括由样品中的颗粒所产生的光波散射以及由样品中的微粒物(particulate matter)所产生的反射。后向散射(Back Scatter)定义为朝向光源方向小于90°。前向反射(Forward scatter)定义为背向光源或与光源相同的总体方向小于90°。现在所用的浊度测量单位大多数是基于90°侧向散射测量技术。
散射光的强度取决于异质混合物中未溶解的(微粒)物质的量并且可以由式I来描述：
F＝I0·Φ·(2.303·ε·c·d)    (式I)
其中
F  为散射光的强度
I0 为入射光束的强度
Φ 为发射光子与吸收光子的比率
ε 为混合物中微粒物质的摩尔吸光系数
c  为比色杯中每体积液体样品(异质混合物)的微粒物质量
d  为比色杯间距厚度
为本发明的目的，用荧光光度计进行90°侧向散射测量以测定含有嗜热菌蛋白酶作为微粒物质的异质混合物的浑浊性。通常，这些混合物为胶体。
在本发明的情况下“粗嗜热菌蛋白酶”是主要由基本上未降解的(＝完整的)嗜热菌蛋白酶和另外的降解产物(通常来自自体溶解攻击)构成的蛋白混合物。通常，发现约70％的粗嗜热菌蛋白酶基本上未降解，而约24％的粗嗜热菌蛋白酶由保留着蛋白水解活性(不同程度)的不同降解产物构成，约6％是无蛋白水解酶活性的片段和其它杂质。THERMOASE是一种用于示例本发明的有益效果的粗嗜热菌蛋白酶制剂。然而，本发明并不限于使用THERMOASE制剂，可以使用酶的其它制剂来实践本发明。
THERMOASE是蛋白含量在约30％[w/w]至约35％[w/w]的范围内的冻干物。冻干物中的蛋白由“粗嗜热菌蛋白酶”构成。
从本领域现有状态知道，如果拟用作干嗜热菌蛋白酶或含有嗜热菌蛋白酶的干组合物的溶剂的水性缓冲剂中存在盐，优选解离的中性盐，则嗜热菌蛋白酶的溶解度增加。然而，嗜热菌蛋白酶的水溶液不稳定，因为溶解的嗜热菌蛋白酶会发生转变，这降低了它的溶解度。该转变的准确性质还不清楚，但是可以合理地推测，嗜热菌蛋白酶的一个或多个疏水结构域的氨基酸残基在此过程中起作用。由于该转变，嗜热菌蛋白酶的溶解度降低。结果，新制备的清澈酶溶液变得不透明并且很大部分的蛋白最终沉淀。缺乏稳定性的实例在实施例6，表13和14，1-3号中给出。即使在冻干物浓度较低并且存在约1.1M NaCl的情况下，嗜热菌蛋白酶在被引入溶液后也有很强的沉淀趋势。
本发明人令人吃惊地发现，该转变可以被抑制并且嗜热菌蛋白酶可以在溶液中稳定。为此目的，使嗜热菌蛋白酶、粗嗜热菌蛋白酶或含有嗜热菌蛋白酶的冻干物和一或多种盐与具有低盐浓度的水性缓冲液接触以形成仅稳定很短的时间段的溶液。随后，添加另外的固体形式的盐并且之后其在溶液中解离。在此步骤之后，溶液中的嗜热菌蛋白酶为稳定形式，其特征在于沉淀趋势显著降低。
根据本发明，在使具有低盐浓度的水性缓冲液与嗜热菌蛋白酶、粗嗜热菌蛋白酶或含有嗜热菌蛋白酶的冻干物接触之前，包括缓冲盐在内的解离的盐在缓冲液中的浓度优选低于150mM，优选在0.1mM至150mM的范围内。依据嗜热菌蛋白酶制剂，水性缓冲液中盐浓度增加至存在于含有嗜热菌蛋白酶的固体制剂中的盐在缓冲液中解离的程度。
所述固体形式的盐优选为除无机硫酸盐之外的中性盐。优选的固体盐选自NaCl、NaBr、NaNO3、NaJ、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2、和它们的混合物。
第一主要步骤是形成含有嗜热菌蛋白酶的清澈溶液。在嗜热菌蛋白酶制剂不能形成均质清澈溶液的情况下，需要另外的澄清步骤。例如，可以通过过滤、离心或等同方法来澄清溶液。
作为第二主要步骤，需要将固体形式的盐添加至新制备的嗜热菌蛋白酶清澈溶液中。在约2℃至约8℃的范围内的温度下，优选在获得嗜热菌蛋白酶的清澈溶液之后不超过30min时添加固体形式的盐。更优选较短的时间，如不超过15min、10min、和5min。
在嗜热菌蛋白酶溶液中使用总浓度在约1.5M至3.5M范围内的解离的盐，溶液中的嗜热菌蛋白酶变得稳定了并且溶液能保持为清澈的均质混合物长达16小时或甚至更长。
令人吃惊地，此溶液甚至可以用具有较低盐浓度的缓冲液渗滤(diafiltrate)；在此过程中，之前添加的解离盐的浓度可被降低(参见实施例2)。在这点上，渗滤是一种交叉流动过滤过程，其使得能够转移低分子量物质、水和/或溶剂穿过膜而不改变溶液体积。此过程被用于纯化保留的大分子量物质(即，基本上完整的嗜热菌蛋白酶)，而去除低分子量物质，包括嗜热菌蛋白酶的蛋白水解片段。渗滤步骤同时使得能够交换缓冲液，从而在渗滤过程之前简单地改变给定溶液的性质。
甚至在这些条件(即，在渗滤过程期间)下，嗜热菌蛋白酶仍保持在稳定的形式，也就是说嗜热菌蛋白酶在溶液中保持稳定。根据本发明的冷冻嗜热菌蛋白酶溶液在融化后也观察到了相同的效果。
因此，本发明尤其提供能够在可重现的条件下较长时间处理嗜热菌蛋白酶的均质溶液的方法(means)、组合物和条件。这在嗜热菌蛋白酶与其它酶共混或嗜热菌蛋白酶溶液分配为等分试样(如使用自动装置)时尤其有用。
然而，更详细地讲，本发明包括下列各项：
1、一种制备嗜热菌蛋白酶(EC 3.4.24.27)溶液的方法，其中所溶解的嗜热菌蛋白酶为稳定形式，所述方法包括第一步骤(P)，将包含嗜热菌蛋白酶的固体制剂与水性溶剂混合并制备第一溶液，所述第一溶液包含：
(i)能够将pH维持在pH 4.5至pH 9范围内的缓冲盐，
(ii)一种或多种盐、和
(iii)嗜热菌蛋白酶，
并且在所述第一溶液中，包括(一种或多种)缓冲盐在内的所述一种或多种盐的合计浓度在约0.1mM至约150mM的范围内，并且
其中所述方法还包括随后的步骤(Q)，量取一定量的另外的盐添加到所述第一溶液中并且溶解该另外的盐，其中所述盐选自NaCl、NaBr、NaNO3、NaJ、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2、和它们的混合物，
从而制备第二溶液，其中所溶解的嗜热菌蛋白酶为稳定形式。
2、根据第1项所述的方法，其中在步骤(P)中获得的所述第一溶液为均质溶液。
3、根据第1和2项中任何一项所述的方法，其中在步骤(P)中所述水性溶剂包含水和缓冲盐。
4、根据第1和2项中任何一项所述的方法，其中在步骤(P)中所述包含嗜热菌蛋白酶的固体制剂还包含一种或多种盐。
5、根据第4项所述的方法，其中在步骤(P)中所述水性溶剂为水。
6、根据第1至5项中任何一项所述的方法，其中在步骤(P)中所述固体制剂包含浓度为约20％[w/w]或更高的嗜热菌蛋白酶。
7、根据第1至5项中任何一项所述的方法，其中在步骤(P)中所述固体制剂包含浓度在约20％[w/w]至100％[w/w]范围内，更优选在约20％[w/w]至约80％[w/w]范围内，并且甚至更优选在约20％[w/w]至约60％[w/w]范围内的嗜热菌蛋白酶。
8、根据第6项或第7项所述的方法，其中在步骤(P)中所述固体制剂包含浓度在约20％[w/w]至50％[w/w]范围内，更优选在约20％[w/w]至约40％[w/w]范围内，并且甚至更优选在约20％[w/w]至约30％[w/w]范围内的嗜热菌蛋白酶。
9、根据第8项所述的方法，其中在步骤(P)中，所述固体制剂包含浓度在约20％[w/w]的嗜热菌蛋白酶。
10、根据第1至9项中任何一项所述的方法，其中在步骤(P)中，包含嗜热菌蛋白酶的制剂在所述水性溶剂中的浓度在约1mg/ml至约100mg/ml范围内。
11、根据第10项所述的方法，其中在步骤(P)中，所述固体制剂的浓度在约20mg/ml至约60mg/ml的范围内，并且更优选在约25mg/ml至约50mg/ml的范围内，甚至更优选为约30mg/ml。
12、根据第1至11项中任何一项所述的方法，其中在步骤(P)中，在所述第一溶液中的所述一种或多种盐(ii)包括选自NaCl、Na2SO4和它们的组合的盐。
13、根据第4项所述的方法，其中在步骤(P)中，在所述含有嗜热菌蛋白酶的固体制剂中，所述一种或多种盐选自NaCl、Na2SO4和它们的组合。
14、根据第13项所述的方法，其中在步骤(P)中，所述固体制剂含有在约50％[w/w]至约70％[w/w]范围内的NaCl、和/或在约0.5％[w/w]至约7.5％[w/w]范围内的Na2SO4，且更优选所述固体制剂含有在约60％[w/w]至约65％[w/w]范围内的NaCl、和/或在约3％[w/w]至约6％[w/w]范围内的Na2SO4。
15、根据第12至14项中任何一项所述的方法，其中在步骤(P)中所述固体制剂含有粗嗜热菌蛋白酶。
16、根据第1至15项中任何一项所述的方法，其中在步骤(P)中，在所述第一溶液中硫酸根离子的浓度在约1mM至约10mM范围内，更优选所述第一溶液中硫酸根离子的浓度为约5mM。
17、根据第1至16项中任何一项所述的方法，其中在所述随后的步骤(Q)中，所述另外的盐以固体形式添加。
18、根据第1至17项中任何一项所述的方法，其中在步骤(Q)后所获得的第二溶液中所述另外的盐的总浓度在约1.5M至约5M范围内。
19、根据第18项所述的方法，其中在步骤(Q)后所获得的第二溶液中所述另外的盐的总浓度在约2M至约3.5M范围内。
20、根据第19项所述的方法，其中在步骤(Q)后所获得的第二溶液中所述另外的盐的总浓度在约2M至约2.5M范围内。
21、根据第19项所述的方法，其中在步骤(Q)后所获得的第二溶液中所述另外的盐的总浓度为约2.3M。
22、根据第17至21项中任何一项所述的方法，其中在步骤(Q)后所获得的第二溶液中硫酸根离子的浓度低于约10mM。
23、根据第22项所述的方法，其中在步骤(Q)后所获得的第二溶液中硫酸根离子的浓度在约1mM至约10mM的范围内，更优选在约1mM至约5mM的范围内。
24、根据第1至23项中任何一项所述的方法，其中在步骤(P)中所获得的第一溶液中，包括(一种或多种)缓冲盐在内的所述一种或多种盐的合计浓度在约100mM至500mM的范围内，更优选在约300mM至400mM的范围内。
25、根据第1至24项中任何一项所述的方法，其中在步骤(P)中所述水性溶剂包含Ca2+离子。
26、根据第25项所述的方法，其中在所述水性溶剂中，Ca2+离子的浓度在约0.1mM至约10mM的范围内，甚至更优选地在约1mM至约10mM的范围内。
27、根据第26项所述的方法，其中在所述水性溶剂中，Ca2+离子的浓度为约5mM。
28、根据第1至27项中任何一项所述的方法，其中在步骤(P)中，所述水性溶剂包含浓度在约0.1mM至约100mM范围内、并且更优选在约1mM至约100mM的范围内的缓冲盐。
29、根据第28项所述的方法，其中在所述水性溶剂中，所述缓冲盐的浓度在约5mM至约50mM范围内。
30、根据第29项所述的方法，其中在所述水性溶剂中，所述缓冲盐的浓度在约15mM至约25mM范围内。
31、根据第30项所述的方法，其中在所述水性溶剂中，所述缓冲盐的浓度为约20mM。
32、根据第28至31项中任何一项所述的方法，其中所述缓冲盐选自BES(N，N-双(2-羟乙基)-2-氨乙基磺酸)、三(三(羟甲基)氨基甲烷)、双三(双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷)、双三丙烷(1，3-双(三(羟甲基)甲基氨基)丙烷)、HEPES(N-(2-羟乙基)-哌嗪-N′-2-乙基磺酸)、MES(2-(N-吗啉基)乙基磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉基)丙基磺酸)、MOPSO(3-吗啉基-2-羟基丙基磺酸)、PIPES(哌嗪-1，4-双(2-乙基磺酸))、TAPS(N-三(羟甲基)甲基-3-氨丙基磺酸)、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨乙基磺酸)、TEA(三乙醇胺)、和Tricine(N-(2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基)甘氨酸)。
33、根据第1至32项中任何一项所述的方法，其中在步骤(P)中，所述第一溶液的pH在约pH 5.5至约pH 8.5的范围内。
34、根据第33项所述的方法，其中所述pH为约7.5。
35、根据第1至34项中任一项所述的方法，其中在步骤(Q)之后所获得的第二溶液中，基本上完整的嗜热菌蛋白酶的浓度为约5mg/ml或更高，并且其中溶液中的嗜热菌蛋白酶为稳定形式。
36、根据第35项所述的方法，其中在骤(Q)之后所获得的第二溶液中，基本上完整的嗜热菌蛋白酶的浓度为约5mg/ml或更高并且低于约35mg/ml。
37、根据第35项所述的方法，其中所述另外的盐选自KCl、LiCl、NaCl、NaBr、NaJ、NaNO3、MgCl2、CaCl2、和它们的混合物。
38、根据第37项所述的方法，其中稳定形式的嗜热菌蛋白酶的浓度为约10mg/ml或更高并且低于约35mg/ml。
39、根据第38项所述的方法，其中稳定形式的嗜热菌蛋白酶的浓度为约20mg/ml。
40、一种液体组合物，包含水；解离形式的嗜热菌蛋白酶；解离的缓冲盐，能够将pH维持在pH 4.5至pH 9的范围内；以及选自下列的解离的盐：NaCl、NaBr、NaNO3、NaJ、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2、和它们的混合物，其中所述组合物含有浓度在约1mg/ml至约10mg/ml范围内的嗜热菌蛋白酶。
41、一种液体组合物，包含水；解离形式的嗜热菌蛋白酶；解离的缓冲盐，能够将pH维持在pH 4.5至pH 9的范围内；以及选自下列的解离的盐：NaCl、NaBr、NaNO3、NaJ、LiCl、MgCl2、CaCl2、和它们的混合物，其中所述组合物为均质溶液达5小时或更长时间，并且所述组合物含有浓度在约10mg/ml至约23mg/ml范围内的嗜热菌蛋白酶。
42、根据第40项或根据第41项所述的液体组合物，所述液体组合物通过根据第1至39项中任何一项所述的方法获得。
43、根据第40至42项中任何一项所述的液体组合物，其中所述解离的嗜热菌蛋白酶为稳定形式。
44、根据第40至43项中任何一项所述的液体组合物，其中在约2℃至约8℃范围内的温度下，在形成组合物后至少5小时，所述组合物的浊度约等于参考溶液的浊度，其中所述参考溶液由与根据第41和42项中任何一项所述的组合物中浓度分别相同的相同解离成分构成，并且其中所述参考溶液缺少嗜热菌蛋白酶或它的片段。
45、根据第40至44项中任何一项所述的液体组合物，通过根据第1至39项中任何一项所述的方法获得并且在约2℃至约8℃范围内的温度下孵育，所述组合物在0-5小时的孵育期间内，甚至更优选在大于5小时的孵育期间内为均质溶液。
46、根据第44至45项中任何一项所述的液体组合物，其中所述解离的嗜热菌蛋白酶为基本上完整的。
47、根据第44至46项中任何一项所述的液体组合物，其中在约2℃至约8℃范围内的温度下，在形成组合物后至少5小时，所述组合物的浊度约等于参考溶液的浊度，其中所述参考溶液由与根据第44和46项中任何一项所述的组合物中浓度分别相同的相同解离成分构成，并且其中所述参考溶液缺少嗜热菌蛋白酶或它的片段。
48、一种液体组合物，包含水；解离形式的嗜热菌蛋白酶；解离的缓冲盐，能够将pH维持在pH 4.5至pH 9的范围内；以及浓度低于500mM的解离的NaCl，并且所述组合物含有浓度在约1mg/ml至约10mg/ml范围内的嗜热菌蛋白酶。
49、根据第48项所述的液体组合物，其中所述组合物的pH在pH 7至pH 8的范围内，甚至更优选为约pH 7.5。
50、根据第48和49项中任何一项所述的液体组合物，其中所述组合物包含Ca2+离子，更优选的Ca2+离子浓度在约0.1mM至约10mM的范围内，并且甚至更优选在约1mM至约10mM的范围内。
51、根据第48至50项中任何一项所述的液体组合物，其中所述组合物中包括缓冲盐在内的解离盐的合计浓度在约400mM至约200mM之间，并且更优选包括缓冲盐在内的解离盐的合计浓度为约200mM。
52、根据第48至51项中任何一项所述的液体组合物，其中所述组合物中解离的钠离子的浓度在约100mM至约250mM之间，更优选地解离的钠离子的浓度在约150mM至约200mM之间，并且甚至更优选地解离的钠离子的浓度为约170mM。
53、根据第48至52项中任何一项所述的液体组合物，其中所述组合物的导电率为约20mS/cm。
54、根据第48至53项中任何一项所述的液体组合物，其中在所述组合物中，基本上完整的嗜热菌蛋白酶的浓度在0.1mg/ml至10mg/ml的范围内，甚至更优选在1mg/ml至7.5mg/ml的范围内，并且甚至更优选在1mg/ml与5mg/ml之间，甚至更优选为2.5mg/ml或5mg/ml。
55、根据第48至54项中任何一项所述的液体组合物，所述液体组合物通过根据第1至39项中任何一项所述的方法以及随后的步骤获得，所述随后的步骤为：用渗滤缓冲液渗滤步骤(Q)后所获得的第二溶液，所述渗滤缓冲液含有能够将pH维持在pH 4.5至pH 9范围内的解离的缓冲盐和浓度低于500mM的解离的NaCl。
56、根据第55项所述的液体组合物，其中所述渗滤缓冲液含有浓度在约0.1mM至约10mM范围内的Ca2+离子。
57、根据第55和56项中任何一项所述的液体组合物，其中在所述渗滤缓冲液中，包括缓冲盐在内的解离的盐的合计浓度在约400mM至约200mM范围内，并且更优选包括缓冲盐在内的解离的盐的合计浓度为约200mM。
58、根据第40至57项中任何一项所述的液体组合物用于储存、运输或分配嗜热菌蛋白酶的用途，其中所述嗜热菌蛋白酶为解离形式。
实施例和附图用于帮助理解本发明，本发明的真正范围列在所附的权利要求书中。应理解在不背离本发明的精神的条件下可以对所述方法步骤进行修改。
实施例
实施例1
制备水性缓冲液和来自THERM0ASE制剂的嗜热菌蛋白酶的混合物
根据厂家提供的信息，约60-65％[w/w]的冻干物为NaCl。此外，冻干物含有约5％[w/w]Na2SO4(十水合物)。在此处以及下文的实施例中所用的THERMOASE冻干物的约30％[w/w]至约35％[w/w]由粗嗜热菌蛋白酶构成(还参见实施例2)。除非另外指明，否则下文所述的所有操作步骤都在2℃至8℃范围内的温度下进行。
制备体积为8升(l)的含有2M NaCl、5mM CaCl2、20mM HEPES，pH 7.5的水性缓冲液(A)。将量为200g的干THERMOASE冻干物与水性缓冲液混合并持续搅拌混合物。然而没有得到均匀的混合物，混合物仍然浑浊并不可能完全澄清。在添加冻干物之后约60min，溶液变得更加浑浊并且嗜热菌蛋白酶开始沉淀。
令人吃惊地，用缓冲液(A)所获得的非均质混合物的形成可以通过首先将THERMOASE制剂溶解于低离子强度的缓冲液中并仅在之后添加盐来避免。因此，在第一步中，制备体积为6.5升的含有5mM CaCl2、20mMHEPES，pH 7.5的水性缓冲液(B)。将量为200g的干THERMOASE冻干物溶解在缓冲液(B)中，得到清澈溶液。随后，作为第二步，添加935g固体NaCl并溶解在溶液中。作为第三步，通过再添加水性缓冲液(B)并搅拌混合将溶液体积调节至8升。得到均质溶液。
考虑到约60-65％[w/w]的冻干物由NaCl构成，溶液中最终的NaCl浓度为约2.3M。溶液中粗嗜热菌蛋白酶的最终浓度在约7.5mg/ml至8.8mg/ml的范围内，对应于约5.7mg/ml(在约5.2mg/ml至6.1mg/ml的范围内)的基本上未降解的嗜热菌蛋白酶浓度。
表5
溶解过程中THERMOASE成分的计算浓度；第一步：将THERMOASE冻干物溶解在6.5升体积中，添加固体NaCl之前
  成分   浓度
  CaCl2   5mM
  HEPES，pH 7.5   20mM
  NaCl   ～329mM
  Na2SO4   ～5mM
  盐和缓冲盐   ～359mM
  粗嗜热菌蛋白酶   ～10mg/ml
  完整的嗜热菌蛋白酶   ～7mg/ml
表6
溶解过程中包括缓冲盐在内的盐的计算浓度；第二步：6.5升体积，添加固体NaCl之后
  成分   浓度
  CaCl2   ～5mM
  HEPES，pH 7.5   ～20mM
  NaCl   ～2790mM
  Na2SO4   ～5mM
  盐和缓冲盐   ～2820mM
表7
在溶解过程中THERMOASE和盐成分的计算的最终浓度；第三步：体积调节至8升
  成分   浓度
  CaCl2   5mM
  HEPES，pH 7.5   20mM
  NaCl   ～2267mM
  Na2SO4   ～4mM
  盐和缓冲盐   ～2296mM
  粗嗜热菌蛋白酶   ～8.1mg/ml
  完整的嗜热菌蛋白酶   ～5.7mg/ml
实施例2
具有较低的NaCl浓度的嗜热菌蛋白酶溶液的稳定性
首先，使用实施例1中所述的缓冲液(B)和三步式方法制备THERMOASE冻干物的溶液。在随后的步骤中，对溶液进行渗滤，其中将液体组合物的缓冲液改成20mM HEPES、5mM CaCl2、170mM NaCl，pH7.5。令人吃惊地，嗜热菌蛋白酶仍然稳定，即，渗滤的溶液保持均质达5小时或比5小时更长的时间。
在渗滤之前和之后用SUPERDEXTM 75pg 10mm/300mm GL柱子(GEBioscience)作为固定相对THERMOASE冻干物的溶液进行HPLC分析。流动相为含有200mM NaCl、1mM CaCl2、50mM HEPES，pH 7.5的水性缓冲液。样品体积各为50μl。流速为0.5ml/min，各HPLC运行进行80min。检测装置为UV-Vis吸收检测器，在280nm处操作。
在各样品中，洗脱主峰，平均保留时间为约27分钟34秒(参见图2所示的区域(i)中的峰和图3所示的区域(vi)中的峰)。
在第一步(未渗滤)后分析的样品通常所显示的峰能够分成如图2所示的5个不同区域。主峰下的区域(表示为(i))反映基本上未降解(＝完整)的嗜热菌蛋白酶。认为对应于约20分钟15秒的保留时间之后的洗脱的峰肩反映的是嗜热菌蛋白酶二聚体。表示为(ii)、(iii)和(iv)的区域下的峰主要对应于嗜热菌蛋白酶的降解产物。表示为(v)的区域下的峰主要反映降解更强(不同程度)的嗜热菌蛋白酶片段及杂质。
在第二步骤之后(即，渗滤之后)分析的样品，给出的结果如图3所示例性显示。最明显地，对应于表示为(vii)和(viii)的峰区域的降解片段和杂质的相对量在渗滤的制剂中降低。此外，表示为(vi)的区域内的主峰与图2中相应的峰相比时通常明显(distinct)许多。渗滤后的色谱表明了未降解的嗜热菌蛋白酶基本上被分离和纯化。
图8
峰的表征和图2的峰面积的定量
  峰区域号   保留时间[min]   高度[mA.U.]   面积[mA.U.*min]   相对峰面积[％]
  (i)   27.56   42.381   88.655   72.19
  (ii)   31.33   0.679   2.658   2.16
  (iii)   33.59   2.810   11.595   9.44
  (iv)   38.60   3.074   7.692   6.26
  (v)   41.27   2.479   12.201   9.94
  ∑   51.423   122.801   100.00
表9
峰的表征和图3的峰面积的定量
  峰区域号   保留时间[min]   高度[mA.U.]   面积[mA.U.*min]   相对峰面积[％]
  (vi)   27.57   33.257   71.322   95.01
  (vii)   31.61   0.460   2.906   3.87
  (viii)   50.39   0.418   0.837   1.11
  ∑   34.135   75.065   100.00
为进一步测试，制备两种不同的嗜热菌蛋白酶储备液(i)5mg/ml和(ii)2.5mg/ml，其中在两个浓度下都通过渗滤将水性缓冲液调节成20mMHEPES、5mM CaCl2、170mM NaCl，pH 7.5；具有溶解的嗜热菌蛋白酶的缓冲液的导电性为约20mS/cm。通过过滤除菌将两种溶液灭菌并将其分装成等分试样。
自冻干物溶解于第一水性缓冲液的时间直到获得两种储备液的等分试样，嗜热菌蛋白酶在溶液中保持解离约6h。整个过程中两种储备液都保持清澈。
此外，将5mg的THERMOASE冻干物溶解于含有1mM CaCl2和5mMHEPES，pH 7.5的1ml水性缓冲液中。在标准条件下(参见上文)使用75柱子10/300，0.5ml/min的泵速对50μl的溶液等分试样进行HPLC分析并在280nm处用UV/Vis检测。流动相为在水中的1mM CaCl2、200mM NaCl、50mM HEPES，pH 7.5。相对于所获得的其它峰定量嗜热菌蛋白酶峰。使用这种方法在几个批次的THERMOASE中测定基本上完整的嗜热菌蛋白酶的相对量。4个独立的测定表明平均约70％的THERMOASE蛋白部分(fraction)为完整的嗜热菌蛋白酶。测得的各个值为59％、72％、71％和76％。
示例量为100g的THERMOASE冻干物含有约33g粗嗜热菌蛋白酶、约65g NaCl、和约2g Na2SO4。观察到在THERMOASE制剂中蛋白含量的变化在每100g冻干物30g至35g的范围内。通常，分子量为约34,600Da的基本上未降解和酶促活性的嗜热菌蛋白酶部分(也称为“嗜热菌蛋白酶”)在干冻干物中为约23％。干冻干物中剩余的约10％的蛋白主要由嗜热菌蛋白酶的降解产物构成，其中约80％保留了蛋白水解活性。其余的包含降解更严重的嗜热菌蛋白酶片段和其它杂质。因此，“粗嗜热菌蛋白酶”在本发明的角度来说应理解为由(a)约70％基本上未降解的嗜热菌蛋白酶、(b)约24％的保留蛋白水解活性(不同程度)的嗜热菌蛋白酶降解产物、和(c)约6％的无蛋白水解活性的片段和其它杂质。
实施例3
具有较低NaCl浓度的嗜热菌蛋白酶储备液在不同温度下的稳定性
在不同温度下孵育根据实施例2的步骤(即，包括渗滤)获得的浓度为(i)5mg/ml和(ii)2.5mg/ml的两种嗜热菌蛋白酶储备液的等分试样。在30min的间隔内通过目测检查评估浊度并如实施例9所述测量。记录溶液变浑浊之前暴露于各个温度的时间。结果总结于表10中。
至此，所有操作步骤都在8℃或更低的温度下(即，在2℃至8℃范围内的温度下)进行。在整个过程中两种储备液都保持清澈。
表10
嗜热菌蛋白酶浓度、温度以及嗜热菌蛋白酶保持清澈的时间
Figure G200910166864XD00221
Figure G200910166864XD00231
实施例4
嗜热菌蛋白酶浓度为2.5mg/ml的溶液在冷冻和融解后的稳定性
在4、6、8和10℃下孵育21h后，在-20℃下冷冻含有2.5mg/ml嗜热菌蛋白酶的等分试样(参见实施例3)并在该温度下储存6天。融解后在8℃下孵育等分试样。记录溶液变浑浊之前暴露于该温度的时间。结果总结于表11中。
表11
冷冻前的孵育温度和融解后嗜热菌蛋白酶溶液保持清澈的时间
  冷冻前的温度   融解后均质(清澈)溶液的保持时间
  4℃   7h
  6℃   6h
  8℃   4h
  10℃   1h
实施例5
具有不同浓度嗜热菌蛋白酶的溶液在冷冻和融解后的稳定性
按照与实施例2中所述类似的方法制备嗜热菌蛋白酶溶液在1mg/ml至5mg/m范围内的储备液。在-20℃下冷冻储备液的等分试样并在该温度下储存7天。融解后在8℃下孵育等分试样。记录溶液变浑浊之前暴露于该温度的时间。结果总结于表12中。
表12
嗜热菌蛋白酶浓度和融解后嗜热菌蛋白酶溶液保持清澈的时间
Figure G200910166864XD00241
实施例6
在存在不同盐的条件下含有嗜热菌蛋白酶的溶液的稳定性
将THERMOASE冻干物以100、50和25mg/ml的浓度溶解于20mMHEPES、5mM CaCl2 pH 7.5中。然后直接添加并溶解选自Na2SO4、NaCH3COO、NaCl、NaBr、NaNO3和NaJ的盐。作为对照，不添加盐。表13显示溶液中各离子的浓度，这些浓度考虑到了冻干物中存在的量。注意在该表中未考虑存在于HEPES缓冲液中的离子。
表13
添加了不同盐的嗜热菌蛋白酶溶液
Figure G200910166864XD00242
Figure G200910166864XD00251
表14显示对于表13所给出的混合物，是否能获得或者能获得多长时间稳定的均质(即，清澈)溶液。通过目测检查评估浊度，并且如实施例9中所述测量，表中所存在的符号表示如下：
     通过目测检查评估    a.u.，90°侧向散射测量
{###}不透明              901-＞1000(溢出(overflow))
{00} 浑浊                401-900
{o}  轻度浑浊            131-400
{}   清澈                0-130
表14
在不同盐的存在下嗜热菌蛋白酶溶液的稳定性
Figure G200910166864XD00252
Figure G200910166864XD00261
表中的结果为{目测评估}和“数值”(a.u.，90°侧向散射测量)
实施例7
在不同盐的存在下含有嗜热菌蛋白酶的溶液的稳定性
将THERMOASE冻干物以100、50和25mg/ml的浓度溶解于20mMHEPES、5mM CaCl2 pH 7.5中。然后直接添加并溶解选自KCl、NaCl、LiCl、MgCl2和CaCl2的盐。作为对照，不添加盐。表15显示溶液中各离子的浓度，这些浓度考虑到了冻干物中存在的量。注意在该表中未考虑存在于HEPES缓冲液中的离子。
表15
添加不同盐的嗜热菌蛋白酶溶液
Figure G200910166864XD00271
表16显示对于表15所给出的混合物，是否能获得或者能获得多长时间稳定的均质(即，清澈、不浑浊)嗜热菌蛋白酶溶液。通过目测检查评估浊度，并且如实施例9中所述测量，表所存在的符号表示如下：
     通过目测检查评估    a.u.，90°侧向散射测量
{###}不透明              901-＞1000(溢出)
{00} 浑浊                401-900
{o}  轻度浑浊            131-400
{}   清澈                0-130
表16
添加不同盐之后嗜热菌蛋白酶溶液的稳定性
Figure G200910166864XD00281
Figure G200910166864XD00291
表中的结果为{目测评估}/“数值”(a.u.，90°侧向散射测量)
实施例8
浊度的测定
对于本发明，用CARY ECLIPSE仪器(Varian，Inc.Palo Alto，CA，USA)进行浊度的仪器观察。
提供两种液体样品，第一种是具有5mM CaCl2、170mM NaCl、20mMHEPES，pH 7.5作为溶解成分的均质水性缓冲液；第二种样品是由相同的缓冲液和另外的约5mg/ml嗜热菌蛋白酶(还参见实施例2和3)组成的胶体。在进行测量之前，在10℃下过夜形成胶体。
仪器的参数设定如下：
仪器：           Cary Eclipse
仪器编号：       EL06033429
数据模式：       荧光
扫描模式         发射
X模式            波长
开始(nm)         200
结束(nm)         1000
激发波长(nm)     800
激发狭缝(nm)     5
发射狭缝(nm)     5
扫描速率(nm/min) 600
数据间隔(nm)     1
平均时间(s)      0.1
激发滤器         自动
发射滤器         开
PMT电压(V)       中等
校正光谱         关
多室支撑座(Multicell holder    多室
多重零(Multi zero)             关
在标准的石英比色杯中分析液体样品。通过波长扫描鉴定两种样品，其中入射光的波长由200nm增至1,000nm。检测波长保持恒定在800nm。既不检测荧光也不检测乳白光(opalescence)。在入射光波长处检测散射光。结果描述于图1(A)和(B)中，对于清澈的缓冲液样品，检测到的散射光强度为约100任意单位(a.u.)。对于第二种样品的胶体，散射光在检测器上产生溢出。
实施例9
目测检测和浊度测量
为证明本发明的效果，用CARY ECLIPSE仪器(Varian，Inc.Palo Alto，CA，USA)进行浊度的仪器观察。入射光的波长为800nm；在相同波长(即，800nm)下测量90°侧向散射。仪器的参数设定如下：
仪器：                        Cary Eclipse
仪器编号：                    EL06033429
数据模式：                    荧光
发射波长(nm)                  800
激发波长(nm)                  800
激发狭缝(nm)                  5
发射狭缝(nm)                  5
平均时间(s)                   0.1
激发滤器                     自动
发射滤器                     开
PMT电压(V)                   中等
多室支撑座(Multicell holder  多室
多重零(Multi zero)           关
重复                          1
样品平均                      关
在标准石英比色杯中分析液体样品。
通过将样品分成下列四个类别进行含有嗜热菌蛋白酶的液体样品的目测检查：(i)“清澈”、(ii)“轻度浑浊”、(iii)浑浊、(iv)“不透明(opaque)”。因此，类别(ii)至(iv)反映了浊度程度的增加。将这些类别与任意单位(a.u.)的读数相关联，如表17所示。
表17
液体样品的浊度、类别
  类别  示例性测量值   类别的数值范围
  清澈  114；85；95   0-130
  轻度浑浊  182；188；236；248；304；297   131-400
  浑浊  760；783；810；815；847   401-900
  不透明  ～1000；＞1000   901-＞1000(＝溢出)
为本发明的目的，“清澈”的含有嗜热菌蛋白酶的溶液的特征在于，其浊度(如上所测定)约等同于(即，约等于)不含嗜热菌蛋白酶但其他成分组成和各成分浓度均相同的溶液的浊度。根据本发明及如上文所示，这对应于0a.u.至130a.u.的范围，更优选对应于50a.u.至130a.u.的范围，如在上述条件下用波长为800nm的光进行的90°侧向散射所测定。
实施例10
来自THERMOASE制剂的蛋白的分光光度检测
在光度测定之前的所有步骤都在冰冷的温度下进行。THERMOASE以冻干的无定形粉末(Daiwa Kasei K.K.)提供。将一定量的THERMOASE冻干物溶解于含有10mM CaCl2、40mM TrisHCl，pH 7.5的水性Tris缓冲液中，得到浓度为1mg/ml的THERMOASE冻干物溶液。
一得到澄清的溶液(通过目测观察评估)，立即在25℃下在277nm处进行光度读数。
重复分析三个不同批次的THERMOASE。光度读数在介于0.57至0.61之间。认为在277nm处和280nm处测定的A(1mg/ml)值之间的差异的可能影响是不显著的并且小于其它可能的错误来源。
表18
使用不同A(1mg/ml)值作为参考得到的THERMOASE制剂中的蛋白(粗嗜热菌蛋白酶)的百分比[w/w]
Figure G200910166864XD00321

Claims (5)

1.一种制备嗜热菌蛋白酶(EC3.4.24.27)溶液的方法，所述溶液中溶解的嗜热菌蛋白酶为稳定形式，所述方法包括第一步骤(P)，将包含嗜热菌蛋白酶的固体制剂与水性溶剂混合并制备第一溶液，所述水性溶剂具有浓度范围为0.1mM-10mM的Ca2+离子，并且其中所述第一溶液包含：
(i)能够将pH维持在pH4.5至pH9范围内的缓冲盐，
(ii)NaCl和Na2SO4，和
(iii)嗜热菌蛋白酶，
在所述第一溶液中，包括缓冲盐在内的盐的合计浓度在0.1mM至500mM的范围内，并且其中所述方法还包括随后的步骤(Q)，量取一定量的另外的盐添加到所述第一溶液中并且溶解该另外的盐，其中所述盐选自NaCl、NaBr、NaNO3、NaJ、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2、和它们的混合物，
从而制备第二溶液，该第二溶液中所溶解的嗜热菌蛋白酶为稳定形式的，并且其中在步骤(Q)后所获得的第二溶液中所述另外的盐的总浓度在1.5M至5M范围内，
在步骤(P)中所述包含嗜热菌蛋白酶的固体制剂在所述水性溶剂中的浓度在1mg/ml至100mg/ml的范围内，
在步骤(P)中所获得的第一溶液中硫酸根离子的浓度在1mM至10mM的范围内，
在步骤(Q)之后所获得的第二溶液中，嗜热菌蛋白酶的浓度为5mg/ml或更高，并且低于35mg/ml。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(P)中，所述包含嗜热菌蛋白酶的固体制剂还包含一种或多种盐。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的方法，其中，在步骤(P)中，所述固体制剂包含浓度在20％[w/w]至100％[w/w]范围内的嗜热菌蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(Q)之后所获得的第二溶液中所述另外的盐的总浓度在2M至3.5M的范围内。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(Q)之后所获得的第二溶液中，嗜热菌蛋白酶的浓度为10mg/ml或更高并且低于35mg/ml，在步骤(Q)中的所述另外的盐选自NaCl、NaBr、NaNO3、NaJ、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2。
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