CN101657542B

CN101657542B - 生物柴油的生产

Info

Publication number: CN101657542B
Application number: CN2007800449907A
Authority: CN
Inventors: L·费希尔; D·尼古拉斯; K·桑德逊
Original assignee: Biomass Res & Refining Pty Ltd (au)
Current assignee: Biomass Res & Refining Pty Ltd (au)
Priority date: 2006-12-05
Filing date: 2007-12-05
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2027-12-05
Also published as: CN101657542A

Abstract

本发明涉及生物柴油原料和生物柴油的制备。提供了一种使用破囊壶菌制备生物柴油的方法。

Description

生物柴油的生产

技术领域

本发明涉及生物柴油原料以及生物柴油的生产。

发明背景

化石柴油和汽油蒸馏产品的储备正在耗竭。生物柴油是一种替代性燃料来源。生物柴油包含烷基酯。所述烷基酯可以通过生物柴油原料中包含的脂肪酸的酯交换反应制备。

生物柴油原料可以得自动物、植物或藻类来源。动物来源包括脂肪，例如动物脂、猪油和黄牛油。目前来说，使用动物来源作为生物柴油原料的商业规模生物柴油生产在经济上并不可行。无论如何，动物来源的供应无法满足目前对生物柴油原料的需求。

植物来源包括大豆油、菜籽油和棕榈油。它们还包括废品，例如这些油应用过程中得到的废品，例如在食品生产加工工业以及酒店业(hospitality)(包括饭店等)中产生的废品。根本上来说，由植物来源生产生物柴油的基建成本和生产成本远远高于由化石储备或汽油蒸馏产品生产柴油的成本。

人们也已经研究了使用藻类作为用于生物柴油原料的脂肪酸来源。但是，美国国立可再生能量源实验室(US National Renewable EnergyLaboratory)于1978年至1996年进行的关于使用藻类生产生物柴油的一项名为“水生生物计划(Aquatic Species Program)”的研究计划发现：商业生产需要具有快速生长速度和高脂类含量的藻类品系。人们发现这样的品系非常难以分离或者非常难以在商业规模下培养以提供可接受的脂肪酸产率。

发明概述

在某些实施方式中，提供了一种用于提供生物柴油的原料的制备方法，该方法包括以下步骤，即：使用破囊壶菌(thraustochytrid)形成不饱和脂肪酸，从而制备用于提供生物柴油的原料。

在其它的实施方式中，提供了一种用来制备生物柴油的方法，该方法包括以下步骤：使用破囊壶菌形成不饱和脂肪酸，对所述不饱和脂肪酸进行酯交换反应，由不饱和脂肪酸形成烷基酯，从而制备生物柴油。

在另外的实施方式中，提供了一种选择用来生产生物柴油原料的破囊壶菌的方法，该方法包括以下步骤：确定所生产的单不饱和脂肪酸的量超过所生产的多不饱和脂肪酸的量的破囊壶菌。

在另外的实施方式中，提供了一种选择用来生产生物柴油原料的破囊壶菌的方法，该方法包括以下步骤：确定能够被诱导从而使得生产单不饱和脂肪酸的量超过生产多不饱和脂肪酸的量的破囊壶菌。

在另外的实施方式中，提供了用来生产生物柴油原料的破囊壶菌的样品。该样品的特征是包含一种或多种以下组分：

(i)产生单不饱和脂肪酸的量超过多不饱和脂肪酸的量的破囊壶菌；或者

(ii)能够被诱导从而使得产生单不饱和脂肪酸的量超过多不饱和脂肪酸的量的破囊壶菌。

在另外的实施方式中，提供了一种生物反应器，其用来制备用于提供生物柴油的原料。所述生物反应器(bioreactor)包含上述破囊壶菌的培养物。

在其它的实施方式中，提供了一种根据上述方法制备的生物柴油原料或生物柴油。

在其它的实施方式中，提供了一种用于提供生物柴油的原料的制备方法，所述方法包括以下步骤：

-选择用来制备包含不饱和脂肪酸的破囊壶菌，所述破囊壶菌的特征是，由所述破囊壶菌制备的油中不大于50％的不饱和脂肪酸是多不饱和脂肪酸；以及

-使用所选的破囊壶菌制备油，

从而制备用于提供生物柴油的原料。

在一个实施方式中，所述破囊壶菌的特征是，由所述破囊壶菌制备的油中不大于25％，优选不大于10％的不饱和脂肪酸是多不饱和脂肪酸。

实施方式的详细描述

破囊壶菌是常见的海生异养生物，其以腐生生物方式生存，或者偶尔以寄生生物方式生存。通常它们的特征是具有外质网形成体(sagenogenetosome)，外质网(ectoplasmic net)，具有非纤维素鳞状物(scale)的细胞壁，以及由营养细胞、游动孢子囊和游动孢子构成的生活周期。

尽管之前人们认为破囊壶菌是原始真菌，但是近来人们将其转而归于破囊壶菌亚纲(subclass Thraustochytridae)(原藻界，不等鞭毛藻纲(Chromista，Heterokonta))，使其与不等鞭毛藻(例如包括硅藻在内的褐藻)更密切地匹配。对它们的18S核糖体RNA基因的分子分析最终显示，破囊壶菌显著不同于卵菌，而接近网黏菌(labyrinthulids)。

破囊壶菌的属的例子包括静配子壶菌属(Aplanochytriu)，网黏壶菌属(Labyrinthuloides)，日本壶菌属(Japonochytrium)，裂殖壶菌属(Schizochytrium)，破囊壶菌属(Thraustochytrium)和吾肯氏壶菌属(Ulkenia)。其中许多种类已被人们认知，包括克氏静配子壶菌(A.kerguelense)，斯托氏静配子壶菌(A.stocchinoi)，鲍网黏壶菌(L.haliotidis)，微网黏壶菌(L.minuta)，约肯氏网黏壶菌(L.yorkensis)，海洋日本壶菌(J.marinum)，集生裂殖壶菌(S.aggregatum)，涡形裂殖壶菌(S.limacinum)，红树林裂殖壶菌(S.mangrovei)，微壶菌(S.minutum)，集生破囊壶菌(T.aggregatum)，金黄色破囊壶菌(T.aureum)，金尼破囊壶菌(T.kinnei)，动孢破囊壶菌(T.motivum)，多增殖性破囊壶菌(T.multirudimentale)，厚皮破囊壶菌(T.pachydermum)，异枝破囊壶菌(T.striatum)，可见破囊壶菌(T.visurgense)，深吾肯氏壶菌(U.profunda)，辐射吾肯氏壶菌(U.radiata)和可见吾肯氏壶菌(U.visurgensis)。

破囊壶菌的主要商业价值与它们制备多不饱和脂肪酸(在本文中称为“PUFA”)的能力有关，所述多不饱和脂肪酸是例如ω-6(ω6或n-6)系列的脂肪酸(包括花生四烯酸)和ω-3(ω3或n-3)系列脂肪酸(包括二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸)。已知PUFA对于神经组织发育以及降低冠心病、中风和风湿性关节炎发病率是很关键的。因此，迄今为止，人们将注意力集中在能够制备PUFA的破囊壶菌的分离和培养上，其目标是提供用来改进人类和动物的营养状况的产品。

能够制备较高PUFA含量的破囊壶菌菌株(在本文中称为″PUFA^高菌株″)能够制备其中约90％为PUFA的不饱和油。由于显而易见的商业原因，人们对PUFA^高菌株的表征的充分性远高于对能够制得其中约10％为PUFA的不饱和油的菌株(在本文中称为“PUFA^低菌株”)的表征。实际上，人们几乎没有，或者完全没有对PUFA^低菌株进行表征。

现在本发明人认识到，PUFA^低菌株是特别重要的，因为这些菌株倾向于产生其中约90％为单不饱和脂肪酸(MUFA)的不饱和油，所述单不饱和脂肪酸(MUFA)包括棕榈油酸(C16:1)，油酸(C18:1)，二十碳烯酸(C20:1)和芥酸(C22:1)。

另外，发现与其它的藻类及其类似生物不一样的是，一些PUFA^低破囊壶菌菌株倾向于生成大量的特定种类的MUFA以及极少的其它的MUFA或PUFA。

脂肪酸链的饱和度与在生物柴油生产中的适用性高度相关，这是因为饱和度至少部分地决定了以下两点：(i)生物柴油的固化温度，以及(ii)生物柴油的氧化稳定性和热稳定性。

更具体来说，固化温度会随着生物柴油中烷基链长度和碳碳双键(C＝C)数量的变化而变化。烷基链较短、双键数较少的生物柴油的固化温度倾向于高于链长较长、饱和度较高的生物柴油。这意味着后者可以无需固化在较低的常温下使用，而前者要在较窄的温度范围内使用，而不能在更低的温度下使用。

另一方面，具有较高多不饱和油丰度的生物柴油倾向于具有较高的氧化速率，因此其稳定性低于不饱和油丰度不那么高的那些生物柴油。例如，油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)和亚麻酸(C18:3)的氧化速率相对比为1∶15∶25。

人们通常不希望生物柴油被氧化，因为由此会导致形成诸如醇、醛和短链脂肪酸之类的产物，这些醇会降低闪点，因此降低燃料效率，醛会导致酸败，短链脂肪酸会对发动机部件造成腐蚀。可以使用抗氧化剂，但是这样做会增加生产成本。

综上所述，很明显碳-碳双键的存在和数量是一个很重要的特征：饱和脂肪酸通常具有较高的固化温度，因此不能在较低的温度下使用，而多不饱和脂肪酸容易对热和氧化不稳定。在本文中，发明人关于作为PUFA^低的破囊壶菌菌株倾向于产生其中约90％为MUFA油的不饱和油这一发现对于生物柴油的生产是特别重要的。

使用破囊壶菌菌株的另一个优点在于，它们可以通过发酵培养维持，通常无需光源，例如用于光合作用的合成。这些特性允许在例如生物反应器中，采用连续培养以生产MUFA油。另外，每单位重量破囊壶菌生成的MUFA油的量倾向于远高于本领域目前常用的MUFA源产生的MUFA油的量。

因此，在某些实施方式中，提供了一种用于提供生物柴油的原料的制备方法，该方法包括以下步骤：使用破囊壶菌形成不饱和脂肪酸，从而制备用于提供生物柴油的原料。

该方法可包括进一步的以下步骤：从破囊壶菌收获油的形式的不饱和脂肪酸。在另一个步骤中，所述方法可以包括对不饱和酸进行分馏以制得MUFA。

在其它的实施方式中，提供了一种用来提供生物柴油的原料的制备方法。该方法包括以下步骤：

-提供一种能够被破囊壶菌发酵的能量源；

-将破囊壶菌加入该能量源；

-使用该破囊壶菌发酵该能量源以形成不饱和油；

-任选地对所述不饱和油进行分馏，得到不饱和油，从而制备原料。

在该方法的第一步骤，提供了一种能量源。如本领域已知的，″能量源″通常是有机物质，例如可以用作燃料或能量源的植物材料，植被(vegetation)或农业废料。

在一个实施方式中，选择能量源用来制备MUFA。在这些实施方式中，还可制备PUFA。

在其它的实施方式中，选择能量源仅用来制备MUFA。在这些实施方式中，可以选择能量源以尽可能减少PUFA的生成。

在某些实施方式中，对能量源进行选择，使得PUFA^高菌株产生MUFA。

在其它的实施方式中，对能量源进行选择以尽可能增加PUFA^低菌株产生的MUFA。

该方法的第二步包括将破囊壶菌加入该能量源。所述破囊壶菌通常是属于PUFA^低菌株的菌株。本领域技术人员可以使用实施例中所述的技术区分PUFA^低菌株与PUFA^高菌株。

在一些实施方式中，可以使用PUFA^高菌株，前提是提供的能量源以及用于发酵的条件会产生影响造成PUFA产生的减少，使得PUFA^高菌株基本采取PUFA^低菌株表型。

所述破囊壶菌可以是天然存在的或者基因工程化的变体。天然存在的破囊壶菌菌株的例子如本文所述。基因工程化的变体通常已经进行过修饰，以尽可能增加MUFA的产生。例如，该变体可以源自PUFA^高菌株，该菌株已经进行过操作，以提供PUFA^低菌株表型。这可以通过使PUFA高菌株的聚酮(polyketide)合成酶***缺失而完成。另一种替代方式是对PUFA^高菌株进行化学修饰，以抑制聚酮合成酶***。可以提供某些抗生素用于该目的。

该方法的第三步骤包括使用破囊壶菌发酵能量源来形成不饱和的油。通常对发酵条件进行选择以生产MUFA。在某些实施方式中，仅产生MUFA。但是在大多数的实施方式中，产生至少一定残余量的PUFA。所选择的用于发酵的条件可以用来尽可能减少PUFA产生，或者用来使得PUFA^高菌株产生MUFA。在其它的实施方式中，对发酵条件进行选择，以尽可能增加PUFA^低菌株产生的MUFA。

通常可以在本文所述的温度下对能量源发酵一段本文所述的时间。

所述发酵过程通常在生物反应器中进行。合适的生物反应器的一个例子是在其中对能量源进行连续的或周期性搅拌的生物反应器。可以将生物反应器调整用于连续培养。

通过使得油从破囊壶菌中释放出来，由发酵培养物得到不饱和油。该过程可以包括裂解破囊壶菌，从中提取脂类。

该方法可以包括第四步骤，该步骤包括对不饱和油进行分馏以得到单不饱和油，从而制得所述原料。当很大一部分的从破囊壶菌提取的脂类是PUFA的情况下，可能需要该步骤。可以通过本领域已知的方法完成将单不饱和油类从多不饱和油类分馏。

在另一些实施方式中提供了一种通过上述方法制备的原料。该原料通常包含MUFA以及极少量的(如果存在的话)PUFA。特别优选原料的例子是包含棕榈油酸(C16:1)，油酸(C18:1)，二十碳烯酸(C20:1)和芥酸(C22:1)的原料。油酸是特别优选的。

在另外的实施方式中，提供了一种制备用于提供生物柴油的原料的生物反应器。该生物反应器包含：

-破囊壶菌的培养物；以及

-能量源，其用来被破囊壶菌发酵，以产生不饱和油形式的原料。

所述破囊壶菌和能量源如上文所述。

在其它的实施方式中，提供了一种用来生产生物柴油的方法，该方法包括以下步骤：使用破囊壶菌形成不饱和脂肪酸，然后使得所述不饱和脂肪酸发生酯交换反应，由不饱和脂肪酸形成烷基酯，从而产生生物柴油。

在其它的实施方式中，提供了一种用来生产生物柴油的方法。该方法包括以下步骤：

-提供用来被破囊壶菌发酵的能量源；

-将破囊壶菌加入该能量源；

-使用所述破囊壶菌发酵能量源，形成不饱和油；

-任选地分馏所述不饱和油，制得单不饱和油；以及

-由所述不饱和油形成烷基酯，以制备生物柴油。

得到不饱和油之后，可以通过具有技术能力的技术人员已知的技术得到生物柴油。这些技术的目的是使得脂肪酸发生酯交换反应，以制备烷基酯。例子包括在反向流动***中，在80-85℃、温和压力的条件下，使用无机强酸，例如硫酸，或磺化离子交换树脂柱以及甲醇进行反应。

本领域常用的另一种技术是氢化。氢化在本领域中也被称为油的“硬化”。基本上，在催化剂的影响之下，使得油中的一部份不饱和脂肪酸与氢结合，制得不饱和程度较小的脂肪酸或者饱和脂肪酸。另外，所述氢化工艺可以是具有选择性的。该选择性会受到氢化反应中各种因素的影响，包括温度和压力。对于PUFA，氢化反应的选择性是由于存在被亚甲基中断的双键而造成的。

氢化工艺具有选择性对于生物柴油生产氢化的优点在于，可以用来将PUFA油转化为MUFA油，而不是将MUFA转化为饱和脂肪酸。例如，包含C18:2，C18:1和C18:0脂肪酸的混合物的油发生选择性氢化时，在基本上将所有的C18:2转化为C18:1之后，才会发生C18:1转化为C18:0。因此，在某些实施方式中，在制备油的时候，所有初始的PUFA都通过氢化转化为MUFA，该氢化工艺不会增加任何另外的不饱和脂肪酸。

在某些实施方式中，通过上述任意实施方式制备的生物柴油应包含约小于1质量％(克/100克生物柴油)的脂肪酸甲酯含量，所述脂肪酸甲酯包含四个或更多个双键。其还可以含有小于12质量％(克/100克生物柴油)的亚麻酸甲酯(一种酯化的PUFA)。

在其它的实施方式中，提供了一种用来制备生物柴油的方法，该方法包括以下步骤：使用破囊壶菌形成不饱和脂肪酸，对所述不饱和脂肪酸进行酯交换反应，由所述不饱和脂肪酸形成烷基酯，从而制备生物柴油。该实施方式包括以下步骤：对所述脂肪酸进行氢化，以由多不饱和脂肪酸形成单不饱和脂肪酸。该氢化工艺可以在酯交换反应之前或之后进行。

因此，在其它的实施方式中，提供了一种用来制备生物柴油的方法。该方法包括以下步骤：

-提供能够被破囊壶菌发酵的能量源；

-将破囊壶菌加入该能量源；

-使用破囊壶菌发酵所述能量源，以形成不饱和油；

-任选地对所述不饱和油进行分馏，以制得单不饱和油；

-对所述不饱和油进行氢化处理，将多不饱和油转化为单不饱和油；以及

-由所述不饱和油形成烷基酯，以制备生物柴油。

在其它的实施方式中，在用来制备生物柴油的方法中提供了以下步骤：使用破囊壶菌发酵能量源以制备不饱和油，该不饱和油可以作为用来生产生物柴油的原料。

在其它的实施方式中，提供了一种通过上述方法制备的生物柴油。

在其它的实施方式中，提供了一种用来确定一种破囊壶菌是否可以用来制备用于提供生物柴油的原料的方法。该方法包括以下步骤：

-得到破囊壶菌；

-确定破囊壶菌是否具有以下特性：

(i)该破囊壶菌产生的MUFA超过PUFA；或者

(ii)该破囊壶菌能够被诱导使得产生的MUFA超过PUFA；

从而确定该破囊壶菌是否可以用来制备用于提供生物柴油的原料。

本发明人已发现所产生的MUFA超过PUFA的破囊壶菌通常是PUFA^低菌株。本领域技术人员可以使用实施例中所述的技术将PUFA^低菌株与PUFA^高菌株相区分。

在另一个实施方式中，提供了一种用来制备生物柴油原料的破囊壶菌培养物。该培养物的特征是包含以下任一组分：

(i)PUFA^低菌株；或者

(ii)能够被诱导从而使得产生的MUFA超过PUFA的PUFA^高菌株。

在一个实施方式中，提供了一种破囊壶菌，本申请人已经于2007年11月15日将其保藏于澳大利亚，维多利亚，南墨尔本，克拉克街51-65号(邮编3205)的国家计量研究所(之前的AGAL，National MeasurementInstitute，51-65 Clarke Street，South Melbourne，Victoria Australia 3205)，保藏号为V07/029468。

在另一个实施方式中，提供了一种本文所述的破囊壶菌在用来制备本文所述的生物柴油或生物柴油原料的方法中的应用。

实施例

实施例1 PUFA^低菌株的分离和鉴别

破囊壶菌是海洋生态***中的植物材料的降解者。它们可以通过海湾河口水域中水生植物群的腐烂分解而分离。

使用两种常规分离方法和一种选择性分离方法。在无菌的50％海水中对腐烂的植物材料漂洗两次，直接置于选择性培养基上。使用0.2微米过滤器对水样品进行无菌过滤，将破囊壶菌从水样品中浓缩出来。保留过滤器，置于选择性培养基上。为了选择性地分离破囊壶菌游动孢子，将样品(水或者水与植物材料)置于无菌泊利罗尼(Palleroni)装置中(Palleroni，美国新泽西州，′细菌化学毒性实验用小室′(Chamber for Bacterial ChemotaxisExperimentsl)(1976)32，Appl Environ Microbiol 729-730)。向每个隔室加入无菌的含50％海水的水，直至液面达到接触槽底部上方2毫米处。将装有处于50％海水中的无菌化学吸引剂(例如谷氨酸、纤维素或果胶)的无菌5微升毛细管(卓蒙德“微帽”(Drummond″Micro-caps″)，卓蒙德科学公司(Drummond Scientific Co.))浸没在该槽之内。在20℃进一步培育2小时之后，将毛细管取出，通过喷射无菌的50％的海水对其外部进行清洗，然后将内容物铺展在琼脂培养基的表面上。不同属的破囊壶菌对吸引剂具有不同的响应，因此可以对分离具有一定的选择性(Fan，KW，Vrijmoed，LLP和Jones，EBG，′香港的红树林破囊壶菌的游动孢子的趋化性(ZoosporeChemotaxis of Mangrove Thraustochytrids From Hong Kong)′(2002)94Mycologia 569-578)。

将样品置于葡萄糖-酵母提取物-海水琼脂(0.5％葡萄糖，0.5％酵母提取物(Oxoid)，50％人造海水(20克/升海盐；Sigma)，1.5％琼脂(Oxoid))上，其中包含抗生物(青霉素，链霉素)以防细菌生长，在室温下培养长达七天。特征菌落(无菌丝体，类似酵母菌)在相同的培养基上次培养以纯化。

使培养物在室温下，在液态或固态的葡萄糖-酵母提取物-海水培养基中生长七天。通过在6000g的条件下离心处理20分钟，从液态培养物中回收生物质。而固态培养物中的生物质则是通过用清洁的显微载玻片刮擦板材而回收的。

根据Nichols，DS等人的′支链脂肪酸的变化标记在单核细胞增多性李司忒氏菌中生长的正常生理程度(Variation of Branched-Chain Fatty AcidsMarks the Normal Physiological Range for Growth in ListeriaMonocytogenes)(2002)68 Appl Environ Microbiol 2809-2813，通过分析脂肪酸甲酯来确定PUFA^低菌株的表型。

通过直接酯交换工艺提取样品(Dionisi，F.，P.A.Golay，M.Elli和L.B.Fay.1999.乳酸菌中脂肪酸量化的过程中环丙烷和共轭亚油酸的稳定性(Stability of cyclopropane and conjugated linoleic acids during fatty acidquantification in lactic acid bacteria)，Lipids 34：1107-1115)，证明制得的脂肪酸的分布可以与Bligh-Dyer溶剂提取法(Bligh，E.G.和W.J.Dyer.1959.全部脂质提取和纯化的快速方法(A rapid method for total lipid extractionand purification).Can.J.Biochem.Physiol.37：911-917)所得的结果相比。简单来说，将样品加入包含3毫升甲醇-氯仿-盐酸(10∶1∶1，V/V/V)的螺旋盖试管内。该试管在80℃加热1小时，然后冷却至室温。加入Milli-Q水(1毫升)，然后所得的脂肪酸甲酯用1.5毫升己烷-氯仿(4∶1，V/V)萃取三次。

使用装有交联的甲基硅酮(膜厚度0.33微米)熔融二氧化硅毛细管柱(长50米，内径0.22毫米)的惠普(Hewlett-Packard)5890 II气相色谱和5970A质量选择检测器分析脂肪酸甲酯。通过将测得组分的谱图与已知标样的谱图相比较，鉴别从所有样品得到的脂肪酸甲酯。通过制备二甲基二硫醚加合物，并对该加合物进行分析，从而确定选定的样品的单不饱和异构体中的双键位置和几何结构。

实施例2 PUFA^低菌株的实施例

PUFA^低菌株的例子包括：ACEM 0004(Thomas E Lewis的2001年的″澳大利亚破囊壶菌的表征和应用(Characterisation and application ofAustralia thraustochytrids)(PhD)，Morris Miller实验室，塔斯马尼亚大学)；以及F3-1和H1-14(Huang等人的2003年的″新分离的能够产生二十二碳六烯酸的破囊壶菌基于它们的多不饱和脂肪酸分布以及18s rRNA基因分析进行的分组(Grouping newly isolated docosahexaenoic acid-producingthraustochytrids based on their polyunsaturated fatty acid profiles andcomparative analysis of 18s rRNA genes)″Mar.Biotechnol.5：450-457)。其它的破囊壶菌菌株是与这些菌株的18s rRNA序列具有约91％核苷酸序列相同性的那些PUFA^低菌株。

实施例3 制备生物柴油原料

培养破囊壶菌的方法大致参见美国专利第6,451,567号。

通常情况下，为了商业可行性，所述破囊壶菌菌株是能够制备约30-60％(以干重为基准计)的MUFA以及小于1-2％的C18:2的菌株。

所述菌株可以在包含葡萄糖、纤维素和甘油的培养基中生长。后者是生物柴油生产的副产物。

该菌株以大约10²-10⁴个细胞/毫升的起始浓度提供于生物反应器内。

发酵条件通常是需氧的，因为去饱和酶是依赖氧气的。可以使用桨叶或涡轮进行搅拌，对培养物进行混合和充气。氧气水平可以为30-60％。该水平可以通过混合很容易地达到，无需补充气体混合物。

光对于培养来说通常并不重要。通常提供约20-28℃的温度范围。

用于批料***的培养物最大浓度通常约为0.8-48克/升。

通过测量吸光性或用显微镜进行检测来评估生长情况，以监控该培养物。可以通过染色，用显微镜或分光光度法估计脂质含量。

大部分批料培养7-10天。对于连续培养而言可进行连续收获。收获的速率可以通过菌株生长速度决定。通常基于生长速率经验性地决定稀释率，或者在化学型培养物(chemistat type culture)中将稀释率保持在一定的水平，以保持容易测量的参数(例如pH值，营养水平，氧气)。

实施例4 制备生物柴油

脂肪酸的来源可以是破囊壶菌产生的油原料，从破囊壶菌产生的原料分离的不饱和油原料，或者破囊壶菌产生的原料经氢化得到的氢化油原料。所述油原料可以适当地与甲醇、盐酸和其它可混溶的有机溶剂混合，形成单相混合物。根据试验确定，在限定的超过80℃的温度下，对该混合物加热限定的时间，可以最大程度地提高脂肪酸甲酯的产率。然后使用合适的有机溶剂的掺混物从反应混合物萃取出脂肪酸甲质，通过浓缩除去溶剂，制得生物柴油产品。

实施例5.对不饱和油或脂肪酸酯进行氢化，以制备生物柴油

可以通过以下方式完成氢化：使得通过本领域已知的方式产生的氢气流通过加热的由破囊壶菌产生的油原料，或者由破囊壶菌产生的酯交换的油原料，在所述油原料中悬浮着细小的粉末状催化剂(通常是与Pt或Ni相关的材料)。可以对该方法进行改良和变化，包括对以下因素进行改良和变化：催化剂、工艺参数、以及催化剂回收方法，从而调节对含有较少多不饱和组分的产物的选择性和最大程度提高其产率。该氢化法可以在酯交换反应之前或之后进行。

应当理解，本说明书所揭示和限定的本发明延伸到文字或附图中描述或显示的两种或更多种单独特征的所有组合。所有这些不同的组合构成本发明其它的方面。

Claims

1.一种用来制备生物柴油的方法，该方法包括以下步骤:

-使用破囊壶菌形成包含不饱和脂肪酸的油;

-对油中的不饱和脂肪酸进行酯交换，由所述不饱和脂肪酸形成烷基酯;

从而制得生物柴油，

其中所述破囊壶菌是所产生的单不饱和脂肪酸超过多不饱和脂肪酸的PUFA^低菌株，或是所产生的多不饱和脂肪酸超过单不饱和脂肪酸但已经经过操作以提供所产生的单不饱和脂肪酸超过多不饱和脂肪酸的PUFA^低菌株表型的PUFA^高菌株。

2.如权利要求1所述的方法，该方法还包括以下步骤:

-对油提供一定的条件，使得油中的多不饱和脂肪酸转化为单不饱和脂肪酸。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述油中的不饱和脂肪酸发生酯交换之前提供所述条件。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述油中的不饱和脂肪酸发生酯交换之后提供所述条件。

5.如权利要求1所述的方法，该方法还包括以下步骤:

-在对所述油进行酯交换以形成烷基酯的步骤之前，收获破囊壶菌形成的油。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，该方法还包括以下步骤:

-对油进行分馏，以制得单不饱和脂肪酸。

7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，由破囊壶菌产生的油包含不饱和脂肪酸，所述不饱和脂肪酸中90％为单不饱和脂肪酸。

8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述破囊壶菌形成的油包含不饱和脂肪酸，所述不饱和脂肪酸中10％为多不饱和脂肪酸。

9.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述破囊壶菌于2007年11月15日在澳大利亚3205，维多利亚，南墨尔本，克拉克街51-65号的国家计量研究所进行保藏，保藏号为V07/029468。

10.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述破囊壶菌是PUFA低菌株ACEM0004、F3-1或H1-14。