CN101657187A - 稳定的水性g-csf制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及pH为3.5－4.8、稳定的谷氨酸盐缓冲G－CSF制剂。本发明还涉及可以从所述制剂获得的冻干剂和粉末，以及包含所述冻干剂和粉末的药剂盒。

Description

稳定的水性G-CSF制剂
本发明涉及稳定的水性G-CSF制剂、G-CSF冻干剂或G-CSF粉剂以及含有这些冻干剂或粉剂的药剂盒(pharmaceutical kit)。
G-CSF(粒细胞-集落刺激因子)是属于细胞因子家族的天然存在的生长因子。G-CSF在造血过程中起着关键作用，并增强嗜中性粒细胞和嗜中性子代细胞的成熟、增殖、分化和存活。G-CSF在临床上主要用于控制肿瘤，尤其用于化疗后嗜中性白血球减少症的治疗，并且其还用于骨髓移植和传染性疾病的治疗。
天然形式的人G-CSF为具有5个半胱氨酸残基的约20kDa的糖蛋白。这些残基中的四个形成对该蛋白活性至关重要的两个分子间二硫键。由于从天然来源仅能获得少量的G-CSF，在药物制备中主要使用重组形式的G-CSF。可以通过，例如在哺乳动物细胞(例如CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞))中或在原核细胞(例如大肠杆菌)中表达G-CSF蛋白，而获得重组G-CSF。在哺乳动物中表达的重组蛋白具有不同于天然存在的G-CSF的糖基化模式。在大肠杆菌中表达的蛋白没有被糖基化，然而这些蛋白可能具有额外的N-末端蛋氨酸残基。
由于G-CSF蛋白的高疏水性，该蛋白的制剂较不稳定，尤其在该蛋白处于未糖基化的重组形式的情况下。G-CSF蛋白易于被小瓶或注射器等的侧壁吸附，并形成二聚体和更高级的聚集体。而且，还会经受化学修饰，例如脱酰胺化、氧化、二硫键断裂或蛋白水解。这常常导致活性损失，尤其在长期贮存所述蛋白的情况下。从治疗上考虑，例如在较长的时间内，以恒定剂量服用G-CSF的情况，这不仅成本高而且并不理想。此外，通过例如二聚化、氧化或降解形成的产物可以引起不利的免疫应答。另外，常规的G-CSF制剂对可能发生的机械应力(例如在运输过程中液体制剂摇动而产生的应力)敏感，并且还对单次或反复冻融敏感。这可能会导致更高级聚集体的形成以及活性的损失。
DE-A-37 23 781描述了包含作为活性成分的G-CSF的药物，其包含至少一种药学上可接受的表面活性剂、糖、蛋白或用于稳定活性成分的高分子量化合物。表面活性剂(诸如脂肪族脂肪酸的聚氧乙烯失水山梨醇酯)与人血清白蛋白和甘露醇组合使用。表面活性剂的使用量优选为1-10,000重量份/重量份G-CSF。pH值为7.4、磷酸盐缓冲的含水制剂可以在4℃长期保持稳定。然而，由于其抗原性，源自人类和动物的蛋白和肽可能引起不利的免疫反应。
EP-A-0 373 679公开的G-CSF是具有2.75-4.0的pH值和低导电性的G-CSF，其可以长期保持稳定。为了避免G-CSF的聚集，优选在这些制剂中不使用缓冲液。如果使用，则可以使用少于2mM的少量羧酸、柠檬酸、乳酸或酒石酸作为缓冲物质。然而，这些条件不能使pH值高于4.0的制剂保持长期稳定。
Herman，A.C.et al.(″Characterisation，Formulation，and Stability of(Filgrastim)，a Recombinant Human Granulocyte-Colony Stimulating Factor.″In：Formulation Characterisation and Stability of Protein Drugs，pp.303-328，R.Pearlman and Y.J.Wang，Eds.，Plenum Press，New York，1996)中阐述了未糖基化重组G-CSF的稳定组合物，其包含10mM乙酸钠(pH 4.0)、5％的甘露醇和0.004％的聚山梨醇酯80。此组合物可在2-8℃保持稳定24小时以上。
WO-A-94/14466公开了包含作为缓冲剂的乙酸、乳酸、柠檬酸、马来酸、磷酸、精氨酸及其盐的水性G-CSF药物制剂。这些制剂的pH值在2.5-5.0和7-8的范围。在这些制剂中，可能发生(例如溶液摇动过程中发生)的机械应力而形成的G-CSF多聚体和聚集体减少。
EP-A-0 306 824阐述了磷酸缓冲的稳定人蛋白(特别是***)制剂，其中，通过加入尿素、氨基酸和去污剂达到稳定。
EP-A-1 060 746公开了包含磷酸缓冲的含G-CSF的制剂，其pH为5-7且包含含量为1重量份或以下表面活性剂/重量份G-CSF的表面活性剂。
WO-A-94/14465公开了冻干的G-CSF药物制剂和由此得到的水性制剂。这些制剂包含作为稳定剂的麦芽糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖或氨基糖。优选通过精氨酸缓冲剂获得稳定的pH值。进一步添加的抗氧化剂、还原剂和氨基酸(例如谷氨酸)对冻干剂的稳定性没有显著影响。
EP-A-1 197 221公开了pH为5-7的长期稳定的G-CSF制剂，其包含赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸和天冬酰胺组成的组中的一种或多种氨基酸以及一种或多种疏水性氨基酸。为了避免G-CSF分子中蛋氨酸残基的氧化，向所述制剂中加入蛋氨酸氨基酸。
US-A-2007/0053871公开了包含G-CSF的水性制剂，其包含抗菌剂和渗透溶质(例如甘油、山梨糖醇、肌氨酸或蔗糖)以减轻抗菌剂对稳定性的破坏。缓冲剂的实例有乙酸盐、琥珀酸盐、葡糖酸盐、柠檬酸盐和组氨酸。
WO-A-2005/039620公开了能够在宽pH范围内保持稳定的琥珀酸盐缓冲组合物和酒石酸盐缓冲组合物。
WO-A-2006/138181公开了包含药物蛋白的组合物，其中所述组合物由蛋白自身进行缓冲。所涉及的大量药物蛋白中的一种蛋白为非格司亭(filgrastim)。
本发明的目的是提供适合药用的G-CSF水性制剂(aqueous G-CSFformulation)，其即使在机械应力和高温的条件下，也无需大量各种类型的稳定剂即可长时间保持稳定。
现已通过pH为3.5-4.8的谷氨酸盐缓冲G-CSF水性液体制剂达到该目的。
本发明还涉及由所述制剂得到的冻干剂和粉末。
本发明人意外发现，pH为3.5-4.8的谷氨酸盐缓冲G-CSF水性制剂能够在较高温度下长期保持稳定，即使制剂中基本不含糖、氨基糖和除谷氨酸/谷氨酸盐之外的氨基酸，例如精氨酸。聚集物(G-CSF的二聚体和更高级的多聚物)的形成仅以较低水平发生，即使贮存较长时间也能保持活性。即使在可能发生的机械应力下，例如复溶包含G-CSF的冻干剂或粉末、过滤G-CSF制剂、装瓶、充入注射器、运输和反复冻融过程中，也足以抑制G-CSF蛋白聚集物的形成或其它二级反应的发生。
本发明还涉及制备本发明制剂的方法，其中，所述方法包括将G-CSF与pH为3.5-4.8的谷氨酸盐缓冲水溶液合并。
本发明还涉及用于制备本发明制剂的药剂盒，其中，所述药剂盒包含被物理隔离的：
(a)含G-CSF的冻干剂或粉末；和
(b)用于复溶含G-CSF的冻干剂或粉末的、pH为3.5-4.8的谷氨酸缓冲水溶液。
本发明的其他实施方案体现于权利要求以及以下描述和附图中，其中：
图1显示以180apm振荡16h和以230apm振荡24h，并涡旋120秒后，由SEC(用峰面积％表示)测定在不同pH值下谷氨酸盐缓冲G-CSF制剂中、乙酸盐缓冲G-CSF制剂中和柠檬酸盐缓冲G-CSF制剂中G-CSF单体的含量；和
图2显示涡旋120秒并以180apm振荡16h后，由SEC(用峰面积％表示)测定的pH 4.4且不含张度剂(tonicity agent)和表面活性剂的乙酸盐缓冲G-CSF制剂和谷氨酸盐缓冲G-CSF制剂中G-CSF单体和G-CSF聚集体的含量。
本发明制剂中的G-CSF蛋白可以是任意的哺乳动物G-CSF，尤其是人G-CSF或是由它们衍生的变体或片段，只要其在造血中具有与哺乳动物G-CSF(尤其是人G-CSF蛋白)基本相同的生物学活性。本文使用的术语G-CSF包括源自天然来源的G-CSF和合成或重组G-CSF及其变体和片段，例如在原核生物中表达G-CSF基因时获得的具有N-末端蛋氨酸残基的重组人G-CSF蛋白、G-CSF融合蛋白以及通过对天然G-CSF取代、删除或***一个或多个氨基酸而获得的G-CSF蛋白。G-CSF可以为糖基化的或非糖基化的。非糖基化G-CSF可以通过例如在原核细胞(例如大肠杆菌)中的表达而获得，而糖基化G-CSF可以通过从天然来源中分离或通过在真核细胞(例如CHO细胞)中表达或通过人工糖基化而获得。人工修饰的G-CSF可以通过，例如酶促糖基化或通过化学聚乙二醇化而获得。用于本发明制剂的G-CSF变体公开于，例如EP-A-0 456 200中。优选在本发明的制剂中使用重组的非糖基化G-CSF；在更优选的实施方案中，G-CSF包含例如DE-A-37 23 781中所示的人G-CSF氨基酸序列或由其衍生的序列。
本发明制剂的缓冲体系基本由谷氨酸/谷氨酸盐体系构成，即本发明的制剂基本不含其它缓冲试剂。例如，可以以谷氨酸和/或其盐为起始原料，并利用合适的无机酸或碱(例如盐酸和碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物)将pH调整至期望值，由此制备本发明中使用的谷氨酸/谷氨酸盐体系。优选生理学上可接受的谷氨酸盐，例如碱金属盐、碱土金属盐或铵盐。优选碱金属盐或铵盐，尤其是单钠盐。优选地，以谷氨酸为起始材料，并利用合适的无机碱(例如氢氧化钠)调整pH值来制备所述缓冲液。
本发明制剂的pH值为3.5-4.8，优选为3.7-4.7。更优选地，pH为3.9-4.6，例如4.2-4.6，更具体为4.3-4.5。
可以方便地调整谷氨酸盐缓冲液的浓度，从而获得足够的缓冲容量和在期望的pH值获得pH-稳定效应。通常，所述谷氨酸盐缓冲液的浓度至少为0.5mM，优选为1-100mM，更优选为2-80mM。缓冲液浓度为2-40mM，尤其为2-25mM(例如5-15mM)可以提供充足的稳定性，并且该浓度也足够低，从而避免在注射位点发生不良反应。然而，40mM以上的缓冲液浓度(例如40-60mM)可以进一步提高在某些应力条件下的稳定性。
本发明制剂中G-CSF的浓度取决于预期应用。所述浓度上限由G-CSF在缓冲液的溶解度决定。在药物制剂中，G-CSF以药物有效量存在，且浓度通常不超过5mg/ml。通常，所述浓度为0.0001-5mg/ml，优选为0.0005-4mg/ml，更优选为0.001-2.5mg/ml，最优选为0.01-2.0mg/ml，例如0.1-1.5mg/ml。然而，在储备溶液(bulk solution，即浓度较高的起始溶液)中，所述浓度可以高达10mg/ml，甚至更高。
在本发明的优选实施方案中，所述制剂包含一种或多种表面活性剂，尤其是一种或多种非离子表面活性剂。所述非离子表面活性剂选自由乙氧化脂肪醇、烷基聚糖苷、聚氧化烯、聚山梨醇酯或上述两种或更多种的混合物组成的组。优选聚氧化烯，如聚氧化烯嵌段共聚物，例如Poloxamer 188(可按商品名PluronicF68获得)，以及聚山梨醇酯，即脂肪族脂肪酸的聚氧乙烯失水山梨醇酯。最优选聚山梨醇酯，例如聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(可按商品名Tween 20获得)、聚氧乙烯失水山梨醇单棕榈酸酯(可按商品名Tween 40获得)、聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯(可按商品名Tween 60获得)、聚氧乙烯失水山梨醇三硬脂酸酯(可按商品名Tween 65获得)、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯(可按商品名Tween 80获得)和聚氧乙烯失水山梨醇三油酸酯(可按商品名Tween 85获得)。最优选聚氧乙烯失水山梨醇单棕榈酸酯和聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯。优选制剂中表面活性剂的添加量低于5mg/ml，例如为1mg/ml或以下的量。优选表面活性剂(尤其是聚山梨醇酯)的使用量为0.001-0.4mg/ml，更优选为0.005-0.3mg/ml，最优选为0.01-0.2mg/ml。
有利地，本发明所述制剂与患者血液等渗，尤其是用于药物的目的(例如注射或输注)。尽管适当地调整所述谷氨酸盐缓冲液的浓度可以提供期望的渗透压，但优选还加入张度剂，尤其是糖醇。合适的糖醇为，例如甘露醇和山梨糖醇，尤其优选山梨糖醇。通常，张度剂的添加量达200mg/ml制剂。添加量优选达100mg/ml，更优选为5-80mg/ml，例如10-70mg/ml，最优选为20-60mg/ml。优选地，本发明的制剂基本不含糖和氨基糖。本文针对某些分子使用的术语“基本不含”表示如果存在所述分子，其含量不超过痕量，并优选小于0.01μg/ml制剂。
优选地，本发明的制剂基本不含除谷氨酸/谷氨酸盐之外的游离氨基酸或氨基酸盐。特别地，本发明的制剂基本不含精氨酸和/或其盐。
如果需要，本发明的制剂可以包含一种或多种还原剂，尤其是含硫的还原剂。合适的还原剂是，例如硫代甘油、谷胱甘肽、乙二硫醇、硫二甘醇、N-乙酰半胱氨酸、硫代山梨糖醇、硫代乙醇胺、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和二硫苏糖醇(dithiothreitol)。适合使用的还原剂浓度为0.1-100mM，优选为1-50mM。然而，还原剂的使用并不是必须的，因此，优选本发明的制剂不含还原剂。
如果需要，本发明的制剂可以包含一种或多种抗氧化剂。合适的抗氧化剂为，例如抗坏血酸或其盐，抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、三戊基没食子酸酯、α-生育酚、生育酚乙酸酯和丁羟基茴香醚。适合使用的抗氧化剂浓度为0.1-100mM，优选为1-50mM。然而，抗氧化剂的使用并不是必须的，因此，优选本发明的制剂不含抗氧化剂。
如果需要，本发明的制剂还包含一种或多种离液剂(chaotropic agent)。合适的离液剂可以为，例如尿素、盐酸胍或异氰酸胍。适合使用的离液剂浓度为0.1-50mM，优选为1-30mM。然而，本发明的制剂并不需要使用离液剂，因此，优选本发明的制剂不含离液剂。
虽然本发明的制剂可以包含络合剂，如羧酸，例如柠檬酸盐，但优选不加入此类物质，并且优选所述制剂基本不含除谷氨酸/谷氨酸盐以外的羧酸或羧酸盐。
如果需要，本发明的G-CSF制剂还可以包含其它蛋白和蛋白样分子，例如人血清蛋白。然而，由于外源蛋白涉及的风险，所述制剂基本不含作为稳定剂的蛋白。
在本发明的优选实施方案中，本发明的水性制剂由谷氨酸盐缓冲水溶液构成，优选为谷氨酸钠缓冲液，缓冲液中包含作为单独组分的G-CSF活性成分、表面活性剂(优选聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯(Tween 80))和张度剂(优选为糖醇，例如山梨糖醇)。
本发明的G-CSF制剂具有保存期长或贮存稳定性高的特性，即在长期贮存后，仅有少量由蛋白吸附、降解或凝聚而引起的G-CSF蛋白损失。优选地，根据例如下文阐述的RP-HPLC测定，在5℃长期贮存24个月后，本发明所述制剂中G-CSF蛋白的含量(下文中也称为“G-CSF含量”)至少为制剂中起始G-CSF含量的95％。根据例如RP-HPLC测定，在25℃长期贮存6个月后，本发明所述制剂中G-CSF蛋白的含量至少为制剂中起始G-CSF含量的90％。
可以按照已知的方式制备本发明的制剂。通常，将所述缓冲物质(例如谷氨酸或其盐)和任选的其它添加剂(例如表面活性剂和张度剂)溶解在合适量的水性溶剂(通常为水)中。如果需要，可以利用以上提及的合适的酸或碱调节pH值。在灭菌步骤(例如过滤通过无菌滤器)之后，以所需的浓度加入G-CSF。然而，也可以首先提供含G-CSF的水溶液，然后利用谷氨酸缓冲体系将pH调节至预期值。
本发明的制剂作为药物制剂特别有用，其中所有的任选成分都必须是生理学上可接受的。可以以各种应用形式使用这些药物制剂，但优选是用于注射或输注的制剂，尤其是用于静脉内、肌肉内或皮下给药的制剂。然而，本发明的制剂还可以用于制备诸如水凝胶或脂质体等形式。本发明的药物制剂可以用于任何可以使用G-CSF的适应症，例如用于治疗嗜中性白细胞减少症、骨髓移植、传染病和肿瘤疾病。
可以通过任何已知方式(例如通过冻干或喷雾干燥方式)，利用本发明的水性制剂获得含G-CSF的冻干剂和粉末。将所述冻干剂和粉末复溶后，所得的G-CSF制剂即使在较高温度下也能长期保持稳定。
为了容易地制备本发明的水性制剂，可以以药剂盒的形式提供所述制剂中的组分。所述药剂盒包含被物理隔离的：a)含G-CSF的冻干剂或粉末；和b)用于复溶含G-CSF的冻干剂或粉末的、pH值为3.5-4.8的谷氨酸盐缓冲水溶液。根据本发明制剂的需要，所述冻干剂/粉末部分和/或水溶液中可以包含可选组分，例如表面活性剂和张度剂。这样，可以在任何期望的时间，由例如医务人员制备本发明的制剂。
下文将参考以下实施例和附图对本发明作更详细的说明，但本发明并不限于此。
实施例
材料和方法
1.缓冲G-CSF制剂的制备
室温下分别利用各缓冲溶液将浓度高达2mg/ml的G-CSF水溶液稀释成G-CSF含量分别为0.6mg/ml或0.96mg/ml。首先分别以所需的摩尔浓度加入各种酸(谷氨酸、乙酸、琥珀酸)或碱性盐(柠檬酸钠，Tris)组分，然后利用氢氧化钠溶液或盐酸溶液将其调整至期望的pH值，由此制备各缓冲溶液。如果需要，缓冲溶液还包含所需量的表面活性剂和张度剂。通过无菌滤器(孔径为0.2μm，
Figure G2008800109149D00081
)过滤所配制的溶液，并将样品等分试样装入4ml 2R玻璃小瓶或由I型水解玻璃(hydrolytic class I)制成的1ml注射器中，并用橡胶塞密封。
2.机械应力的条件
2.1振荡应力
通过在空气-水界面产生运动和更替的振荡平板上的水平运动产生振荡应力。将各含1ml G-CSF制剂的2R小瓶水平放置在振荡平台上，并在受控室温下以180apm或230apm(振幅/分钟)摇动。16h和24h后，每个时间点取出3个小瓶并分析蛋白聚集体(二聚体和更高级的多聚G-CSF分子)。将三个未经应力的曝光小瓶，和贮存于2-8℃下的小瓶作为对照进行分析。另外，不含G-CSF的各种溶液的小瓶也包含在所有应力试验之中，以排除基体影响(matrix effects)。
2.2涡旋应力
利用含1ml G-CSF制剂的2R小瓶进行涡旋。每个样品涡旋120秒。
2.3冷冻/融解循环
将样品反复冻融以进行冷冻/融解循环。对经历5个和10个循环的含1mlG-CSF制剂的2R小瓶进行评价。
在测试前，将所有样品静置30分钟以形成聚集。
3.聚集分析
3.1通过散射光(浊度)测量进行分析
为了通过浊度测量进行聚集分析，按照已知的方式，在HACH Nephelometer2100AN上的玻璃试管中通过散射光测量来检测未经稀释的G-CSF制剂，并以标准G-CSF溶液为参考。在90°的角度测量被所述液体漫散射偏转的散射光，并与标准悬浮液比较。数值以散射法浊度单位(NTU)表示。
3.2非还原SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)
在非还原形式的4-12％BIS-TRIS凝胶中通过SDS-PAGE进行聚集分析。根据标准方法，例如欧洲药典第五版(European Pharmacopoeia 5.0)中阐述的方法进行电泳。根据常规方法通过银染完成可视化。计算分子量高于G-CSF单体的条带。
3.3体积排阻色谱(SEC)
根据标准方法(PHARMEUROPA，Vol.19，No.1(2007)page 89，right column，“Impurities with molecular masses higher than that of filgrastim”)利用30℃的亲水硅胶作为固定相进行SEC聚集分析。利用磷酸盐缓冲的碳酸氢铵溶液作为流动相，以0.5ml/分钟的流速进行洗脱。在215nm进行分光光度检测。对色谱图进行定量，区分G-CSF单体和更高级的聚集体。结果用峰面积百分比(峰面积％)表示。
3.4反相(RP)HPLC
根据标准方法(参见，PHARMEUROPA，Vol.19，No.1(2007)page 91，“Related proteins.”)，利用RP-HPLC分析经长期贮存的样品中G-CSF的含量。简而言之，在65℃温度下，利用孔径为20nm的色谱用十八烷基甲硅烷基硅胶作为固定相，并且使用长0.15m、直径4.6mm的色谱柱进行色谱。流动相为由500ml水、499ml乙腈和1ml三氟乙酸组成的混合物。流速为1.0ml/分钟，在215nm进行分光光度检测。以G-CSF标准参照物确定蛋白含量。
实施例1
缓冲体系对温度稳定性的影响
为了研究本发明G-CSF制剂的温度稳定性和保存期，制备以下制剂并与诸如乙酸盐、琥珀酸盐和Tris的常规缓冲液进行比较。在这些试验中使用的制剂如下表1所示。
表1：利用不同缓冲体系的G-CSF制剂
Figure G2008800109149D00101
所述制剂(每种1ml)在2-8℃、25℃、37℃和＜-15℃的温度下贮存7天，利用上述非还原SDS-PAGE，通过计数与T0(时间为0)时的标准G-CSF制剂相比，分子量大于G-CSF单体的条带数量来确定稳定性。所述凝胶中所见的除G-CSF单体以外的条带数量示于表2中。
表2：不同缓冲体系中G-CSF的温度稳定性
Figure G2008800109149D00102
nd：由于溶液在目测检查时不澄清(这表明有不可溶的聚集体)而没有进行测定。
-：除了G-CSF单体外，没有条带
在目测检查(数据未显示)时，在所有贮存条件下，含乙酸盐或谷氨酸盐和0.1％或1.0％Poloxamer 188的所有小瓶都为澄清溶液。这与除G-CSF单体以外的没有检测到其它条带的非还原SDS-PAGE非常符合。含0.1％Poloxamer 188的琥珀酸盐制剂在目测检查时是澄清的，或仅可见小颗粒。然而，在非还原SDS-PAGE时还检测到其它条带，这表明在所有贮存条件下(甚至在T0时)都存在可溶的聚集体。这个效果在从＜-15℃融解后尤为明显。利用较高浓度的表面活性剂(即10mg/mL Poloxamer 188)可能获得稳定性。在目测检查时，所有含Tris的制剂都显示纤维样颗粒或为浑浊的溶液，因此没有进行SDS-PAGE。
所述结果显示，谷氨酸盐缓冲制剂可以使G-CSF在不同温度下以及冻融后具有良好的稳定性。即使在表面活性剂浓度低时，其稳定性也与乙酸盐缓冲制剂相当。与此相反，琥珀酸盐缓冲制剂显示其迅速形成可溶且可见的聚集体，并仅在表面活性剂浓度较高时才可以保持稳定。Tris缓冲制剂在检测的所有Poloxamer浓度下都显示可溶和可见的聚集体。
实施例2
G-CSF制剂在机械应力条件下的稳定性
为了研究本发明的G-CSF制剂在机械应力条件下的稳定性，制备了使用缓冲液浓度为5mM、10mM和50mM的G-CSF制剂，其pH值为4.0、4.4和5.0。在乙酸盐和柠檬酸盐缓冲液浓度均为10mM时，与乙酸盐和柠檬酸盐缓冲液进行比较。在这些试验中使用的制剂如下表3所示。
表3：在应力条件下进行试验的G-CSF制剂
  制剂   G-CSF(mg/ml)   谷氨酸盐(mM)   乙酸盐(mM)   柠檬酸盐(mM)   pH   山梨糖醇(mg/ml)   Tween 80(mg/ml)
  9   0.96   5   4.0   50   0.04
  10   0.96   5   4.4   50   0.04
  11   0.96   5   5.0   50   0.04
  12   0.96   10   4.0   50   0.04
  13   0.96   10   4.4   50   0.04
  14   0.96   10   5.0   50   0.04
  15   0.96   50   4.0   50   0.04
  16   0.96   50   4.4   50   0.04
  17   0.96   50   5.0   50   0.04
  18   0.96   10   4.0   50   0.04
  19   0.96   10   4.4   50   0.04
  20   0.96   10   5.0   50   0.04
  21   0.96   10   4.0   50   0.04
  22   0.96   10   4.4   50   0.04
  23   0.96   10   5.0   50   0.04
所述制剂未经处理(T0)或分别在180apm和230apm下振荡16h和24h并涡旋120秒。根据在“材料和方法”中阐述的方法进行散射光测量和SEC，以检测聚集体的形成。结果示于表4和图1中。
Figure G2008800109149D00131
Figure G2008800109149D00141
由表4和图1所示的结果可见，在所有缓冲液浓度下，谷氨酸盐缓冲的G-CSF制剂在应力条件下的稳定性在pH 4.0和pH4.4时最好，在pH 5.0时快速下降。还可以通过提高缓冲液浓度来提高稳定性。
振荡
缓冲液浓度为10mM、pH值为4.0的谷氨酸盐缓冲制剂和乙酸盐缓冲制剂在180apm振荡16h后，G-CSF单体水平仅显示较小的降低(分别为99.1％和99.4％)，然而pH为4.0的柠檬酸盐缓冲制剂中的G-CSF单体水平急剧下降(29.8％)。pH值为4.4的谷氨酸盐缓冲制剂在振荡16h后，G-CSF单体的水平降低至90％。然而，与乙酸盐缓冲制剂(73.3％)和柠檬酸盐缓冲(72.4％)制剂相比，乙酸盐和柠檬酸盐缓冲制剂减少得更明显。对于谷氨酸盐缓冲制剂和乙酸盐缓冲制剂，将样品在230apm振荡24h时，也可以观察到这种现象。与柠檬酸盐缓冲制剂相比较，谷氨酸缓冲制剂略差。在pH值为5.0时，柠檬酸盐缓冲制剂具有最高的G-CSF单体含量。
涡旋
对于pH和缓冲液浓度，涡旋时G-CSF制剂的稳定性显示出与上述振荡试验观察到的相似方式。对于检测的所有pH值，在10mM缓冲液浓度的情况，谷氨酸盐缓冲制剂的稳定性高于或至少等于乙酸盐缓冲制剂和柠檬酸盐缓冲制剂。
实施例3
在机械应力条件下没有表面活性剂存在的谷氨酸盐缓冲G-CSF制剂的稳定性
为了测定不含其它成分(例如表面活性剂和张度剂)的谷氨酸盐缓冲G-CSF制剂的应力抗性，制备以下水性制剂(表5)。
表5：不含表面活性剂的G-CSF制剂
  制剂   G-CSF(mg/ml)   谷氨酸盐(mM)   乙酸盐(mM)   pH
  24   0.96   10   4.4
  25   0.96   10   4.4
在实施例2所述的振荡和涡旋条件下，测定制剂的稳定性，不同之处在于仅在180apm下持续16h。所得结果如表6所示。图2显示了这些制剂的SEC纯度。
表6：不存在表面活性剂时G-CSF制剂的物理稳定性
Figure G2008800109149D00161
从表6的结果可以看出，与乙酸盐缓冲制剂相比，谷氨酸盐缓冲制剂对振荡和涡旋的抗性更高。这确认了上述结果，并表明该有利作用是缓冲液导致的，并且与表面活性剂无关。
实施例4
反复冻融后G-CSF制剂的稳定性
根据“材料和方法”中的阐述，对表4中显示的制剂13和19进行反复冷冻/融解循环。将不含G-CSF的10mM水性谷氨酸缓冲液作为对照。通过上述SEC，对样品进行分析。结果示于下表7中。
表7：G-CSF制剂的冷冻/融解稳定性
Figure G2008800109149D00162
可以看出，pH为4.4的谷氨酸盐缓冲制剂在反复冻融后保持稳定，证明没有G-CSF单体损失。结果与乙酸盐缓冲制剂相当。
实施例5
G-CSF制剂的长期稳定性
通过表8中列出的制剂测试不同pH值的谷氨酸缓冲G-CSF制剂的长期稳定性。
表8：长期贮存的G-CSF制剂
Figure G2008800109149D00171
将上述制剂的0.5ml样品贮存于1ml注射器中，在没有振荡的条件下放置24个月(5℃)或6个月(25℃)，然后在不同时间点取样并通过上述SEC方法检测G-CSF单体和聚集体。G-CSF单体的结果以峰面积％表示于表9中。
同时，取样以通过在3.4部分“材料和方法”中阐述的RP-HPLC测量G-CSF蛋白含量(μg/ml)。将起始时间点(T0)的G-CSF含量设为100％，根据起始时间点的蛋白含量计算各个测量时间的G-CSF含量。结果示于下表10中。
表9：在5℃和25℃长期贮存后，谷氨酸盐缓冲G-CSF制剂中G-CSF的稳定性
Figure G2008800109149D00172
表9的结果显示，在所检测的任何pH值下，G-CSF单体随时间的损失都非常少，并且谷氨酸盐缓冲G-CSF制剂在5℃足以稳定至少24个月，在25℃足以稳定至少6个月。
表10在5℃和25℃长期贮存后，谷氨酸盐缓冲G-CSF制剂中G-CSF的稳定性
Figure G2008800109149D00182
表10中的结果显示，在所检测的任何pH值，长期贮存后仅有少量的G-CSF蛋白损失。在所有受测样品中，在5℃的温度下贮存24个月后G-CSF的含量为起始G-CSF含量的至少95％，在25℃温度下贮存6个月G-CSF的含量为起始G-CSF含量的至少90％。

Claims (21)

1.谷氨酸盐缓冲G-CSF水性制剂，其是pH为3.5-4.8的稳定液体。
2.根据权利要求1所述的制剂，其中，所述制剂的pH为3.7-4.7，优选为3.9-4.6，更优选为4.2-4.6。
3.根据权利要求1或2所述的制剂，其中，所述谷氨酸盐为谷氨酸和/或其盐的形式，其存在浓度至少为0.5mM，优选为2-100mM。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的制剂，其中，G-CSF的存在浓度为0.0001-5mg/ml，优选为0.0005-4mg/ml，更优选为0.01-2.0mg/ml，最优选为0.1-1.5mg/ml。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的制剂，其还包含非离子表面活性剂。
6.根据权利要求5所述的制剂，其中，所述非离子表面活性剂选自由乙氧化脂肪醇、烷基聚糖苷、聚氧化烯、聚山梨醇酯或上述两种或更多种的混合物组成的组。
7.根据权利要求5或6所述的制剂，其中，所述表面活性剂为聚山梨醇酯或聚山梨醇酯的混合物，优选选自以下组成的组：聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇三油酸酯和聚氧乙烯失水山梨醇三硬脂酸酯。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的制剂，其还包含张度剂。
9.根据权利要求8所述的制剂，其中，所述张度剂为山梨糖醇。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的制剂，其中，所述制剂基本不含精氨酸或其盐。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的制剂，其中所述制剂基本不含除谷氨酸/谷氨酸盐之外的氨基酸或氨基酸盐。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的制剂，其中，所述制剂基本不含糖和氨基糖。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的制剂，其中，在5℃长期贮存24个月后，通过RP-HPLC测定的所述制剂中G-CSF含量为起始G-CSF含量的至少95％。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的制剂，其中，在25℃长期贮存6个月后，通过RP-HPLC测定的所述制剂中G-CSF含量为起始G-CSF含量的至少90％。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的制剂，其是药物可接受的制剂。
16.根据权利要求15所述的制剂，其中，所述药物制剂为用于注射或输注的溶液。
17.包含G-CSF的冻干剂或粉末，其可分别通过冻干或喷雾干燥从权利要求1-16中任一项所述的水性制剂获得。
18.用于制备权利要求15或16所述的水性制剂的药剂盒，其包含被物理隔离的：
(a)含G-CSF的冻干剂或粉末；和
(b)pH为3.5-4.8的谷氨酸缓冲水溶液，其用于复溶含G-CSF的冻干剂或粉末。
19.权利要求1-16中任一项所述的制剂的制备方法，其包括将G-CSF和pH值为3.5-4.8的谷氨酸盐缓冲水溶液混合。
20.权利要求17所述的冻干剂或粉末的制备方法，其包括冻干或喷雾干燥权利要求1-16中任一项所述的制剂。
21.水凝胶制剂或脂质体制剂，其包含权利要求1-16中任一项所述的制剂。
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