CN101654677A - 一种高效表达核酸酶p1的基因及其应用 - Google Patents

一种高效表达核酸酶p1的基因及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN101654677A
CN101654677A CN200910183311A CN200910183311A CN101654677A CN 101654677 A CN101654677 A CN 101654677A CN 200910183311 A CN200910183311 A CN 200910183311A CN 200910183311 A CN200910183311 A CN 200910183311A CN 101654677 A CN101654677 A CN 101654677A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
nuclease
ala
pichia pastoris
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN200910183311A
Other languages
English (en)
Inventor
应汉杰
贺沁婷
许琳
熊健
柏建新
栗西木
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Tech University
Original Assignee
Nanjing Tech University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Tech University filed Critical Nanjing Tech University
Priority to CN200910183311A priority Critical patent/CN101654677A/zh
Publication of CN101654677A publication Critical patent/CN101654677A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高效表达核酸酶P1的基因，及包含其的表达载体和宿主细胞和该基因的应用，本发明还公开了一种表达桔青霉产核酸酶P1基因的重组毕赤酵母菌CGMCC No.3188及其构建方法。本发明的重组工程菌株毕赤酵母CGMCC No.3188能够高效表达桔青霉nucP基因，分泌表达核酸酶P1具有较高的磷酸二酯酶活性，用于水解RNA，产物得率高，产生的杂质较少，有利于减少下游分离的工序和降低生产成本。利用本发明的重组工程菌株毕赤酵母CGMCC No.3188进行高密度发酵，酶活是野生菌株的1.5倍。将获得的重组酶应用于酶解RNA溶液，水解率达到40％以上，且得到的水解产物副产物大大减少。

Description

一种高效表达核酸酶P1的基因及其应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，特别涉及一种表达核酸酶P1的基因及其应用。
背景技术
5′-核苷酸在细胞结构、代谢、能量和调节功能等方面起着重要作用[汪余勤，程五凤，李宣海.核苷酸与营养.国外医学卫生学分册，1999，26(5)：257-260]，是生物体内不可或缺的活性物质。在食品行业中，已经由最初的食品助鲜剂，扩展为具有提高生物体免疫功能的功能性食品添加剂，可以添加在面包、饼干等食品中，尤其在婴幼儿食品中的使用效果非常明显，能够有效增强婴幼儿抵抗细菌性痢疾的能力，减少腹泻的发生；在医药领域，5’-核苷酸不但能够作为药物使用，而且还是许多抗病毒抗肿瘤药物的生产原料；此外，核苷酸制剂还可以作为动植物生长调节剂，有着明显的增产、增重功效[王定昌核苷酸的生产技术及应用前景粮油食品科技，2008，16(3)：65-66]。5’-核苷酸的主要生方法是采用磷酸二酯酶水解RNA获得，而桔青霉来源的核酸酶P1是目前产生核苷酸应用最广泛的磷酸二酯酶。
核酸酶P1(E.C.3.1.30.1)是由桔青霉(Penicillium citrinum)产生的磷酸二酯酶，能水解RNA产生四种单核苷酸(5’AMP，5’CMP，5’GMP，5’UMP)。桔青霉(Penicilliumcitrinum)属于不对称青霉组，绒状青霉亚组，桔青霉系，存在于土壤，以及腐烂的水果、蔬菜、肉食和储藏的粮食上等。由发酵法制备的桔青霉来源的核酸酶P1，发酵成本高，且产生的杂酶较多，影响水解效率，造成后期四个单核苷酸分离困难，增了加生产成本。
解决上述问题的有效手段是将桔青霉中产核酸酶P1的基因nucP整合进入毕赤酵母中，构建工程菌株。毕赤酵母在有氧条件下能高密度生长，有利于大规模生产获得高浓度细胞，从而进行高效表达；毕赤酵母自身分泌到培养基中蛋白很少，使得分泌性的外源蛋白容易从培养基的基质中分离；通过质粒整合到毕赤酵母基因组的外源基因结构稳定，不易丢失；外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，能够筛选到高表达菌株[李志龙张富春巴斯德毕赤酵母表达***研究进展，生物技术通报2006(6)；9-13]。由于上述优点，采用毕赤酵母体系表达目标酶，能够减少杂酶产生，获得更高酶活性，提高酶解效率，降低后期分离单核苷酸成本。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高效表达核酸酶P1的基因。
本发明还要解决的一个技术问题是提供包含上述基因的表达载体。
本发明还要解决的一个技术问题是提供包含上述表达载体的宿主细胞。
本发明还要解决的另一个技术问题是提供上述宿主细胞的构建方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述高效表达核酸酶P1的基因在生产核酸酶P1中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种高效表达核酸酶P1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该核酸酶P1nucP基因长度为810bp，编码了270个氨基酸残基。
一种表达载体，含有权利要求1所述的基因。
上述表达载体优选含有如SEQ ID NO：1所示基因的毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K-nucP。
一种宿主细胞，含有上述表达载体。
上述宿主细胞优选含有pPIC9K-nucP表达载体的巴氏毕赤酵母。
上述宿主细胞更有选表达核酸酶P1的毕赤酵母工程菌株，其分类命名为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)，保藏编号CGMCC No.3188。该菌株已于2009年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。
构建宿主细胞CGMCC No.3188的方法，采用RT-PCR方法从桔青霉(Penicilliumcitrinum)菌株中提取nucP基因，构建重组表达质粒载体pPCI9K-nucP，利用电转化方法将重组质粒整合到巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株上，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行诱导表达，筛选得到一株产酶量最高的菌株CGMCC No.3188。
上述高效表达核酸酶P1的基因在生产核酸酶P1中的应用。
上述应用具体表现为利用重组工程菌CGMCC No.3188生产核酸酶P1。方法如下：在发酵罐中采用高密度发酵技术扩大培养生产重组工程菌CGMCC No.3188，培养基为每升含磷酸15～20mL，磷酸钙0.1～0.5g，硫酸钾10～20g，硫酸镁12～20g，氢氧化钾2.0～4.0g，甘油20～40g，发酵温度28～30℃，pH6.0，溶氧控制在5LPM，发酵分为两个阶段，第一阶段为菌体生长阶段，按10％(v/v)接种在上述培养基中生长，第一阶段培养时间15～18小时，当甘油耗尽后，溶氧迅速上升，此时转入增殖阶段，流加诱导剂甲醇，诱导剂的加入体积为培养基体积的3％，流加时间为6～10h，使得溶氧维持在5LPM以上，增殖阶段总培养时间为45～50h，滤去酵母细胞得到含核酸酶P1的上清液。
有益效果：本发明首次发现了桔青霉(Penicillium citrinum)中高效表达核酸酶P1的基因nucP，并实现了核酸酶P1基因在真核表达***毕赤酵母中的高效表达。重组工程菌株毕赤酵母CGMCC No.3188能够高效表达桔青霉nucP基因，分泌表达核酸酶P1具有较高的磷酸二酯酶活性，用于水解RNA，产物得率高，产生的杂质较少，有利于减少下游分离的工序和降低生产成本。利用本发明的重组工程菌株毕赤酵母CGMCCNo.3188进行高密度发酵，最终菌体OD600为210，核酸酶P1酶活达到629U/mL，与出发菌株410U/mL相比，酶活是野生菌株的1.5倍。将获得的重组酶应用于酶解RNA溶液，水解率达到40％以上，且得到的水解产物副产物大大减少。
具体实施方式：
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、反应条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：重组酵母菌的构建。
1、桔青霉(Penicillium citrinum)核酸酶P1基因nucP的克隆。
(1)桔青霉总RNA的提取。
取50ml桔青霉菌液，4℃、8000℃r·min-1离心15min收集菌体，将研钵用液氮预冷，边加液氮边研磨成粉末状，加3～5倍Trizol试剂；室温放15min，加1/5V氯仿，votex混匀10s，室温10min，4℃，离心1200rpm，15min；去上清液分装500～600μL，加等体积异丙醇，上下混匀5次，静置10min，12000g，离心4℃，15min；倒上清液，吸水纸吸干，加1mL 75％乙醇冲洗沉淀，静置1min，4℃，12000g离心10min；弃上清，倒置于泡沫板，超净台吹干，加DEPC水10μL，votex后稍离心，55℃水浴10min，得到桔青霉总RNA，1％的琼脂糖进行电泳检测，分光光度计测定RNA的浓度。
(2)cDNA反转录。
实验采用了MLVRT逆转录酶，在去RNase的0.5mL离心管中加入约5μL的RNA样品，2μL Oligo dT和0.5μL Ribonuclease inhibitor混匀后70℃温育5min，取出冰浴5min。随后加入反应溶液，42℃保温90min后，即可使总RNA中mRNA反转录生成cDNA。反应液如下：5×缓冲液5μL，dNTP 5μL，RNase抑制剂(40U·μL-1)0.5μL，MLV RTase(10U·μL-1)6μL，去RNase水至25μL。
(3)核酸酶P1基因的扩增。
上游引物5’-TGGGGCAACCTGGGGCATG-3’，下游引物5’-CTTAGCAATTTCAGAACCGTGAATTTCGTT-3’。取1μL反转录产物为模板，采用Taq DNA聚合酶进行基因的PCR扩增。反应溶液如下：无菌水40.5μL，10×缓冲液5μL，dNTP 1μL，正、反向引物(50μmol·L-1)各1μL，模板1μL，DNA聚合酶0.5μL。PCR条件为变性94℃1min；94℃1min；54℃1min；72℃1.5min；共30个循环；最后72℃延伸10min。取3μL扩增产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
(4)核酸酶P1基因的克隆。
采用TaKaRa Agarose Gel DNA purification Kit回收PCR扩增产物，在T4DNA连接酶的作用下与PgemR-T Vector进行连接反应。向100μLDH5a感受态细胞中加入5μL连接液于无菌的离心管中混匀，冰上放置20min。开始转化实验，42℃水浴50s后冰浴2min，每管加入1mL LB培养基37℃摇床培养1-1.5h。最后5000r·min-1室温离心5min，去上清，加入200μL LB培养基振荡悬浮细胞。吸取100μL转化液至含Amp的LB固体培养基上，用涂布棒将转化液均匀涂布到琼脂平板表面。将平板至于室温直至转化液完全被吸收，倒置平板37℃培养12-16h出现单菌落。
(5)质粒DNA的提取：减法提取质粒DNA。
(6)重组T载体质粒的测序：重组T载体质粒送南京金思特有限公司在ABI3730型测序仪上完成测序。核酸酶P1nucP基因长度为810bp，编码了270个氨基酸残基。
2、基因nucP表达载体的构建。
根据获得的nucP基因的核苷酸序列设计表达引物，在引物的5’端和3’端分别引物SnaBI和NotI酶切位点，PCR扩增，采用SnaBI和NotI双酶切PCR产物和质粒pPIC9K，将两个酶切产物用T4连接酶连接，获得重组质粒pPIC9K-nucP，并采用化学转化的方法进入大肠杆菌DH5α，经菌落PCR法筛选得到含核酸酶P1基因的重组表达质粒，并进行PCR和酶切鉴定，测序确认重组质粒的读码框正确。
3、表达桔青霉核酸酶P1nucP基因的毕赤酵母工程菌株的构建及筛选。
(1)重组表达质粒的线性化：将重组表达质粒pPIC9K-nucP用限制性内切酶Sal I线性化。
(2)转化：电击转化酵母Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞，转化方法参见Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。
(3)筛选：用灭菌牙签挑取转化子对应点种在MM和MD平板上，30℃培养2-3d，挑取在MD/MM平板上均生长良好的转化子为阳性转化子。挑取阳性转化子分别点种于250μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL及600μg/mL G418的平板上筛选多拷贝转化子。
实施例2：重组毕赤酵母菌株在摇瓶中的诱导表达。
挑选一单菌落，置于装有25mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，于30℃，250-300r·min-1培养至OD600到2-6。室温下1500-3000g离心5min，收集菌体，用BMMY重悬菌体，使OD600达1.0左右(约100-200mL)。将所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30℃，250-300r·min-1的摇床上继续生长。每24h向培养基中添加100％甲醇1～5％(v/v)。经检测，酶活达到625U/mL，比出发野生菌株酶活高52.43％。
实施例3：重组毕赤酵母菌株在5L发酵罐中的高密度发酵。
发酵培养基为培养基为每升含磷酸16mL，磷酸钙0.3g，硫酸钾12g，硫酸镁15g，氢氧化钾3.0g，甘油27g，发酵温度28℃，pH6.0，溶氧控制在5LPM。发酵分为两个阶段，第一阶段为菌体生长阶段，按10％(v/v)接种在上述培养基中生长，第一阶段培养时间16小时，当甘油耗尽后，溶氧迅速上升，此时转入增殖阶段，流加诱导剂甲醇，诱导剂的加入体积为培养基体积的3％，流加时间为16h，使得溶氧维持在5LPM以上，增殖阶段总培养时间为48h，滤去酵母细胞得到上清液。最终菌体OD600为210，核酸酶P1酶活达到621U/mL。
酶活检测方法：将1.9ml的底物溶液(含有浓度为1％左右的RNA；0.2M pH5.2的醋酸缓冲液以0.0005M的ZnSO4)于70℃恒温水浴10min后，加入0.1ml经适当稀释的酶液，70℃保温15min后加入2.0ml核酸沉淀剂(0.25％钼酸铵-2.5过氯酸)，冰水浴20min后离心、取上清夜用蒸馏水稀释一定倍数，测定其260nm处的吸光值为A260。以先加沉淀剂者作为对照，其它操作同前。在上述条件下，每分钟所生成的核苷酸量在260nm处的吸光值的差值为1.0时定义为1个酶活力单位。其计算公式如下：
Figure G2009101833115D00051
其中α为原酶液的稀释倍数，β为离心上清夜的稀释倍数。
实施例4：重组毕赤酵母菌株产核酸酶P1酶解RNA。
酶解条件：配制5％含量的RNA溶液100ml，磷酸缓冲液控制pH7.0，65℃反应，加入获得的重组核酸酶P11～2ml，水解3～5小时，取样进行HPLC分析。最终酶解效果为24.323g/L，酶解达46.67％。
检测方法：采用HPLC
淮阴汉邦科技有限公司制LichrospherC18柱(5mm，250mm×4.6mm)；流动相为A：20mmol·L-1的(NH4)2HPO4溶液(用超纯水配制)；B：甲醇，梯度洗脱。流速：1mL·min-1；检测波长：254nm；进样量：20μL。
精密称取四种核苷酸的标品，用缓冲液配制成质量浓度约为50mg·L-1的标准品溶液；将经预处理的样品用缓冲液稀释至约50mg·L-1，并用O.45μm微孔膜进行过滤后，作为供试品溶液。
SEQUENCE LISTING
<110>南京工业大学
<120>一种高效表达核酸酶P1的基因及其应用
<130>njut090915
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>810
<212>DNA
<213>桔青霉(Penicillium citrinum)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(810)
<400>1
tgg ggc aac ctg ggg cat gca aca gtt gct tat gtt gct caa cat tat    48
Trp Gly Asn Leu Gly His Ala Thr Val Ala Tyr Val Ala Gln His Tyr
1               5                   10                  15
gta tcg ccc gaa gca gct tca tgg gcg caa ggg atc ctt ggg agc tca    96
Val Ser Pro Glu Ala Ala Ser Trp Ala Gln Gly Ile Leu Gly Ser Ser
            20                  25                  30
tcc agc tcg tat ctg gcc agt att gcc tca tgg gca gac gaa tat cgc   144
Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Ser Ile Ala Ser Trp Ala Asp Glu Tyr Arg
        35                  40                  45
ttg aca agc gcc ggg aaa tgg tca gct tca ttg cat ttc atc gat gca    192
Leu Thr Ser Ala Gly Lys Trp Ser Ala Ser Leu His Phe Ile Asp Ala
    50                  55                  60
gaa gat aat ccc ccc acg aac tgc aac gtg gat tat gag cga gac tgc    240
Glu Asp Asn Pro Pro Thr Asn Cys Asn Val Asp Tyr Glu Arg Asp Cys
65                  70                  75                  80
ggg agc tca ggc tgc tca atc tca gca att gca aat tac acc cag cgt    288
Gly Ser Ser Gly Cys Ser Ile Ser Ala Ile Ala Asn Tyr Thr Gln Arg
                85                  90                  95
gtg agt gat agc agt ctt tca tca gag aac cat gca gaa gct ctg agg    336
Val Ser Asp Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asn His Ala Glu Ala Leu Arg
            100                 105                 110
ttc ctt gtt cac ttc att gga gac atg acc cag ccg cta cac gac gag    384
Phe Leu Val His Phe Ile Gly Asp Met Thr Gln Pro Leu His Asp Glu
        115                 120                 125
gcc tac gca gtc ggg ggt aat aaa atc aat gtc acc ttc gac gga tac    432
Ala Tyr Ala Val Gly Gly Asn Lys Ile Asn Val Thr Phe Asp Gly Tyr
    130                 135                 140
cac gac aac ctc cat tca gat tgg gat act tat atg ccc cag aaa ctg    480
His Asp Asn Leu His Ser Asp Trp Asp Thr Tyr Met Pro Gln Lys Leu
145                 150                 155                 160
atc ggt ggc cat gca ctc tca gat gca gag tca tgg gca aag acc ttg    528
Ile Gly Gly His Ala Leu Ser Asp Ala Glu Ser Trp Ala Lys Thr Leu
                165                 170                 175
gtc caa aat atc gaa tcg ggg aat tat acg gct caa gct atc gga tgg    576
Val Gln Asn Ile Glu Ser Gly Asn Tyr Thr Ala Gln Ala Ile Gly Trp
            180                 185                 190
atc aag ggt gat aat atc agc gag cca att act acc gca act cga tgg    624
Ile Lys Gly Asp Asn Ile Ser Glu Pro Ile Thr Thr Ala Thr Arg Trp
        195                 200                 205
gct tca gat gcg aat gct tta gtc tgc act gtt gtt atg cct cat gga    672
Ala Ser Asp Ala Asn Ala Leu Val Cys Thr Val Val Met Pro His Gly
    210                 215                 220
gct gcc gct tta cag acc ggt gat ctt tat ccc acc tat tat gat tca    720
Ala Ala Ala Leu Gln Thr Gly Asp Leu Tyr Pro Thr Tyr Tyr Asp Ser
225                 230                 235                 240
gtc atc gac acc atc gaa ttg cag att gct aag ggc ggc tat cga ttg    768
Val Ile Asp Thr Ile Glu Leu Gln Ile Ala Lys Gly Gly Tyr Arg Leu
                245                 250                 255
gca aat tgg gtc aac gaa att cac ggt tct gaa att gct aag            810
Ala Asn Trp Val Asn Glu Ile His Gly Ser Glu Ile Ala Lys
            260                 265                 270
<210>2
<211>270
<212>PRT
<213>桔青霉(Penicillium citrinum)
<400>2
Trp Gly Asn Leu Gly His Ala Thr Val Ala Tyr Val Ala Gln His Tyr
1               5                   10                  15
Val Ser Pro Glu Ala Ala Ser Trp Ala Gln Gly Ile Leu Gly Ser Ser
            20                  25                  30
Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Ser Ile Ala Ser Trp Ala Asp Glu Tyr Arg
        35                  40                  45
Leu Thr Ser Ala Gly Lys Trp Ser Ala Ser Leu His Phe Ile Asp Ala
    50                  55                  60
Glu Asp Asn Pro Pro Thr Asn Cys Asn Val Asp Tyr Glu Arg Asp Cys
65                  70                  75                  80
Gly Ser Ser Gly Cys Ser Ile Ser Ala Ile Ala Asn Tyr Thr Gln Arg
                85                  90                  95
Val Ser Asp Ser Ser Leu Ser Ser Glu Asn His Ala Glu Ala Leu Arg
            100                 105                 110
Phe Leu Val His Phe Ile Gly Asp Met Thr Gln Pro Leu His Asp Glu
        115                 120                 125
Ala Tyr Ala Val Gly Gly Asn Lys Ile Asn Val Thr Phe Asp Gly Tyr
    130                 135                 140
His Asp Asn Leu His Ser Asp Trp Asp Thr Tyr Met Pro Gln Lys Leu
145                 150                 155                 160
Ile Gly Gly His Ala Leu Ser Asp Ala Glu Ser Trp Ala Lys Thr Leu
                165                 170                 175
Val Gln Asn Ile Glu Ser Gly Asn Tyr Thr Ala Gln Ala Ile Gly Trp
            180                 185                 190
Ile Lys Gly Asp Asn Ile Ser Glu Pro Ile Thr Thr Ala Thr Arg Trp
        195                 200                 205
Ala Ser Asp Ala Asn Ala Leu Val Cys Thr Val Val Met Pro His Gly
    210                 215                 220
Ala Ala Ala Leu Gln Thr Gly Asp Leu Tyr Pro Thr Tyr Tyr Asp Ser
225                 230                 235                 240
Val Ile Asp Thr Ile Glu Leu Gln Ile Ala Lys Gly Gly Tyr Arg Leu
                245                 250                 255
Ala Asn Trp Val Asn Glu Ile His Gly Ser Glu Ile Ala Lys
            260                 265                 270

Claims (9)

1、一种高效表达核酸酶P1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2、一种表达载体，其特征在于含有权利要求1所述的基因。
3、根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于所述表达载体为含有权利要求1所述的基因的毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K-nucP。
4、一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求2所述的表达载体。
5、根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有pPIC9K-nucP表达载体的巴氏毕赤酵母。
6、根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为表达核酸酶P1的毕赤酵母工程菌株，其分类命名为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)，保藏编号CGMCCNo.3188。
7、构建权利要求6所述的宿主细胞的方法，其特征在于采用RT-PCR方法从桔青霉菌株中提取nucP基因，构建重组表达质粒载体pPCI9K-nucP，利用电转化方法将重组质粒整合到巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)GS 115菌株上，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行诱导表达，筛选得到一株产酶量最高的菌株CGMCC No.3188。
8、权利要求1所述的高效表达核酸酶P1的基因在生产核酸酶P1中的应用。
9、根据权利要求8所述的高效表达核酸酶P1的基因在生产核酸酶P1中的应用，其特征在于在发酵罐中采用高密度发酵技术扩大培养生产重组工程菌CGMCCNo.3188，培养基为每升含磷酸15～20mL，磷酸钙0.1～0.5g，硫酸钾10～20g，硫酸镁12～20g，氢氧化钾2.0～4.0g，甘油20～40g，发酵温度28～30℃，pH6.0，溶氧控制在5LPM，发酵分为两个阶段，第一阶段为菌体生长阶段，按10％(v/v)接种在上述培养基中生长，第一阶段培养时间15～18小时，当甘油耗尽后，溶氧迅速上升，此时转入增殖阶段，流加诱导剂甲醇，诱导剂的加入体积为培养基体积的3％，流加时间为6～10h，使得溶氧维持在5LPM以上，增殖阶段总培养时间为45～50h，滤去酵母细胞得到含核酸酶P1的上清液。
CN200910183311A 2009-09-17 2009-09-17 一种高效表达核酸酶p1的基因及其应用 Pending CN101654677A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200910183311A CN101654677A (zh) 2009-09-17 2009-09-17 一种高效表达核酸酶p1的基因及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200910183311A CN101654677A (zh) 2009-09-17 2009-09-17 一种高效表达核酸酶p1的基因及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101654677A true CN101654677A (zh) 2010-02-24

Family

ID=41709129

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200910183311A Pending CN101654677A (zh) 2009-09-17 2009-09-17 一种高效表达核酸酶p1的基因及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101654677A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102757977A (zh) * 2012-07-19 2012-10-31 中国科学技术大学 颗粒溶解素的表达和制备方法
WO2015143638A1 (zh) * 2014-03-26 2015-10-01 南京工业大学 核苷酸的生产工艺
CN106318926A (zh) * 2015-06-19 2017-01-11 安琪酵母股份有限公司 一种桔青霉发酵产核酸酶p1的生产方法
CN113025634A (zh) * 2021-03-05 2021-06-25 中国食品发酵工业研究院有限公司 一种包含糖醇和atp结合域的基因序列及其在解脂亚罗酵母中表达和功能验证方法
WO2023103543A1 (zh) * 2021-12-07 2023-06-15 南京工业大学 一种核酸酶p1的制备方法
CN118109448A (zh) * 2024-03-18 2024-05-31 武汉新华扬生物股份有限公司 一种提高核酸酶稳定性的助剂及其制备方法和应用

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102757977A (zh) * 2012-07-19 2012-10-31 中国科学技术大学 颗粒溶解素的表达和制备方法
WO2015143638A1 (zh) * 2014-03-26 2015-10-01 南京工业大学 核苷酸的生产工艺
CN106318926A (zh) * 2015-06-19 2017-01-11 安琪酵母股份有限公司 一种桔青霉发酵产核酸酶p1的生产方法
CN106318926B (zh) * 2015-06-19 2019-10-25 安琪酵母股份有限公司 一种桔青霉发酵产核酸酶p1的生产方法
CN113025634A (zh) * 2021-03-05 2021-06-25 中国食品发酵工业研究院有限公司 一种包含糖醇和atp结合域的基因序列及其在解脂亚罗酵母中表达和功能验证方法
WO2023103543A1 (zh) * 2021-12-07 2023-06-15 南京工业大学 一种核酸酶p1的制备方法
CN118109448A (zh) * 2024-03-18 2024-05-31 武汉新华扬生物股份有限公司 一种提高核酸酶稳定性的助剂及其制备方法和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101654677A (zh) 一种高效表达核酸酶p1的基因及其应用
CN104342394B (zh) 一株暹罗芽孢杆菌及其在防治禾谷镰刀菌方面的应用
CN104403962B (zh) 一株特基拉芽孢杆菌及其防治禾谷镰刀菌方面的应用
CN108277179B (zh) 一种枯草芽孢杆菌的高密度发酵及喷雾干燥方法
CN112210513B (zh) 产褐藻胶裂解酶菌株及其应用
CN104774825A (zh) 腈水解酶突变体及其应用
CN109182147B (zh) 一种青霉及其生产烟曲霉素的方法
CN101717745B (zh) 一株羰基还原酶重组菌高效制备(s)-苯基乙二醇的方法
CN104312996A (zh) α-L-鼠李糖苷酶Rha1及其表达基因和应用
CN104357468A (zh) 食清洁剂细小棒菌zjb14001、卤醇脱卤酶基因、酶、工程菌及应用
CN104046586B (zh) 一株基因工程菌及其在生产(2r,3r)-2,3-丁二醇中的应用
CN109679875B (zh) 一种戴尔福特菌及应用
CN105238797A (zh) 一种无乳链球菌的gshF基因的突变基因及其应用
CN102876642B (zh) 一种菊酯类农药降解酶的制备方法
CN107893033A (zh) 烟曲霉sqh4及在生物转化法制备花旗松素中的应用
JPWO2009093634A1 (ja) マツタケ子実体の誘導方法
CN101875940B (zh) 一株耐盐的苜蓿中华根瘤菌nsm18及其专用基因簇
CN115340964B (zh) 一种具有膨胀素活性的芽孢菌属菌株及其应用
CN102757914A (zh) 一株解木聚糖类芽孢杆菌及用其制备木葡聚糖酶的方法
CN113337407B (zh) 卷枝毛霉cauliu-fungus-1及其用途
JP5366070B2 (ja) 酵母菌体の製造方法
CN105062906B (zh) 一种优化有机磷水解酶酵母工程菌及其酶的生产方法
CN108130281A (zh) 土曲霉ddt98801及其筛选方法和在降解滴滴涕中的应用
CN110423711B (zh) 南极来源的产低温几丁质酶菌株及其发酵方法
CN106701867A (zh) 一种提高尼可霉素产量的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20100224