CN101636502B

CN101636502B - 结合cd19的人类抗体及其用途

Info

Publication number: CN101636502B
Application number: CN200780050552.1A
Authority: CN
Inventors: D·J·金; C·拉奥-耐克; C·潘; J·卡尔达雷利; D·布兰塞特
Original assignee: Medarex LLC
Current assignee: E.R. expensive precious & Sheng Si limited liability company is executed
Priority date: 2006-12-13
Filing date: 2007-12-13
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2027-12-13
Also published as: CN101636502A; ZA200904424B

Abstract

本公开提供了以高亲和力特异结合CD19的分离的单克隆抗体，特别是人类单克隆抗体。优选地，这些抗体与人类CD19相结合。在某些实施方案中，这些抗体能被内化至表达CD19的细胞中或能介导抗原依赖性细胞毒作用。还提供了编码本公开的抗体的核酸分子、表达载体、宿主细胞以及用于表达本公开抗体的方法。还提供了抗体-配偶体分子缀合物、双特异性分子、以及包含本公开抗体的药物组合物。本公开还提供了检测CD19的方法，以及使用本公开的抗CD19抗体治疗癌症的方法，这些癌症为例如B细胞恶性肿瘤，例如，非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、滤泡型淋巴瘤、B谱系弥漫性大细胞淋巴瘤、和多发性骨髓瘤。

Description

结合CD19的人类抗体及其用途

相关申请

本专利申请要求于2006年12月13日提交的美国临时申请系列号60/869,904、以及于2007年11月30日提交的美国临时申请系列号60/991,700的优先权，将其内容并入本文作为参考。

发明背景

CD19是一个95kDa的膜受体，它早期表达于B细胞分化中，并持续表达直到B细胞被触发进行终末分化(Pezzutto et al.，(1987)J Immunol.138：2793；Tedder et al.(1994)Immunol Today 15：437)。CD19的细胞外结构域包含两个C2型免疫球蛋白(IG)样结构域，它们被一个较小的潜在的二硫键连接的结构域分开。CD19的细胞质结构域在结构上是独特的，但在人类、小鼠与豚鼠之间是高度保守的(Fujimoto et al.，(1998)SeminImmunol.10：267)。CD19是在B淋巴细胞的细胞表面上发现的一种蛋白质复合体的部分。该蛋白质复合体包括CD19、CD21(补体受体，2型)、CD81(TAPA-1)、以及CD225(Leu-13)(Fujimoto，在上)。

CD19是B细胞中重要的跨膜信号调节体。CD19细胞表面密度的增加或降低影响B细胞的发育以及功能，造成多种疾病，如自身免疫以及低丙种球蛋白血症(Fujimoto，在上)。CD19复合体通过对在B细胞膜上发现的两个单独的信号转导复合体进行交联而增强B细胞在体内对抗原的反应。这两个与膜IgM以及CD19相关的信号转导复合体通过不同的机制激活磷脂酶C(PLC)。CD19以及B细胞受体的交联降低了激活PLC所需的IgM分子的数目(Fujimoto，在上；Ghetie，在上)。此外，CD19作为专门的衔接子蛋白发挥作用，用于Arc家族激酶的扩增(Hasegawa et al.，(2001)J Immunol 167：3190)。

CD19结合已经显示出增强并抑制B细胞的激活以及增殖，这取决于发生交联的量(Tedder，在上)。CD19在大于90％的B细胞淋巴瘤上表达，并已经被预测在体外以及体内影响淋巴瘤的生长(Ghetie，在上)。目前针对CD19产生的抗体为鼠类抗体。使用鼠类抗体治疗人类患者的缺点是施用于患者后的人类抗鼠(HAMA)反应。因此，对于针对CD19的经修饰的治疗抗体存在着需要，这些抗体更有效地治疗和/或预防通过CD19介导的疾病。

概述

本公开提供了分离的单克隆抗体，特别是人类单克隆抗体，这些抗体特异性结合CD19并且表现出多种所希望的特性。这些特性包括结合人类CD19的高亲和力、被表达CD19的细胞内化、和/或介导抗原依赖性细胞毒性的能力。本发明的抗体可以用于(例如)检测CD19蛋白或抑制表达CD19的细胞(如表达CD19的肿瘤细胞)的生长。还提供了使用本公开的抗体以及组合物治疗多种CD19介导的疾病的方法。

一方面，本公开涉及一种分离的人类单克隆抗体、或该抗体的抗原结合部分，其中该抗体结合人类CD19，并且表现出以下特性中的至少一种：

(a)以1×10^-7M或更小的K_D与人类CD19相结合；

(b)与Raji以及Daudi B细胞肿瘤细胞相结合；

(c)被表达CD19的细胞内化；

(d)表现出针对表达CD19的细胞的抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)；并且

(e)当缀合细胞毒素时在体内抑制表达CD19的细胞的生长。

优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、以及(e)中的至少两种。更优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、以及(e)中的至少三种。更优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、以及(e)中的四种。甚至更优选地，该抗体表现出特性(a)、(b)、(c)、(d)、以及(e)中的全部五种。在另一个优选的实施方案中，当该抗体缀合细胞毒素时该抗体抑制表达CD19的肿瘤细胞在体内的生长。

在一个实施方案中，该抗体以5×10^-8M或更小的K_D与人类CD19相结合，以2×10^-8M或更小的K_D与人类CD19相结合，以1×10^-8M或更小的K_D与人类CD19相结合，以5×10^-9M或更小的K_D与人类CD19相结合，以4×10^-9M或更小的K_D与人类CD19相结合，以3×10^-9M或更小的K_D与人类CD19相结合，或以2×10^-9M或更小的K_D与人类CD19相结合。

优选地，该抗体是一种人类抗体，尽管在备选实施方案中该抗体可以是一种鼠类抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

另一方面，本发明涉及一种分离的人类单克隆抗体、或其抗原结合部分；其中该抗体交叉竞争结合人类CD19上可被参考抗体识别的表位，其中该参考抗体包含：

(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：1；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：8；

或该参照抗体包含：(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：1；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：9；

或该参照抗体包含：(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：2；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：10；

或该参照抗体包含：(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：3；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：11；

或该参照抗体包含：(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：12；

或该参照抗体包含：(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：13；

或该参照抗体包含：(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：6；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：14；

或该参照抗体包含：(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：15。

另一方面，本公开涉及分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，其中该抗体包含作为人类V_H 5-51基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体异地结合CD19。本公开还提供了一种分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，其中该抗体包含作为人类V_H 1-69基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体特异地结合CD19。本公开还进一步提供了一种分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包含作为人类V_k L18基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异地结合CD19。本公开甚至进一步提供了一种分离的人类单克隆抗体、或其抗原结合部分，其中该抗体包含作为人类V_K A27基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异地结合CD19。本公开甚至进一步了提供一种分离的人类单克隆抗体、或其抗原结合部分，其中该抗体包含作为人类V_K L15基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异地结合CD19。

在一个优选的实施方案中，本公开提供一种分离的人类单克隆抗体、或其抗原结合部分，其中该抗体包含：(a)人类V_H 5-51或1-69基因的重链可变区；以及(b)人类V_K L18、A27或V_K L15的轻链可变区；其中该抗体特异地结合CD19。

另一方面，本公开提供了一种分离的人类单克隆抗体、或其抗原结合部分，其中该抗体包含：包括CDR1、CDR2、以及CDR3序列的重链可变区；以及包括CDR1、CDR2、以及CDR3序列的轻链可变区，其中：(a)该重链可变区CDR3序列包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自：氨基酸序列SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35以及36，以及它们的保守性修饰；(b)该轻链可变区CDR3序列包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自：氨基酸序列SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57以及58，以及它们的保守性修饰；(c)该抗体以1×10^-7M或更小的K_D与人类CD19相结合；并且(d)与Raji以及Daudi B细胞肿瘤细胞相结合。

优选地，该重链可变区CDR2序列包括一条氨基酸序列，该氨基酸序列选自：氨基酸序列SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28以及29，以及它们的保守性修饰；并且该轻链可变区CDR2序列包括一条氨基酸序列，该氨基酸序列选自：氨基酸序列SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49以及50，以及它们的保守性修饰。优选地，该重链可变区CDR1序列包括一条氨基酸序列，该氨基酸序列选自：氨基酸序列SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21以及22，以及它们的保守性修饰；并且该轻链可变区CDR1序列包括一条氨基酸序列，该氨基酸序列选自：氨基酸序列SEQ ID NO：37、38、39、40、41、42以及43，以及它们的保守性修饰。

一种优选的组合包括：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：16；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：23；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：30；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：37；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：44；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：51。

另一种优选的组合包括：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：16；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：23；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：30；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：37；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：44；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：52。

另一种优选的组合包括：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：17；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：24；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：31；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：38；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：45；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：53。

另一种优选的组合包括：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：18；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：25；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：32；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：39；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：46；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：54。

另一种优选的组合包括：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：19；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：26；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：33；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：40；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：47；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：55。

另一种优选的组合包括：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：20；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：27；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：34；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：41；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：48；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：56。

另一种优选的组合包括：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：21；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：28；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：35；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：42；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：49；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：57。

另一种优选的组合包括：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：22；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：29；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：36；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：43；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：50；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：58。

其他优选的抗体、或其抗原结合部分，包括：

(a)重链可变区，包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6以及7；以及

(b)轻链可变区，包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列选自SEQ IDNO：8、9、10、11、12、13、14以及15；

其中该抗体特异地结合CD19。

一个优选的组合包括：(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ IDNO：1；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：8。

另一种优选的组合包括：(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ IDNO：1；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：9。

另一个优选的组合包括：(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ IDNO：2；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：10。

另一个优选的组合包括：(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ IDNO：3；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：11。

另一个优选的组合包括：(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ IDNO：4；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：12。

另一个优选的组合包括：(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ IDNO：5；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：13。

另一个优选的组合包括：(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ IDNO：6；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：14。

另一个优选的组合包括：(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ IDNO：7；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：15。

本公开的另一方面，提供了多种抗体、或它们的抗原结合部分或片段，这些抗体或它们的抗原结合部分或片段与以上提及的抗体中的任何抗体竞争结合CD19。

例如，本公开的抗体可以是全长抗体，例如IgG1或IgG4同种型。备选地，该抗体可以是诸如Fab、Fab’或Fab’2片段的抗体片段，或单链抗体。

本公开还提供了一种免疫连接物，其包含连接到治疗剂(例如细胞毒素或放射性同位素)的本公开的抗体、或其抗原结合部分。

在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了一种免疫连接物，该免疫连接物包括连接到细胞毒素(例如，此处说明的细胞毒素或者说明于2006年12月28日提交的美国专利申请号60/882,461或2007年11月30日提交的美国专利申请号60/991,300中，将它们完整并入本文作为参考)的本公开的抗体、或其抗原结合部分(例如，通过硫醇连接)。例如，在不同的实施方案中，本发明提供了以下优选的免疫连接物：

(i)一种免疫连接物，包含一种抗体、或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：

(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：1；以及轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：8；

(b)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：1；以及轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：9；

(c)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：2；以及轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：10；

(d)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：3；以及轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：11；

(e)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；以及轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：12；

(f)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；以及轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：13；

(g)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：6；以及轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：14；或者

(h)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；以及轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：15，

其中，该抗体或其抗原结合部分被连接到细胞毒素上：

(ii)一种免疫连接物，包括连接到细胞毒素的抗体、或其抗原结合部分，该抗体或其抗原结合部分包含：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：16；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：23；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：30；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：37；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：44；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：51；

一种抗体、或其抗原结合部分，包含：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：16；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：23；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：30；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：37；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：44；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：52；

一种抗体、或其抗原结合部分，包含：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：17；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：24；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：31；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：38；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：45；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：53；

一种抗体、或其抗原结合部分，包含：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：18；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：25；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：32；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：39；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：46；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：54；

一种抗体、或其抗原结合部分，包含：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：19；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：26；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：33；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：40；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：47；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：55；

一种抗体、或其抗原结合部分，包含：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：20；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：27；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：34；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：41；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：48；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：56；

一种抗体、或其抗原结合部分，包含：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：21；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：28；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：35；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：42；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：49；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：57；或者

一种抗体、或其抗原结合部分，包含：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：22；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：29；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：36；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：43；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：50；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：58；以及

(iii)一种免疫连接物，包括连接到细胞毒素的抗体、或其抗原结合部分，其中该抗体或其抗原结合部分与一种抗体所识别(例如，与下述抗体竞争结合人类CD19)的表位相同的表位相结合，后一抗体包含：

(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：1；以及轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：8。

(b)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：1；以及轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：9。

(h)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；以及轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：15。

本公开还提供了一种双特异性分子，该双特异性分子包含本公开的抗体、或其抗原结合部分或片段，其中该抗体或其抗原结合部位或片段与第二个功能部分相连接，该第二功能部分具有与所述抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性。

还提供了多种组合物，其包含本公开的抗体、或其抗原结合部分、或免疫连接物、或双特异性分子，以及药学上可接受的载体。

本公开还包括对本公开的抗体、或它们的抗原结合部分进行编码的核酸分子、以及包含此类核酸的表达载体以及包含此类表达载体的宿主细胞。还提供了使用包括此类表达载体的宿主细胞制备抗CD19抗体的方法，并且这些方法可包括步骤：(i)在宿主细胞中表达该抗体以及(ii)从宿主细胞中分离该抗体。

在又一方面中，本发明涉及一种制备抗CD19抗体的方法。该方法包括：

(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，包括CDR1序列，该CDR1序列选自：SEQ ID NO：16至22；CDR2序列，该CDR2序列选自：SEQ IDNO：23至29；和/或CDR3序列，该CDR3序列选自：SEQ ID NO：30至36；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，包含CDR1序列，该CDR1序列选自：SEQ ID NO：37至43；CDR2序列，该CDR2序列选自：SEQ ID NO：44至50，和/或CDR3序列，该CDR3序列选自：SEQ ID NO：51至58；

(b)在重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中改变至少一个氨基酸残基，以产生至少一种被改变的抗体序列；并且

(c)将被改变的抗体序列表达成蛋白质。

本公开还提供了以高亲和力与CD19特异性结合的分离的抗CD19抗体-配偶体分子缀合物，特别是那些包含人类单克隆抗体的抗CD19抗体-配偶体分子缀合物。此类抗体-配偶体分子缀合物中有某些能被内化至表达CD19的细胞中，并且能介导抗原依赖性细胞毒作用。本公开还提供了使用在此公开的抗CD19抗体-配偶体分子缀合物治疗癌症的方法，这些癌症例如B细胞恶性肿瘤，包括非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、滤泡型淋巴瘤、B谱系弥漫性大细胞淋巴瘤、以及多发性骨髓瘤。

还提供了包含与本公开的配偶体分子相缀合的抗体、或其抗原结合部分的组合物。可以有利地与在此公开的抗体配偶体分子缀合物中的抗体相缀合的配偶体分子包括但不限于：作为药物的分子、细胞毒素、标记分子(如放射性同位素)、蛋白质、以及治疗剂。还在此公开了包含抗体-配偶体分子缀合物以及药学上可接受的载体的组合物。

一方面，此类抗体-配偶体分子缀合物通过化学连接体相缀合。在一些实施方案中，该连接体是肽基连接体，并在此被表示为(L⁴)_p-F-(L¹)_m。其他连接体包括肼以及二硫键连接体，并在此中被分别表示为(L⁴)_p-H-(L¹)_m或(L⁴)_p-J-(L¹)_m。除了与配偶体相附着的连接体之外，本发明还提供了适用于附着至基本上任何分子种类的可切割的连接臂。

另一方面，本发明涉及抑制表达CD19的肿瘤细胞生长的方法。该方法包括将表达CD19的肿瘤细胞与本公开的抗体-配偶体分子缀合物相接触，使得表达CD19的肿瘤细胞的生长受到抑制。在一个优选的实施方案中，该配偶体分子是一种治疗剂，如细胞毒素。特别优选的表达CD19的肿瘤细胞是B细胞肿瘤细胞。

另一方面，本发明涉及治疗受试者体内癌症的方法。该方法包括给予该受试者本公开的抗体-配偶体分子缀合物，使得该受试者体内的癌症得到治疗。在一个优选的实施方案中，该配偶体分子是一种治疗剂，如细胞毒素。用于治疗的特别优选的癌症是B细胞恶性肿瘤，例如非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、滤泡型淋巴瘤、B谱系弥漫性大细胞淋巴瘤、以及多发性骨髓瘤。

从以下详细的说明以及实施例中本公开的其他特征及优点将是显而易见的，这些说明与实施例不得被解释为是对本公开的限制。本申请全文引用的所有参考文献、Genbank登录号、专利、以及已公开的专利申请都明确地并入本文作为参考。

附图简述

图1A示出了21D4以及21D4a人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：59)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。描绘了CDR1(SEQ ID NO：16)、CDR2(SEQ ID NO：23)、以及CDR3(SEQ ID NO：30)区，并指明了V、D、以及J的种系来源。

图1B示出了21D4人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：66)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。描绘了CDR1(SEQ IDNO：37)、CDR2(SEQ ID NO：44)、以及CDR3(SEQ ID NO：51)区，并指明了V与J的种系来源。

图1C示出了21D4a人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：67)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。描绘了CDR1(SEQ IDNO：37)、CDR2(SEQ ID NO：44)、以及CDR3(SEQ ID NO：52)区，并指明了V与J的种系来源。

图2A示出了47G4人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：60)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。描绘了CDR1(SEQ IDNO：17)、CDR2(SEQ ID NO：24)、以及CDR3(SEQ ID NO：31)区，并指明了V、D、以及J的种系来源。

图2B示出了47G4人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：68)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。描绘了CDR1(SEQ IDNO：38)、CDR2(SEQ ID NO：45)、以及CDR3(SEQ ID NO：53)区，并指明了V与J的种系来源。

图3A示出了27F3人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：61)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。描绘了CDR1(SEQ IDNO：18)、CDR2(SEQ ID NO：25)、以及CDR3(SEQ ID NO：32)区，并指明了V、D、以及J的种系来源。

图3B示出了27F3人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：69)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：11)。描绘了CDR1(SEQ IDNO：39)、CDR2(SEQ ID NO：46)、以及CDR3(SEQ ID NO：54)区，并指明了V与J的种系来源。

图4A示出了3C10人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：62)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。描绘了CDR1(SEQ IDNO：19)、CDR2(SEQ ID NO：26)、以及CDR3(SEQ ID NO：33)区，并指明了V、D、以及J的种系来源。

图4B示出了3C10人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：70)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。描绘了CDR1(SEQ IDNO：40)、CDR2(SEQ ID NO：47)、以及CDR3(SEQ ID NO：55)区，并指明了V与J的种系来源。

图5A示出了5G7人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：63)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。描绘了CDR1(SEQ IDNO：20)、CDR2(SEQ ID NO：27)、以及CDR3(SEQ ID NO：34)区，并指明了V、D、以及J的种系来源。

图5B示出了5G7人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：71)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：13)。描绘了CDR1(SEQ IDNO：41)、CDR2(SEQ ID NO：48)、以及CDR3(SEQ ID NO：56)区，并指明了V与J的种系来源。

图6A示出了13F1人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：64)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。描绘了CDR1(SEQ IDNO：21)、CDR2(SEQ ID NO：28)、以及CDR3(SEQ ID NO：35)区，并指明了V、D、以及J的种系来源。

图6B示出了13F1人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：72)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。描绘了CDR1(SEQ IDNO：42)、CDR2(SEQ ID NO：49)、以及CDR3(SEQ ID NO：57)区，并指明了V与J的种系来源。

图7A示出了46E8人类单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：65)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。描绘了CDR1(SEQ IDNO：22)、CDR2(SEQ ID NO：29)、以及CDR3(SEQ ID NO：36)区，并指明了V、D、以及J的种系来源。

图7B示出了46E8人类单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：73)以及氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。描绘了CDR1(SEQ IDNO：43)、CDR2(SEQ ID NO：50)、以及CDR3(SEQ ID NO：58)区，并指明了V与J的种系来源。

图8示出了21D4以及21D4a的重链可变区的氨基酸序列(均为SEQID NO：1)与人类种系V_H 5-51氨基酸序列(SEQ ID NO：74)的比对。JH4b种系被公开为SEQ ID NO：80。

图9示出了47G4的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)与人类种系V_H 1-69氨基酸序列(SEQ ID NO：75)的比对。JH5b种系被公开为SEQ ID NO：81。

图10示出了27F3的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)与人类种系V_H 5-51氨基酸序列(SEQ ID NO：74)的比对。JH6b种系被公开为SEQ ID NO：82。

图11示出了3C10的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)与人类种系V_H 1-69氨基酸序列(SEQ ID NO：75)的比对。JH6b种系被公开为SEQ ID NO：82。

图12示出了5G7的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)与人类种系V_H 5-51氨基酸序列(SEQ ID NO：74)的比对。JH6b种系被公开为SEQ ID NO：83。

图13示出了13F1的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)与人类种系V_H 5-51氨基酸序列(SEQ ID NO：74)的比对。JH6b种系被公开为SEQ ID NO：82。

图14示出了46E8的重链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)与人类种系V_H 5-51氨基酸序列(SEQ ID NO：74)的比对。JH6b种系被公开为SEQ ID NO：82。

图15示出了21D4的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)与人类种系V_K L18氨基酸序列(SEQ ID NO：76)的比对。JK2种系被公开为SEQ ID NO：84。

图16示出了21D4a的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)与人类种系V_K L18氨基酸序列(SEQ ID NO：76)的比对。JK3种系被公开为SEQ ID NO：85。

图17示出了47G4的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)与人类种系V_k A27氨基酸序列(SEQ ID NO：77)的比对。JK3种系被公开为SEQ ID NO：85。

图18示出了27F3的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)与人类种系V_k L18氨基酸序列(SEQ ID NO：76)的比对。JK2种系被公开为SEQ ID NO：84。

图19示出了3C10的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)与人类种系V_k L15氨基酸序列(SEQ ID NO：78)的比对。JK2种系被公开为SEQ ID NO：84。

图20示出了5G7的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)与人类种系V_k L18氨基酸序列(SEQ ID NO：76)的比对。JK1种系被公开为SEQ ID NO：86。

图21示出了13F1的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)与人类种系V_k L18氨基酸序列(SEQ ID NO：76)的比对。JK2种系被公开为SEQ ID NO：87。

图22示出了46E8的轻链可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)与人类种系V_k L18氨基酸序列(SEQ ID NO：76)的比对。JK2种系被公开为SEQ ID NO：87。

图23是显示实验结果的一个曲线图，这些实验证明针对人类CD19的人类单克隆抗体47G4与人类CD19特异性地相结合。

图24A及B是显示实验结果的一个曲线图，这些实验结果证明针对CD19的人类单克隆抗体在Raji细胞竞争结合。

图25A至D示出了流式细胞术实验的结果，证明针对人类CD19的人类单克隆抗体21D4、21D4a、47G4、3C10、5G7以及13F1结合B细胞肿瘤细胞系的细胞表面。(A)在经人类CD19转染的CHO细胞上HuMAb21D4以及47G4的流式细胞术。(B)在Daudi B肿瘤细胞上HuMAb 47G4的流式细胞术。(C)在Raji B肿瘤细胞上HuMAb 21D4以及47G4的流式细胞术。(D)在Raji B肿瘤细胞上HuMAb 21D4、21D4a、3C10、5G7以及13F1的流式细胞术。

图26A至B示出了内化实验的结果，通过3H-胸苷释放测定，证明针对人类CD19的人类单克隆抗体21D4以及47G4进入CHO-CD19细胞以及表达CD19的Raji B肿瘤细胞。(A)HuMAb 47G4内化进入CHO-CD19细胞。(B)HuMAb 21D4以及47G4内化进入Raji B肿瘤细胞。

图27A及B示出了胸苷掺入测定的结果，证明针对人类CD19的人类单克隆抗体杀死Raji B细胞肿瘤细胞。

图28示出了Ramos***模型中小鼠存活的Kaplan-Meier曲线。

图29A至B示出了Ramos***模型中小鼠体重的变化。

图30A至B示出了体内小鼠肿瘤模型研究的结果，证明用裸露的抗CD19抗体21D4的治疗对淋巴瘤具有直接的体内抑制作用。(A)ARH-77肿瘤(B)Raji肿瘤。

图31示出了抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)测定的结果，证明非岩藻糖基化的人类单克隆抗CD19抗体以ADCC依赖的方式增强了对人类白血病细胞的细胞毒性。

图32示出了体内小鼠肿瘤模型研究的结果，证明缀合了细胞毒素的抗CD19抗体减小肿瘤体积。毒素1是细胞毒素N1，而毒素2是细胞毒素N2。

图33示出了Raji肿瘤模型研究中小鼠的体重变化。毒素1是细胞毒素N1，而毒素2是细胞毒素N2。

图34示出了猕猴研究的结果，表明用岩藻糖基化或非岩藻糖基化的抗CD19 HuMAb治疗后CD20阳性细胞群体减少。

图35示出了用岩藻糖基化或非岩藻糖基化的抗CD19 HuMAb治疗后各个猕猴的结果。

图36A至C示出了胸苷掺入测定的结果，证明仅针对人类CD19或者缀合了细胞毒素的人类单克隆抗体杀死Raji以及SU-DHL-6 B细胞肿瘤细胞。

图37示出了在皮下异种移植SCID小鼠模型中免疫连接物抗CD19-N2针对肿瘤形成的体内功效。

图38示出了在皮下伯基特淋巴瘤SCID小鼠模型中免疫连接物抗CD19-N2针对肿瘤形成的体内功效。

图39示出了在***的SCID小鼠模型中免疫连接物抗CD19-N2针对肿瘤形成的体内功效。

图40A示出了在给予21D4后B细胞(CD20阳性)以剂量依赖方式减少，在0.01mg/kg时具有最小的或者完全没有清除。在给予0.1mg/kg后，B细胞减少至基线的16％到32％。

图40B展示了在给予21D4后B细胞清除的量级以及时间长度与注射0.1mg/kg利妥希玛后B细胞清除的量级以及时间长度相似。

图41示出了在Raji异种移植SCID小鼠模型中单次剂量的抗CD19-细胞毒素A针对肿瘤形成的体内功效。

图42示出了在Raji异种移植SCID小鼠模型中单次剂量的抗CD19-细胞毒素A针对肿瘤形成的体内功效，包括同种型对照。

图43示出了在Ramos异种移植Es1^e裸鼠模型中单次剂量以及重复剂量的抗CD19-细胞毒素A针对肿瘤形成的体内功效。

图44示出了在Daudi异种移植SCID小鼠模型中单次剂量的抗CD19-细胞毒素A针对肿瘤形成的体内功效。

图45示出了在SU-DHL6异种移植SCID小鼠模型中单次剂量的抗CD19-N2针对肿瘤形成的体内功效。N2＝细胞毒素B。

图46是细胞毒素A的结构。

详述

本公开涉及分离的单克隆抗体，特别是人类单克隆抗体，这些抗体以高亲和力特异地结合人类CD19并且具有所希望的功能特性。在某些实施方案中，本公开的抗体衍生自特定的重链及轻链种系序列和/或包含特定的结构特征，例如包括特定的氨基酸序列的CDR区。本公开提供了分离的抗体，制备此类抗体、抗体-配偶体分子缀合物、以及包括此类抗体的双特异性分子的方法，以及包含本公开的抗体、抗体-配偶体分子缀合物、或双特异性分子的药物组合物。本公开还涉及使用所述抗体如检测CD19，以及治疗与CD19的表达相关的疾病(例如表达CD19的B细胞恶性肿瘤)的方法。因此，本公开还提供使用本公开的抗CD19抗体以及抗体-配偶体分子缀合物治疗B细胞恶性肿瘤的方法，例如，治疗非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、滤泡型淋巴瘤、B谱系弥漫性大细胞淋巴瘤、以及多发性骨髓瘤。

为了更容易地理解本公开，首先定义了某些术语。其他定义在整个详细说明中给出。

如此处使用的术语“CD19”指(例如)人类CD19的变体、同种型、同源物、直向同源物、以及侧向同源物。因此，本公开的人类抗体在某些情况下可以与来自除人类之外的其他物种的CD19进行交叉反应。在某些实施方案中，该抗体对于一个或多个人类CD19蛋白可能是完全特异的，并且可能不表现出物种或其他类型的非人类交叉反应性，或者可能与来自某些其他物种但不是所有其他物种的CD19交叉反应(如与灵长类CD19进行交叉反应但不与小鼠CD19进行交叉反应)。术语“人类CD19”指人类序列CD19，如具有Genbank登录号NM_001770的人类CD19的完整氨基酸序列(SEQ ID NO：79)。术语“小鼠CD19”指小鼠序列CD19，如具有Genbank登录号AAA37390的小鼠CD19的完整氨基酸序列。通过具有例如保守突变或在非保守区的突变，该人类CD19序列可能不同于Genbank登录号NM_001770的人类CD19，而该CD19具有基本上与Genbank登录号NM_001770的人类CD19相同的生物功能。

一个特定的人类CD19序列与Genbank登录号NM_001770的人类CD19在氨基酸序列上通常会有至少90％的同一性，并且含有多个氨基酸残基，当与其他物种(如鼠类)的CD19氨基酸序列相比时，这些氨基酸残基将该氨基酸序列鉴定为是人源的。在某些情况下，人类CD19与Genbank登录号为NM_001770的CD19在氨基酸序列上可具有至少95％，或者甚至至少96％、97％、98％或99％的同一性。在某些实施方案中，与Genbank登录号NM_001770的CD19序列相比，人类CD19序列可展示出不超过10个氨基酸差异。在某些实施方案中，与Genbank登录号NM_001770的CD19序列相比，该人类CD19可展示出不超过5个，或者甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。百分比同一性可以如此处所说明进行确定。

术语“免疫应答”是指例如，淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞、以及由上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子、以及补体)的作用，这些作用导致对侵入性病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或者，在自身免疫及病理炎症情况下，正常的人类细胞或组织的选择性损害、破坏或将它们从人体清除。

“信号转导途径”是指在多种信号传导分子之间的生物化学关系，这些分子在将信号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分中发挥作用。在此使用的短语“细胞表面受体”包括，例如，能够接受信号并将这种信号传递穿过细胞的原生质膜的分子及分子的复合体。本公开的“细胞表面受体”的一个实例是CD19受体。

在此使用的术语“抗体”包括整个抗体及它们的任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或它们的单链。“抗体”指包括通过二硫键互相连接的至少两条重链(H链)及两条轻链(L链)的糖蛋白，或其抗原结合部分。每一条重链都包括重链可变区(在此缩写为V_H)以及重链恒定区。该重链恒定区包括三个结构域，C_H1、C_H2以及C_H3。每一条轻链都包括轻链可变区(在此缩写为V_L)及轻链恒定区。该轻链恒定区包括一个结构域，C_L。V_H和V_L区域可以进一步被细分为多个高可变性区域，被称为互补决定区(CDR)，其间散布有更为保守的被称为构架区(FR)的多个区域。每个V_H以及V_L均由3个CDR及4个FR构成，按照以下顺序从氨基端至羧基端排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链及轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。这些抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主的组织或因子的结合，这些宿主的组织或因子包括免疫***的不同细胞(例如效应细胞)及经典补体***的第一成分(Clq)。

在此所使用的术语“抗体片段”以及抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保留特异性结合抗原(例如CD19)的能力的抗体的一个或多个片段。已经发现抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来实现。术语抗体的“抗原结合部分”中所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L及C_H1结构域构成的单价片段组成；(ii)F(ab′)₂片段，为包括在铰链区由二硫桥连接的两个Fab片段的一个二价片段；(iii)Fab’片段，它实质上是带有铰链区部分的Fab(见，FUNDAMENTALIMMUNOLOGY(Paul ed.，3^rd ed.1993)；(iv)由V_H及C_H1结构域构成的Fd片段；(v)由抗体的一个单臂的V_L及V_H结构域构成的Fv片段；(vi)dAb片段(Ward et al.1989)Nature 341：544-546)，它由V_H结构域构成；(vii)分离的互补决定区(CDR)；以及(viii)纳米抗体(nanobody)，含有一个单一可变结构域及两个恒定结构域的重链可变区。此外，虽然Fv片段的两个结构域，V_L与V_H，是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法由合成接头将它们连接起来，该接头使它们成为单一蛋白链，其中V_L及V_H区域配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird etal.(1988)Science 242：423-426；及Huston et al.(1988)Science242：423-426；及Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。术语抗体的“抗原结合部分”也旨在涵盖此类单链抗体。这些抗体片段可通过本领域技术人员已知的常规方法获得，并且对于这些片段进行的有用性的筛选与筛选完整抗体的方式相同。

此处使用的“分离的抗体”，意指抗体，它基本上没有具有不同抗原特异性的其他抗体(例如，特异性结合CD19的分离的抗体基本上没有特异性结合除CD19以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合CD19的分离的抗体对于其他抗原，例如来自其他物种的CD19分子，可以具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上没有其他细胞材料和/或化学物。

此处使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指由单一分子组分的抗体分子形成的制剂。单克隆抗体组合物显示了针对某一特定表位的单一结合特异性及亲和力。

此处使用的术语“人类抗体”意指包括具有可变区的抗体，在这些可变区中，构架区及CDR区均源自人类种系免疫蛋白序列。此外，如果该抗体包括恒定区，则该恒定区也源自人类种系免疫球蛋白序列。本公开的人类抗体可以包括不是由人类种系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(例如，在体外由随机诱变或位点特异性诱变引入的突变或在体内由体细胞突变引入的突变)。然而，此处使用的术语“人类抗体”并非意指包括以下抗体：其中源自另一个哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人类构架区序列上。

术语“人单克隆抗体”是指显示出单一结合特异性的抗体，这些抗体具有多个可变区，其中构架和CDR区均源自人类种系免疫球蛋白序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括由转基因非人类的动物(例如转基因小鼠)获到的B细胞，所述动物具有包括融合至无限增殖化细胞的人类重链转基因及轻链转基因的基因组。

此处使用的术语“重组人类抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人类抗体，例如(a)从动物(例如小鼠)中分离的抗体，该动物对于人类免疫球蛋白基因是转基因的或转染色体的，或从由其制备出的杂交瘤分离的抗体(以下将进一步说明)；(b)从经转化以表达人类抗体的宿主细胞(例如转染瘤)中分离的抗体，(c)从重组的组合人类抗体文库中分离的抗体，以及(d)通过任何其他方法来制备、表达、产生或分离的抗体，这些方法包括将人类免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列。这种重组人类抗体具有可变区，其中构架区及CDR区均源自于人类种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施方案中，这种重组人类抗体也可经受体外诱变(或者，在使用对于人类Ig序列转基因的动物时，经受体内体细胞诱变)，并且接着，重组抗体的V_H和V_L区域的氨基酸序列为这样的序列：其尽管衍生于人类种系V_H和V_L序列并与其相关，但是并不天然存在于体内人类抗体种系所有组成成分之中。

此处使用的“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM或IgG1)。

短语“识别抗原的抗体”与“对抗原特异的抗体”此处可以与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。

术语“人类抗体衍生物”是指人类抗体的任何经修饰的形式，例如，该抗体与另一种试剂或抗体的偶联物。

术语“人源化抗体”意指以下抗体，其中源自另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列被移植到人类构架序列上。可以在人类构架序列中进行额外的构架区修饰。

术语“嵌合抗体”意指以下抗体，其中可变区序列源自一个物种而恒定区序列源自另一个物种，例如一种抗体，其中可变区序列源自小鼠抗体而恒定区序列源自人类抗体。

术语“抗体模拟物”旨在表示能够模拟抗体的结合抗原的能力的分子，但是它们不局限于天然抗体结构。此类抗体模拟物的实例包括但不限于亲和体(Affibody)、经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)、抗运载蛋白(Anticalin)、Avimer、以及万能抗体(Versabody)，所有这些抗体模拟物采用结合结构，尽管它们模拟常规抗体结合，但是这些结构从不同的作用机理产生并通过这些机理发挥作用。

此处使用的术语“配偶体分子”指实体，它缀合至抗体-配偶体分子缀合物中的抗体上。配偶体分子的实例包括药物、细胞毒素、标记分子(包括但不限于肽以及小分子标记物，如荧光染料标记物，以及单原子标记物，如放射性同位素)、蛋白质以及治疗剂。

此处使用的“特异性结合人类CD19”的抗体旨在表示以1×10^-7M或更小，更优选地5×10^-8M或更小，更优选地3×10^-8M或更小，更优选地1×10^-8M或更小，甚至更优选地5×1^-9M或更小的K_D结合人类CD19的抗体。

此处使用的术语“基本上不结合”一种蛋白质或细胞是指不结合或不以高亲和力结合蛋白质或细胞，即，以1×10^-6M或更大，更优选为1×10^-5M或更大，更优选为1×10^-4M或更大，更优选为1×10^-3M或更大，甚至更优选为1×10^-2M或更大的K_D结合蛋白质或细胞。

此处使用的术语“K_assoc”或“K_a”旨在表示特定的抗体-抗原相互作用的结合速率，而此处使用的术语“K_dis”或“K_d”旨在表示特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。此处使用的术语“K_D”旨在表示解离常数，它是由K_d与K_a之比(即K_d/K_a)得到，并被表示为摩尔浓度(M)。抗体的K_D值可以使用本领域成熟的方法进行确定。确定抗体的K_D的一种优选方法是通过使用表面等离振子共振，优选使用诸如

***的生物传感器***。

此处使用的术语IgG抗体的“高亲和力”是指抗体对于靶抗原具有的K_D为1×10^-7M或更小，更优选地为5×10^-8M或更小，并且甚至更优选地为1×10^-9M或更小，并且甚至更优选地为5×10^-9M或更小。然而，对于其他抗体同种型而言，“高亲和力”结合可以发生变化。例如，对于IgM同种型而言，“高亲和力”结合是指抗体具有的K_D值为10^-6M或更小，更优选为10^-7M或更小，甚至更优选为10^-8M或更小。

此处使用的术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、犬、猫、马、奶牛、鸡、两栖动物、爬行动物等等。

符号“-”，不论是用作一个键或显示为垂直于一个键时均表明一个点，在该点处所显示的部分(moiety)连接到该分子、固相支持体等的其余部分上。

除非另作说明，术语“烷基”，就其本身或作为另一个取代基的部分，是指直链或支链的或环状烃基、或它们的组合，它可以是完全饱和的、单不饱和的、或多不饱和的，并且能包括二价以及多价***，具有所指定的碳原子数目(即C₁-C₁₀是指1至10个碳原子)。饱和烃基的实例包括但不限于以下基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基、以及(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物或异构体、以及类似物。不饱和烷基基团是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基基团的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基以及3-丙炔基、3-丁炔基，以及更高级同系物以及异构体。除非另有说明，术语“烷基”还意在包括那些以下详细说明的烷基衍生物，如“杂烷基”。限于烃基基团的烷基基团被称为“同烷基”。

术语“亚烷基”其本身或作为另一个取代基的部分是指衍生自烷烃的二价基团，例如但不局限于-CH₂CH₂CH₂CH₂-，并且进一步包括那些如下说明为“杂亚烷基”的基团。典型地，烷基(或亚烷基)基团将具有1到24个碳原子，其中具有10个或更少的碳原子的那些基团在本发明中是优选的。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链的烷基或亚烷基基团，一般具有八个或更少的碳原子。

除非另作说明，术语“杂烷基”就其本身或与另一个术语组合，是指稳定的直链或支链、或环状烃基、或它们的组合，由所说明的数目的碳原子以及至少一个杂原子组成，该杂原子选自：O、N、Si、以及S，并且其中氮、碳、以及硫原子会可任选地被氧化，并且氮杂原子会可任选地被季铵化。一个或多个杂原子O、N、S、及Si可位于杂烷基基团的任何内部位置，或可位于该烷基团附着于该分子的其余部分的位置。实例包括但不限于：-CH₂-CH₂-O-CH₃、-CH₂-CH₂-NH-CH₃、-CH₂-CH₂-N(CH3)-CH₃、-CH₂-S-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃、-CH＝CH-O-CH₃、-Si(CH3)₃、-CH₂-CH＝N-OCH₃、以及-CH＝CH-N(CH3)-CH₃。多达两个杂原子可以是连续的，例如-CH₂-NH-OCH₃以及-CH₂-O-Si(CH₃)₃。类似地，术语“杂亚烷基”就其本身或作为另一个取代基的部分是指衍生自杂烷基的二价基，例如但不限于-CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂-以及-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-。对于杂亚烷基基团，杂原子也可占据链末端的任一端或两端(例如，亚烷氧基、亚烷二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、等等)。术语“杂烷基”与“杂亚烷基”包括聚(乙二醇)及其衍生物(参见例如，Shearwater Polymers Catalog，2001)。此外，对于亚烷基以及杂亚烷基连接基团，书写连接基团的分子式的方向并不表示连接基团的方向。例如，式-C(O)₂R’-代表-C(O)₂R’-以及-R’C(O)₂-。

与术语“烷基”或“杂烷基”组合使用的术语“低级”是指具有1到6个碳原子的部分。

术语“烷氧基”、“烷氨基”、“烷基磺酰基”、以及“烷硫基”(或硫代烷氧基)都是以它们的常规意义使用，并分别指通过氧原子、氨基基团、SO₂基团、或硫原子附着于该分子的其余部分的那些烷基基团。术语“芳香磺酰基”是指通过SO₂基团附着于该分子其余部分的芳基基团，且术语“巯基”是指SH基团。

一般而言，“酰基取代基”也选自以上所给出的组。在此使用的术语“酰基取代基”指附着于羰基碳并满足其化合价的基团，该羰基碳直接或间接地附着于本发明的此合物的多环核上。

除非另作说明，术语“环烷基”与“杂环烷基”，就它们本身或与其他术语组合，分别表示环型的取代或未取代的“烷基”以及取代或未取代的“杂烷基”。另外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环附着于分子的其余部分的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基、等等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基、等等。环结构的杂原子以及碳原子可任选地被氧化。

除非另作说明，术语“卤”或“卤素”，就它们自身或作为另一个取代基的部分，是指氟、氯、溴、或碘原子。此外，术语如“卤烷基”是指包括单卤烷基以及多卤烷基。例如，术语“卤(C₁-C₄)烷基”旨在包括但不限于三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯代丁基、3-溴丙基、等等。

除非另作说明，术语“芳基”是指取代或未取代的多不饱和的芳香烃取代基，它可以是单一的环或多环(优选地从1至3个环)，这些环稠合在一起或以共价键相连接。术语“杂芳基”指芳基基团(或环)，这些芳基基团含有一至四个选自N、O、以及S的杂原子，其中氮、碳、以及硫原子可任选地被氧化，并且氮原子可任选地被季铵化的。杂芳基可以通过杂原子附着于该分子的其余部分。芳基以及杂芳基基团的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、以及6-喹啉基。以上提到的每一个芳基以及杂芳基环状体系的取代基选自以下说明的可接受的取代基的组。“芳基”以及“杂芳基”也包括环体系，其中一个或多个非芳香族环体系被稠合、或者以其他方式结合至芳基或杂芳基体系上。

简言之，术语“芳基”当与其他术语(如芳氧基、芳硫基、芳烷基)组合使用时，包括以上定义的芳基环以及杂芳基环。因此，术语“芳烷基”意在包括那些基团，其中芳基基团附着于烷基基团(例如，苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基、等等)；包括那些烷基基团，其中一个碳原子(例如，亚甲基基团)已被(例如)一个氧原子取代(如苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基、等等)。

以上术语(如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”、以及“杂芳基”)各自均包括指定基团的取代以及未取代的形式。以下提供每个类型基团的优选取代基。

烷基、以及杂烷基的取代基(包括那些经常提到的如亚烷基、链烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基、以及杂环烯基)一般分别称为“烷基取代基”以及“杂烷基取代基”，并且它们可以是一个或多个基团，这些基团选自但不限于：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO₂R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)₂R’、-NR-C(NR’R”R”’)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-NRSO₂R’、-CN、以及-NO₂，数量在从0到(2m’+1)的范围内，其中m’是这种基团的碳原子的总数。R’、R”、R”’以及R””各自均优选地独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基，例如取代有1至3个卤素的芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基基团、或芳烷基基团。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当这些基团中多于一个基团存在时，这些R基团各自均独立地选为R’、R”、R”’以及R””基团。当R’和R”附着于相同的氮原子时，它们可与氮原子组合成5、6、或7元环。例如，-NR’R”旨在包括，但不局限于，1-吡咯烷基以及4-吗啉基。从以上取代基的讨论中，本领域中的技术人员会明白术语“烷基”旨在包括结合到非氢基团的基团上的碳原子的基团，例如卤烷基(如-CF₃以及-CH₂CF₃)以及酰基(如-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃、等等)。

类似于对烷基基团所说明的取代基，芳基取代基以及杂芳基取代基通常分别被称为“芳基取代基”以及“杂芳基取代基”，并且是不同的并选自，例如：卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO₂R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)₂R’、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-NRSO₂R’、-CN以及-NO₂、-R’、-N₃、-CH(Ph)₂、氟(C₁-C₄)烷氧基、以及氟(C₁-C₄)烷基，并且其数目从0到芳香环状体系上开放化合价的总数的范围内；并且其中R’、R”、R”’以及R””优选独立地选自氢、(C₁-C₈)烷基以及杂烷基、未取代的芳基以及杂芳基、(未取代的芳基)-(C₁-C₄)烷基、以及(未取代的芳基)氧基-(C₁-C₄)烷基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当这些基团中多于一个基团存在时这些R基团各自均被独立地选为R’、R”、R”’以及R””基团。

任选地，在该芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个芳基取代基可被具有式为-T-C(O)-(CRR’)_q-U-的取代基取代，其中，T和U独立为-NR-、-O-、-CRR’-或单键；且q是从0到3的整数。备选地，在该芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选被具有式-A-(CH₂)_r-B-的取代基取代，其中，A和B独立地为-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S(O)₂NR’-或单键；且r是从1到4的整数。如此形成的新环的单键之一可任选被双键代替。备选地，在该芳基或杂芳基环的相邻原子的取代基上的两个取代基可任选地被具有式为-(CRR’)_s-X-(CR”R”’)_d-的取代基取代，其中s和d独立地是从0至3的整数，并且X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)、-S(O)₂-、或-S(O)₂NR’-。优选地，取代基R、R’、R”以及R”’独立地选自氢或取代或未取代的(C₁-C₆)烷基。

此处使用的术语“二磷酸酯”包括但不局限于包含两个磷酸酯基团的磷酸的酯。术语“三磷酸酯”包括但不局限于包含三个磷酸酯基团的磷酸的酯。例如，具有二磷酸酯或三磷酸酯的特定的药物包括：

此处使用的术语“杂原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、以及硅(Si)。

符号“R”是一个通用缩写，它代表取代基，该取代基选自：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环基基团。

在以下各分部中进一步详细地说明了本发明的不同方面。

具有特定功能特性的抗CD19抗体

本公开的抗体的特征为抗体的特定的功能特征或特性。例如，该抗体特异地结合人类CD19。优选地，本公开的抗体以高亲和力结合CD19，例如以1×10^-7M或更小的K_D。本公开的抗CD19抗体优选地显示以下特征中的一种或多种：

(a)以1×10^-7M或更小的K_D与人类CD19相结合；

(b)与Raji以及Daudi B细胞肿瘤细胞相结合；

(c)被表达CD19的细胞内化；

(e)当与细胞毒素相缀合时抑制表达CD19的细胞在体内的生长。

优选地，该抗体以5×10^-8M或更小的K_D与人类CD19相结合，以1×10^-8M或更小的K_D与人类CD19相结合，以5×10^-9M或更小的K_D与人类CD19相结合，以4×10^-9M或更小的K_D与人类CD19相结合，以3×10^-9M或更小的K_D与人类CD19相结合，或以2×10^-9M或更小的K_D与人类CD19相结合，或以1×10^-9M或更小的K_D与人类CD19相结合。

本发明的抗体与CD19的结合可用一种或多种本领域已建立的技术进行评估。例如，在一个优选的实施方案中，抗体可用流式细胞术测定进行检测，其中该抗体与表达人类CD19的细胞系进行反应，例如已经被转染而能在CHO细胞表面表达CD19的CHO细胞，或表达CD19的细胞系，如OVCAR3、NCI-H226、CFPAC-1和/或KB(例如，对于一种合适的测定参见实施例3A，以及细胞系的进一步说明)。另外地或可选择地，抗体的结合，包括结合动力学(如KD值)可在BIAcore结合测定中进行测试(例如，针对合适的测定参见实施例3B)。其他适宜的结合测定包括ELISA测定，例如使用重组的CD19蛋白(例如，针对合适的测定参见实施例1)。

优选地，本公开的抗体与CD19蛋白结合的K_D为5×10^-8M或更小、与CD19蛋白结合的K_D为3×10^-8M或更小、与CD19蛋白结合的K_D为1×10^-8M或更小、与CD19蛋白结合的K_D为7×10^-9M或更小、与CD19蛋白结合的K_D为6×10^-9M或更小、或者与CD19蛋白结合的K_D为5×10^-9M或更小。该抗体对CD19的结合亲和力可以通过例如标准BIACORE分析来评估(参见例如实施例3B)。

用于通过表达CD19的细胞评估抗CD19抗体的内化作用的标准测定在本领域中是已知的(参见如实施例5中说明的Hum-ZAP以及免疫荧光测定)。用于通过抗CD19抗体评估CD19与CA125的结合及其抑制作用的标准测定在本领域中也是已知的(参见如实施例6中说明的OVCAR3细胞黏着测定)。用于评估针对表达CD19的细胞的ADCC的标准测定在本领域中也是已知的(参见如实施例7中说明的ADCC测定)。用于通过抗CD19抗体评估体内肿瘤细胞生长的抑制作用，以及其细胞毒素缀合物的标准测定在本领域中也是已知的(参见如实施例8中说明的肿瘤异种移植小鼠模型)。

本发明的抗体优选是人类单克隆抗体。另外地或备选地，该抗体可以是例如嵌合的或人源化的单克隆抗体。

单克隆抗体21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1以及46E8

本公开的优选的抗体是人类单克隆抗体21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1以及46E8，它们如在实施例16、17、18、19、20、21以及22所说明的那样进行分离并且进行结构表征。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1以及46E8的V_H氨基酸序列分别示于SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、以及7中。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1以及46E8的V_L氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13、14以及15中。

考虑到这些抗体中每一种均能结合CD19，可将V_H和V_L序列进行“混合并匹配”，以产生本公开的其他抗CD19结合分子。可以使用以上所说明以及实施例中的结合测定(如ELISA)来测试此类“混合并匹配”的抗体与CD19的结合。优选地，当V_H和V_L链被混合并匹配时，来自特定V_H/V_L对的V_H序列被结构相似的V_H序列代替。同样地，优选地来自特定V_H/V_L对的V_L序列被结构相似的V_L序列代替。

因此，一方面，本公开提供了分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括：

(a)重链可变区，包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、以及7；以及

(b)轻链可变区，包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQ IDNO：8、9、10、11、12、13、14以及15；

其中该抗体特异地结合CD19，优选人类CD19。

优选的重链及轻链组合包括：

(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：1；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：8；或者

(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：1；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：9；或者

(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：2；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：10；或者

(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：3；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：11；或者

(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：4；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：12；或者

(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：5；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：13；或者

(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：6；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：14；或者

(a)重链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：7；以及(b)轻链可变区，包含氨基酸序列SEQ ID NO：15。

另一方面，本公开提供了包括21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1以及46E8的重链和轻链CDR1、CDR2、以及CDR3或它们的组合的抗体。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1以及46E8的V_H CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21、以及22中。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1以及46E8的V_H CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28、以及29中。21D4、21D4a、47G4、34F3、3C10、5G7、13F1以及46E8的V_H CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35、以及36中。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1以及46E8的V_K CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：37、38、39、40、41、42、以及43中。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1以及46E8的V_K CDR2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49、以及50所示。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1以及46E8的V_K CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57、以及58所示。CDR区是用Kabat***描述的(Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health andHuman Services，NIH Publication No.91-3242)。

在这些抗体中每一种均能够结合CD19、并且抗原结合特异性主要由CDR1、CDR2、及CDR3区提供的条件下，V_H CDR1、CDR2、以及CDR3序列与V_k CDR1、CDR2、以及CDR3序列可以被“混合并匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以被混合并匹配，尽管每种抗体均必须包含V_HCDR1、CDR2、以及CDR3以及V_k CDR1、CDR2，以及CDR3)，以产生本公开的其他抗CD19结合分子。可以使用以上所说明及实施例中的结合测定(例如，ELISA、分析)检测CD19与此类“混合并匹配”的抗体的结合。优选地，当V_H CDR序列被混合并匹配时，来自特定V_H序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被结构上相似的一种或多种CDR序列代替。同样，当V_k CDR被混合并且匹配时，来自特定V_k序列的CDR1、CDR2、和/或CDR3序列被结构上相似的一个或多个CDR序列代替。对于本领域普通技术人员非常清楚的是，通过用来自在此公开的单克隆抗体21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1以及46E8的CDR序列的结构上类似的序列代替一个或多个V_H和/或V_L CDR区序列，可以产生新颖的V_H和V_L序列。

因此，另一方面，本公开提供了一种分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包含：

(a)重链可变区CDR1，包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQID NO：16、17、18、19、20、21、以及22；

(b)重链可变区CDR2，包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQID NO：23、24、25、26、27、28、以及29；

(c)重链可变区CDR3，包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQID NO：30、31、32、33、34、35、以及36；

(d)轻链可变区CDR1，包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQID NO：37、38、39、40、41、42、以及43；

(e)轻链可变区CDR2，包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQID NO：44、45、46、47、48、49以及50；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57以及58；

其中该抗体特异地结合CD19，优选人类CD19。

在一个优选的实施方案中，该抗体包含：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：16；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：23；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：30；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：37；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：44；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：51。

在另一个优选的实施方案中，该抗体包含：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：16；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：23；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：30；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：37；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：44；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：52。

在另一个优选的实施方案中，该抗体包含：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：17；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：24；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：31；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：38；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：45；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：53。

在另一个优选的实施方案中，该抗体包含：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：18；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：25；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：32；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：39；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：46；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：54。

在另一个优选的实施方案中，该抗体包含：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：19；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：26；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：33；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：40；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：47；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：55。

在另一个优选的实施方案中，该抗体包含：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：20；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：27；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：34；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：41；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：48；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：56。

在另一个优选的实施方案中，该抗体包含：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：21；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：28；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：35；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：42；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：49；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：57。

在另一个优选的实施方案中，该抗体包含：

(a)重链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：22；

(b)重链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：29；

(c)重链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：36；

(d)轻链可变区CDR1，包含SEQ ID NO：43；

(e)轻链可变区CDR2，包含SEQ ID NO：50；以及

(f)轻链可变区CDR3，包含SEQ ID NO：58。

在本领域中所熟知的是，CDR3结构域独立于一个或多个CDR1和/或CDR2结构域，可以单独决定抗体对于同族抗原的结合特异性，并且可预期地产生多种抗体，这些抗体具有基于共同的CDR3序列的相同的结合特异性。参见，例如Klimka et al.，British J.of Cancer 83(2)：252-260(2000)(描述了仅使用鼠类抗CD30抗体Ki-4的重链可变结构域CDR3来产生人源化抗CD30抗体)；Beiboer et al.，J. Mol.Biol.296：833-849(2000)(描述了仅使用亲代鼠类MOC-31抗EGP-2抗体的重链CDR3序列的重组上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗体)；Rader et al.，Proc. Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：8910-8915(1998)(描述了使用鼠类抗整联蛋白α_vβ₃抗体LM609的重链及轻链可变CDR3结构域的一组人源化抗整联蛋白α_vβ₃抗体，其中每一种成员抗体在CDR3结构域之外均包含不同的序列，并且与亲代鼠类抗体一样结合相同的表位，并且亲和力与亲代鼠类抗体一样高或比亲代鼠类抗体更高)；Barbas et al.，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)(披露了CDR3结构域对抗原结合的贡献度最大)；Barbas et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)(描述了将三个针对人类胎盘DNA的Fab(SI-1、SI-40、以及SI-32)的重链CDR3序列移植到抗破伤风类毒素Fab的重链上，由此替换现有的重链CDR3，并证实仅有CDR3结构域就能够赋予结合特异性)；以及Ditzel et al.，J.Immunol.157：739-749(1996)(描述了移植研究，其中仅将亲代多特异性Fab LNA3的重链CDR3移植到单特异性IgG破伤风类毒素结合的Fab p313抗体的重链上，就足以保留亲代Fab的结合特异性)；Berezov et al.，BIAjournal 8：Scientific Review 8(2001)(说明了基于抗HER2单克隆抗体的CDR3的肽模拟物)；Igarashict al.,J.Biochem(Tokyo)117：452-7(1995)(说明了对应于抗磷脂酰丝氨酸抗体的CDR3结构域的一种12个氨基酸的合成多肽)；Bourgeois et al.，J.Virol 72：807-10(1998)(显示了衍生自抗呼吸道合胞病毒(RSV)抗体的重链CDR3结构域的一个单肽能够在体外中和该病毒)；Levi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：4374-8(1993)(说明了基于鼠类抗HIV抗体的重链CDR3结构域的一种肽)；Polymenis和Stoller，J.Immunol.152：5218-5329(1994)(说明了通过移植Z-DNA结合抗体的重链CDR3区使得能够结合scFv)；以及Xu和Davis，Immunity 13：37-45(2000)(说明了重链CDR3的多样性足以使得其他部分相同的IgM分子区分多种半抗原以及蛋白质抗原)。还见于美国专利号6,951,646；6,914,128；6,090,382；6,818,216；6,156,313；6,827,925；5,833,943；5,762,905；以及5,760,185，说明了由单一CDR结构域定义的已获得专利的抗体。这些参考文献中每一篇均完整引入本文作为参考。

因此，本公开提供了单克隆抗体，其包含来自衍生自人类或非人类动物的抗体的一个或多个重和/或轻链CDR3结构域，其中该单克隆抗体能够特异性结合CD19。在某些方面，本公开提供了包括来自非人类抗体(例如小鼠或大鼠抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的单克隆抗体，其中该单克隆抗体能够特异地性结合CD19。在一些实施方案中，包括来自非人类抗体的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域的此类创造性的抗体与相应的亲代非人类抗体相比：(a)能够与其竞争结合；(b)保留其功能特性；(c)与其结合至相同的表位；和/或(d)与其具有相似的结合亲和力。

在其他方面，本公开提供了单克隆抗体，其包含来自人类抗体(例如，获自非人类动物的一种人类抗体)的一个或多个重和/或轻链CDR3结构域，其中该人类抗体能够特异性结合CD19。在其他方面，本公开提供了多种单克隆抗体，其包括来自第一人类抗体(例如，从非人类的动物获得的人类抗体)的一个或多个重链和/或轻链CDR3结构域，其中该第一人类抗体能够特异性结合CD19，并且其中来自该第一人类抗体的CDR3功能域替换了人类抗体中缺乏CD19结合特异性的CDR3结构域，以产生能够特异性结合CD19的第二人类抗体。在一些实施方案中，包括来自第一人类抗体的一种或多种重链和/或轻链CDR3结构域的这种发明的抗体对相应的亲代第一人类抗体而言：(a)能够与其竞争结合；(b)保留其功能特征；(c)与其结合至相同的表位；和/或(d)与其具有相似的结合亲和力。

具有特定种系序列的抗体

在某些实施方案中，本公开的抗体包括来自特定的种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定的种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。

例如，在一个优选的实施方案中，本公开提供了一种分离的单克隆抗体、或它的抗原结合部分，包含作为人类V_H 5-51基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体特异地结合CD19。在另一个优选的实施方案中，本公开提供了一种分离的单克隆抗体、或它的抗原结合部分，包含作为人类V_H 1-69基因的产物或衍生自该基因的重链可变区，其中该抗体特异地结合CD19。在另一个优选的实施方案中，本公开提供了一种分离的单克隆抗体、或它的抗原结合部分，包含作为人类V_K L18基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异地结合CD19。在另一个优选的实施方案中，本公开提供了一种分离的单克隆抗体、或它的抗原结合部分，包含作为人类V_K A27基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异地结合CD19。在另一个优选的实施方案中，本公开提供了一种分离的单克隆抗体、或它的抗原结合部分，包含作为人类V_KL15基因的产物或衍生自该基因的轻链可变区，其中该抗体特异性结合CD19。在另一个优选的实施方案中，本公开提供了一种分离的单克隆抗体、或它的抗原结合部分，其中该抗体：

(a)包含重链可变区，该重链可变区是人类V_H 5-51或1-69基因的产物或衍生自该基因(这些基因所编码的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：74以及75中给出)；

(b)包含轻链可变区，该轻链可变区是人类基因V_K L18、V_K A27、或V_K L15基因的产物或衍生自该基因(这些基因所编码的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：76、77、以及78中给出)；并且

(c)特异地结合CD19，优选人类CD19。

此类抗体也可能拥有以上详细说明的一个或多个功能特性，例如结合人类CD19的高亲和力、被表达CD19的细胞内化、介导针对表达CD19的细胞的ADCC的能力、和/或当与一种细胞毒素相缀合时在体内抑制表达CD19的肿瘤细胞的肿瘤生长的能力。

分别具有V_H 5-51以及V_k L18的V_H以及V_k的抗体的实例是21D4、21D4a、27F3、5G7、13F1以及46E8。分别具有V_H 1-69以及V_K A27的V_H以及V_K的抗体的一个实例是47G4。分别具有V_H 1-69以及V_K L15的V_H以及V_K的抗体的一个实例是3C10。

如此处所用，如果一种人类抗体的可变区由使用人类种系免疫球蛋白基因的***获得，则所述人类抗体包括的重链或轻链可变区是特定种系序列的“产物”或者由其“衍生”。这种***包括用目的抗原对携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫，或者用目的抗原对在噬菌体上展示的人类免疫球蛋白基因文库进行筛选。通过对人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并选择在序列上最接近(即最大百分数同一性)人类抗体的序列的人类种系免疫球蛋白序列，“产自”或“源自”人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体就可以被鉴定为是此类抗体。一种“产自”或“源自”特定的人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体，与该种系序列相比，可以含有氨基酸差异，因为例如，自然产生的体细胞突变或故意引入定点突变。然而，经选择的人类抗体典型地与由人类种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90％的同一性，而且与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠类种系序列)进行比较时，含有将所述人类抗体鉴定为人源的氨基酸残基。在某些情况下，人类抗体与该种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列在氨基酸序列上可以具有至少95％、或甚至至少96％、97％、98％、或99％的同一性。典型地，与由人类种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列相比，来自特定的人类种系序列的人类抗体将展示不超过10个氨基酸差异。在某些情况下，与由该种系免疫球蛋白基因所编码的氨基酸序列相比，所述人类抗体可以展示不超过5个，或甚至不超过4个、3个、2个，或1个氨基酸差异。

同源抗体

在又一个实施方案中，本公开的抗体包括一些重链可变区及轻链可变区，这些可变区含有与本文所述的优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中，该抗体保留本公开的抗-CD19抗体的所希望的功能特性。

例如，本公开提供了一种分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括重链可变区及轻链可变区，其中：

(a)该重链可变区包括氨基酸序列，它与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、以及7的氨基酸序列具有至少80％的同源性；

(b)该轻链可变区包括氨基酸序列，它与选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13、14以及15的氨基酸序列具有至少80％的同源性；

(c)该抗体以1×10^-7M或更小的K_D与人类CD19相结合；

(d)与Raji以及Daudi B细胞肿瘤细胞相结合。

另外地或者备选地，该抗体可具有以上讨论的以下功能特性中的一个或多个，例如结合人类CD19的高亲和力、被表达CD19的细胞内化、介导针对表达CD19的细胞的ADCC的能力、和/或当与一种细胞毒素相缀合时在体内抑制表达CD19的肿瘤细胞的肿瘤生长的能力。

在不同的实施方案中，该抗体可以是(例如)人类抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。

在其他实施方案中，V_H和/或V_L氨基酸序列可以与以上给出的序列具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的同源性。具有与以上给出的序列的V_H与V_K区具有高度同源性(即，80％或更大)的V_H与V_L区的抗体可以通过以下方式来获得：对编码SEQ ID NO：59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72或73的核酸分子进行诱变(例如，位点定向诱变或PCR介导的诱变)，然后用此处所述的功能测定检测所编码的、被改变的抗体所保留的功能(即以上(c)到(d)所给出的功能)。

如在此所使用，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等同于两个序列之间的同一性百分数。在这两个序列之间的同一性百分数是这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置数/位置总数×100)，考虑到空位(gap)的数目，及每个空位的长度，它们需要被引入用于这两条序列的最优比对。正如在以下的非限制性实例中所述，使用数学算法可以完成两条序列之间的序列比较以及同一性百分数的测定。

使用E.Meyers及W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17(1988)的算法可以确定在两条氨基酸序列之间的同一性百分数，该算法已经结合至ALIGN程序(版本2.0)中，该算法使用了PAM120权重残基表(weightresidue table)、空位长度罚分(gap length penalty)12以及空位罚分4。此外，使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))算法能确定在两条氨基酸序列之间的同一性百分数，该算法已结合至GCG软件包的GAP程序中(可在http://www.gcg.com获得)，该算法使用了Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，以及空位权重16、14、12、10、8、6，或4以及长度权重1、2、3、4、5，或6。

额外地或者可替代地，本公开的蛋白质序列可进一步用作“查询序列”，对公共数据库进行检索，例如鉴定相关序列。这种检索可采用Altschul，etal.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程序(版本2.0)来进行。通过XBLAST程序，记分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质检索，以获得与本公开的抗体分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的的空位比对，可利用如Altschul et al.((1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402所述的Gapped BLAST。当利用BLAST及Gapped BLAST程序时，可使用各自的程序(例如XBLAST与NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

具有保守性修饰的抗体

在某些实施方案中，本公开的抗体包含含有CDR1、CDR2、以及CDR3序列的重链可变区以及含有CDR1、CDR2、以及CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个序列包括特定的氨基酸序列，这些氨基酸序列基于已知的抗CD19抗体、或它们的保守性修饰，并且其中这些抗体保留了本公开的抗CD19抗体的所希望的功能特性。在本领域中所理解的是，可以进行某些保守性序列修饰，这些保守性序列修饰并不去除抗原结合。见，例如，Brummell et al.(1993)Biochem 32：1180-8(说明了在对沙门氏菌特异的抗体的CDR3重链结构域的突变分析)；de Wildt etal.(1997)Prot.Eng.10：835-41(说明了抗UA1抗体的突变研究)；Komissarov et al.(1997)J.Biol.Chem.272：26864-26870(显示了在HCDR3中间的突变导致被消除或减低的亲和力)；Hall et al.(1992)J.Immunol.149：1605-12(说明在CDR3区中的单一氨基酸改变消除了结合活性)；Kelley和O’Connell(1993)Biochem.32：6862-35(说明了酪氨酸残基在抗原结合中的贡献)；Adib-Conquy et al.(1998)Int.Immunol.10：341-6(说明了疏水性在结合中的作用)以及Beers et al.(2000)Clin.Can.Res.6：2835-43(说明了HCDR3氨基酸突变体)。因此，本公开提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括含有CDR1、CDR2、以及CDR3序列的重链可变区以及含有CDR1、CDR2、以及CDR3序列的轻链可变区，其中：

(a)该重链可变区CDR3序列包括氨基酸序列，该氨基酸序列选自：氨基酸序列SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35以及36，以及它们的保守性修饰；

(b)该轻链可变区CDR3序列包括氨基酸序列，该氨基酸序列选自：氨基酸序列SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57以及58，以及它们的保守性修饰的氨基酸序列；

(c)该抗体以1×10^-7M或更小的K_D与人类CD19相结合；

(d)与Raji以及Daudi B细胞肿瘤细胞相结合。

另外地或者备选地，该抗体可能拥有以上说明的以下功能特性中的一个或多个，例如结合人类CD19的高亲和力、被表达CD19的细胞内化、介导针对表达CD19的细胞的ADCC的能力、和/或当与一种细胞毒素相缀合时在体内抑制表达CD19的肿瘤细胞的肿瘤生长的能力。

在一个优选的实施方案中，该重链可变区CDR2序列包括一条氨基酸序列，该氨基酸序列选自：氨基酸序列SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28以及29，以及它们的保守性修饰；并且该轻链可变区CDR2序列包括一条氨基酸序列，该氨基酸序列选自：氨基酸序列SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49、以及50，以及它们的保守性修饰。在另一个优选的实施方案中，该重链可变区CDR1序列包括一条氨基酸序列，该氨基酸序列选自：氨基酸序列SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21以及22，以及它们的保守性修饰；并且该轻链可变区CDR1序列包括一条氨基酸序列，该氨基酸序列选自：氨基酸序列SEQ ID NO：37、38、39、40、41、42以及43，以及它们的保守性修饰。

在不同的实施方案中，该抗体可以是例如人类抗体、人源化抗体、或嵌合抗体。

如在此所使用，术语“保守性序列修饰”意指不会显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这种保守性修饰包括氨基酸的置换、添加、以及缺失。通过本领域已知的标准技术(例如位点定向诱变及PCR介导的诱变)可将修饰引入本公开的抗体中。保守性氨基酸置换是指以下的置换，其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。已经在本领域中定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本公开的抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且使用此处说明的功能测定对已改变的抗体的保留功能(即，在以上(c)至(d)中给出的功能)进行测试。

与本公开的抗CD19抗体结合至相同表位的抗体

在另一个实施方案中，本公开提供了多种抗体，它们结合至本公开的抗CD19单克隆抗体中的任何抗体所识别的人类CD19上的表位上(即，有能力与本公开的单克隆抗体中的任一抗体进行交叉竞争而结合至CD19上的抗体)。在优选的实施方案中，用于交叉竞争研究的参照抗体可以是单克隆抗体21D4(具有分别示于SEQ ID NO：1和8的V_H和V_L序列)、或单克隆抗体21D4a(具有分别示于SEQ ID NO：1和9的V_H和V_L序列)、或单克隆抗体47G4(具有分别示于SEQ ID NO：2和10的V_H和V_L序列)、或单克隆抗体27F3(具有分别示于SEQ ID NO：3和11的V_H和V_L序列)、或单克隆抗体3C10(具有分别示于SEQ ID NO：4和12的V_H和V_L序列)、或单克隆抗体5G7(具有分别示于SEQ ID NO：5和13的V_H和V_L序列)、或单克隆抗体13F1(具有分别示于SEQ ID NO：6和14的V_H和V_L序列)、或单克隆抗体46E8(具有分别示于SEQ ID NO：7和15的V_H和V_L序列)。此类交叉竞争抗体可以在标准的CD19结合测定中基于它们与21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8进行交叉竞争的能力而被鉴别。可使用标准ELISA测定，其中将重组的人类CD19蛋白固定在板上，这些抗体中有一种用荧光进行标记，并且评价了未标记的抗体进行竞争使被标记的抗体脱离结合(off the binding)的能力。另外地或备选地，BIAcore分析也可以用于评价抗体的交叉竞争的能力。例如，如进一步在实施例3中所说明的，使用BIAcore的表位封闭(epitope binning)实验证明了3C10、6A4以及7B1抗体识别并结合CD19上不同的表位。一种试验抗体抑制(例如)21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8结合人类CD19的能力证明该试验抗体能与21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8竞争而与人类CD19相结合，并且因此与21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8结合至人类CD19上的相同的表位。在一个优选的实施方案中，与21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8结合至人类CD19上的相同表位的抗体是人类单克隆抗体。正如在该实例中所说明的，可以对此类人类单克隆抗体进行制备并分离。

工程化并且经修饰的抗体

通过以下方式可以进一步制备本发明的抗体：可以使用具有一个或多个已知的CD19抗体V_H和/或V_L序列的抗体作为起始材料，对经修饰的抗体进行工程化，这种经修饰的抗体与起始抗体相比可能具有经改变的特性。通过在一个或两个可变区(即V_H和/或V_L)中，例如在一个或多个CDR区内和/或在一个或多个构架区内中修饰一个或多个氨基酸，可以对抗体进行工程化。额外地或备选地，通过在一个或多个恒定区中修饰残基，可以对抗体进行工程化，例如以改变该抗体的一种或多种效应功能。

在某些实施方案中，可以使用CDR移植以对抗体的可变区进行工程化。抗体与靶抗原主要通过位于六个重链及轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基进行相互作用。因此，CDR中的氨基酸序列在各个抗体之间比在CDR之外的序列更具有多样性。因为CDR序列负责大部分抗体-抗原相互作用，所以通过构建表达载体，表达模拟特定自然发生的抗体特性的重组抗体是可能的，所述表达载体包括来自自然发生的抗体的CDR序列，其被移植至来自具有不同特性的不同抗体的构架序列(参见，例如Riechmann，L.et al.(1998)Nature 332：323-327；Jones，P.et al.(1986)Nature 321：522-525；Queen，C.et al(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539，以及Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762及6,180,370)。

因此，本公开的另一个实施方案涉及一种分离的单克隆抗体、或其抗原结合部分，该单克隆抗体、或其抗原结合部分包括含有CDR1、CDR2、以及CDR3序列的重链可变区，该CDR1、CDR2、以及CDR3序列包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列分别选自：SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21以及22，SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28以及29，以及SEQID NO：30、31、32、33、34、35以及36；以及含有CDR1、CDR2、以及CDR3序列的轻链可变区，该CDR1、CDR2、以及CDR3序列包括一个氨基酸序列，该序列分别选自：SEQ ID NO：37、38、39、40、41、42以及43，SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49以及50，以及SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57以及58。因此，此类抗体含有单克隆抗体21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8的V_H和V_L的CDR序列，但是可能包含与这些抗体不同的构架序列。

这种构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或已公开的参考文献获得。例如，人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人类种系序列数据库中找到(在互联网http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase中获得)，并且在以下文献中找到：Kabat，E.A.，et al.(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242；Tomlinson，I.M.，et al.(1992)″TheRepertoire of Human Germline V_H Sequences Reveals about Fifty Groupsof V_H Segments with Different Hypervariable Loops″J.Mol.Biol.227：776-798；以及Cox，J.P.L.et al.(1994)″A Directory of HumanGerm-line V_H Segments Reveals a Strong Bias in their Usage″Eur.J.Immunol.24：827-836；这些文献的每一篇内容均明确地并入本文作为参考。作为另一个实例，人类重链及轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中找到。例如，在HCo7 HuMAb小鼠中发现的以下重链种系序列在所附的Genbank登录号中可获得：1-69(NG_0010109、NT_024637、以及BC070333)、3-33(NG_0010109以及NT_024637)、以及3-7(NG_0010109以及NT_024637)。作为另一个实例，在HCo12HuMAb小鼠中发现的以下的重链种系序列在所附的Genbank登录号中可获得：1-69(NG_0010109、NT_024637、以及BC070333)、5-51(NG_0010109以及NT_024637)、4-34(NG_0010109以及NT_024637)、3-30.3(CAJ556644)、以及3-23(AJ406678)。然而人类重链和轻链种系序列的另一个来源为人类免疫球蛋白基因数据库，该数据库可获自IMGT(http://imgt.cines.fr)。

用序列相似性检索方法中的一种方法(被称为Gapped BLAST)将抗体蛋白序列与汇编的蛋白数据库进行比较(Altschul et al.(1997)NucleicAcids Research 25：3389-3402)，这种方法对于本领域的技术人员而言是熟知的。BLAST是一种启发式算法，因为在抗体序列与数据库序列之间的在统计学上显著的比对可能包含比对字符的高得分片段对(HSP)。通过扩展或修正不能提高片段对分数的片段对被称为命中项(hit)。简言之，翻译VBASE来源的核苷酸序列(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)，并且保留FR1至FR3构架区之间的区域(包括FR1至FR3构架区)。这些数据库序列具有的平均长度为98个残基。除去重复序列(它们是蛋白质全部长度上的精确匹配)。用于蛋白质的BLAST搜索，使用带有默认值的程序blastp、除低复杂性过滤(已被关闭)以外的标准参数，以及BLOSUM62的置换矩阵，针对实现序列相配的前5个命中项进行过滤。在全部六个框架中翻译核苷酸序列，并且在数据库序列的匹配片段中不具有终止密码子的框架被视为潜在的命中项。进而使用BLAST程序tblastx对此进行确认。该程序翻译了全部六个框架中的抗体序列，并且将这些翻译与在全部六个框架中被动态翻译的VBASE核苷酸序列进行比较。可以如以上说明使用类似于VBASE的方法对其他人类种系序列数据库(例如可从IMGT(http://imgt.cines.fr)获得的数据库)进行检索。

同一性是在抗体序列与蛋白质数据库之间序列的全长上精确的氨基酸匹配。这些阳性项(同一性+取代匹配)不是相同的，而是由BLOSUM62置换矩阵所引导的氨基酸置换。如果抗体序列以相同的同一性匹配数据库序列中的两条序列，则具有最大阳性的命中项将被判定为匹配的序列命中项。

可用于本公开的抗体的优选的构架序列是与所选择的本公开的抗体所用的构架序列在结构上类似的那些构架序列，例如类似于本公开的优选的单克隆抗体所使用的以下构架序列：V_H 5-51构架序列(SEQ ID NO：74)和/或V_H 1-69构架序列(SEQ ID NO：75)和/或V_K L18构架序列(SEQ IDNO：76)和/或V_K A27构架序列(SEQ ID NO：77)和/或V_K L15构架序列(SEQ ID NO：78)。这些V_H CDR1、CDR2、和CDR3序列，以及V_K CDR1、CDR2、和CDR3序列可以被移植至多个构架区上，这些构架区具有与从中衍生出该构架序列的种系免疫球蛋白基因中所发现的序列相同的序列，或者这些CDR序列可以被移植至多个构架区上，这些构架区与这些种系序列相比含有一个或多个突变。例如，已发现在某些情况下对构架区内的残基进行突变以保持或增强该抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762以及6,180,370)。

另一种类型的可变区修饰是在V_H和/或V_K CDR1、CDR2和/或CDR3区中对氨基酸残基进行突变，由此改善目的抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定向诱变或PCR介导的诱变来引入一种或多种突变，并且对于抗体的结合能力、或其他目的功能特性的作用可以在体内或体外试验中进行评估，如本文所述并在实施例中所提供。优选地引入保守性修饰(如上所述)。这些突变可以是氨基酸置换、添加、或缺失，但优选是置换。此外，典型地在一个CDR区域中改变不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。

因此，在另一个实施方案中，本公开提供了分离的抗CD19单克隆抗体、或其抗原结合部分，包括重链可变区，该重链可变区包含：(a)V_H CDR1区，包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO：16、17、18、1 9、20、21以及22，或者与SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21以及22相比具有一个、两个、三个、四个、或五个氨基酸置换、缺失、或添加的氨基酸序列；(b)V_H CDR2区，包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28以及29，或者与SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28以及29相比具有一个、两个、三个、四个、或五个氨基酸置换、缺失、或添加的氨基酸序列；(c)V_H CDR3区，包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35以及36，或者与SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35以及36相比具有一个、两个、三个、四个、或五个氨基酸置换、缺失、或添加的氨基酸序列；(d)V_K CDR1区，包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQ IDNO：37、38、39、40、41、42以及43，或者与SEQ ID NO：37、38、39、40、41、42以及43相比具有一个、两个、三个、四个、或五个氨基酸置换、缺失、或添加的氨基酸序列；(e)V_K CDR2区，包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49以及50，或者与SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49以及50相比具有一个、两个、三个、四个、或五个氨基酸置换、缺失、或添加的一个氨基酸序列；以及(f)V_K CDR3区，包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列选自：SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57以及58，或者与SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57以及58相比具有一个、两个、三个、四个、或五个氨基酸置换、缺失、或添加的氨基酸序列。

本公开的工程化抗体包括以下抗体：其中在V_H和/或V_K内已经对构架残基进行了修饰，例如改进了抗体的特性。典型地，对这种构架进行修饰，以降低抗体的免疫原性。例如，一个方法是将一个或多个构架残基“回复突变”成为相应的种系序列。更具体地说，已经经历了体细胞突变的抗体可能包含与从中衍生出该抗体的种系序列不同的构架残基。这些残基可以通过将该抗体构架序列与从中衍生出该抗体的种系序列进行比较而被鉴定。

例如，在以下表1中显示在抗PD-1抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3以及5F4的构架区内的许多与重链亲代种系序列不同的氨基酸改变。为了将构架区序列中氨基酸残基中的一个或多个氨基酸残基返回至它们的种系构型，通过例如定点诱变或PCR介导的诱变，可以将体细胞突变“回复突变”为该种系序列。

表1.对来自重链种系构型的抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3以及5F4的修饰

抗CD19抗体氨基酸位置抗体的氨基酸种系构型的原始氨基酸

21D4 30 S T

77 R S

21D4a 30 S T

77 R S

47G4 24 D A

3C10 77 N S

88 A S

5G7 19 N K

77 N S

13F1 19 Q K

28 T S

85 G S

46E8 19 Q K

28 T S

85 G S

另一种类型的构架修饰涉及对构架区内一个或多个残基，或甚至对一个或多个CDR区域内的一个或多个残基进行突变，以去除T细胞表位，由此降低该抗体的潜在免疫原性。这一方法也被称为“去免疫原化”，并且在Carr等人的美国专利公开号20030153043中有进一步的详细说明。

除了在构架区或CDR区域内进行的修饰之外，或作为其替代，还可以对本公开的抗体进行工程化，以在Fc区域内也包括一些修饰，典型地改变该抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体固定(complementfixation)、Fc受体结合、和/或依赖抗原的细胞毒性作用。此外，本公开的抗体可以被化学修饰(例如，可以将一个或多个化学物部分附着至该抗体)，或被修饰以改变其糖基化作用，再次以便改变该抗体的一个或多个功能特性。以下对这些实施方案中的每一个均进行进一步详细的说明。Fc区中残基的编号是Kabat的EU索引编号。

在一个实施方案中，对CH1的铰链区进行修饰，使得铰链区中的半胱氨酸残基的个数发生变化(例如，增加或减少)。在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步说明了该方法。CH1的铰链区中的半胱氨酸残基的数目发生变化，例如便于组装轻链及重链或者增大或减小该抗体的稳定性。

在另一个实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变以减小该抗体的生物半衰期。更确切地说，将一个或多个氨基酸突变引入Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区域，使得相对于天然Fc铰链域的葡萄球菌A蛋白(Staphylococal protein A，SpA)的结合而言，该抗体减弱了SpA的结合。Ward等人的美国专利号6,165,745更详细地说明了这一方法。

在另一个实施方案中，对该抗体进行修饰以增大其生物半衰期。不同的方法是可能的。例如，如Ward的美国专利号6,277,375所述，引入以下突变中的一个或多个突变：T252L、T254S、T256F。备选地，为增加生物半衰期，该抗体可以在CH1或CL区域中发生变化以包括从IgG的Fc区域的CH2结构域的两个环处获得的补救受体(salvage receptor)结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046及6,121,022中所述。

在另外的其他的实施方案中，通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基以改变Fc区，从而改变该抗体的一种或多种效应功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320及322的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基所替换，使得抗体对于效应物配体而言具有已改变的亲和力，但仍保留该亲本抗体的抗原结合能力。例如，亲和力被改变的效应物配体可以是Fc受体或补体的C1成分。Winter等人的美国专利号5,624,821及5,648,260进一步详细说明了这一方法。

在另一个实例中，选自氨基酸残基329、331及322的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基所替换，使得该抗体具有已改变的C1q结合能力和/或减低的或消除的依赖补体的细胞毒性(CDC)。Idusogie等人的美国专利号6,194,551进一步详细说明了这一方法。

在另一个实例中，改变氨基酸位置2316、17、18、19、20、21以及2239中的一个或多个氨基酸，由此改变抗体固定补体的能力。Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中进一步详细说明了这一方法。

在另一个实例中，为了提高该抗体介导抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)的能力和/或提高该抗体对Fcγ受体的亲和性，通过在下列位置修饰一个或多个氨基酸，对Fc区域进行了修饰：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。Presta的PCT公开文件WO 00/42072中进一步详细地说明了这一方法。此外，在人类IgG1上已做出针对FcγRI、FcγRII、FcγRIII及FcRn的结合位点的图谱，并说明了具有改善的结合的变体(参见Shields，R.L.et al.(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。在位置256、290、298、333、334及339具有的特定突变显示出改善对FcγRIII的结合。另外，下列组合突变体显示出改善FcγRIII的结合：T256A/S298A，S298A/E333A，S298A/K224A及S298A/E333A/K334A。

在再一个实施方案中，如美国临时申请号系列号60/957,271(其全文并入本文作为参考)所说明，通过引入半胱氨酸残基来修饰本发明的抗体的C末端。此类修饰包括但不限于在全长重链序列的C端处或在其附近替换现有的氨基酸残基，以及将包含半胱氨酸的延长序列(extension)引入至全长重链序列的C端。在优选的实施方案中，包含半胱氨酸的延长序列包括序列丙氨酸-丙氨酸-半胱氨酸(从N端至C端)。

在优选的实施方案中，此类C末端的半胱氨酸修饰的存在为配偶体分子的缀合提供了位点，该配偶体分子为例如治疗剂或标记物分子。特别是，由于C末端半胱氨酸修饰而出现的反应活性硫醇基团可采用以下详细说明的二硫化物连接体与配偶体分子相缀合。抗体与配偶体分子以这一方式的缀合使得可以增强对所附着的特异的位点的控制。此外，通过在C末端或在其附近引入该附着点，优化了缀合，使得它减少或者消除对该抗体的功能特性的干扰，并且使得缀合物制备物的简化分析以及质量控制成为可能。

在再一个实施方案中，对抗体的糖基化进行了修饰。例如，可以制备去糖基化的抗体(即，该抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化，以(例如)增加该抗体对抗原的亲和力。例如，通过在该抗体序列中改变一个或多个糖基化的位点可以实现此类碳水化合物修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸的置换，这导致去除一个或多个可变区构架的糖基化位点，由此在该位点处消除糖基化作用。这种去糖基化作用可提高该抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等人的美国专利号5,714,350以及6,350,861中有更详细的说明。以下文献还更详细地说明了另外一些改变糖基化作用的方法：Hanai等人的美国专利7,214,775、Presta的美国专利号6,737,056、Presta的美国专利公开号20070020260、Dickey等人的PCT公开号WO/2007/084926、Zhu等人的PCT公开号WO/2006/089294，以及Ravetch等人的PCT公开号WO/2007/055916，以上文献的每一篇其全文并入本文作为参考。

额外地或备选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有减少的岩藻糖残基含量的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证实这种已改变的糖基化模式可以提高一些抗体的ADCC能力。例如，通过在具有被改变的糖基化机器的宿主细胞中表达该抗体可以实现这种碳水化合物修饰。具有被改变的糖基化机器的细胞在本领域中描述，并可以用作表达本公开的重组抗体的宿主细胞，由此产生具有被改变的糖基化作用的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705、及Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1，6)岩藻糖基转移酶)，使得在Ms704、Ms705，及Ms709细胞系中表达的抗体在它们的碳水化合物上缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705以及Ms709 FUT8^-/-细胞系是通过使用两种替换载体对CHO/DG44细胞中的FUT8基因进行靶向破坏之后产生的(参见Yamane等人的美国专利公开号20040110704及Yamane-Ohnuki et al.(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。作为另一个实例，Hanai等人的EP 1,176,195描述了一种带有在功能上被破坏的FUT8基因的细胞系(该基因编码岩藻糖基转移酶)，使得通过减少或消除α1，6键相关的酶，在这种细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。Hanai等人也描述了多种细胞系，这些细胞系具有用于将岩藻糖添加至N-乙酰葡糖胺的低酶活性(该N-乙酰葡糖胺结合至该抗体的Fc区域)，或者不具有该酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。Presta的PCT公开号WO 03/035835描述了一种变异CHO细胞系Lec13细胞，其将岩藻糖连接至与Asn(297)相连的碳水化合物的能力降低，这也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(还可参见Shields，R.L.et al.(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT公开文件WO 99/54342中描述了经过工程化而表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在这种经过工程化的细胞系中表达的抗体具有增多的二等分GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性提高(还可参见Umana et al.(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。作为替代，可以使用岩藻糖苷酶切去该抗体的岩藻糖残基。例如，该岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体上除去岩藻糖残基(Tarentino，A.L.et al.(1975)Biochem.14：5516-23)。

额外地或备选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，其中该改变涉及该抗体的唾液酸化水平。此类改变在Dickey等人的PCT公开号WO/2007/084926以及Ravetch等人的PCT公开号WO/2007/055916中有说明，将这两篇文献完整并入本文作为参考。例如，可以采用使用唾液酸酶的酶反应，例如产脲节杆菌唾液酸酶(Arthrobacter ureafacenssialidase)。这一反应的条件通常说明于美国专利号5,831,077中，其全部内容并入本文作为参考。适宜的酶的其他非限制性实例是神经氨酸酶以及N-糖苷酶F，分别如在Schloemer et al.J.Virology，15(4)，882-893(1975)以及Leibiger et al.Biochem J.，338，529-538(1999)中说明。去唾液酸化的抗体可以通过使用亲和层析被进一步纯化。备选地，可以采用多种方法提高唾液酸化的水平，例如采用唾液酸转移酶。这种反应的条件通常说明于Basset et al.，Scandinavian Journal of Immunology，51(3)，307-311(2000)中。

由本公开在此所考虑的抗体的另一种修饰是聚乙二醇化作用(pegylation)。对抗体进行聚乙二醇化以便(例如)增加抗体的生物学半衰期(例如血清半衰期)。为了对抗体进行聚乙二醇化，典型地在使一个或多个聚乙二醇(PEG)基团附着至该抗体或抗体片段的条件下，将该抗体，或其片段与PEG(例如PEG的反应活性酯或醛衍生物)进行反应。优选地，使用反应活性PEG分子(或一种类似的反应性的水溶性聚合物)，通过酰基化反应或烷基化反应进行聚乙二醇化。在此使用的术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生其他蛋白的PEG的任何形式，例如单(C1-C10)烷氧基聚乙二醇或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，有待聚乙二醇化的抗体是去糖基化的抗体。对蛋白进行聚乙二醇化的方法在本领域中是已知的，并可以被应用于本公开的抗体。参见，例如Nishimura等人的EP 0 154 316及Ishikawa等人的EP 0 401 384。

抗体片段和抗体模拟物

本发明不限于常规的抗体，并可通过抗体片段以及抗体模拟物的使用得以实施。如下面的详细说明，多种抗体片段以及抗体模拟物技术现在已经被开发出来并且已在本领域广为人知。虽然这些技术中有许多技术(如结构域抗体、纳米抗体、以及UniBody)使用了多种常规抗体结构的片段、或这些常规抗体结构的其他修饰，但是还存在着多种可替代的技术，如亲和体、设计的锚蛋白重复序列蛋白、抗运载蛋白、高亲和力多聚体、以及万能抗体，它们采用了多种结合结构，这些结构(尽管它们模拟常规的抗体结合)产生于不同的机制并通过这些不同的机制发挥功能。

结构域抗体(dAb)是抗体的最小功能结合单位，对应于人类抗体的重链(V_H)或轻链(V_L)的可变区。结构域抗体的分子量大约为13kDa。Domantis已经开发了一系列全部人类V_H与V_L dAb的大而高功能性文库(每一文库中有超过一百亿个不同的序列)，并使用这些文库来选择对治疗靶标特异的dAb。与许多常规的抗体相比，结构域抗体在细菌、酵母、以及哺乳动物的细胞体系中的表达良好。结构域抗体及其生产方法的进一步细节可通过参见以下文献而获得：美国专利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；6,696,245；美国系列号2004/0110941；欧洲专利申请号1433846、以及欧洲专利0368684和0616640；WO2005/035572、WO2004/101790、WO2004/081026、WO2004/058821、WO2004/003019、以及WO2003/002609，其中每一项的全文完整并入本文作为参考。

纳米抗体(Nanobody)是源自抗体的治疗性蛋白质，它包含天然发生的重链抗体的独特结构及功能特性。这些重链抗体包含一个单一可变区(VHH)和两个恒定区(CH2与CH3)。重要的是，经克隆并分离的VHH结构域是携带原始重链抗体的全部抗原结合能力的完全稳定的多肽。纳米抗体与人类抗体的V_H结构域有高同源性，并且可以进一步被人源化而不会损失任何活性。重要的是，纳米抗体具有低免疫原性的潜力，这在使用纳米抗体先导化合物的灵长类动物研究中已得到证实。

纳米抗体结合了常规抗体的优点以及小分子药物的重要特征。与常规抗体一样，纳米抗体显示出高靶标特异性，对它们的靶标的高亲和力以及低固有毒性。然而，像小分子药物一样，它们能够抑制酶类并且容易接近受体裂缝(receptor cleft)。此外，纳米抗体非常稳定，可以通过注射之外的方法进行给药(例如，参见WO 2004/041 867，其全文并入本文作为参考)，并且易于制造。纳米抗体的其他优点包括：由于其尺寸小而识别不常见的或隐藏的表位；由于其独特的三维的、药物形式的灵活性而以高亲和力及选择性结合进入蛋白靶标的空腔或活性位点；对半衰期的定制，以及容易并且快速的发现药物。

纳米抗体由单一基因编码，并在几乎全部的原核宿主和真核宿主中被有效生产，这些宿主例如大肠杆菌(E.coli)(参见，如，US 6,765,087，其全文并入本文作为参考)、霉菌(例如曲霉属或木霉属)、以及酵母(例如酵母属、克鲁维酵母属、汉逊酵母属、或毕赤酵母属)(参见，如，US6,838,254，其全文并入本文作为参考)。该生产方法是可放大的，并且已经生产了几千克量的纳米抗体。因为与常规抗体相比纳米抗体显示出优越的稳定性，所以它们可以被配制成保质期长，立即可用的溶液。

纳米克隆方法(见，例如WO 06/079372，其全文并入本文作为参考)是一种用于产生针对所希望的靶标的纳米抗体的专有方法，它基于B细胞的自动高通量选择，并且能够在本发明的情况中使用。

UniBody是另一种抗体片段技术，然而这一技术是基于去除IgG4抗体的铰链区。缺失铰链区得到基本上是常规IgG4抗体一半尺寸的分子，并且该分子具有单价结合区而不是IgG4抗体的二价结合区。众所周知，IgG4抗体为惰性的，并且因此不与免疫***进行相互作用，这可能对治疗不期望产生免疫应答的疾病有利，并且这一优势被传到了Unibody。例如，Unibody可发挥抑制或沉默它们所结合的细胞的作用，但不杀死这些细胞。此外，结合至癌细胞的UniBody并不刺激它们的增殖。此外，因为Unibody为常规IgG4抗体的大小的一半，它们在更大的实体瘤上可显示出更好的分布，具有潜在的有利功效。Unibody以与完整IgG4抗体相似的速度从人体中被清除并且能以与完整抗体相似的亲和力结合它们的抗原。Unibody的进一步的细节可从专利申请WO2007/059782获得，其全文并入本文作为参考。

亲和体分子代表一种新类型的亲和蛋白，它基于58个氨基酸残基的蛋白结构域，衍生自葡萄球菌蛋白A的IgG结合结构域中的一个。这个三螺旋束结构域已被作为支架用于构建组合噬菌粒文库，使用噬菌体展示技术可从该文库中选择靶向希望的分子的Affibody变体(Nord K，Gunneriusson E，Ringdahl J，Stahl S，Uhlen M，Nygren PA，Bindingproteins selected from combinatorial libraries of anα-helical bacterialreceptor domain，Nat Biotechnol 1997；15：772-7.Ronmark J，Gronlund H，Uhlen M，Nygren PA，Human immunoglobulin A(IgA)-specific ligandsfrom combinatorial engineering of protein A，Eur J Biochem2002；269：2647-55.)。Affibody分子的结构简单坚固，并且它们的分子量低(6kDa)，这使它们适宜于各种广泛的应用，例如，作为检测试剂(Ronmark J，Hansson M，Nguyen T，et al，Construction andcharacterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli，JImmunol Methods 2002；261：199-211)，以及抑制受体的相互作用(Sandstorm K，Xu Z，Forsberg G，Nygren PA，Inhibition of theCD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody liganddeveloped by combinatorial protein engineering，Protein Eng2003；16：691-7)。Affibody以及它们的生产方法的进一步细节可通过参见美国专利号5,831,012而获得，其全文并入本文作为参考。

被标记的亲和体在用于确定同种型丰度的成像的应用中也可能是有用的。

DARPin(经设计的锚蛋白重复蛋白)是抗体模拟物DRP(经设计的重复蛋白)技术的一个实例，已对该技术进行开发以利用非抗体多肽的结合能力。重复蛋白，例如锚蛋白或富含亮氨酸的重复蛋白是普遍存在的结合分子，与抗体不同，它们出现在细胞内及细胞外。它们独特的模块结构以重复结构单元(重复子)为特征，这些重复子堆叠在一起以形成展示可变的以及模块的靶标结合表面的延长重复结构域。基于这一模块性，可以生成具有高度多样性的结合特异性的多肽组合文库。这一策略包括自我相容的重复体(self-compatible repeat)(其展示可变的表面残基)的一致性设计，并将它们随机组装进入重复结构域中。

经设计的锚蛋白重复蛋白可以在细菌表达***中以相当高的产率生产，并且它们属于已知的最稳定的蛋白质。已经选择出了针对大量的靶蛋白的高特异、高亲和力的经设计的锚蛋白重复蛋白，这些靶蛋白包括人类受体、细胞因子、激酶、人类蛋白酶、病毒及膜蛋白。可以获得亲和力在几纳摩尔至几皮摩尔范围内的经设计的锚蛋白重复蛋白。

经设计的锚蛋白重复蛋白已经被用于广泛的应用中，包括ELISA、夹层ELISA、流式细胞术分析(FACS)、免疫组织化学分析(IHC)、芯片应用、亲和纯化或蛋白质印迹法。还证明了经设计的锚蛋白重复蛋白在胞内区室中具有高活性，例如作为胞内标记物蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)融合。经设计的锚蛋白重复蛋白进一步被用于抑制病毒进入，其IC₅₀在pM范围内。经设计的锚蛋白重复蛋白不仅在阻断蛋白-蛋白相互作用方面是理想的，还抑制酶类。已经成功地抑制了蛋白酶、激酶、以及转运蛋白，通常是别构抑制模式。非常快速并且在肿瘤上特异地富集、以及以非常有利的肿瘤与血液的比例，使得经设计的锚蛋白重复蛋白非常适宜体内诊断或治疗方法。

有关经设计的锚蛋白重复蛋白及其他DRP技术的另外的信息可以在美国专利申请公开号2004/0132028及国际专利申请公开号WO 02/20565中找到，它们的全文均并入本文作为参考。

抗运载蛋白是另一种抗体模拟技术，然而在这种情况下，结合的特异性源自脂笼蛋白，脂笼蛋白是一个低分子量蛋白家族，在人体组织及体液中天然地大量表达。脂笼蛋白已经得到进化，在体内进行与生理运输及化学敏感的或不溶性化合物的存储有关的多种功能。脂笼蛋白具有坚固的内部结构，包括在该蛋白的一端支持四个环的高度保守的β-桶。这些环形成了结合口袋的入口，并且在分子这一部分中的构象差异解释了在各个脂笼蛋白之间的结合特异性的不同。

尽管由保守的β-片层构架支持的超变环的整体结构让人联想起免疫球蛋白，但脂笼蛋白与抗体在大小上差异显著，它由160至180个氨基酸的单个多肽链构成，该单个多肽链略大于单个免疫球蛋白结构域。

对脂笼蛋白进行克隆，并对它们的环工程化以便产生抗运载蛋白。已经生成了在结构上多样的抗运载蛋白的文库，并且抗运载蛋白的展示允许对结合功能进行选择和筛选，随后通过在原核或真核体系中表达并产生可溶性蛋白而进一步分析。研究已经成功地证明了可以开发出对几乎任何人类靶蛋白特异的抗运载蛋白，可以将它们分离出来，并且可以获得在纳摩尔或更高范围内的结合亲和力。

抗运载蛋白还可以被编排成双靶向性蛋白，被称为Duocalin。使用标准的生产方法，Duocalin在易于生产的单体蛋白中结合两种单独的治疗性靶标，同时保持靶标特异性和亲和力，无论它的两个结合结构域的结构取向如何。

通过单个分子调节多个靶标在已知涉及一种以上发病因子的疾病中是特别有优势的。此外，二价或多价结合形式(例如Duocalin)通过细胞表面受体的结合及聚簇在靶定疾病中的细胞表面分子、介导信号转导通路上的激动效应或诱导增强的内化效应具有显著的潜力。此外，Duocalin的高固有稳定性与单体抗运载蛋白是相当的，为Duocalin提供灵活的配制及递送潜力。

有关抗运载蛋白的其他信息可以在美国专利号7,250,297及国际专利申请公开号WO 99/16873中找到，它们的全文均并入本文作为参考。

在本公开的上下文中有用的另一种抗体模拟技术是高亲和力多聚体。高亲和力多聚体是通过体外外显子改组及噬菌体展示从人类细胞外受体结构域的大家族中演化而来，产生具有结合及抑制特性的多结构域蛋白。已显示连接多种独立的结合结构域产生亲合力，并且与常规的单一表位结合蛋白相比，该结合结构域产生了经改善的亲和力及特异性。其他潜在的优点包括在大肠杆菌中简单并有效地产生多靶标特异性的分子，经改善的热稳定性以及对蛋白酶的抵抗力。已经得到了针对多种靶标的具有亚纳摩尔亲和力的高亲和力多聚体。

关于Avimer的其他信息可在美国专利申请公开号2006/0286603、2006/0234299、2006/0223114、2006/0177831、2006/0008844、2005/0221384、2005/0164301、2005/0089932、2005/0053973、2005/0048512、2004/0175756中找到，其全部内容均并入本文作为参考。

万能抗体是另一种可用于本公开上下文的抗体模拟技术。万能抗体是具有大于15％的半胱氨酸的小分子蛋白质(3至5kDa)，它形成高二硫化物密度支架，替换典型蛋白具有的疏水核。这种用少量的二硫化物替换大量疏水性氨基酸(包括疏水核)使得蛋白质更小，更亲水(聚集及非特异性结合更小)，对于蛋白酶及热具有更大的抵抗力，并且具有较低密度的T细胞表位，因为对MHC呈递的贡献最多的残基是疏水性的。这些特性中的全部四种都公知会影响免疫原性，并且预期它们一起会大幅度降低免疫原性。

万能抗体的启示来自于由水蛭、蛇、蜘蛛、蝎子、蜗牛、以及海葵产生的天然的可注射的生物药剂，已知这些生物药剂显示出乎意料的低免疫原性。从经选择的自然蛋白家族开始，通过设计并通过筛选尺寸，疏水性、蛋白水解抗原加工、以及表位密度被最小化至远远低于天然的可注射蛋白质的平均值的水平。

鉴于万能抗体的结构，这些抗体模拟物提供了多样的形式，包括多价、多特异性、多样化的半衰期机制、组织靶定模块及抗体Fc区域的缺失。此外，可以在大肠杆菌中以高产率生产万能抗体，并且由于它们的亲水性和尺寸小，万能抗体高度可溶，而且能够被配制成高浓度。万能抗体具有特别的热稳定性(它们可被煮沸)，并且具有延长的保质期。

关于万能抗体的其他信息可在美国专利申请公开号2007/0191272中找到，其全文并入本文作为参考。

以上提供的抗体片段及抗体模拟技术的详细说明并非旨在成为可以在本说明书的上下文中使用的所有技术的详细列表。例如，但并非作为限制，多种另外的技术，包括可替代的基于多肽的技术，如在Qui et al.，NatureBiotechnology，25(8)921-929(2007)中概述的互补决定区的融合(其全文并入本文作为参考)，以及基于核酸的技术，如在美国专利号5,789,157、5,864,026、5,712,375、5,763,566、6,013,443、6,376,474、6,613,526、6,114,120、6,261,774以及6,387,620中说明的RNA适体技术都可用于本发明的上下文中，这些文献全部本文本文作为参考。

抗体的物理特性

本公开的抗体的进一步的特征为抗CD19抗体的不同物理特性。基于这些物理特性，可以使用不同测定法来检测和/或区分不同类型的抗体。

在一些实施方案中，本公开的抗体可以在轻链或重链可变区含有一个或多个糖基化位点。在可变区中存在一个或多个糖基化位点，可导致抗体的免疫原性提高或抗体的pK值发生变化，这是因为抗原结合发生改变(Marshall et al(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala FA andMorrison SL(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick et al(1988)J Exp Med168：1099-109；Spiro RG(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh et al(1985)Nature 316：452-7；Mimura et al.(2000)Mol Immunol 37：697-706)。已知糖基化作用发生在包含N-X-S/T序列的基序中。使用Glycoblot测定可以检测可变区的糖基化作用，该测定对该抗体进行切割产生Fab，并接着使用测量高碘酸盐氧化及席夫碱形成的测定来检测糖基化作用。备选地，使用Dionex光色谱法(Dionex-LC)可以检测可变区的糖基化，该测定将Fab上的糖类切割成单糖，并分析每种糖的含量。在某些情况下，优选使用不包含可变区糖基化的抗CD19抗体。这可以通过选择在可变区中不含有糖基化基序的抗体、或者通过使用本领域熟知的标准技术在糖基化基序中对残基进行突变来实现。

在一个优选的实施方案中，本公开的抗体不含有精氨酸同分异构位点。在N-G序列或D-G序列上可能分别发生脱酰胺作用或异天冬氨酸效应。脱酰胺作用或异天冬氨酸效应导致异天冬氨酸残基的生成，其通过在侧链羧基端而不是在主链上生成缠绕结构去除，降低抗体的稳定性。使用iso-quant测定可以测量异天冬氨酸的产生，该测定使用反相HPLC来检测异天冬氨酸。

每种抗体都具有独特的等电点(pI)，但是抗体的等电点通常都落在pH6至9.5之间的范围内。IgG1抗体的pI典型地落在pH7至9.5的范围内，并且IgG4抗体的pI典型地落在pH6至8的范围内。抗体可以具有该范围外的pI。虽然这些作用并不完全清楚，但是推测pI在正常范围之外的抗体在体内条件下可能有一定的解折叠及不稳定性。使用毛细管等电聚焦测定可以测量等电点，该测定产生pH梯度，并可以使用激光聚焦来提高准确性(Janini et al(2002)Electrophoresis 23：1605-11；Ma et al.(2001)Chromatographia 53：S75-89；Hunt et al(1998)J Chromatogr A800：355-67)。在某些情况下，优选使用pI值落在正常范围内的抗CD19抗体。这可以通过选择pI值在正常范围内的抗体，或者通过使用本领域熟知的标准技术对带电荷的表面残基进行突变来实现。

每种抗体都有一个解链温度，这是热稳定性的指标(Krishnamurthy Rand Manning MC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3：361-71)。较高的热稳定性表明抗体在体内的总体稳定性较高。可以使用如差示扫描量热法的技术来测量抗体的解链温度(Chen et al(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando et al(1999)Immunol Lett 68：47-52)。T_M1表示抗体起始解折叠的温度。T_M2表示抗体的完全解折叠的温度。通常地，优选本公开的抗体的T_M1高于60℃，优选高于65℃，甚至更优选高于70℃。备选地，使用圆二色性可以测量抗体的热稳定性(Murray et al.(2002)J.Chromatogr Sci40：343-9)。

在一个优选的实施方案中，选择不会快速降解的抗体。可以使用本领域公知的毛细管电泳(CE)以及MALDI-MS来测量抗CD19抗体的片段化(Alexander AJ and Hughes DE(1995)Anal Chem 67：3626-32)。

在另一个优选的实施方案中，选择具有最小化聚集作用的抗体。聚集作用可导致引发不需要的免疫应答和/或经改变的或不利的药物动力学特性。总体上，可接受的抗体的聚集度是25％或更低，优选20％或更低，甚至更优选是15％或更低，甚至更优选是10％或更低，并甚至更优选地是5％或更低。通过本领域熟知的几种技术可以对聚集进行测量以鉴别单体、二聚体、三聚体或多聚体，这些技术包括大小排阻柱(SEC)、高效液相色谱(HPLC)、以及光散射法。

工程化抗体的方法

如以上讨论，通过修饰V_H和/或V_k序列，或其附着的一个或多个恒定区，可以使用在此公开的具有V_H和V_k序列的抗CD19抗体以产生新的抗CD19抗体。因此，在本公开的另一方面，使用本公开的抗CD19抗体，如21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8的结构特征，用于产生在结构上相关的抗CD19抗体，该抗体保留了本公开抗体的至少一种功能特性，例如结合人类CD19。例如，如以上所讨论，可以将21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8的一个或多个CDR区，或它们的突变与已知的构架区和/或其他CDR重组组合，以产生另外的重组工程化的本公开的抗CD19抗体。其他类型的修饰包括前面章节中说明的那些修饰。用于工程化方法的起始材料是在此提供的V_H和/或V_k序列中的一个或多个序列，或它们的一个或多个CDR区。为产生工程化的抗体，不必实际地制备出一种抗体(即，表达成蛋白质)，该抗体具有在此提供的V_H和/或V_k序列中的一个或多个序列，或它们的一个或多个CDR区。相反，使用这个或这些序列中含有的信息作为起始材料，生成衍生自这个或这些原始序列的一个或一些“第二代”序列，并接着制备这个或这些“第二代”序列，并将其表达成蛋白。

因此，在另一个实施方案中，本公开提供了制备抗CD19抗体的方法，包括：

(a)提供(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，包括CDR1序列，该序列选自：SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21以及22；CDR2序列，该序列选自：SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28以及29；和/或CDR3序列，该序列选自：SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35以及36；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，包含CDR1序列，该序列选自：SEQ ID NO：37、38、39、40、41、42以及43；CDR2序列，该序列选自：SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49以及50；和/或CDR3序列，该序列选自：SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57以及58；

(b)改变在重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列中的至少一个氨基酸残基，以产生至少一种被改变的抗体序列；并且

(c)将被改变的抗体序列表达成蛋白质。

可以使用标准的分子生物学技术来制备并表达被改变的抗体序列。

优选地，由被改变的一种或多种抗体序列编码的这种抗体是这样一种抗体，它保留了在此所述的抗CD19抗体的一种、几种或全部功能特性，该功能特性包括但不限于：

(a)以1×10^-7M或更小的K_D与人类CD19相结合；

(b)与Raji以及Daudi B细胞肿瘤细胞相结合；

(c)被表达CD19的细胞内化；

(e)当与细胞毒素相缀合时在体内抑制表达CD19的细胞的生长。

使用本领域可获得的和/或在此所述的标准测定法例如实例中给出的测定法(例如流式细胞术，结合测定)可以对改变的抗体的功能特性进行评估。

在本公开的工程化抗体的方法的某些实施方案中，可沿抗-CD19抗体编码序列的全长或一部分中随机地或选择性地引入突变，并针对结合活性和/或在此所述的其他功能特性对得到的经修饰的抗-CD19抗体进行筛选。突变方法已经在本领域中进行说明。例如，Short的PCT公开文件WO02/092780说明了使用饱和诱变、合成连接装配、或它们的组合来生成并筛选抗体突变的方法。备选地，Lazar等人的PCT公开文件WO 03/074679说明了使用计算机筛选方法优化抗体的理化特性的方法。

编码本公开的抗体的核酸分子

本公开的另一个方面涉及对本公开的抗体进行编码的核酸分子。这些核酸可以存在于整个细胞中、细胞裂解液中、或者以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过标准技术(包括碱/SDS处理，CsCl成带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳以及本领域的其他熟知技术)从其他细胞成分或其他杂质(如其他细胞核酸或蛋白质)中纯化出核酸时，该核酸是“分离的”或“使之基本上是纯的”。参见F.Ausubel et al.(1987)Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本公开的核酸可以是，例如DNA或RNA，并且可以含有或不含有内含子序列。在优选的实施方案中，核酸为cDNA分子。

使用标准的分子生物学技术可以获得本公开的核酸。对于杂交瘤表达的抗体(例如，从以下进一步说明的携带人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)而言，通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术可以获得编码杂交瘤产生的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)而言，可以从该文库回收编码该抗体的一种或多种核酸。

本公开的优选的核酸分子是那些编码21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8单克隆抗体的V_H和V_L序列的核酸分子。对21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1以及46E8的V_H序列进行编码的DNA序列分别示于SEQ ID NO：59、60、61、62、63、64、以及65中。对21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、71F1以及46E8的V_L序列进行编码的DNA序列分别示于SEQ ID NO：66、67、68、69、70、71、72以及73中。

一旦获得了编码V_H和V_L区段的DNA片段，则通过标准的重组DNA技术可以进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转变成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码V_L或V_H的DNA片段被有效连接至编码另一种蛋白质(例如抗体恒定区或柔性接头)的另一条DNA片段。在此使用的术语“有效连接”意指连接两条DNA片段，使得由这两条DNA片段编码的氨基酸序列保留在读框内。

通过将编码V_H的DNA有效连接至另一个编码重链恒定区(CHl、CH2及CH3)的DNA分子，可以将编码V_H区的分离的DNA转化成全长重链基因。人类重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat，E.A.，el al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，FifthEdition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242)，并且包含这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增来获得。该重链恒定区可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgGl或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因而言，可以将编码V_H的DNA有效连接至另一个仅对重链CH1恒定区进行编码的DNA分子。

通过将编码V_L的DNA有效连接至另一个编码轻链恒定区C_L的DNA分子上，可以将编码V_L区的分离的DNA转化成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人类轻链恒定区基因序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat，E.A.，el al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242)，并且通过标准PCR扩增可以获得包含这些区的DNA片段。在优选的实施方案中，该轻链恒定区可以为κ或λ恒定区。

为了产生scFv基因，将编码V_H和V_L的DNA片段有效连接至编码柔性接头的另一条片段，例如编码氨基酸序列(Gly₄-Ser)₃，使得V_L和V_H序列可表达为连续的单链蛋白，其中V_H和V_L区域通过柔性接头连接(参见，例如Bird et al.(1988)Science 242：423-426；Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty et al.，(1990)Nature348：552-554)。

本公开的单克隆抗体的生产

可以通过多种技术产生本公开的单克隆抗体(mAb)，该技术包括常规的单克隆抗体方法学，例如Kohler and Milstein(1975)Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交步骤，但是原则上可以采用其他用于生产单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒性转化或致癌性转化。

用于制备杂交瘤的优选的动物***是鼠类***。在小鼠中产生杂交瘤是充分确立的程序。用于分离被免疫的脾细胞以进行融合的免疫方案和技术在本领域中是已知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。

基于如上所述制备的非人单克隆抗体的序列，可以制备本公开的嵌合抗体或人源化抗体。从目的非人杂交瘤可以获得对重链和轻链免疫球蛋白进行编码的DNA，并且使用标准的分子生物学技术进行工程化，以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为生成嵌合抗体，使用本领域中已知的方法可以将鼠类可变区与人类恒定区连接(参见例如Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，使用本领域已知的方法可以将鼠类CDR区***人类构架区(参见例如Winter的美国专利号5,225,539及Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762以及6,180,370)。

在优选的实施方案中，本公开的抗体是人类单克隆抗体。使用携带部分人免疫***而不是小鼠***的转基因小鼠或转染色体小鼠，可以产生针对BTLA的这种人类单克隆抗体。这些转基因小鼠及转染色体小鼠包括在此分别称为HuMAb

及KM

的小鼠，并在此统称为“人类Ig小鼠”。

HuMAb

(Medarex，Inc.)含有对非重排的人重链(μ及γ)以及κ轻链免疫球蛋白序列进行编码的人类免疫球蛋白基因微基因座，并含有使内源性μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如Lonberg，et al.(1994)Nature 368(6474)856-859)。因此，这些小鼠表现出小鼠IgM或κ的表达降低，并且响应于免疫应答，被导入的人类重链和轻链转基因经历了类别转换及体细胞突变，以产生高亲和力的人类IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.et al.(1994)，supra；Lonberg，N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.and Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93，以及Harding，F.and Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546中综述)。HuMAb小鼠的制备和用途，以及由这种小鼠携带的基因组修饰，进一步记载于Taylor，et al.(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.et al.(1993)InternationalImmunology 5：647-656；Tuaillon et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：3720-3724；Choi et al.(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.et al.(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon et al.(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.et al.(1994)International Immunology 6：579-591；以及Fishwild，D.et al.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，所有这些文献的内容完整并入本文作为参考。进一步参见，均为Lonberg及Kay的美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；及5,770,429；Surani等人的美国专利号5,545,807；均为Lonberg及Kay的PCT公开号WO 92/03918，WO 93/12227，WO 94/25585，WO 97/13852，WO 98/24884及WO99/45962；以及Korman等人的PCT公开号WO 01/14424。还可以使用携带人类λ轻链基因的转基因小鼠，如Bruggemann的PCT公开号WO00/26373中说明的那些转基因小鼠。例如，携带人类λ轻链转基因的小鼠可与携带人类重链转基因(如HCo7)并可任选地还携带人类κ轻链转基因(如KCo5)的小鼠进行杂交以产生同时携带人类重链转基因和轻链转基因的小鼠(见，如实施例1)。

在另一个实施方案中，使用在转基因及转染色体上携带人类免疫球蛋白序列的小鼠(例如，携带一个人类重链转基因及一个人类轻链转染色体的小鼠)可以生产本公开的人类抗体。这种小鼠在此被称为“KM”，在Ishida等人的PCT公开文件WO 02/43478中有详细的说明。

再者，备选的表达人类免疫球蛋白基因的转基因动物***在本领域内是可以获得的，并且可以用于生产本公开的抗-CD19抗体。例如，可以使用被称作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的备选转基因***；这种小鼠记载于，例如Kucherlapat等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584及6,162,963中。

此外，备选的表达人类免疫球蛋白基因的转基因动物***在本领域内是可以获得的，并且可以用于生产本公开的抗-CD19抗体。例如，可以使用被称作“TC小鼠”的小鼠，该小鼠同时携带人类重链转染色体和人类轻链转染色体；这种小鼠记载于Tomizuka et al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。此外，在本领域中已经说明了携带人类重链转染色体和人类轻链转染色体的奶牛(例如，Kuroiwa et al.(2002)NatureBiotechnology 20：889-894和PCT申请号WO 2002/092812)，并且这些奶牛可以被用于生产本公开的抗-CD19抗体。

通过用于筛选人类免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法也可以制备本公开的人类单克隆抗体。这种用于分离人类抗体的噬菌体展示方法在本领域内已经建立。参见例如：Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484；以及5,571,698；Dower等人的美国专利号5,427,908及5,580,717；McCafferty等人的美国专利号5,969,108及6,172,197；以及Griffiths等人的5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,9130，6,582,915以及6,593,081。

使用SCID小鼠也可以制备本公开的人类单克隆抗体，其中人类免疫细胞已被重建入SCID小鼠，使得免疫时可产生人类抗体反应。这种小鼠记载于，例如Wilson等人的美国专利号5,476,996及5,698,767中。

在另一个实施方案中，可以使用如Buechler等的美国专利号6,794,132中说明的人类Ig小鼠以及噬菌体展示技术的组合来制备人类抗CD19抗体。更确切地说，该方法首先涉及通过用一种或多种CD19抗原对人类Ig小鼠(例如以上说明的HuMab小鼠或KM小鼠)进行免疫，在这些小鼠中形成抗CD19抗体反应，随后从该小鼠的淋巴细胞中分离编码人类抗体链的核酸，并将这些核酸导入展示载体(例如噬菌体)中以提供展示包装体(display package)文库。由此，每个文库成员包含编码一种人类抗体链的核酸，并且每种抗体链通过展示包装体被展示出来。然后用CD19蛋白筛选该文库以分离出与CD19特异性结合的文库成员。然后将所选文库成员中的核酸***片段进行分离并通过标准方法测序以确定所选CD19结合子的轻链和重链可变序列。通过标准的重组DNA技术可以将可变区转化成全长抗体链，这些技术例如，将可变区克隆进入携带人类重链及轻链恒定区的表达载体，使得V_H区被可操作地连接至C_H区，并且V_L区被可操作地连接至C_L区。

人类Ig小鼠的免疫接种

当人类Ig小鼠用于产生本公开的人类抗体时，用CD19抗原和/或重组CD19、或表达CD19蛋白的细胞、或CD19融合蛋白的经纯化或者富集的制品，可以对此类小鼠进行免疫，如Lonberg，N.et al.(1994)Nature368(6474)：856-859；Fishwild，D.et al.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851；以及PCT公开文件WO 98/24884与WO 01/14424所说明。优选地，这些小鼠在初次输注时是6至16周龄。例如，用CD19抗原的经纯化的或重组的制备物(5至50μg)经腹膜内和/或皮下可对人Ig小鼠进行免疫。最优选地，用于生产本公开的抗体的免疫原是CD19融合蛋白，该融合蛋白包括CD19蛋白的细胞外结构域，在其N-末端与非CD19的多肽(例如His标签)相融合(在实施例1中进一步说明)。

在以下实施例1中说明了用于产生结合人类CD19的全长人类单克隆抗体的详细操作。关于不同抗原的积累的经验已显示，在以下条件下转基因小鼠会应答：当用完全弗氏佐剂中的抗原经腹膜内(IP)进行初始免疫，随后每隔一周用不完全弗氏佐剂中的抗原进行IP免疫(达到共6次)。然而，发现除弗氏佐剂之外的其他佐剂也是有效的(例如RIBI佐剂)。另外，也发现在没有佐剂的情况下整个细胞具有高度的免疫原性。在免疫过程中可以用眶后取血得到的血浆样品监测免疫应答。通过ELISA(如以下所述)可以筛选该血浆，并且具有足够滴度的抗-CD19人类免疫球蛋白的小鼠可用于融合。例如可以在处死并取出脾脏前的3天，通过静脉内对小鼠用抗原加强。预期对每个免疫可能需要进行2至3次融合。每种抗原通常对6至24只小鼠进行免疫。通常使用HCo7与HCo12品种。另外，HCo7与HCo12两个转基因均可以被共同培育成单一小鼠，该小鼠具有两种不同的人类重链转基因(HCo7/HCo12)。备选地或额外地，可以使用KM

品系。

产生本发明的人类单克隆抗体的杂交瘤的生成

为了生成产生本公开的人单克隆抗体的杂交瘤，可从被免疫的小鼠分离脾细胞和/或***细胞，并且与合适的无限增殖化细胞系(例如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。针对抗原特性抗体的产生可以对得到的杂交瘤进行筛选。例如，通过50％的PEG可以将来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)相融合。备选地，使用基于电场的电融合方法，使用CytoPulse大腔细胞融合电穿孔仪(large chamber cell fusionelectroporator)(CytoPulse Sciences，Inc.，Glen Burnie Maryland)，可以融合来自经免疫的小鼠脾淋巴细胞的单细胞悬液。将大约2×10⁵个细胞接种于平底微量滴定板上，之后在以下选择性培养基中培育2周：该培养基含有20％胎Clone Serum、18％“653”条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM的2-巯基乙醇、50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素以及1X HAT(Sigma；融合后24小时加入HAT)。大约2周后，可以将细胞培养于以HT替换HAT的培养基中。然后由ELISA针对人类单克隆IgM与IgG抗体对这些单个孔进行筛选。一旦出现杂交瘤的扩大生长，通常可以在10至14天后观察培养基。可以对分泌抗体的杂交瘤进行再接种、再筛选，并且如果对人类IgG仍是阳性，则可以通过有限稀释将该单克隆抗体亚克隆至少2次。然后可以在体外培养稳定的亚克隆以便在组织培养基中产生少量抗体用于表征。

为了纯化人类单克隆抗体，可以将已选择的杂交瘤培养于2升的旋瓶中用于单克隆抗体纯化。可以对上清液进行过滤并浓缩，之后用A蛋白-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。通过凝胶电泳及高效液相色谱可以检查被洗脱的IgG以确保纯度。可以将该缓冲液交换为PBS，并且通过OD₂₈₀使用1.43的消光系数确定其浓度。可以将单克隆抗体等份，并保存于-80℃。

产生本发明的单克隆抗体的转染瘤的生成

使用(例如)本领域中熟知的重组DNA技术及基因转染方法的结合，在宿主细胞转染瘤中也可以产生本公开的抗体(例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202)。

例如，为了表达抗体，或它们的抗体片段，可以通过标准的分子生物学技术(例如，使用表达目的抗体的杂交瘤的PCR扩增或cDNA克隆)获得对部分或全长轻链和重链进行编码的DNA，并且可以将这些DNA***至表达载体中，使得这些基因被有效连接至转录和翻译控制序列。在本文中，术语“有效连接”意指将抗体基因连接进入载体，使得载体中转录和翻译控制序列起到其调节抗体基因的转录和翻译的预期功能。对表达载体及表达控制序列进行选择以便与所使用的表达宿主细胞相容。可以将该抗体轻链基因与该抗体重链基因***至单独的载体中，或者更典型地是将两个基因均***至相同的表达载体中。通过标准的方法(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制位点，或者如果不存在限制位点则进行平端连接)将这些抗体基因***至该表达载体中。可以通过以下方法将本文所述的该抗体的轻链和重链可变区用于生产任何抗体同种型的全长抗体基因：将轻链和重链可变区***至已经对希望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区进行编码的表达载体中，使得V_H区段有效连接至载体中的C_H区段，并且将V_K区段有效连接至载体中的C_L区段。另外地或备选地，重组的表达载体可以编码一种信号肽，该信号肽有助于从宿主细胞中分泌抗体链。可以将抗体链基因克隆进入该载体，使得该信号肽符合读框地被连接至该抗体链基因的氨基末端。该信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或者是异源的信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。

本公开的重组表达载体除了抗体链基因之外，还携带在宿主细胞中调控抗体链基因表达的调节序列。术语“调节序列”意指包括启动子、增强子以及控制抗体链基因的转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多聚腺苷酸化信号)。这种调控序列被描述于，例如Goeddel(Gene ExpressionTechnology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))中。本领域技术人员将会了解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可以依赖于以下因素，如待转化的宿主细胞的选择、希望的蛋白质的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如来自巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))及多瘤病毒的启动子和/或增强子。备选地，可以使用非病毒调节序列，例如泛蛋白启动子或β-珠蛋白启动子。再者，可使用由来自不同来源的序列组成的调节元件，例如SRα启动子***，它包含来自SV40早期启动子及人类T细胞白血病病毒I型的长末端重复序列(Takebe，Y.et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。

本公开的重组表达载体除了携带抗体链基因和调节序列之外，还可以携带另外的序列，例如在宿主细胞中调节载体复制的序列(例如，复制起点)及可选择的标记基因。该可选择的标记基因有利于对其中已导入载体的宿主细胞的选择(参见例如，均为Axel等人的美国专利号4,399,216、4,634,665及5,179,017)。例如，典型地可选择的标记基因赋予已导入载体的宿主细胞对，例如G418、潮霉素或甲氨喋呤的药物抗性。优选的可选择的标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞中用于甲氨喋呤选择/扩增)以及neo基因(用于G418选择)。

为了轻链及重链的表达，通过标准技术将编码这些重链与轻链的一个或多个表达载体转染进入宿主细胞中。术语“转染”的不同形式旨在涵盖范围宽广的多种技术，这些技术一般用于将外源DNA导入原核的或真核的宿主细胞，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。虽然在理论上可以无论在原核宿主细胞或在真核宿主细胞中均表达本公开的抗体，但是在真核细胞中抗体的表达，并且最优选在哺乳动物宿主细胞中的表达是最优选的，因为这种真核细胞，并且特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更有可能组装并分泌正确折叠并且具有免疫活性的抗体。已经报道了抗体基因的原核表达不能有效产生大量活性抗体(Boss，M.A.and Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。

用于表达本公开的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr^-CHO细胞，说明于Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，使用DHFR选择标记，例如R.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)J.Mol.Biol.159：601-621中所说明)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞及SP2细胞。特别是，对于使用NSO骨髓瘤细胞而言，另一种优选的表达***是在(Wilson的)WO 87/04462、(Bebbington的)WO 89/01036、以及(Bebbington的)EP 338,841中披露的GS基因表达***。在编码抗体基因的重组表达载体基因被引入哺乳动物宿主细胞时，通过对宿主细胞培养一段时间可以产生抗体，所述时间足够使该抗体在该宿主细胞中得到表达，或者更优选地使该抗体分泌进入生长宿主细胞的培养基。使用标准的蛋白纯化方法可以从培养基中回收抗体。

结合至抗原的抗体的表征

可以通过例如标准ELISA测试本公开的抗体与人类CD19的结合。简言之，将微量滴定板用PBS中的0.25μg/ml的经纯化的CD19进行包被，并接着用含5％牛血清白蛋白的PBS进行封闭。在每个孔中加入抗体的稀释物(例如，来自被CD19免疫的小鼠血浆的稀释物)，并在37℃下孵育1至2小时。用PBS/吐温冲洗该板，并接着与缀合至碱性磷酸酶的第二试剂(例如，对于人类抗体而言，一种山羊-抗人类IgG Fc特异性的多克隆试剂)在37℃孵育1小时。冲洗后，用pNPP底物(1mg/ml)对该板进行显影，并在OD 405至650下进行分析。优选地，形成最高效价的小鼠将用于融合。

以上说明的ELISA测定还可用于筛选与CD19免疫原显示阳性反应的杂交瘤。对以高亲合力和/或亲和力结合CD19的杂交瘤进行亚克隆并且进一步表征。可以从每个杂交瘤(通过ELISA)选择保持亲本细胞反应性的一个克隆，用于制备5至10小瓶细胞库，保存于-140℃，并用于抗体纯化。

为了纯化抗-CD19抗体，可以将已选择的杂交瘤生长于两升的组织培养瓶或旋瓶中用于单克隆抗体纯化。可以将上清液进行过滤并浓缩，之后用A蛋白-琼脂糖(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。通过凝胶电泳及高效液相色谱可以检查被洗脱的IgG以确保纯度。可以将该缓冲液交换到PBS中，并且通过OD₂₈₀使用1.43消光系数确定其浓度。可以将单克隆抗体等分，并保存于-80℃。

为了确定已选择的抗-CD19单克隆抗体是否结合至独特的表位，使用可商购的试剂(Pierce，Rockford，IL)可以对每种抗体进行生物素化。使用未标记的单克隆抗体及生物素化的单克隆抗体的竞争性研究可以用以上描述的经CD19包被的ELISA板进行。使用链霉抗生物素蛋白-抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针可以检测生物素化的mAb结合。

为了确定纯化的抗体的同种型，可以使用对特定同种型的抗体特异的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人类单克隆抗体的同种型，可以用1μg/ml的抗-人类免疫球蛋白抗体在4℃下过夜对微量滴定板的孔进行包被。用1％BSA封闭后，该板与1μg/ml或更低的测试单克隆抗体或者经纯化的同种型对照在环境温度下反应1至2小时。随后将这些孔与人类IgG1或人类IgM-特异的碱性磷酸酶缀合的探针进行反应。如以上所述对板进行显影并分析。

通过蛋白质印迹法可以进一步测试抗CD19人类IgG与CD19抗原的反应性。简言之，可制备CD19并对其进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将被分开的抗原转移至硝酸纤维素膜上，用10％胎牛血清封闭，并用待测试的单克隆抗体进行探测。可使用抗人类IgG碱性磷酸酶检测人类IgG结合并用BCIP/NBT底物片进行显影(Sigma Chem.Co.，St.Louis，Mo.)。

还可以通过监测该抗体与表达CD19蛋白的细胞的结合(例如通过流式细胞术)，来确定本公开的抗体的结合特异性。可以使用天然表达CD19蛋白的细胞或细胞系例如OVCAR3、NCI-H226、CFPAC-1或KB细胞(在实施例3中进一步说明)，或者可以用编码CD19的表达载体转染细胞系(例如CHO细胞系)，使得CD19在这些细胞的表面上表达。该经转染的蛋白可包含标签，如myc-标签或his-标签，优选地位于N-末端，使用针对该标签的抗体进行检测。本公开的抗体与CD19蛋白的结合可以通过将该经转染的细胞与该抗体孵育，并且检测所结合的抗体进行确定。可将抗体与经转染蛋白上的标签的结合用作阳性对照。

双特异性分子

在另一方面，本公开的特征在于包含本公开的抗-CD19抗体，或该抗体的片段的双特异性分子。本公开的抗体，或其抗原结合部分可被衍生化或与另一种功能分子相连接，例如与另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或受体的配体)相连接，以生成结合至少两种不同的结合位点或靶分子的双特异性分子。事实上，本公开的抗体可能被衍生化或连接至多于一个的其他功能分子上，以生成结合到多于两种不同的结合位点和/或靶分子的多特异性分子；在此所使用的术语“双特异性分子”也旨在涵盖这种多特异性分子。为了生成本公开的双特异性分子，可将本公开的抗体与一个或多个其他的结合分子(例如，另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物)功能性地连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价连接等等)，由此得到双特异性分子。

因此，本公开还包括双特异性分子，该双特异性分子含有针对CD19的至少一种第一结合特异性以及针对第二靶表位的第二结合特异性。在本公开的一个具体实施方案中，该第二靶表位是Fc受体，例如人类FcγRI(CD64)或人类Fcα受体(CD89)。因为，本公开包括的双特异性分子既能够结合表达FcγR或FcαR受体的效应细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))，又能够结合表达CD19的靶细胞。这些双特异性分子将表达CD19的细胞靶向效应细胞，并触发Fc受体介导的效应细胞活性，例如，表达CD19的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子的释放、或超氧化物阴离子的生成。

在本公开的一个实施方案(其中该双特异性分子是多特异性的)中，该分子除了包括抗-Fc结合特异性及抗-CD19结合特异性之外，还能进一步包括第三种结合特异性。在一个实施方案中，第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如，结合至涉及细胞毒素活性的表面蛋白上并由此增强针对靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是结合至给定分子(例如抗原或受体)的抗体、功能抗体片段、或配体，并且由此增强Fc受体或靶细胞抗原的结合决定簇的效果。“抗增强因子部分”可以结合Fc受体或靶细胞抗原。备选地，抗增强因子部分可以结合实体，该实体不同于第一及第二结合特异性结合的实体。例如，抗增强因子部分可结合细胞毒性T细胞(例如，经CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1、或其他免疫细胞，导致针对该靶细胞的免疫应答的增强)。

在一个实施方案中，本公开的双特异性分子包含作为一种结合特异性的至少一种抗体、或该抗体的抗体片段，包括，Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、Fd、dAb或单链Fv。该抗体还可以是轻链或重链二聚物，或是其任何最小片段，例如Fv或单链构建体，如在Ladner等人的美国专利号4,946,778所述，其内容明确地并入本文作为参考。

在一个实施方案中，Fcγ受体的结合特异性由单克隆抗体提供，其结合并未被人类免疫球蛋白G(IgG)所阻断。在此所使用的术语“IgG受体”指位于染色体1上的8个γ链基因的任何基因。这些基因总共编码12种跨膜或可溶性受体同种型，它们被分为三类Fcγ受体：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、以及FcγRIII(CD16)。在一个优选的实施方案中，Fcγ受体是人类高亲合性FcγRI。人类FcγRI是一种72kDa的分子，它对单体IgG具有高亲合性(10⁸至10⁹M^-1)。

在Fanger等人的PCT公开文件WO 88/00052及美国专利号4,954,617中描述了某些优选的抗-Fcγ单克隆抗体的制备及表征，其中传授的内容都通过引用全部结合在此。这些抗体结合至FcγI、FcγII及FcγIII的表位上不同于受体的Fcγ结合位点的位点，并因此它们的结合基本上不会被IgG的生理水平所阻断。在本公开有用的特异性抗-FcγRI抗体是mAb 22、mAb32、mAb 44、mAb 62及mAb 197。产生mAb 32的杂交瘤可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，ATCC保藏号HB9469。在其他实施方案中，抗-Fcγ受体抗体是一种单克隆抗体22(H22)的人源化形式。H22抗体的制备及表征说明于Graziano，R.F.et al.J.(1995)Immunol 155(10)：4996-5002，及Tempest等人的PCT公开文件WO 94/10332中。产生H22抗体的细胞系保藏于美国典型培养物保藏中心，被命名为HA022CL1，保藏号为CRL 11177。

在另外的优选实施方案中，对于Fc受体的结合特异性由结合至人类IgA受体的抗体提供，所述人类IgA受体例如是Fcα受体(FcαRI(CD89))，这种结合优选不会被人类免疫球蛋白A(IgA)所阻断。术语“IgA受体”意在包括位于染色体19上的一个α基因(FcαRI)的基因产物。已知这一基因编码几种55至110kDa的选择性剪接的跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞及嗜中性粒细胞中组成型表达，但在非效应细胞类群中不组成型表达。FcαRI对于IgA1和IgA2都具有中等的亲合力(≈5×10⁷M^-1)，该亲合性在暴露于细胞因子例如G-CSF或GM-CSF时会增加(Morton，H.C.et al.(1996)Critical Reviews in Immunology16：423-440)。已经描述了四种FcαRI特异性的单克隆抗体，被鉴定为A3、A59、A62及A77，它们结合IgA配体结合域外侧的FcαRI(Monteiro，R.C.et al.(1992)J.Immunol.148：1764)。

在本公开的双特异性分子的使用中，FcαRI及FcγRI是优选的触发受体，因为它们：(1)主要表达于免疫效应细胞(例如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞)；(2)表达水平高(例如5,000至100,000/细胞)；(3)是细胞毒性活性(例如ADCC、吞噬作用)的介体；以及(4)介导靶向它们的抗原(包括自身抗原)的增强的抗原呈递。

虽然人类单克隆抗体是优选的，但是可用于本公开的双特异性分子的其他抗体是鼠类抗体、嵌合抗体及人源化单克隆抗体。

使用本领域中已知的方法通过缀合组成性结合的特异性(例如，抗-FcR及抗-CD19的结合特异性)可以制备本公开的双特异性分子。例如，可以单独地生成双特异性分子中的每一种结合特异性，并接着将它们缀合在一起。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶联试剂或交联试剂来进行共价缀合。交联试剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5，5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻-亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、以及4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见例如，Karpovsky et al.(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括在Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132；Brennan etal.(1985)Science 229：81-83)，以及Glennie et al.(1987)J.Immunol.139：2367-2375)中说明的方法。优选的缀合试剂是SATA及磺基-SMCC，都可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)公司购得。

当这些结合特异性是抗体时，它们可以通过两个重链之间的C末端铰链区的巯基键合相缀合。在一个特别优选的实施方案中，在缀合之前对铰链区进行修饰，使其含有奇数个巯基残基，优选地含有一个巯基残基。

备选地，两种结合特异性均可以在相同的载体中被编码并在同一宿主细胞中被表达并且组装。当双特异性分子是mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)₂或配体×Fab融合蛋白时，这一方法特别有用。本公开的一种双特异性分子可以是含有一个单链抗体及一个结合决定簇的单链分子，或含有两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以含有至少两种单链分子。制备双特异性分子的方法说明在例如美国专利号5,260,203；5,455,030；4,881,175；5,132,405；5,091,513；5,476,786；5,013,653；5,258,498；及5,482,858中，将它们都明确并入本文作为参考。

双特异性分子与它们的特异性靶标的结合可以通过下列方法来确认，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)、或蛋白印迹测定。这些测定中的每一种测定通常都是通过采用对目的复合体特异的标记试剂(例如，抗体)，检测特定目的蛋白-抗体复合体的存在。例如，可以使用例如识别并且特异性结合至抗体-FcR复合体的酶联抗体或抗体片段来检测这些FcR-抗体复合体。备选地，使用多种其他免疫测定中的任何测定可以检测这些复合体。例如，该抗体可被放射性标记，并用于放射免疫测定(RIA)中(参见例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，Seventh TrainingCourse on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March，1986，将其并入本文作为参考)。可以使用例如γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影来检测放射性同位素。

连接体

本发明提供了抗体-配偶体缀合物，其中该抗体通过化学连接体连接到该配偶体上。在某些实施方案中，该连接体为肽基连接体，并且在此描绘为(L⁴)_p-F-(L¹)_m。其他的连接体包括肼连接体以及二硫键连接体，并在此被分别描绘为(L⁴)_p-H-(L¹)_m或(L⁴)_p-J-(L¹)_m。除了与附着于配偶体的连接体之外，本发明还提供了适用于附着于基本上任何分子种类的可剪切的连接臂。本发明的连接臂方面在此通过参考它们附着于治疗部分而示例。然而，对本领域的熟练人员来说很明显，这些连接体可被附着于多种种类上，包括但不局限于，诊断试剂、分析试剂、生物分子、靶向试剂、可检测的标记、等等。

在抗体-配偶体缀合物中肽基以及其他连接体的使用描述于美国临时专利申请系列号60/295,196；60/295,259；60/295342；60/304,908；60/572,667；60/661,174；60/669,871；60/720,499；60/730,804；以及60/735,657；以及美国专利申请序列号10/160,972；10/161,234；11/134,685；11/134,826；及11/398,854以及美国专利号6,989,452以及PCT专利申请号PCT/US2006/37793，所有文献都并入本文作为参考。

其他连接体说明于美国专利号6,214,345(Bristol-Myers Squibb)，美国专利申请2003/0096743以及美国专利申请2003/0130189(均属于SeattleGenetics)，de Groot et al.，J.Med.Chem.42，5277(1999)；de Groot et al.J.Org.Chem.43，3093(2000)；de Groot et al.，J.Med.Chem.66，8815，(2001)；WO 02/083180(Syntarga)；Carl et al.，J.Med.Chem.Lett.24，479，(1981)；Dubowchik et al.，Bioorg&Med.Chem.Lett.8，3347(1998)；以及60/891,028(于2007年2月21日提交)。

一方面，本发明涉及用于将靶向基团附着于治疗剂以及标记物的连接体。另一方面，本发明提供了连接体，该连接体赋予化合物稳定性、减小其体内毒性、或者另外有利地影响其药物代谢动力学、生物利用度和/或药效学。通常优选的是在此类实施方案中，一旦药物被递送至其作用部位，连接体即被切割，释放出该活性药物。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的连接体是无痕迹的，使得一旦连接体从治疗剂或标记物上去除(例如在活化期间)，该连接体的存在不留下痕迹。

在本发明的另一个实施方案中，连接体的特征在于它们在一个位点或临近靶细胞处(如在治疗作用位点或标记物活性位点)被切割的能力。此类切割本质上具有酶促性的。这一特性有助于减小该治疗剂或标记物的***激活、减少毒性、以及全身副作用。用于酶促切割的优选的可切割基团包括肽键、酯连接、以及二硫键连接。在其他的实施方案中，该连接体对pH敏感，并且通过改变pH而被切割。

本发明的一个重要的方面是控制连接体的切割速度的能力。快速切割的连接体经常是所希望的。然而，在一些实施方案中，可能优选切割较慢的连接体。例如，在缓释制剂或同时具有快速释放成分以及慢速释放成分的制剂中，提供较慢切割的连接体是有用的。WO 02/096910提供了几种具有肼连接体的特异的配体-药物复合体。然而，无法根据所需的环化速度来“调节”连接体组成，并且所说明的特定化合物以慢于许多药物-连接体缀合物所优选的速度从该药物上剪切配体。相比之下，本发明的肼连接体提供了从很快到很慢的环化速度的范围，从而允许基于所希望的环化速度挑选特定的肼连接体。

例如，用切割时产生单一5元环的肼连接体可实现非常快速的环化。用于将细胞毒性剂定向递送至细胞的优选环化速度，可使用肼连接体实现，所述肼连接体在剪切时产生来自在偕位置具有两个甲基的连接体的两个5元环或一个6元环。已显示，与在偕位置没有两个甲基的单一6元环相比，这种偕-二甲基(gem-dimetyl)效应加快了环化反应的速度。这是因为应力在环中得以释放。然而有时，取代基可能减慢反应速度而不是使它变快。通常阻碍的原因可追溯至位阻。例如，与偕碳是CH₂时相比，该偕-二甲基取代使环化反应发生得更快。

然而，重要的是应注意，在一些实施方案中，切割较慢的连接体可以是优选的。例如，在缓释制剂或同时具有快速释放成分以及慢速释放成分的制剂中，提供较慢切割的连接体是有用的。在某些实施方案中，使用肼连接体实现慢速环化，一旦切割肼连接体，将产生没有该偕二甲基取代的单个6元环、或单个7元环。

这些连接体用于在循环中稳定治疗剂或标记物，防止其降解。这一特性提供了重要的有利因素，因为这种稳定性导致所附着的试剂或标记物的循环半衰期延长。该连接体还可用于减弱所附着的试剂或标记物的活性，使得该缀合物在循环时相对为良性，而配偶体在所希望的作用位点激活后具有所希望的效应，例如具有毒性。对于治疗剂缀合物而言，连接体这一特点用于改善该试剂的治疗指数。

稳定化基团被优选地选择出来，以限制由可能存在于血液或者非靶组织中的酶对治疗剂或标记物的清除及代谢，并且进一步选择这些稳定基团，以限制该试剂或者标记物运输进入细胞。这些稳定基团用于阻止该试剂或者标记物的降解，并且也可以在提供该试剂或标记物的其他物理特性中发挥作用。稳定化基团也可以在贮藏中以配制或未配制的形式改善试剂或标记物的稳定性。

理想情况下，该稳定化基团对于稳定治疗剂或标记物是有用，条件是该稳定化基团所起的作用是在通过将治疗剂或标记物在人类血液中于37℃贮藏2小时而进行测试时保护了该治疗剂或标记物免于降解、并且导致在给定的测定条件下存在于人类血液中的酶对该治疗剂或标记物的切割少于20％，优选的少于10％，更优选的少于5％、以及甚至更优选的少于2％。

本发明还涉及包含这些连接体的缀合物。更特别地，本发明涉及前体药物，这些前体药物可用于治疗疾病，特别是癌症化疗。具体而言，使用在此说明的连接体提供了多种前体药物，这些前体药物相对于相似结构的前体药物而言，展示出高的作用特异性、降低的毒性、以及提高的稳定性。

在此说明的本发明的连接体可位于配偶体分子内的多个位置。

因此，提供了一种连接体，该连接体可包含多种基团中的任一基团作为其链的一部分，相对于缺乏此类基团的构建体而言，这些基团在体内(例如，在血流中)剪切的速率增强。还提供了连接臂与治疗剂以及诊断试剂的缀合物。这些连接体对于形成治疗剂的前体药物的类似物是有用的，并且对可逆地将治疗剂或诊断试剂连接至靶定试剂、可检测的标记、或固相支撑体是有用的。该连接体可被掺入到包括细胞毒素的复合体中。

前体药物对抗体的附着可带来另外的超过常规的细胞毒素药物的抗体缀合物的安全性优点。在肿瘤细胞中，以及一些正常的组织(包括血浆)中，都可用酯酶完成前体药物的激活。已经表明人类中相关酯酶的活性水平虽然比在小鼠中观察到的小，但与大鼠以及非人类灵长类动物中观察到的很相似。前体药物的激活也可通过葡糖醛酸糖苷酶的切割完成。

除了可切割的肽、肼、或二硫键基团外，一个或多个的自消连接体基团L¹可任选地被引入至细胞毒素与寻靶试剂之间。这些连接体基团还可被描述为间隔基团，并且包含至少两个反应性官能团。典型地，间隔基团的一个化学官能度键合至该治疗剂(例如细胞毒素)的化学官能度，而间隔基团的其他化学官能度被用于键合至寻靶试剂或者可切割的连接体的化学官能度。间隔基团的化学官能度的实例包括羟基、巯基、羰基、羧基、氨基、酮基、以及巯基基团。

该自消连接体由L¹代表，一般是取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂烷基。在一个实施方案中，该烷基或芳基可以包含1至20个碳原子。它们还可包含聚乙二醇部分。

示例性间隔基团包括，例如6-氨基己醇、6-巯基己醇、10-羟基癸酸、甘氨酸以及其他氨基酸、1，6-己二醇、β-丙氨酸、2-氨基乙醇、半胱胺(2-氨基乙硫醇)、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、3-马来酰亚胺基苯甲酸、苯酞、α-取代的苯酞、羰基、缩醛胺酯、核酸、肽、等等。

该间隔基可以用于引导另外的分子量以及化学官能度进入该细胞毒素-靶向试剂复合体。通常，另外的质量以及官能度将影响该复合体的血清半衰期以及其他特性。因此，通过仔细挑选间隔基团，可以制得具有一系列血清半衰期的细胞毒素复合体。

位于与药物部分直接相邻的位置的一个或多个间隔基也表示为(L1)_m，其中m是选自0、1、2、3、4、5、以及6的整数。当多个L¹间隔基存在时，可使用相同或不同的间隔基。L¹可能是任何自消基团。

L⁴是连接体部分，利用包含该部分或改变该缀合物的水解速率的连接体，它优选地赋予缀合物增大的溶解性或减小的聚集特性。L⁴连接体并非必须是自消亡的。在一个实施方案中，L⁴部分是取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂烷基、或未取代的杂烷基，这些基团中的任一种可以是直链、支链、或环状的。这些取代基可以是例如低级(C¹-C⁶)烷基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、或者二烷基氨基。在一些实施方案中，L⁴包括非环状部分。在另一个实施方案中，L⁴包括带正电或负电的氨基酸聚合物，如聚赖氨酸或聚精氨酸。L⁴可包括诸如聚乙二醇部分的聚合物。另外，L⁴连接体可以包括，例如多聚体成分以及小分子化学部分。

在一个优选的实施方案中，L⁴包括聚乙二醇(PEG)部分。L⁴的PEG部分可以是长度为1到50个单元。优选地，PEG将具有1到12个重复单元，更优选3到12个重复单元，更优选2到6个重复单元，或甚至更优选3到5个重复单元，并且最优选4个重复单元。L⁴可仅仅由PEG部分组成，或也可包括其他的取代或未取代的烷基或杂烷基。将PEG作为L⁴部分的一部分进行组合可以用于提高复合体的水溶性。另外，该PEG部分在药物与抗体缀合时降低了聚集度。

在一些实施方案中，L⁴包含：

其直接附着于(AA¹)_c的N末端。R²⁰是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员。R²⁵、R²⁵’、R²⁶、以及R²⁶’各自独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；并且s和t独立地是1至6的整数。优选地，R²⁰、R²⁵、R²⁵’、R²⁶、以及R²⁶’是疏水的。在一些实施方案中，R²⁰是H或烷基(优选未取代的低级烷基)。在一些实施方案中，R²⁵、R²⁵’、R²⁶以及R²⁶’独立地是H或烷基(优选未取代的C¹-C⁴烷基)。在某些实施方案中，R²⁵、R²⁵’、R²⁶、以及R²⁶’均为H。在某些实施方案中，t是1并且s是1或2。

肽连接体(F)

如上所述，本发明的肽基连接体可由通式(L⁴)_p-F-(L¹)_m表示，其中F表示含有肽基部分(moiety)的连接体部分。在一个实施方案中，该F部分包括一个或多个任选的附加自消连接体(L²)以及羰基基团。在另一个实施方案中，该F部分包括氨基基团以及一个或多个任选的间隔基团L³。

因此，在一个实施方案中，包含该肽连接体的缀合物包括具有下式(a)的结构：

在这一实施方案中，L¹是自消连接体，如以上所述，并且L⁴是一个部分，该部分优选地赋予增强的溶解性、或减少的聚集特性，或改变水解速率，如以上说明。L²表示一个或多个自消连接体。此外，m是0、1、2、3、4、5、或6；并且o和p独立地是0或1。AA¹表示一个或多个天然的氨基酸、和/或非自然的α-氨基酸；c是从1到20的整数。在某些实施方案中，c在2到5的范围内或c是2或3。

在本发明的具有上式(a)的肽连接体中，AA¹在其氨基末端直接连接到L⁴或，当L⁴不存在时，直接连接到X⁴基团(即，靶向试剂、可检测的标记、受保护的反应官能团或不受保护的反应官能团)。在某些实施方案中，当L⁴存在时，L⁴不含直接附着到(AA¹)_c的N末端的羧基酰基基团。因此，在这些实施方案中，不必存在一个直接在L⁴或X⁴与AA¹之间的羧基酰基单元，而在美国专利号6,21 4,345的肽连接体中则是必需的。

在另一个实施方案中，包含肽基连接体的缀合物包括具有下式(b)的结构：

在这一实施方案中，L⁴是一个部分，该部分优选地赋予增加的溶解性、或减少的聚集特性、或改变水解速率，如以上说明；L³是间隔基团，包含伯胺、或仲胺、或羧基官能团，并且L³的胺与D的侧羧基官能团形成酰胺键、或者L³的羧基与D的侧胺基官能团形成酰胺键；并且o和p独立地为0或1。AA¹表示1个或多个天然氨基酸，和/或非天然α-氨基酸；c是从1到20的整数。在这个实施方案中，不存在L¹(即m在该通式中为0) 。

在本发明的具有上式(b)的肽连接体中，AA¹在其氨基末端直接连接到L⁴或，当L⁴不存在时，直接连接到X⁴基团(即，靶向试剂、可检测的标记、受保护的反应官能团或不受保护的反应官能团)。在某些实施方案中，当L⁴存在时，L⁴不含直接附着到(AA¹)_c的N末端的羧基酰基基团。因此，在这些实施方案中，不必存在直接在L⁴或X⁴与AA¹之间的羧基酰基单位，而它在美国专利6,214,345的肽连接体中是必需的。

自消连接体L²

自消连接体L²是双官能化学部分，它能将两个间隔的化学部分共价连接成通常稳定的三节分子，通过酶切割的方法从该三节分子释放所述间隔的化学部分中的一个；在所述酶切割之后，从该分子的其余部分中自发切割而释放所述间隔的化学部分中的另一个。根据本发明，自消间隔基在其一端以共价键与肽部分相连，并在其另一端以共价键与药物部分的化学反应位点相连，药物部分的衍生化会抑制药理学活性，以便间隔并将肽部分与药物部分共价连接成三节分子，该分子在靶标酶不存在的情况下是稳定的，并且无药理活性，但在将间隔基部分与肽部分共价连接的键上可被此类靶标酶进行酶促切割，从而使肽部分从该三节分子中释放。反过来，该酶促切割又能够激活间隔基部分的自消性质，且引发共价连接间隔基部分与药物部分的键的自发断裂，从而实现药理学活性形式的药物的释放。

自消连接体L²可以是任何自消基团。L²优选是取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、未取代的杂环烷基、取代的杂环烷基、取代以及未取代的芳基、以及取代以及未取代的杂芳基。

一个特别优选的自消间隔基L²可以由下式(c)表示：

氨基苄基基团的芳环可被一个或多个“K”基团取代。“K”基团是该芳香环上的取代基，它替换了原本连接为部分环结构的四个未取代的碳原子之一的氢。“K”基团可能是单个原子，如卤素，或可能是多原子的基团，如烷基、杂烷基、氨基、硝基、羟基、烷氧基、卤烷基、以及氰基。每一个K独立地选自：取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR²¹R²²、NR²¹COR²²、OCONR²¹R²²、OCOR²¹、以及OR²¹，其中R²¹和R²²独立地选自：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、以及未取代的杂环烷基。示例性K取代基包括但不限于F、Cl、Br、I、NO₂、OH、OCH₃、NHCOCH₃、N(CH₃)₂、NHCOCF₃、以及甲基。对于“K_i”，i是0、1、2、3或4的整数。在一个优选的实施方案中，i是0。

以上显示的结构的醚氧原子与羰基相连。从NR²⁴官能度进入芳环的线表示胺功能度可能被键合至5个碳的任何一个，其都形成环并且未被-CH₂-O-基团取代。优选地，X的NR²⁴官能度以相对于-CH₂-O-的对位与芳环共价结合。R²⁴是选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基。在一个具体的实施方案中，R²⁴是H。

在一个实施方案中，本发明提供具有上式(a)的肽连接体，其中F包含以下结构：

其中，R²⁴是选自下组的成员，该组的构成是：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基。每一个K均是独立地选自下组的成员：取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR²¹R²²、NR²¹COR²²、OCONR²¹R²²、OCOR²¹、以及OR²¹，其中R²¹和R²²独立地选自：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、以及未取代的杂环烷基，并且i是整数0、1、2、3、或4。

在另一个实施方案中，具有上式(a)的肽连接体包含-F-(L¹)_m-，它含有以下结构：

其中，每一个R²⁴均是选自下组的成员，该组的构成是：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基。

在一些实施方案中，自消间隔基L¹或L²包括：

其中R¹⁷、R¹⁸、以及R¹⁹各自均独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，并且w是从0到4的整数。在一些实施方案中，R¹⁷和R¹⁸独立地是H或烷基(优选未取代的C1-4烷基)。优选地，R¹⁷和R¹⁸是C₁-C₄烷基，如甲基或乙基。一些实施方案中，w是0。尽管不希望被任何特定的理论束缚，已经有实验发现，这个特定的自消间隔基成环速度相对较快。

在一些实施方案中，L¹或L²包括：

间隔基团L³

间隔基团L³的特征在于它包括伯胺或仲胺或羧基官能团，并且L³基团的胺与D的侧羧基官能团形成酰胺键，或者L³的羧基与D的侧胺官能团形成酰胺键。L³可选自下组，其构成是：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、或取代或未取代的杂环烷基。在一个优选的实施方案中，L³包含芳香族基团。更优选地，L³包括苯甲酸基团、苯胺基团、或吲哚基团。用作-L³-NH-间隔基的结构的非限制性实例包括以下结构：

其中Z是选自O、S和NR²³的成员，并且其中R²³是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员。

切割包含本发明的L³的连接体时，L³部分仍然附着在药物D上。因此，选择L³部分，使得它附着到D的存在不会显著地影响D的活性。在另一个实施方案中，药物D的一部分本身起L³间隔基的功能。例如，在一个实施方案中，药物D是多卡米星(duocarmycin)的衍生物，其中药物的部分起L³间隔基的作用。此类实施方案的非限制性实例包括那些实例，其中NH₂-(L³)-D具有选自如下的结构：

以及

其中，Z是选自O、S、以及NR²³的成员，其中R²³是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员；并且其中各个结构上的NH₂基团与(AA¹)_c进行反应形成-(AA¹)_c-NH-。

肽序列AA¹

基团AA¹表示单个氨基酸或由酰胺键连接到一起的多个氨基酸。这些氨基酸可能是天然氨基酸和/或非天然α-氨基酸。

肽序列(AA¹)_c在功能上是单个氨基酸(c＝1时)或通过酰胺键连接在一起的多个氨基酸的酰胺化残基。选择本发明的肽用于在生物***中在目的位置指导酶进行的肽的酶催化切割。例如，对于使用靶向试剂被靶向至细胞但是并未被该细胞内化的缀合物，选择肽，通过存在于细胞外基质中的一种或多种蛋白酶对该肽进行剪切，例如由于附近濒于死亡的细胞释放细胞内物质，使得该肽在细胞外被剪切。在肽中氨基酸的数目可在从1到20的范围内；但是更优选(AA¹)_c包含1至8个氨基酸、1至6个氨基酸、或1、2、3、或4个氨基酸。容易被特定的酶或酶类切割的肽序列在本领域是已经熟知的。

许多被血清、肝、肠等中的酶切割的肽的序列在本领域是已知的。本发明的示例性肽序列包括一种被蛋白酶切割的肽序列。以下关于蛋白酶敏感序列的用途的讨论的中心是为了阐述的清晰性，并不用于限制本发明的范围。

当切割该肽的酶是蛋白酶时，该连接体一般包括包含蛋白酶切割识别序列的肽。蛋白酶的切割识别序列是在蛋白水解切割过程中被蛋白酶所识别的特定的氨基酸序列。许多蛋白酶切割位点在本领域中是已知的，并且这些以及其他切割位点可以被包括在该连接体部分中。见，例如Matayoshiet al.Science 247：954(1990)；Dunn et al.Meth.Enzymol.241：254(1994)；Seidah et al.Meth.Enzymol.244：175(1994)；Thornberry，Meth.Enzymol.244：615(1994)；Weber et al.Meth.Enzymol. 244：595(1994)；Smith et al.Meth.Enzymol.244：412(1994)；Bouvier et al.Meth.Enzymol.248：614(1995)，Hardy et al.，in Amyloid Protein Precursor in Development，Aging，and Alzheimer′s Disease，ed.Masters et al.pp.190-198(1994)。

基于肽序列(AA¹)_c的氨基酸对于由特定分子(例如肿瘤相关蛋白酶)进行选择性酶切的适宜性，对肽序列(AA1)_c的氨基酸进行选择。所用的氨基酸可以是天然或非天然氨基酸。它们可能是L或D构型。在一个实施方案中，使用了至少三种不同的氨基酸。在另一个实施方案中，仅仅使用了两种氨基酸。

在一个优选的实施方案中，选择肽序列(AA¹)_c是基于它被溶酶体蛋白酶剪切的能力，这些蛋白酶的非限制性实例包括组织蛋白酶B、C、D、H、L、以及S。优选地，该肽序列(AA¹)_c在体外能被组织蛋白酶B切割，这可以使用本领域已知的体外蛋白酶切割测定法进行测试。

在另一个实施方案中，选择肽序列(AA¹)_c是基于它被肿瘤相关蛋白酶剪切的能力，该蛋白酶例如在肿瘤细胞附近在细胞外发现的蛋白酶，其非限制性实例包括甲拌磷寡肽酶(TOP)和CD10。肽能被TOP或CD10切割的能力可用本领域已知的体外蛋白酶切割测定法进行测试。

适宜在本发明的缀合物中使用的适宜的但非限制性的肽序列实例包括Val-Cit、Cit-Cit、Val-Lys、Phe-Lys、Lys-Lys、Ala-Lys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp、Cit、Phe-Ala、Phe-N⁹-tosyl-Arg、Phe-N⁹-nitro-Arg、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Leu-Ala-Leu、Ile-Ala-Leu、Val-Ala-Val、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：88)、β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQID NO：89)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ.ID NO：90)、Val-Ala，Leu-Leu-Gly-Leu(SEQ ID NO：101)、Leu-Asn-Ala、以及Lys-Leu-Val。优选的肽序列是Val-Cit和Val-Lys。

在另一个实施方案中，位于与药物部分最近的位置的氨基酸选自：Ala、Asn、Asp、Cit、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、以及Val。在又一个实施方案中，位于与药物部分最近的位置的氨基酸选自：Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、以及Val。

蛋白酶与癌症转移有关。蛋白酶尿激酶合成的增加在许多癌症中与转移能力的增加相关。尿激酶将纤溶酶原激活为纤溶酶，纤溶酶原在细胞外间隙中广泛存在，并且其激活作用导致细胞外基质中的蛋白降解，由此转移性肿瘤细胞侵入。纤溶酶也可以激活胶原酶，因此促进在围绕毛细管以及淋巴***的基底膜中胶原的降解，由此允许肿瘤细胞侵入到靶组织中(Dano，et al.Adv.Cancer.Res.，44：139(1985))。因此，使用通过尿激酶剪切的肽序列作为连接体也在本发明的范围内。

本发明也提供对类胰蛋白酶切割敏感的肽序列的用途。人类的肥大细胞表达至少四种不同的类胰蛋白酶，被称作α、βI、βII、以及βIII。这些酶不被血浆蛋白酶抑制剂控制，并且仅在体外切割一些生理学底物。丝氨酸蛋白酶的类胰蛋白酶家族与涉及肥大细胞的多种过敏性疾病以及炎性疾病有关，因为在患有这些病症的患者的生物液体里发现了类胰蛋白酶水平升高。然而，仍需要对类胰蛋白酶在疾病的病理生理学中的确切作用进行描绘。类胰蛋白酶的生物学功能的范围以及相应的生理学结果基本上由它们的底物特异性限定。

类胰蛋白酶是前-尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)的有效的激活剂，uPA是与肿瘤转移以及侵入有关的蛋白酶的酶原形式。纤溶酶原级联反应的激活(导致细胞外基质的破坏而产生细胞溢出以及迁移)可以是在Pro-Arg-Phe-Lys的P4-P1序列(SEQ ID NO：91)上类胰蛋白酶激活化前-尿激酶纤溶酶原激活物的函数(Stack et al.Journal of Biological Chemistry269(13)：9416-9419(1994))。血管活性肠肽(一种神经肽，与血管渗透性的调控有关)也被类胰蛋白酶切割，主要在Thr-Arg-Leu-Arg(SEQ.IDNO：92)序列处切割(Tam，et al.，Am.J.Respir.Cell Mol. Biol. 3：27-32(1990))。G-蛋白偶联的受体PAR-2可在Ser-Lys-Gly-Arg(SEQ.ID NO：93)序列上被剪切并被类胰蛋白酶激活，以促进成纤维细胞的增殖，而凝血酶激活受体PRA-1在Pro-Asn-Asp-Lys(SEQ.ID NO：94)序列上被类胰蛋白酶失活(Molino et al.，Journal of Biological Chemistry 272(7)：4043-4049(1997))。综合在一起，这一证据提示类蛋白激酶在疾病导致的组织重塑中起核心作用。这与在几个肥大细胞介导的病症中观察到的深刻变化一致。慢性哮喘以及其他的长期的呼吸道疾病的特点是下面组织(underlyingtissue)的纤维化以及增厚，这可能是类胰蛋白酶激活其生理学靶标的结果。类似地，一系列报道已经表明血管生成与多种癌症中的肥大细胞密度、类胰蛋白酶活性、以及不良的预后有关(Coussens et al.，Genes andDevelopment 13(11)：1382-97(1999))；Takanami et al.，Cancer 88(12)：2686-92(2000)；Toth-Jakatics et al.，Human Pathology 31(8)：955-960(2000)；Ribatti et al.，International Journal of Cancer 85(2)：171-5(2000))。

本领域已知评价特定的蛋白酶是否切割已选择的肽序列的方法。例如，使用7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)荧光肽底物是确定蛋白酶特异性的已很好确立的方法(Zimmerman，M.，et al.，(1977)Analytical Biochemistry78：47-51)。N-酰苯胺键(anilide bond)的特异性切割释放荧光AMC离去基团，允许对各个底物的切割速率进行简单测定。近来，通过在单个实验中对宽范围的底物进行取样，可采用AMC肽底物文库的阵列(Lee D.etal.(1999)Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 9：1667-72)和位置扫描(positional-scanning)文库(Rano T.A.et al.(1997)Chemistry andBiology 4：149-55)快速描绘蛋白酶的N末端的特异性。因此，本领域中的技术人员可容易地评定肽序列的阵列，以确定它们在本发明中的效用，而不用采取过度的实验。

本发明的抗体-配偶体缀合物可任选地包含两个或两个以上连接体。这些连接体可以相同或不同。例如，肽基连接体可能用于将药物连接到配体上，并且第二肽基连接体可将诊断试剂附着到复合体上。另外的连接体的其他用途包括将分析试剂、生物分子、靶向试剂、以及可检测标记连接到抗体-配偶体复合体。

同样在本发明的范围之内的是本发明的化合物，它们是多价的种类，包括，例如，诸如本发明的化合物或其反应性类似物的二聚体、三聚体、四聚体、或更高的同系物。多价的种类可由本发明的单一种类或多于一个种类装配而成。例如，二聚体构建体可为“均二聚体”或者“异二聚体”。此外，多价的构建体(其中本发明的化合物或其反应性类似物附着到寡聚或多聚构架)(例如聚赖氨酸、右旋糖酐、羟乙基淀粉、以及类似物)也是在本发明的范围内，该构架优选是多官能的(即，具有一批用于附着本发明的化合物的反应性位点)。此外，该构架可用本发明的单一种类或本发明的多于一个的种类进行衍生。

此外，本发明包括多种化合物，这些化合物相对于没有类似地被官能化的类似化合物而言，被官能化以产生具有增强了的水溶性的化合物。因此，在此给出的取代基中的任何取代基可被类似的具有增强了的水溶性的基团替换。例如，用二醇或具有季铵、羟基胺或类似的更具有水溶性部分的胺替换羟基基团，这也在本发明的范围内。在一个优选的实施方案中，通过用增强亲本化合物水溶性的部分对在此给出的化合物的离子通道的活性不是必需的位点进行取代，赋予了附加的水溶性。增强有机化合物水溶性的方法在本领域中是已知的。此类方法包括，但不局限于，用永久带电的部分，例如季铵、或在生理学上相关的pH条件下带电的基团(例如羧酸、胺)使有机核官能化。其他方法包括向有机核添加包含羟基或胺的基团，例如醇、多元醇、聚醚、等等。代表性的例子包括但不局限于，聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(乙二醇)以及聚(丙二醇)。这些化合物的适宜的官能化化学以及方案在本领域中是已知的。见，例如，Dunn，R.L.，et al.，Eds.Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems，ACS Symposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。

肼连接体(H)

在第二实施方案中，本发明的缀合物包含肼自消连接体，其中该缀合物具有以下结构：

X⁴-(L⁴)_p-H-(L¹)_m-D

其中，D、L¹、L⁴、以及X⁴如上所限定，并且在此处进一步说明，并且H是包含以下结构的连接体：

其中n₁是从1至10的整数；n₂是0、1、或2；每个R²⁴均是独立地选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基；并且I或是一个键(即，主链上的碳原子与临近氮原子之间的键)、或是以下结构：

其中，n₃是0或1，条件是当n₃是0时，n₂不是0；并且n₄是1、2或3，其中当I是一个键，n₁是3，并且n₂是1时，D不能是：

其中R是Me或CH₂-CH₂-NMe₂。

在一个实施方案中，苯环上的取代是对位取代。在优选的实施方案中，n₁是2、3、或4或n₁是3。在优选的实施方案中，n₂是1。在优选的实施方案中，I是一个键(即，主链上的碳原子与临近氮原子之间的键)。一方面，肼连接体H可在切割时形成一个6元的自消连接体，例如当n₃是0并且n₄是2时。另一方面，肼连接体H可在切割时形成两个5元的自消连接体。在其他方面，切割时，H形成一个5元的自消连接体、H形成一个7元的自消连接体、或H形成一个5元的自消连接体以及一个6元的自消连接体。切割速率受切割时形成的环大小的影响。因此，依据所希望的剪切速率，可选择剪切时形成的适宜大小的环。

五元的肼连接体

在一个实施方案中，该肼连接体包括一个5元的肼连接体，其中H包括以下结构：

在一个优选的实施方案中，n₁是2、3或4。在另一个优选的实施方案中，n₁是3。

在以上结构中，每个R²⁴是独立选自：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基的成员。在一个实施方案中，每个R²⁴均独立地为H或C₁-C₆烷基。在另一个实施方案中，每个R²⁴均独立地为H或C₁-C₃烷基，更优选H或CH₃。在另一个实施方案中，至少一个R²⁴为甲基基团。在另一个实施方案中，每个R²⁴均是H。对每个R²⁴进行选择以调整化合物的空间效应并且用于改变溶解性。

5元的肼连接体可经历一次或更多环化反应，将药物与连接体分开，并且可以通过例如下式进行说明：

制备本发明的5元的连接体的示例性合成路线为：

在亚硫酰二氯溶液中，受Cbz保护的DMDA b与2，2-二甲基丙二酸a反应，形成Cbz-DMDA-2，2-二甲基丙二酸c。在EDC存在下，化合物c与Boc-N-甲基肼d反应，形成DMDA-2，2-二甲基丙二酸-Boc-N-甲基肼e。

六元的肼连接体

在另一个实施方案中，该肼连接体包括一个6元的肼连接体，其中H包括以下结构：

在一个优选的实施方案中，n₁是3。在以上结构中，每个R²⁴是独立地选自如下的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基。在一个实施方案中，每个R²⁴独立地为H或C₁-C₆烷基。在另一个实施方案中，每个R²⁴均独立地为H或C₁-C₃烷基，更优选H或CH₃。在另一个实施方案中，至少一个R²⁴为甲基基团。在另一个实施方案中，每个R²⁴均是H。每个R²⁴被选择为对该化合物的位阻效应进行调整并且用于改变溶解性。在一个优选的实施方案中，H包括以下结构：

在一个实施方案中，H包括偕二甲基取代。在以上结构的一个实施方案中，每个R²⁴均独立地为H或取代或未取代的烷基。

6元肼连接体会经历环化反应，该反应将该药物与该连接体分开，并可被描述为：

制备本发明的6元连接体的示例性合成路线为：

在含二氯甲烷的溶液中，受Cbz保护的二甲基丙氨酸a与HOAt、以及CPI反应，形成受Cbz保护的二甲基丙氨酸肼b。该肼b通过甲醇作用而被脱保护，形成化合物c。

其他肼连接体

预期本发明包括七元的连接体。这一连接体不可能像五元或六元连接体那样快的进行环化，但对一些抗体-配偶体缀合物而言这可能是优选的。类似地，该肼连接体可包括两个六元环或具有一个六元及一个五元环化产物的肼连接体。还考虑了一个五元以及七元连接体以及一个六元以及七元的连接体。

另一种肼结构H具有下式：

其中q是0、1、2、3、4、5、或6；并且

每个R²⁴均是独立地选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基。该肼结构也可形成五-、六-、或七-元环，并且可以加入附加成分以形成多个环。

二硫化物连接体(J)

在又一个实施方案中，该连接体包括可进行酶促切割的二硫化物基团。在一个实施方案中，本发明提供一种具有式(d)结构的细胞毒性抗体-配偶体化合物：

其中，D、L¹、L⁴、以及X⁴如以上所定义，并且在此进一步说明，并且J是包括具有以下结构的基团的二硫化物连接体：

其中，每个R²⁴均是独立地选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、以及未取代的杂烷基；每个K均是独立地选自下组的成员：取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR²¹R²²、NR²¹COR²²、OCONR²¹R²²、OCOR²¹、以及OR²¹，其中，R²¹和R²²独立地是选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、以及未取代的杂环烷基；i是0、1、2、3、或4的整数；并且d是0、1、2、3、4、5、或6的整数。

该二硫化物连接体的芳香环可用一个或多个“K”基团取代。“K”基团是芳香环上的取代基，它替换原本附着于为部分环结构的四个未取代的碳之一的氢。“K”基团可以是单个原子，如卤素，或可以是多原子的基团，如烷基、杂烷基、氨基、硝基、羟基、烷氧基、卤烷基、以及氰基。示例性的K取代基独立地包括但不限于F、Cl、Br、I、NO₂、OH、OCH₃、NHCOCH₃、N(CH₃)₂、NHCOCF₃、以及甲基。对于“K_i”，i是0、1、2、3或4的整数。在一个特定实施方案中，i是0。

在一个优选的实施方案中，该连接体包含具有下式的可酶促切割的二硫化物基团：

在这一实施方案中，L⁴、X⁴、p、以及R²⁴的身份已如以上说明，并且d是0、1、2、3、4、5、或6。在一个特定实施方案中，d是1或2。

更具体的二硫化物连接体如下式所示

这一实施方案的一个特定实例如下：

优选地，d是1或2。

另一种二硫化物连接体如下式所示：

这一实施方案的一个特定实例如下：

优选地，d是1或2。

在不同的实施方案中，二硫化物在胺的邻位。在另一个特定的实施方案中，a是0。在一个优选的实施方案中，R²⁴独立地选自H和CH₃。

制备本发明的二硫化物连接体的示例性合成路线如下：

3-巯基丙酸a的溶液与二吡啶基二硫(aldrithiol-2)进行反应，形成碘化3-甲基苯并噻唑鎓(3-methyl benzothiazolium iodide)b。碘化3-甲基苯并噻唑鎓c与氢氧化钠进行反应，形成化合物d。化合物d的甲醇溶液与化合物b进一步反应，形成化合物e。通过乙酰氯与甲醇的作用，化合物e被脱保护，形成化合物f。

对于细胞毒素的类型、连接体、以及将治疗剂缀合至抗体的方法的进一步讨论，还参见Gangwar等人的PCT公开文件WO 2007/05940，且标题为“Cytotoxic Compounds And Conjugates，”Saito，G.et al.(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.et al.(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.and Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter，P.D.and Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264，它们中的每一个的全文均并入本文作为参考。

配偶体分子

一方面，本发明的描述了缀合配偶体分子(例如细胞毒素、药物(如免疫抑制剂)或放射性毒素)的抗体。此类缀合物在此也被称为“免疫连接物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫连接物被称为“免疫毒素”。细胞毒素或者细胞毒性剂包括任何对细胞有害(例如杀死细胞)的试剂。

本发明的配偶体分子的实例包括紫杉醇、松胞菌素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anth racindione)、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、***、以及嘌呤霉素、以及其类似物或同系物。配偶体分子的实例还包括，例如抗代谢物(如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氮烯咪胺)、烷基化试剂(如氮芥、噻替哌、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)及洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C，及顺铂(II)(DDP顺铂)、蒽环类抗生素(如柔红比星(以前称柔红霉素)以及阿霉素)，抗生素(如更生霉素(以前称放线菌素)、博来霉素、光辉霉素，及安曲霉素(AMC))，以及抗有丝***剂(如长春新碱以及长春碱)。

其他可与本发明的抗体缀合的配偶体优选实例包括都卡霉素、加利车霉素、美登素、以及阿里斯达汀(auristatin)、以及其衍生物。加利车霉素抗体缀合物的一种实例是可商购的(

American HomeProducts)。

配偶体分子的优选的例子是CC-1065以及都卡霉素。CC-1065首次由Upjohn公司从泽尔链霉菌(streptomyces zelensis)分离出来(Hanka et al.，J.Antibiot.31：1211(1978)；Martin et al.，J.Antibiot.33：902(1980)；Martinet al.，J.Antibiot.34：1119(1981))，并且被发现在体外以及在实验动物中都具有有效的抗肿瘤以及抗微生物活性(Li et al.，Cancer Res.42：999(1982))。CC-1065结合到双链B-DNA的具有优先序列为5′-d(A/GNTTA)-3′以及5′-d(AAAAA)-3′的小沟内(Swenson et al.，Cancer Res.42：2821(1982))，并且通过它在分子中存在的CPI左手单元使3′-腺嘌呤的N3位置烷基化(Hurley et al.，Science 226：843(1984))。尽管CC-1065具有有效且广泛的抗肿瘤活性，但因为CC-1065引起了实验动物的迟缓死亡，所以它不能被用于人类。

CC-1065以及都卡霉素的许多类似物以及衍生物在本领域是已知的。已对许多化合物的结构、合成以及特性的研究进行综述。参见，例如，Bogeret al.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：1438(1996)；以及Boger et al.，Chem.Rev.97：787(1997)。

Kyowa Hakko Kogya Co.，Ltd.的一个团队已经制备了许多CC-1065衍生物。参见，例如，美国专利号5,101,038；5,641,780；5,187,186；5,070,092；5,703,080；5,070,092；5,641,780；5,101,038；以及5,084,468；以及已公开的PCT申请WO 96/10405以及已公开的欧洲申请0 537 575 A1。

Upjohn Company(Pharmacia Upjohn)已经在积极制备CC-1065的衍生物。参见，例如，美国专利号5,739,350、4,978,757、5,332,837、以及4,912,227。

本发明的一个特别优选的方面提供了细胞毒素化合物，该化合物具有根据下式(e)的结构：

其中，环体系A是选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基中的成员。示例性的环体系包括苯基以及吡咯。

符号E和G独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键，或者E和G可任选地进行结合形成一个环状体系，该体系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基。

符号X表示选自O、S以及NR²³中的成员。R²³是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员。

符号R³表示选自(＝O)、SR¹¹、NHR¹¹以及OR¹¹中的成员，其中R¹¹是H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磺酸酯、酰基、C(O)R¹²R¹³、C(O)OR¹²、C(O)NR¹²R¹³、P(O)(OR¹²)₂、C(O)CHR¹²R¹³、SR¹²或SiR¹²R¹³R¹⁴。符号R¹²、R¹³、以及R¹⁴独立地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，其中R¹²和R¹³与它们所附着的氮原子或碳原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，可任选地包含2个或多个杂原子。R¹²、R¹³、或R¹⁴中的一个或多个在其结构内可包括可切割的基团。

R⁴、R⁴’、R⁵以及R⁵’是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁵R¹⁶、NC(O)R¹⁵、OC(O)NR¹⁵R¹⁶、OC(O)OR¹⁵、C(O)R¹⁵、SR¹⁵、OR¹⁵、CR¹⁵＝NR¹⁶、以及O(CH₂)_nN(CH₃)₂的成员，其中，n是从1到20的整数，或者R⁴、R⁴’、R⁵及R⁵’的任何相邻的一对与它们所附着的碳原子连接在一起以形成一个有4到6元的取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系。R¹⁵和R¹⁶独立地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R¹⁵和R¹⁶与它们所附着的氮原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，可任选地包含两个或更多个杂原子。一个示例性的结构是苯胺。

R⁴、R⁴’、R⁵、R⁵’、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁵以及R¹⁶在它们的结构内可任选地包括一个或多个可切割的基团，例如可切割的连接体或可切割的底物。示例性的可切割的基团包括，但不限于肽、氨基酸、肼、二硫化物、以及头孢菌素衍生物。

在一些实施方案中，R⁴、R⁴’、R⁵、R⁵’、R¹¹、R¹²、R³、R¹⁵以及R¹⁶中的至少一个用于将药物与本发明的连接体或酶可切割的底物相结合，如此处所说明的，例如连接至L¹上(如果存在)，或连接至F、H、J、或X²、或J上。

在又一个示例性实施方案中，R⁴、R⁴’、R⁵、R⁵’、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁵以及R¹⁶中的至少一个带有适合用于缀合该化合物的反应基。在另一个示例性实施方案中，R⁴、R⁴’、R⁵、R⁵’、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁵以及R¹⁶独立地选自H、取代的烷基以及取代的杂烷基，并且在烷基或杂烷基部分的游离末端具有反应官能团。R⁴、R⁴’、R⁵、R⁵’、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁵以及R¹⁶中的一个或多个可以缀合到另一种类上，例如，靶向试剂、可检测的标记、固相支持体等。

R⁶是单键，它存在或不存在。当R⁶存在时，R⁶和R⁷结合形成一个环丙基环。R⁷是CH₂-X¹或-CH₂-。当R⁷是-CH₂-时，它是环丙烷环的一个组成部分。符号X¹表示离去基团如卤素，例如Cl、Br或F。以不会违反化学价原则的方式解释R⁶和R⁷的组合。

X¹可以是任何离去基团。有用的离去基团包括但不限于卤素、叠氮化物、磺基酯(如烷基磺酰基、芳基磺酰基)、氧鎓离子、高氯酸烷基酯、氨基烷烃磺酸酯、烷基氟代磺酸酯以及氟化化合物(如三氟甲磺酸盐、全氟丁基甲磺酸盐、三氟乙磺酸盐)等等。用作离去基团的具体卤素是F、Cl以及Br。对于特定的反应条件组来说适当的这些以及其他离去基团的选择在本领域的普通技术人员的能力之内(参见，例如，March J，AdvancedOrganic Chemistry，2nd Edition，John Wiley and Sons，1992；Sandler SR，Karo W，Organic Functional Group Preparations，2nd Edition，AcademicPress，Inc.，1983；以及Wade LG，Compendium of Organic SyntheticMethods，John Wiley and Sons，1980)。

六元环中的曲线表明该环可具有一个或多个不饱和度，并且它可以是芳族的。因此，环结构(如以下所给出)、以及相关结构在式(f)的范围内：

在一些实施方案中，R⁴、R⁴’、R⁵、以及R⁵’中的至少一个将所述药物连接至L¹(如果存在)上，或连接至F、H、J、或X²上，并且包括

其中v是从1到6的整数；并且R²⁷、R²⁷’、R²⁸以及R²⁸′各自均独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基。在一些实施方案中，R²⁷、R²⁷’、R²⁸以及R²⁸’都是H。在一些实施方案中，v是从1到3的整数(优选是1)。这一单位可用于将芳基取代基与药物分开，并因此阻碍或避免产生多抗药性的底物的化合物。

在一个实施方案中，R¹¹包括一个部分X⁵，它不会自我环化，并将药物连接至L¹(如果存在)上，或连接至F、H、J、或X²上。部分X⁵优选使用酶可剪切，并且被剪切时提供活性药物。作为一个实例，R¹¹可具有以下结构(其右侧与药物的其余部分相偶联)：

在一个示例性实施方案中，式(e)的环状体系A是取代或未取代的苯基环。环状体系A可被在本文定义部分中给出的一个或多个芳基取代基所取代。在一些实施方案中，该苯基环被CN或甲氧基部分所取代。

在一些实施方案中，R⁴、R⁴’、R⁵、以及R⁵’中的至少一个将所述药物与L¹(如果存在)相连接，或与F、H、J、或X²相连接，并且R³选自SR¹¹、NHR¹¹以及OR¹¹。R¹¹选自-SO(OH)₂、-PO(OH)₂、-AA_n、-Si(CH₃)₂C(CH₃)₃、-C(O)OPhNH(AA)_m、

或任何其他糖、或多种糖的组合、

及其药学上可接受的盐，其中n是1到10范围内的任意整数，m是1到4范围内的任意整数，p是1到6范围内的任意整数，并且AA是任何天然或非天然氨基酸。在一些实施方案中，AA_n或AA_m选自以上说明的肽连接体(F)的相同氨基酸序列并且任选地与在R⁴、R⁴’、R⁵或R⁵’的连接体部分所用的氨基酸序列相同。在至少一些实施方案中，R³在体内是可切割的以提供一种活性药物化合物。在至少一些实施方案中，R³提高化合物在体内的溶解度。在一些实施方案中，血液中活性药物浓度降低的速率实质上快于提供活性药物的R³的切割速率。当活性药物的毒性实质上高于药物前体形式的毒性时，这可能是特别有用的。在其他的实施方案中，为提供活性药物而剪切R³的速率快于血液中活性药物浓度的降低的速率。

在另一个示例性实施方案中，本发明提供了具有根据式(g)的结构的化合物：

在这个实施方案中，取代基R³、R⁴、R⁴’、R⁵、R⁵’、R⁶、R⁷以及X的身份，以及对于特定的实施方案的优选项，基本上如同以上对于式(a)所做的说明所述。符号Z是独立选自O、S和NR²³的成员。符号R²³表示选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员。对每个R²³进行独立地选择。符号R¹代表H、取代或未取代的低级烷基，或C(O)R⁸或CO₂R⁸。R⁸是选自取代的烷基、未取代的烷基、NR⁹R¹⁰、NR⁹NHR¹⁰以及OR⁹的成员。R⁹和R¹⁰独立地选自H、取代或未取代的烷基、以及取代或未取代的杂烷基。R²是H、或取代或未取代的低级烷基。通常优选的是当R²是取代的烷基时，它不同于全氟烷基，例如CF₃。在一个实施方案中，R²是取代的烷基，其中取代基不是卤素。在另一个实施方案中，R²是一个未取代的烷基。

在一些实施方案中，R¹是酯部分，例如CO₂CH₃。在一些实施方案中，R²是低级烷基，它可以是取代或未取代的。目前优选的低级烷基是CH₃。在一些优选的实施方案中，R¹是CO₂CH₃且R²是CH₃。

在一些实施方案中，R⁴、R⁴’、R⁵、以及R⁵’是独立地选自H、卤素、NH₂、OMe、O(CH₂)₂N(R²⁹)₂、以及NO₂的成员。每个R²⁹均独立地是H或低级烷基(例如甲基)。

在一些实施方案中，对药物进行选择，使离去基团X¹是选自下组的成员：卤素、烷基磺酰基、芳基磺酰基、以及叠氮化物。在一些实施方案中，X¹是F、Cl、或Br。

在一些实施方案中，Z是O或NH。在一些实施方案中，X是O。

在又一个示例性实施方案中，本发明提供了具有根据式(h)或(i)的结构的化合物：

式(e)的都卡霉素类似物的另一个优选的结构是一个结构，其中环状体系A是未取代的或取代的苯基环。当环状体系A是吡咯时，在以上说明的具有式7的结构的药物分子上的优选的取代基也是当环状体系A是未取代的或取代的苯基环时优选的取代基。

例如，在一个优选的实施方案中，药物(D)包含结构(j)：

在这个结构中，R³、R⁶、R⁷、X如以上式(e)中说明。此外，Z是选自O、S以及NR²³的成员，其中R²³是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员；

R¹是H、取代或未取代的低级烷基、C(O)R⁸、或CO₂R⁸，其中R⁸是选自NR⁹R¹⁰和OR⁹的成员，其中R⁹和R¹⁰是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基的成员；

R¹’是H、取代或未取代的低级烷基、或C(O)R⁸，其中R⁸是选自NR⁹R¹⁰和OR⁹的成员，其中R⁹和R¹⁰是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基的成员；

R²是H、或取代或未取代的低级烷基、或未取代的杂烷基、或氰基、或烷氧基；R²’是H、或取代或未取代的低级烷基、或未取代的杂烷基。

R⁴、R⁴’、R⁵、R⁵’、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁵或R¹⁶中的至少一个将药物连接至L¹(如果存在)上，或连接至F、H、J、或X²上。

药物(D)的另一个实施方案包括结构(k)，其中R⁴和R⁴’已相结合形成杂环烷基：

在这个结构中，R³、R⁵、R⁵’、R⁶、R⁷、X如以上式(e)所说明。此外，Z是选自O、S以及NR²³的成员，其中R²³是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、和酰基的成员；

R³²选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁵R¹⁶、NC(O)R¹⁵、OC(O)NR¹⁵R¹⁶、OC(O)OR¹⁵、C(O)R¹⁵、SR¹⁵、OR¹⁵、CR¹⁵＝NR¹⁶、以及O(CH₂)_nN(CH₃)₂，其中，n是从1到20的整数。R¹⁵和R¹⁶独自地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基以及取代或未取代的肽基，其中R¹⁵和R¹⁶与它们所附着的氮原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有从4到6元，任选地包含两个或更多个杂原子。R³²在其结构内任选地包含一个或多个可切割的基团，例如可切割的连接体或可切割的底物。示例性的可切割的基团包括，但不限于肽、氨基酸、肼、二硫化物、以及头孢菌素衍生物。而且，此处说明的R⁴、R⁴’、R⁵、R⁵’、R¹⁵、以及R¹⁶的取代基的任何选择也可应用于R³²。

R⁵、R⁵’、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁵、R¹⁶、或R³²中的至少一个将该药物连接至L¹(如果存在)上，或连接至F、H、J、或X²上。在至少一些实施方案中，R³²将药物连接至L¹(如果存在)上，或连接至F、H、J、或X²上。

这个化合物的一个优选的实施方案是：

另一个实施方案具有下式：

在这个结构中，A、R⁶、R⁷、X、R⁴、R⁴’、R⁵以及R⁵’如以上式(e)所说明。此外，Z是选自O、S以及NR²³的成员，其中R²³是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员；

R³³选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁵R¹⁶、NC(O)R¹⁵、OC(O)NR¹⁵R¹⁶、OC(O)OR¹⁵、C(O)R¹⁵、SR¹⁵、OR¹⁵、CR¹⁵＝NR¹⁶、以及O(CH₂)_nN(CH₃)₂，其中，n是从1到20的整数。R¹⁵和R¹⁶独自地表示H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基以及取代或未取代的肽基，其中R¹⁵和R¹⁶与它们所附着的氮原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多个杂原子。R³³将药物连接至L¹(如果存在)上，或连接至F、H、J、或X²上。

优选地，A是取代或未取代的苯基或取代或未取代的吡咯。另外，此处说明的用于R¹¹的取代基的任何选择也可应用于R³³。

配体

X⁴表示一种配体，该配体选自：受保护的反应官能团、未受保护的反应官能团、可检测的标记、以及靶向试剂。优选的配体是靶向试剂，如抗体及其片段。

在一些实施方案中，基团X⁴可以被说明为选自R²⁹、COOR²⁹、C(O)NR²⁹、以及C(O)NNR²⁹的成员，其中R²⁹是选自取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的杂芳基的成员。在又一个示例性的实施方案中，R²⁹是硫醇反应成员。在另一个示例性实施方案中，R²⁹是硫醇反应成员，选自卤代乙酰基以及烷基卤衍生物、马来酰亚胺、氮丙啶、以及丙烯酰衍生物。以上的硫醇反应成员可以充当反应保护基团，这些反应保护基团可以与(例如)靶向试剂(如抗体)的氨基酸侧链反应，由此使该靶向试剂连接至该连接体-药物部分上。

可检测的标记

与本发明的化合物结合使用的特定的标记或可检测的基团以及本发明的方法通常不是本发明的关键方面，只要它不显著干扰本发明的化合物的活性或效用。可检测的基团可以是任何具有可检测的物理或化学特性的物质。此类可检测的标记在免疫测定的领域中已得到很好的发展，并且通常，在此类方法中有用的大部分任何标记都能被应用至本发明中。因此，标记是可通过光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学手段可检测的任何组分。本发明中有用的标记包括磁珠(例如DYNABEADS^TM)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明等)、放射性标记(例如³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、或³²P)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶以及其他在ELISA中常用的酶)、以及比色标记，如胶体金或有色玻璃或塑料珠(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)。

根据本领域熟知的方法，标记可直接或间接偶联到本发明的化合物上。如以上所指，可使用多种标记，标记的选择取决于所需的灵敏度、与化合物缀合的容易程度、稳定性需求、可用的仪器、以及可支配的供应物。

当本发明的化合物与可检测的标记相缀合时，该标记优选是选自下组的成员：放射性同位素、荧光试剂、荧光试剂前体、生色团、酶类及它们的组合。将各种基团缀合到抗体的方法在本领域是熟知的。例如，经常被缀合到抗体的可检测的标记是酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、以及葡萄糖氧化酶。

非放射性标记常常是通过间接手段附着的。通常，配体分子(例如生物素)被共价地结合到该缀合物的一个成分上。然后该配体与另一个分子(如抗生蛋白链菌素)结合，该分子是固有地可检测的或者与信号***(如可检测的酶、荧光化合物、或化学发光化合物)共价结合。

本发明的缀合物的成分还可以直接缀合到产生信号的化合物上，例如通过与酶或荧光团相缀合。作为标记的目的酶主要是水解酶，特别是磷酸酶、酯酶以及糖苷酶、或氧化酶(oxidotase)，特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、伞形酮等。化学发光化合物包括萤光素、以及2，3-二氢酞嗪二酮，例如鲁米诺。对于可以使用的各种标记或信号产生体系的评述，参见美国专利号4,391,904。

检测标记的手段是本领域普通技术人员熟知的。因此，例如，当该标记是一种放射性标记时，检测手段包括闪烁计数器或如在放射自显影法中的照相胶片。当该标记是荧光标记时，可通过用适当光波长激发荧光染料并检测产生的荧光可对其进行检测。可通过照相胶片、通过使用电子探测器(例如电荷耦合器件(CCD)或光电倍增管等等)，可对该荧光进行视觉上的检测。类似地，可通过提供酶的适当底物并检测产生的反应产物来对酶标记进行检测。最后，可通过观察与该标记相关的颜色对简单的比色标记进行简单地检测。因此，在各种试纸条测定(dipstick assay)中，所缀合的金经常显示成粉红色，而各种缀合的珠子显示出珠子的颜色。

荧光标记是目前优选的，因为它们具有操作上需要的预防措施少、并适合高通量显像技术(光学分析包括在包含计算机的集成***中用于分析的图像的数字化)的优点。优选的标记典型地具有以下的一项或多项特征：高灵敏度、高稳定性、低背景、低环境敏感性、以及标记的高特异性。许多荧光标记可从以下公司商购获得：SIGMA化学公司(Saint Louis，MO)、Molecular Probes(Eugene，OR)、R&D systems(Minneapolis，MN)、Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway，NJ)、CLONTECHLaboratories，Inc.(Palo Alto，CA)、Chem Genes Corp.、Aldrich ChemicalCompany(Milwaukee，WI)、Glen Research，Inc.、GIBCO BRL LifeTechnologies，Inc.(Gaithersburg，MD)、Fluka Chemica-BiochemikaAnalytika(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)、以及AppliedBiosystems(Foster City，CA)，以及许多技术人员已知的其他的商业来源。此外，本领域的普通技术人员将认识到如何选择合适的荧光团用于特定的应用中，并且如果它不容易商购获得，则能够从头合成必需的荧光团或对可商购的荧光化合物进行合成修饰以获得所希望的荧光标记。

除了小分子荧光团外，天然发生的荧光蛋白以及此类蛋白的工程化的类似物在本发明中也是有用的。此类蛋白包括(例如)刺胞动物的绿色荧光蛋白(Ward et al.，Photochem.Photobiol. 35：803-808(1982)；Levine et al.，Comp.Biochem.Physiol.，72B：77-85(1982))、来自费氏弧菌菌株的黄色荧光蛋白(Baldwin et al.，Biochemistry 29：5509-15(1990))、来自共生甲藻属甲藻(dinoflagellate Symbiodinium sp.)的多甲藻黄素-叶绿素(Morris et al.，Plant Molecular Biology 24：673：77(1994))、来自海洋蓝细菌(如聚球藻属(Synechococcus))的藻胆蛋白，例如藻红蛋白和藻蓝蛋白(Wilbanks et al.，J.Biol.Chem.268：1226-35(1993))，及类似物。

通常，在细胞毒素与靶向(或其他)试剂之间形成连接(并且任选是间隔基团)之前，这些化学官能度中的至少一个会被激活。本领域的普通技术人员将理解，可以使用许多种标准方法和条件来激活化学官能度，包括羟基、氨基以及羧基基团。例如，可以通过用光气处理形成相应的氯甲酸盐或用对硝基苯基氯甲酸盐处理形成相应的碳酸盐来激活细胞毒素或靶向试剂的羟基。

在一个示例性实施方案中，本发明利用包括羧基官能度的靶向试剂。羧基可通过，例如，转变为相应的酰卤或活性酯而被激活。这一反应可在March，supra pp.388-89中阐述的多种条件下进行。在一个示例性实施方案中，通过含羧基的基团与草酰氯进行反应来制备酰卤。被激活的试剂与细胞毒素或细胞毒素-连接体臂组合进行反应，以形成本发明的缀合物。本领域的普通技术人员将理解使用含羧基的靶向试剂仅仅是说明性的，并且具有许多其他官能团的试剂可缀合到本发明的连接体上。

反应官能团

为了阐述的清晰性，后面的讨论集中于细胞毒素与靶向试剂的缀合。焦点例证了本发明的一个实施方案，从这个实施方案，本领域的技术人员很容易推断出其他的实施方案。集中讨论单个实施方案并不意味着对本发明的限制。

本发明的示例性化合物带有一个反应官能团，该官能团通常位于取代或未取代的烷基或杂烷基链上，使它们易附着于另一种类上。该反应基的一个有利位置是该链的末端位置。

在实施本发明时有用的反应基和反应种类通常是那些在生物缀合化学领域所熟知的反应基和反应种类。反应官能团可以是受保护的或未受保护的，并且该官能团的受保护的本性可以通过有机合成领域已知的方法进行改变。用反应性细胞毒素类似物可获得的优选的反应种类是那些在相对温和的条件下进行的反应种类。这些反应种类包括但不限于亲核取代(例如，胺和醇与酰卤、活性酯的反应)、亲电取代(例如，烯胺反应)以及碳-碳以及碳-杂原子多个键的加成(例如，迈克尔反应、第尔斯-阿尔德反应)。这些以及其他有用的反应讨论于例如March，Advanced OrganicChemistry，3rd Ed.，John Wiley & Sons，New York，1985；Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego，1996；以及Feeney etal.，Modification of Proteins；Advances in Chemistry Series，Vol.198，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。

示例性反应类型包括羧基及其不同的衍生物的反应，羧基衍生物包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并***酯、酰卤、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯基酯、烷基、链烯基、炔基以及芳族酯。羟基基团可被转变为酯、醚、醛等。通过与例如胺、羧酸阴离子、硫醇阴离子、碳负离子或醇盐离子进行反应，卤烷基基团可被转变为新的种类。亲双烯体(例如马来酰亚胺)基团参与第尔斯-阿尔德反应。醛基或酮基基团可被转变为亚胺、腙、缩氨基脲或肟，或通过例如Grignard加成反应或烷基锂加成反应这样的机制完成这些转变。磺酰卤容易与胺进行反应，例如形成磺酰胺。胺或巯基基团被(例如)酰化、烷基化或氧化。使用环加成作用、酰化作用、迈克尔加成等，可将烯转变为一系列新的种类。环氧化物容易与胺以及羟基化合物反应。

本领域的普通技术人员将容易理解，这些连接中有许多可通过多种方法并使用多种条件产生。对于酯的制备，见例如，March supra 1157页；对于硫酯，见March，supra，362-363页，491，720-722，829，941，和1172；对于碳酸酯，见March，supra，346-347页；对于氨基甲酸酯，见March，supra at 1156-57；对于酰胺，见March supra at 1152页；对于脲及硫脲，见March supra，1174页；对于缩醛以及缩酮，见Greene et al.supra178-210和March supra，1146页；对于酰氧基烷基衍生物，见Prodrugs：Topical and Ocular Drug Delivery，K.B.Sloan，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1992；对于烯醇酯，见March supra 1160页；对于N-磺基亚磺亚酰胺(N-sulfonylimidates)，见例如Bundgaard et al.，J.Med.Chem.，31：2066(1988)；对于酸酐，见March supra at 355-56，636-37，990-91，和1154；对于N-酰基亚胺酸酯，见March supra 379页；对于N-曼尼希碱，见March supra 800-02，和828；对于羟甲基酮酯，见Petracek et al.AnnalsNY Acad.Sci.，507：353-54(1987)；对于二硫化物，见March supra，1160页；以及对于磷酸酯及膦酰胺酯的制备。

反应官能团可以是未被保护的并被选择，使得它们不参与或干涉反应。备选地，反应官能基团可通过保护基团的存在受到保护而不参与反应。本领域的普通技术人员将理解怎样保护特定官能团不干扰已选择的一组反应条件。对于有用的保护基的例子，参见Greene et al.，Protective Groups inOrganic Synthesis，John Wiley & Sons，New York，1991。

典型地，使用标准的化学技术通过靶向试剂各自的化学官能度将它们共价连接至细胞毒素上。任选地，连接体或试剂通过一个或多个间隔基团与该试剂偶联。当组合使用时，间隔基团可以是等效的或不同的。

通常，在细胞毒素与反应性官能团(并且任选地是间隔基团)之间形成连接之前，化学官能团中的至少一个将被激活。本领域的普通技术人员将理解，使用许多种标准方法和条件可以激活多种化学官能度，包括羟基、氨基以及羧基基团。在一个示例性实施方案中，本发明包含作为反应官能团的羧基官能度。羧基可以如以上说明被激活。

可切割的底物

本发明的可切割的底物被说明为“X²”。优选地，可切割的底物是一种可被酶切割的可切割的酶底物。优选地，这种酶优选直接或间接与待处理的肿瘤或其他靶细胞相关联。该酶可以由待处理的肿瘤或其他靶细胞产生。例如，该可切割的底物可以是一种肽，该肽优选可被肿瘤或其他靶细胞周围或在其中发现的一种酶切割。另外地或备选地，该酶可被附着于与肿瘤细胞进行特异结合的靶向试剂，例如对肿瘤抗原特异的抗体。

作为适宜于偶联到以上说明的药物的酶可剪切的底物的例子，PCT专利申请公开文件WO 00/33888、WO 01/95943、WO 01/95945、WO 02/00263以及WO 02/100353(它们均并入本文作为参考)公开了可剪切的肽与药物的附着。这种肽可被与肿瘤相关的酶剪切，例如trouase(如甲拌磷寡肽酶)、CD10(中性溶酶)、基质金属蛋白酶(如MMP2或MMP9)、II型跨膜丝氨酸蛋白酶(如Hepsin、睾蛋白、TMPRSS4或matriptase/MT-SP1)、或组织蛋白酶。在这个实施方案中，前体药物包括以上说明的药物、肽、稳定化基团、以及任选地在药物与肽之间的连接基团。稳定化基团附着于肽末端，以保护前体药物在到达肿瘤或其他靶细胞前不被降解。适宜的稳定化基团的例子包括非氨基酸，例如琥珀酸、二甘醇酸、马来酸、聚乙二醇、焦谷氨酸、醋酸、萘羧酸、对苯二酸、以及戊二酸衍生物；以及非遗传编码的氨基酸或天冬氨酸、或谷氨酸，其在天冬氨酸的β-羧基或谷氨酸的γ-羧基处附着于肽的N末端。

肽典型地包括3至12(或更多)个氨基酸。特定氨基酸的选择将至少部分取决于将用于剪切该肽的酶，以及这种肽在体内的稳定性。适宜的可切割肽的一个例子是β-AlaLeuAlaLeu(SEQ ID NO：102)。这可与稳定化基团组合，形成琥珀酰基-β-AlaLeuAlaLeu(SEQ ID NO：102)。其他适宜的可切割肽的例子提供于以上引用的文献中。

作为一个说明性实例，CD10，也被称为中性溶酶、中性内肽酶(NEP)、以及常见急性淋巴细胞白血病抗原(CALLA)，是一种II型细胞-表面锌依赖型金属蛋白酶。适宜用于CD10的可切割的底物包括LeuAlaLeu以及IleAlaLeu。其他已知的用于CD10的底物包括长度达50个氨基酸的肽，尽管催化效率常随底物变大而降低。

另一个说明性实例基于基质金属蛋白酶(MMP)。作为也许是与肿瘤有关的最佳表征的蛋白水解酶，在肿瘤微环境中MMP的激活存在明显的相关性。特别是，已经对可溶性基质酶MMP2(明胶酶A)以及MMP9(明胶酶B)进行了深入研究，并且它们在包括肿瘤生长在内的组织重塑中显示出被选择性地激活。已设计出可被MMP2以及MMP9剪切的肽序列并测试了以下物质的缀合物：葡聚糖和甲氨喋呤(Chau et al.，Bioconjugate Chem.15：931-941(2004))；PEG(聚乙二醇)和阿霉素(Baeet al.，Drugs Exp.Clin.Res.29：15-23(2004))；以及白蛋白和阿霉素(Kratzet al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.11：2001-2006(2001))。适宜与MMP一起使用的序列的实例包括但不限于：ProValGlyLeuIleGly(SEQ ID NO：95)、GlyProLeuGlyVal(SEQ ID NO：96)、GlyProLeuGlyIleAlaGlyGln(SEQID NO：97)、ProLeuGlyLeu(SEQ ID NO：98)、GlyProLeuGlyMetLeuSerGln(SEQ ID NO：99)、以及GlyProLeuGlyLeuTrpAlaGln(SEQ ID NO：100)。(参见例如，前文引用的参考文献连同Kline et al.，Mol. Pharmaceut.1：9-22(2004)以及Liu etal.，Cancer Res.60：6061-6067(2000))。也可使用其他可切割的底物。

又一个实例是II型跨膜丝氨酸蛋白酶。这一组酶包括例如hepsin、睾蛋白、以及TMPRSS4。GlnAlaArg是一种底物序列，该序列与蛋白裂解酶(matriptase)/MT-SP1(在乳腺癌和卵巢癌中被过表达)一起使用，并且LeuSerArg与hepsin(在***和其他一些肿瘤类型中被过表达)一起使用。(参见例如，Lee et.al.，J.Biol. Chem.275：36720-36725以及Kurachi和Yamamoto，Handbook of Proeolytic Enzymes Vol.2，2^nd edition(BarrettAJ，Rawlings ND & Woessner JF，eds)pp.1699-1702(2004))。也可使用其他可切割的底物。

另一类型的可切割的底物的安排包括制备能够剪切该可切割的底物的单独的酶，该底物变得与肿瘤或细胞相关联。例如，酶能够偶联到肿瘤特异的抗体(或其他实体，该实体优选地被吸引至肿瘤上或其他靶细胞上，例如受体配体)上，并接着酶-抗体缀合物可提供给病人。酶-抗体缀合物可定向到肿瘤相关的抗原并与之结合。随后，将该药物-可切割的底物缀合物作为前体药物提供给病人。当药物-可切割的底物缀合物与已变得与肿瘤相结合的酶相互作用时，药物只在肿瘤附近释放，这样可切割的底物被剪切并且药物被释放。例如，美国专利号4,975,278；5,587,161；5,660,829；5,773,435；以及6,132,722，所有文献都并入本文作为参考，公开了这种安排。适宜的酶以及底物的例子包括但不限于，β-内酰胺酶以及头孢菌素衍生物、羧肽酶G2及谷氨酸及天冬氨酸的叶酸酯衍生物。

在一个实施方案中，酶-抗体缀合物包括一种抗体或抗体片段，该抗体或抗体片段是基于它对于目的靶细胞或靶位点上表达的相关抗原的特异性来进行选择。在上文提供了抗体的讨论。适宜的头孢菌素-可切割的底物的一个例子是

缀合物的实例

本发明的连接体和可切割的底物可被用在含有多种配偶体分子的缀合物中。本发明的缀合物的例子在以下作进一步详尽的说明。除非另外指明，如以上所给出的在有关细胞毒素、连接体、以及可切割的底物的部分中对取代基进行限定。

A.连接体缀合物

适宜的缀合物的一个例子是具有下式的化合物：

其中L¹是自消连接体；m是整数0、1、2、3、4、5、或6；F是包括以下结构的连接体：

其中AA¹是独立地选自下组的一个或多个成员：天然氨基酸和非天然α-氨基酸；c是从1到20的整数；L²是自消连接体并且包含

其中R¹⁷、R¹⁸、以及R¹⁹各自独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，并且w是从0到4的整数；o是1；L⁴是连接体成员；p是0或1；X⁴是选自下组的成员：受保护的反应官能团、未受保护的反应官能团、可检测的标记、以及靶向试剂；并且D包含以下结构：

其中环状体系A是选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基的成员；E和G是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键的成员，或者E和G相结合，形成一个环状体系，该环状体系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；X是选自O、S以及NR²³的成员；R²³是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员；R³是OR¹¹，其中R¹¹是选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磺酸酯、酰基、C(O)R¹²R¹³、C(O)OR¹²、C(O)NR¹²R¹³、P(O)(OR¹²)₂、C(O)CHR¹²R¹³、SR¹²、以及SiR¹²R¹³R¹⁴，R⁴、R⁴’、R⁵及R⁵’是独立选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁵R¹⁶、NC(O)R¹⁵、OC(O)NR¹⁵R¹⁶、OC(O)OR¹⁵、C(O)R¹⁵、SR¹⁵、OR¹⁵、CR¹⁵＝NR¹⁶、以及O(CH₂)_nN(CH₃)₂，或R⁴、R⁴’、R⁵和R⁵’的任何相邻一对与它们所附着的碳原子连接在一起以形成一个具有4到6元的、取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系；其中n是从1到20的整数；R¹⁵和R¹⁶是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R¹⁵和R¹⁶与它们所附着的氮原子一起可任选地相连接以形成一个具有4到6元的、任选地包含两个或更多个杂原子的取代或未取代的环状体系；R⁶是单键，它存在或者不存在，并且当R⁶存在时，R⁶和R⁷相结合，形成环丙基环；并且R⁷是在所述环丙基环中与R⁶结合的CH₂-X¹或-CH₂-，其中X¹是离去基团，其中R¹¹将所述药物连接至L¹(如果存在)上，或连接至F上。

在一些实施方案中，药物具有以上的结构(c)或(f)。适宜作为缀合物使用的化合物的一个具体的例子是

一类缀合物的另一个例子是具有下式的化合物

其中AA¹是独立地选自下组的一个或多个成员：天然氨基酸和非天然α-氨基酸；c是从1到20的整数；L²是自消连接体；o是0或1；L⁴是连接体成员；p是0或1；X⁴是选自受保护的反应官能团、未受保护的反应官能团、可检测的标记、以及靶向试剂的成员；并且D包含以下结构：

其中环状体系A是选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基基团的成员；E和G是独立选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键的成员，或者E和G相结合，形成一个环状体系，该环状体系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；X是选自O、S以及NR²³的成员；R²³是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员；R³是选自下组的成员：(＝O)、SR¹¹、NHR¹¹以及OR¹¹，其中R¹¹选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磺酸酯、酰基、C(O)R¹²R¹³、C(O)OR¹²、C(O)NR¹²R¹³、P(O)(OR¹²)₂、C(O)CHR¹²R¹³、SR¹²以及SiR¹²R¹³R¹⁴，其中R¹²、R¹³、及R¹⁴是独立选自下组的成员：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，其中R¹²和R¹³与它们所附着的氮原子或碳原子一起可任选地连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多个杂原子；R⁴、R⁴’、R⁵及R⁵’是独立选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁵R¹⁶、NC(O)R¹⁵、OC(O)NR¹⁵R¹⁶、OC(O)OR¹⁵、C(O)R¹⁵、SR¹⁵、OR¹⁵、CR¹⁵＝NR¹⁶、以及O(CH₂)_nN(CH₃)₂，或者R⁴、R⁴’、R⁵及R⁵’的任何相邻对与它们所附着的碳原子连接在一起以形成一个具有4到6元的、取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系，其中n是从1到20的整数；R¹⁵R¹⁶独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R¹⁵和R¹⁶与它们所附着的氮原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多杂原子；其中R⁴、R⁴’、R⁵及R⁵’中的至少一个连接所述药物到L¹(如果存在)上，或连接至F上，并且包括

其中v是从1到6的整数；并且R²⁷、R²⁷′R²⁸及R²⁸’各自独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；R⁶是单键，它存在或者不存在，并且当R⁶存在时，R⁶和R⁷相结合，形成环丙基环；并且R⁷是在所述环丙基环中与R⁶结合的CH₂-X¹或-CH₂-，其中X¹是离去基团。

其中r是从0到24范围内的整数。

适宜的缀合物的另一个例子是具有下式的化合物：

其中AA¹是独立地选自下组的一个或多个成员：天然氨基酸和非天然α-氨基酸；c是从1到20的整数；L³是含有伯胺或仲胺或羧基官能团的间隔基团；其中如果L³存在，则m是0，并且L³的胺与D的侧羧基官能团形成酰胺键或者L³的羧基与D的侧胺官能团形成酰胺键；o是0或1；L⁴是连接体成员，其中L⁴包括

其直接附着到(AA¹)_c的N端上，其中R²⁰是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员，R²⁵、R²⁵’、R²⁶、以及R²⁶’各自独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；并且s和t独立地是从1到6的整数；p是1；X⁴是选自下组的成员：受保护的反应官能团、未受保护的反应官能团、可检测的标记、以及靶向试剂；并且D含有以下结构：

其中环状体系A是选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基基团的成员；E和G是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键的成员，或者E和G相结合，形成一个环状体系，该环状体系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；X是选自O、S以及NR²³的成员；R²³是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员；R³是选自下组的成员：(＝O)、SR¹¹、NHR¹¹以及OR¹¹，其中R¹¹是选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、磺酸酯、酰基、C(O)R¹²R¹³、C(O)OR¹²、C(O)NR¹²R¹³、P(O)(OR¹²)₂、C(O)CHR¹²R¹³、SR¹²以及SiR¹²R¹³R¹⁴，其中R¹²、R¹³和R¹⁴是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基的成员，其中R¹²和R¹³与它们所附着的氮原子或碳原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多个杂原子；R⁴、R⁴’、R⁵以及R⁵’是独立选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁵R¹⁶、NC(O)R¹⁵、OC(O)NR¹⁵R¹⁶、OC(O)OR¹⁵、C(O)R¹⁵、SR¹⁵、OR¹⁵、CR¹⁵＝NR¹⁶、以及O(CH₂)_nN(CH₃)₂，或R⁴、R⁴’、R⁵以及R⁵’的任何相邻对与它们所附着的碳原子连接在一起以形成一个具有4到6元的、取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系，其中n是从1到20的整数；R¹⁵和R¹⁶是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R¹⁵和R¹⁶与它们所附着的氮原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多杂原子；R⁶是单键，存在或者不存在，并且当R⁶存在时，R⁶和R⁷相结合，形成环丙基环；并且R⁷是在所述环丙基环中与R⁶结合的CH₂-X¹或-CH₂-，其中X¹是离去基团，其中R⁴、R⁴’、R⁵、R⁵’、R¹⁵或R¹⁶中的至少一个将所述药物连接至L¹(如果存在)上，或连接至F上。

在一些实施方案中，该药物具有以上的结构(c)或(f)。适宜作为缀合物使用的化合物的一个具体的例子是

其中r是范围从0到24的整数。

作为缀合物使用的适宜的化合物的其他例子包括：

以及

其中r是

并且r是在从0到24范围内的整数。

还可以用具有结构(g)的药物形成缀合物，例如以下化合物：

(其中r是从0至24范围中的整数)。

还可以使用具有以下结构的药物形成缀合物：

此类细胞毒素的合成，以及关于它们连接至抗体的细节公开于2007年11月30号提交的美国专利申请系列号60/991,300中。

在某些实施方案中，抗CD19缀合到连接体以及具有结构N1的治疗剂：

在某些实施方案中，抗CD19缀合到连接体以及具有结构N2的治疗剂：

B.可切割的连接体缀合物

适宜的缀合物的一个例子是具有以下结构的化合物：

其中L¹是自消间隔基；m是0、1、2、3、4、5、或6的整数；X²是可切割的底物；并且D含有以下结构：

其中环状体系A是选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基基团的成员；E和G是独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、杂原子、单键的成员，或者E和G结合形成一个环状体系，该环状体系选自取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；X是选自O、S以及NR²³的成员；R²³是选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及酰基的成员；R³是选自下组的成员：(＝O)、SR¹¹、NHR¹¹以及OR¹¹，其中R¹¹是选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的杂烷基、未取代的杂烷基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、酰基、C(O)R¹²R¹³、C(O)OR¹²、C(O)NR¹²R¹³、P(O)(OR¹²)₂、C(O)CHR¹²R¹³、SR¹²以及SiR¹²R¹³R¹⁴，其中R¹²、R¹³以及R¹⁴是独立选自下组的成员：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、以及取代或未取代的芳基，其中R¹²和R¹³与它们所附着的氮原子或碳原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，任选地包含两个或更多个杂原子；R⁶是单键，它存在或者不存在，并且当R⁶存在时，R⁶和R⁷结合形成环丙基环；并且R⁷是在所述环丙基环中与R⁶结合的CH₂-X¹或-CH₂-，其中X¹是离去基团，R⁴、R⁴’、R⁵以及R⁵’是独立选自下组的成员：H、取代的烷基、未取代的烷基、取代的芳基、未取代的芳基、取代的杂芳基、未取代的杂芳基、取代的杂环烷基、未取代的杂环烷基、卤素、NO₂、NR¹⁵R¹⁶、NC(O)R¹⁵、OC(O)NR¹⁵R¹⁶、OC(O)OR¹⁵、C(O)R¹⁵、SR¹⁵、OR¹⁵、CR¹⁵＝NR¹⁶、以及O(CH₂)_nN(CH₃)₂，或R⁴、R⁴’、R⁵以及R⁵’的任何相邻的一对与它们所附着的碳原子连接在一起以形成一个具有4到6元的、取代或未取代的环烷基或杂环烷基环状体系，其中n是从1到20的整数；R¹⁵和R¹⁶独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烷基、以及取代或未取代的肽基，其中R¹⁵和R¹⁶与它们所附着的氮原子一起可任选地相连接以形成一个取代或未取代的杂环烷基环状体系，该环状体系具有4到6元，可任选地包含两个或更多个杂原子；其中R⁴、R⁴’、R⁵以及R5’中的至少一个将所述药物连接至L¹(如果存在)上，或连接至X²上，并且选自：

其中R³⁰、R³⁰’、R³¹以及R³¹’各自独立地选自H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基；并且v是从1到6的整数。

适宜的可切割的连接体的例子包括β-AlaLeuAlaLeu(SEQ IDNO：102)以及

药物组合物

在另一方面，本公开提供了一种组合物，例如药物组合物，该组合物包含本公开的一种单克隆抗体或多种单克隆抗体的组合、或它们的一个或多个抗原结合部分，并与药学上可接受的载体共同配制而成。这种组合物可包含本公开的一种抗体或(例如，两种或多种不同的)多种抗体的组合、或免疫缀合物、或双特异性分子。例如，本公开的药物组合物可以包含多种抗体(或免疫缀合物、或双特异性分子)的组合，这些抗体与该靶抗原上的不同表位结合、或具有互补的活性。

还可以在联合治疗中施用本公开的药物组合物(即，与其他试剂组合)。例如，该联合疗法可以包括本公开的抗-CD19抗体，该抗-CD19抗体与至少一种其他抗癌剂组合。以下在本公开的关于抗体用途的章节中对可用于联合治疗的治疗剂的实例进行了更加详尽的说明。

如此处使用的“药学上可接受的载体”包括任何及全部的生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延缓剂等。优选地，该载体适宜于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮给药(例如通过注射或输注)。依据给药途径，活性化合物(即抗体、免疫缀合物、或双特异性分子)可用材料包被以保护该化合物免受可能导致该化合物失活的酸以及其他自然条件的作用。

本公开的药物化合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指一种盐，它保持了母体化合物的希望的生物活性并不会引起任何不希望的毒理学效应(参见例如Berge，S.M.，et al.(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这种盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括源自无毒无机酸的盐，例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等，以及源自无毒有机酸的盐，例如脂肪族单羧酸及二羧酸、苯基取代的烷醇酸、羟基烷醇酸、芳香酸、脂肪族及芳香族磺酸等。碱性加成盐包括源自碱土金属的盐，例如钠、钾、镁及钙等的盐，以及源自无毒有机胺的盐，例如N，N′-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺及普鲁卡因等。

本公开的药物组合物还可包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)，丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯及α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸及磷酸等。

在本公开的药物组合物中可以采用的适宜的水性及非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇及聚乙二醇等)，以及它们的适宜的混合物、植物油，如橄榄油，以及可注射的有机酯，例如油酸乙酯。例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)、通过维持分散系中所需颗粒的大小、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。

这些组合物还可包含佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂及分散剂。可通过灭菌程序(见上文)，以及通过加入不同的抗细菌剂及抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)均可确保防止微生物的存在。将等渗剂(如糖及氯化钠等)包含进入这些组合物中也可能是令人希望的。另外，通过包含延迟吸收的物质(如单硬脂酸铝及明胶)可以实现可注射药物形式的延长吸收。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液、以及用于无菌注射溶液或分散液的即时配制的无菌粉末。用于药学活性物质的这种介质及试剂的使用在本领域中是已知的。除了与活性化合物不相容的任何常规介质或试剂之外，可考虑它在本公开的多种药学组合物中使用。还可以在这些组合物中掺入辅助性活性化合物。

治疗组合物典型地必须是无菌的并且在制造及存储条件下是稳定的。该组合物可以被配制成溶液、微乳剂、脂质体、或者其他适于高药物浓度的有序结构。该载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇，以及液体聚乙二醇等)，以及它们的适宜的混合物。例如，通过使用一种包衣(如卵磷脂)、通过维持分散系中所需颗粒的大小、以及通过使用表面活性剂，可维持适合的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗试剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)，或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐及明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。

通过在适当的溶剂中将所需量的活性化合物与以上列举的多种组分中的一种或组合(按照需要)相掺和、然后进行无菌微过滤即可制备出无菌注射液。总体上，通过将活性化合物掺入至无菌载体(它包含基本分散介质及上述列举的所需的其他组分)来制备分散体。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况，优选的制备方法是真空干燥及冷冻干燥(冻干)，制得该活性组分以及任何来自其预先无菌过滤的溶液的其他希望的组分的粉末。

与载体物质组合以产生单一剂型的活性组分的量值将随着正在接受治疗的受试者及具体给药方式而变化。与载体物质组合以产生单一剂型的活性组分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。总体上讲，在100％的数量内，与药学上可接受的载体组合的活性组分的量大约是从0.01％至约99％的范围内，优选从约0.1％至约70％，最优选从约1％至约30％。

对剂量方案进行调节以提供最佳的理想的反应(如治疗反应)。例如，可给予单次大丸剂，可以随时间施用几次分份剂量，或者根据治疗情况的紧急程度所示按比例减少或增加剂量。为给药方便以及剂量统一而按剂量单位形式配制成肠胃外组合物尤为有利。此处使用的剂量单位形式指用于待治疗的受试者单一剂量的物理上不连续的单位；每个单位包含经计算能与所需的药学载体相结合产生理想的疗效的预定量的活性化合物。本公开的剂量单位形式的说明由以下因素决定并直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特性及待实现的特定疗效，以及(b)配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的领域中固有的局限性。

对于该抗体的给药，剂量为约0.0001至100mg/kg，并且更经常是0.01至5mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或者在1至10mg/kg的范围内。一种示例性治疗方案限定为每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每三个月一次或每3至6个月一次。本公开的抗-CD19抗体的优选的剂量方案包括通过静脉内给药1mg/kg体重或3mg/kg体重，使用以下剂量方案之一给予抗体：(i)每4周给予6个剂量，之后每3个月给药；(ii)每三周给药；(iii)3mg/kg体重一次给药，接着每三周按1mg/kg体重给药。

在一些方法中，两种或多种具有不同的结合特异性的单克隆抗体被同时给药，这种情况下，所给予的每种抗体的剂量都在所指示的范围之内。通常在多个时间点给予抗体。单个剂量之间的间隔可以是，例如一周、一个月、每三个月或一年。间隔也可以是不规则的，如通过测量患者的针对靶抗原的抗体的血液水平所指示。在一些方法中，调整剂量使血浆抗体浓度大约是1至1000μg/ml，并且在一些方法中大约是25至300μg/ml。

备选地，抗体可以作为缓释制剂给药，在这种情况中需要以较低频率给药。剂量及频率随抗体在患者体内的半衰期而变。一般而言，人类抗体的半衰期最长，其次是人源化抗体、嵌合抗体、以及非人类抗体。给药的剂量及频率可根据治疗是预防性的或是治疗性的而变化。在预防性应用时，在很长的一段时间内以相对较不频繁的间隔给予相对少的剂量。一些患者在其余生中继续接受治疗。在治疗性的应用时，有时需要在相对较短的间隔内给予相对较高的剂量直至疾病缓减或终止，并且优选地直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。之后，该患者可以接受预防性的给药方案。

为用于与细胞增殖异常有关的疾病预防和/或治疗，所施用化合物的循环浓度优选为大约0.001μM到20μM，优选大约0.01μM到5μM。

此处说明的化合物的患者口服剂量典型地是从大约1mg/天到大约10,000mg/天的范围内，更典型地从大约10mg/天到大约1,000mg/天，并且最典型地从大约50mg/天到大约500mg/天。按照患者体重所述，典型的剂量是从大约0.01到大约150mg/kg/天的范围内，更典型地从大约0.1到大约15mg/kg/天，并且最典型地从大约1到大约10mg/kg/天，例如5mg/kg/天或3mg/kg/天。

在至少一些实施方案中，患者的阻滞或抑制肿瘤生长的剂量可以是1μmol/kg/天或者更少。例如，患者的剂量可以是0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.45、0.3、0.2、0.15、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、或0.005 mol/kg或更小(指药物的摩尔)。优选地，抗体-药物缀合物当在至少5天时间内以日剂量给药时，阻止肿瘤细胞的生长。在至少一些实施方案中，该肿瘤为SCID小鼠体内的人类型的肿瘤。作为一个例子，SICD小鼠可以是CB17.SCID小鼠(可从Taconic，Germantown，NY获得)。

可以改变本公开的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以获得针对特定患者、组合物及给药方式而言有效实现所希望的治疗反应而对患者无毒的活性成分的量。所选的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括采用的本公开的特定组合物或其酯、盐、或酰胺的活性，给药途径，给药时间，所用的特定化合物的***速率，疗程，在与所采用的特定组合物组合中使用的其他药物、化合物和/或材料，正在接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状态、总体健康状态和病史，以及在医学领域众所周知的类似因素。

本公开的抗CD19抗体的“治疗有效剂量”优选地导致减轻疾病症状的严重程度、延长无疾病症状时间的频率及持续时间、或防止由于该病痛产生的损害或残疾。例如，对于CD19阳性肿瘤的治疗而言，“治疗有效剂量”优选地抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，并仍更优选至少约80％。化合物抑制肿瘤生长的能力可以在预测人类肿瘤功效的动物模型***中进行评价。备选地，组合物的这一特性可通过检验该化合物的抑制细胞生长能力来评价，这种抑制作用可通过有经验的从业者已知的测定方法在体外测定。治疗性化合物的治疗有效量可减小肿瘤的大小，或者缓解受试者的症状。本领域的技术人员应能根据受试者的大小、受试者症状的严重程度、以及所选具体组合物或所选择的给药途径等因素而确定这种量值。

使用本领域已知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径可以对本公开的组合物进行给药。如技术人员应当理解，给药途径和/或方式将随所希望的结果而变化。本公开的抗体的优选给药途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊髓或其他胃肠外给药途径，例如通过注射或输注。此处使用的短语“胃肠外给药”是指除了肠内及局部给药外的其他给药方式，通常通过注射，并包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外及胸骨内注射及输注。

备选地，本公开的抗体可经非胃肠外途径进行给药，非胃肠外途径例如局部、表皮或粘膜途径给药，例如经鼻内、口服、***、直肠、舌下或局部途径给药。

活性化合物可用载体制备，该载体将保护化合物免于快速释放，例如控释制剂，包括植入剂、经皮贴剂、以及微囊化递送***。可以使用生物降解的、生物相容性的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、以及聚乳酸。用于制备这种制剂的许多方法已获得专利，或者是本领域技术人员所熟知的。参见，例如Sustained and ControlledRelease Drug Delivery SystemsJ.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1978。

治疗组合物可利用本领域中已知的医用装置进行给药。例如，在优选的实施方案中，本公开的治疗组合物可利用无针皮下注射装置进行给药，例如在美国专利号5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556中所披露的装置。在本公开中有用的熟知的植入剂与装置的实例包括：美国专利号4,487,603，它披露了用于以受控速度释放药物的一种可植入式微量输注泵；美国专利号4,486,194，它披露了用于通过皮肤给药的一种治疗装置；美国专利号4,447,233，它披露了用于以精确的输注速度递送药物的一种药物输注泵；美国专利号4,447,224，它披露了用于持续药物递送的一种可变流速的可植入输注装置；美国专利号4,439,196，它披露了一种具有多腔区室的渗透药物送递***；以及美国专利号4,475,196，它披露了一种渗透药物送递***。这些专利通过引用并入本文。许多其他这种植入剂、递送***、以及模型是本领域技术人员已知的。

在某些实施方案中，对本公开的人类单克隆抗体进行配制以确保其在体内分布适宜。例如，血脑屏障(BBB)阻止了许多高亲水性化合物。为确保本公开的治疗性化合物穿过BBB(如果需要时)，(例如)可以将它们配制在脂质体中。用于制造脂质体的方法，参见，例如，美国专利号4,522,811；5,374,548；以及5,399,331。这些脂质体可能包含一个或多个部分，这些部分被选择性地输送到特定的细胞或器官中，由此增强靶标药物的递送(参见，例如V.V.Ranade J.Clin.Pharmacol.29：685，(1989))。示例性靶向部分包括叶酸盐或生物素(参见，例如Low等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman et al(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais et al.(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe et al.(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier etal.(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods4：273。

本发明的用途和方法

本公开的抗体，特别是人类抗体、抗体组合物、抗体-配偶体分子缀合物组合物以及方法具有与诊断和治疗CD19介导的病症相关的多种体外和体内诊断及治疗用途。例如，这些分子可在体外或离体地被施用至培养物中的细胞，或者给予人类受试者(例如体内)，以便治疗、预防和诊断多种病症。如在此所使用的术语“受试者”旨在包括人类及非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物及非哺乳动物，例如，非人灵长类动物、绵羊、犬、猫、牛、马、鸡、两栖动物、以及爬行动物。优选的受试者包括患有由CD19活性介导的病症的人类患者。这些方法特别地适合于治疗患有与CD19异常表达相关的病症的人类患者。当与CD19缀合的抗体-配偶体分子缀合物与另一种活性剂一起给药时，这两种物质可以顺序或者同时给药。

在本公开的抗体对于CD19特异结合的情况下，本公开的抗体可用于专门检测在细胞表面CD19的表达，而且，还可用于通过免疫亲和纯化来纯化CD19。

此外，在不同肿瘤细胞上CD19的表达的情况下，本公开的人类抗体-配偶体分子缀合物组合物和方法可用于治疗患有致瘤性病症的受试者，这些致瘤性病症例如是以存在表达CD19的肿瘤细胞为特征的病症，包括例如，非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、多发性骨髓瘤、皮肤T淋巴细胞瘤、滤泡型小裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、免疫母细胞淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞性/中心细胞性(entroblastic/centrocytic)(cb/cc))滤泡型淋巴瘤、B谱系弥散性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性***病(AILD)样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、胚胎性癌、未分化的鼻咽癌(例如施明克瘤)、巨大***增生、卡波西肉瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症及其他B细胞淋巴瘤。

另外，CD19的过量表达可以导致B细胞耐受力的降低以及自身免疫病症的产生(Tedder et al.(2005)Curr Dir Autoimmun 8：55)。通过CD19阳性B细胞在类风湿性关节炎患者的发炎关节中的积累已看到这种自身免疫效应(He et al.(2001)J Rheumatol 28：2168)。如此，本公开的人类抗体、抗体组合物及方法可用于治疗具有自身免疫病症的受试者，例如，以存在表达CD19的B细胞为特征的病症包括，例如，类风湿性关节炎。

在一个实施方案中，本公开的抗体(例如，人类单克隆抗体、多特异性和双特异性分子及组合物)可用于检测CD19的水平或在其细胞膜表面含有CD19的细胞的水平，接着可将这些水平与某些疾病症状相关联。备选地，所述抗体可用于抑制或阻断CD19的功能，这又可与某些疾病症状的预防或缓解相关联，由此暗示了CD19为该疾病的介体。这可通过使样品与对照样品在一些条件下与抗CD19抗体相接触来实现，这些条件允许该抗体与CD19之间形成复合体。检测该抗体与CD19之间所形成的任何复合体，并在样品与对照样品中进行比较。

在另一个实施方案中，可初始测试本公开的抗体(例如，人类抗体、多特异性和双特异性分子及组合物)与体外治疗或诊断用途相关的结合活性。例如，可用以下实施例中说明的流式细胞术测定法测试本公开的组合物。

本公开的抗体(例如，人类抗体、多特异性以及双特异性分子、免疫连接物以及组合物)具有在CD19相关疾病的治疗以及诊断方面的其他用途。例如，人类单克隆抗体、多特异性分子或双特异性分子、及免疫连接物可用于在体内或体外激发一个或多个以下的生物学活性：抑制表达CD19的细胞的生长和/或杀死表达CD19的细胞；在人类效应细胞存在时介导表达CD19的细胞的吞噬作用或ADCC；或阻断CD19配体结合到CD19。

在一个具体的实施方案中，该抗体(例如，人类抗体、多特异性和双特异性分子及组合物)用于体内治疗、预防或诊断多种CD19相关的疾病。CD19相关的疾病的例子包括自身免疫病症、类风湿性关节炎、癌症、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、多发性骨髓瘤、皮肤T淋巴细胞瘤、滤泡型小裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、免疫母细胞淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞性/中心细胞性(cb/cc)滤泡型淋巴瘤、B谱系弥漫性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞***病(AILD)样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、胚胎性癌、未分化型鼻咽癌(例如，施明克瘤)、巨大***增生、卡波西肉瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症及其他B细胞淋巴瘤

体内或体外施用本公开的抗体组合物(如，人类单克隆抗体、多特异性和双特异性分子及免疫连接物)的适宜途径在本领域中是熟知的，并且可通过由本领域的普通技术人员进行选择。例如，这些抗体组合物可通过注射(如静脉内或皮下)进行给药。所用分子的适宜剂量将取决于受试者的年龄与体重、以及抗体组合物的浓度和/或剂型。

如以上前所述，本公开的人类抗CD19抗体可与一种或多种治疗剂(例如细胞毒剂、放射毒性剂、或免疫抑制剂)共同给药。可将抗体连接至治疗剂(作为免疫复合体)上，或者可与该治疗剂分开给药。在后一种(分开给药)情况下，抗体可以在该治疗剂给药之前、之后、或与该治疗剂同时给药、或者可以与其他已知治疗(例如抗癌治疗，如放射)共同给药。此类治疗剂包括抗肿瘤剂，例如多柔比星(阿霉素)、顺铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、以及环磷酰胺、羟基脲，它们自身只在对患者有毒性或亚毒性的水平时才是有效的。顺铂以100mg/剂静脉内给药，每四周一次，阿霉素以60至75mg/ml的剂量静脉内给药，每21天一次。本公开的人类抗CD19抗体或它们的抗原结合片段与化学治疗剂的共同给药提供了两种抗癌剂，这两种抗癌剂通过不同的机制起作用，产生针对人类肿瘤细胞的细胞毒效应。这种共同给药可以解决由于肿瘤细胞产生药物抗性或者抗原性改变方面的问题，产生抗药性或抗原性改变会导致肿瘤细胞与抗体不反应。

本公开的靶特异性效应细胞，例如，与组合物(例如，人类抗体、多特异性分子、以及双特异性分子)相连的效应细胞，还可用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人类白细胞，例如，巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞以及其他带有IgG-或IgA-受体的细胞。如果希望，效应细胞可从待治疗的受试者体内获得。这些靶特异性效应细胞可作为在生理学上可接受的溶液中的细胞悬液给药。施用的细胞数可以是10⁸至10⁹数量级，但会根据治疗目的有所变化。通常，该量值足以获得在靶细胞(例如，表达CD19的肿瘤细胞)的定位，并通过(例如)吞噬作用实现细胞杀伤。给药途径也可以变化。

靶特异性效应细胞的疗法可与其他去除靶细胞的技术联合进行。例如，使用本公开的组合物(例如，人类抗体、多特异性分子、以及双特异性分子)和/或装备这些组合物的效应细胞的抗肿瘤疗法可以与化学疗法联合使用。此外，联合免疫疗法可用于指导两种不同的细胞毒性效应群体对肿瘤细胞的排斥作用。例如，与抗Fc-γRI或抗CD3相连的抗CD19抗体可与IgG-或IgA-受体特异性结合剂联合使用。

本公开的双特异性分子及多特异性分子也可用于调节效应细胞上的FcγR或FcγR水平，例如通过对细胞表面的受体进行帽化及清除。抗Fc受体的混合物也可用于这一目的。

本发明的组合物(例如人类抗体、多特异性分子和双特异性分子及免疫连接物)也可在存在补体的情况下使用，所述组合物具有补体结合位点，例如来自结合补体的IgG1、IgG2或IgG3或IgM的部分)。在一个实施方案中，细胞群(包括具有本公开的结合剂的靶细胞及合适的效应细胞)的离体治疗可通过添加补体或含有补体的血清来补充。包被有本公开的结合剂的靶细胞的吞噬作用可通过补体蛋白质的结合得以改善。在另一个实施方案中，包被有本公开的组合物(例如人类抗体、多特异性及双特异性分子)的靶细胞还可被补体裂解。在又一实施方案中，本公开的组合物不激活补体。

本公开的组合物(例如人类抗体、多特异性分子和双特异性分子及免疫连接物)还可与补体一起给药。在某些实施方案中，本发明公开提供了包含人类抗体、多特异或双特异分子以及血清或补体的组合物。当补***于与人类抗体、多特异或双特异分子非常相近的位置时这些组合物是有利的。备选地，本公开的人类抗体、多特异性或双特异性分子可与补体或血清分开给药。

同样在本公开范围内的是包括本公开的抗体组合物(例如人类抗体、双特异性或多特异性分子、或免疫连接物)、以及使用说明书的试剂盒。该试剂盒可以进一步包括一种或多种其他的试剂，例如免疫抑制试剂、细胞毒素剂或放射毒性剂、或一种或多种本公开的其他的人类抗体(例如，具有互补活性的人类抗体，该抗体结合于CD19抗原中的一个表位，该表位不同于第一人类抗体结合的表位)。

因此，用本公开的抗体组合物治疗的患者可(在施用本公开的人类抗体之前、同时或之后)额外地施用另一种治疗剂，例如细胞毒性剂或放射毒性剂，这增强或增大了这些人类抗体的治疗作用。

在其他的实施方案中，可额外地用调节(例如增强或抑制)Fcγ或Fcγ受体表达或活性的药剂来治疗受试者，例如用细胞因子治疗受试者。在用多特异性分子治疗过程中施用的优选的细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、γ干扰素(IFN-γ)及肿瘤坏死因子(TNF)。

本公开的组合物(例如人类抗体、多特异性及双特异性分子)还可用于靶定表达FcγR或CD19的细胞，例如用于标记此类细胞。对于这种用途，可将该结合剂与一种可被检测的分子相连接。因此，本公开提供了活体外或体外定位表达Fc受体(例如FcγR或CD19)的细胞的方法。该可检测的标记可以是(例如)放射性同位素、荧光化合物、酶、或酶辅因子。

在一个具体的实施方案中，本公开提供了用于检测样品中CD19抗原的存在或者测量CD19抗原的量的方法，这些方法包括：将该样品以及对照样品与特异性地结合CD19的人类单克隆抗体或它的抗原结合部分在该抗体或其部分与CD19之间可形成复合体的条件下相接触。然后检测复合体的形成，其中在该样品与对照样品之间复合体形成的差异表明在该样品中存在CD19抗原。

在其他实施方案中，本公开提供了通过对受试者施用上述人类抗体在受试者体内治疗由CD19介导的病症的方法，这些病症例如自身免疫病症、类风湿性关节炎、癌症、非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、皮肤T淋巴细胞瘤、滤泡型小裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、免疫母细胞淋巴瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞性/中心细胞性(cb/cc))滤泡型淋巴瘤、B谱系弥漫性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞***病(AILD)样T细胞淋巴瘤、HIV相关的基于体腔的淋巴瘤、胚胎性癌、未分化的鼻咽癌(例如，施明克瘤)、巨大***增生、卡波西肉瘤、多发性骨髓瘤、沃尔丹斯特伦氏巨球蛋白血症以及其他B细胞淋巴瘤。此类抗体及其衍生物用于抑制与某些病症相关的由CD19诱导的活性(如增殖和分化)。通过将该抗体与CD19接触(例如通过将该抗体施用至受试者)，CD19诱导此类活性的能力即得到抑制，因此使相关的病症得到治疗。该抗体组合物可单独给药或者与另一治疗剂(如细胞毒剂或放射毒性剂)一起给药，这一治疗剂与所述抗体组合物联合或协同作用，以治疗或预防CD19介导的疾病。

在另一个实施方案中，本公开的免疫连接物可用于将化合物(例如，治疗剂、标记、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)靶向到具有CD19细胞表面受体的细胞上，这种应用是通过将此类化合物连接至该抗体进行的。例如，抗CD19抗体可被缀合至说明于美国专利号6,281,354和6,548,530，美国专利公开文件号20030050331、20030064984、20030073852、以及20040087497，或者公开于WO 03/022806的任一毒素化合物。因此，本公开还提供了在离体或体内对表达CD19的细胞进行定位的方法(例如，具有可检测的标记，如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。备选地，该免疫连接物可用于通过将细胞毒素或放射性毒素靶向到CD19来杀伤具有CD19细胞表面受体的细胞。

通过以下实施例对本公开进行进一步阐述，这些实例不应被解释为进一步限定。本申请通篇引用的所有附图及所有参考文献、Genbank序列、专利及公开的专利申请的内容的全文均明确地并入本文作为参考。

实施例

实施例1：针对CD19的人类单克隆抗体的产生

抗原

B细胞肿瘤细胞系Raji(ATCC保藏号#CCL-86)以及Daudi(ATCC保藏号#CCL-213)用作抗原被用于免疫接种。

转基因转染色体的KM

使用表达人类抗体基因的转基因转染色体小鼠的KM品系制备抗CD19的完全人类单克隆抗体。在这个小鼠品系中，内源性小鼠κ轻链基因如在Chen et al.(1993)EMBO J.12：811-820中所说明已经被纯合地破坏，并且该内源性小鼠重链基因如在PCT公开文件WO 01/09187的实施例1对于HuMab小鼠中所说明的已经被纯合地破坏。这种小鼠携带人类κ轻链转基因KCo5，如在Fishwild et al.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851中所说明。这种小鼠还携带人类重链转染色体SC20，如在PCT公开WO02/43478中所说明。

KM-

免疫接种

为了产生针对CD19的完全人类单克隆抗体，用Raji或Daudi B细胞肿瘤细胞系对KM-的同龄组进行免疫。通常的免疫方案说明于Lonberg，N.et al(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.et al.(1996)Nature Biotechnology 14：845-851及PCT公开WO 98/24884中。第一次输注抗原时小鼠是6至16周龄。使用细胞制备物对该小鼠(KM-

)进行腹膜内(IP)免疫。

转基因小鼠用完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原经IP免疫两次，然后用不完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原经IP免疫3至21天(达到总计11次免疫接种)。通过眶后取血监测免疫应答。通过ELISA筛选血浆(如下说明)，并将具有足够的抗CD19人免疫球蛋白滴度的小鼠用于融合。用抗原经静脉内对小鼠加强免疫3天，然后处死并去除脾脏。

产生抗CD19抗体的KM

的选择

为了选择产生与CD19相结合的KM-，如通过Fishwild，D.etal.(1996)(见上文)最初所说明通过改进的ELISA测试来自经免疫的小鼠的血清。简言之，用PBS中的1至2μg/ml经纯化的重组CD19融合蛋白对微量滴定板进行包被，每孔50μl，在4℃下孵育过夜，然后用PBS中的5％的BSA以每孔200μl进行封闭。将被CD19免疫的小鼠的血浆的稀释液加至每个孔，并在环境温度下孵育1至2小时。用PBS/吐温洗涤这些板，并接着用缀合有碱性磷酸酶的山羊-抗人类κ轻链多克隆抗体在室温下孵育1小时。洗涤后，用pNPP底物对平板进行显色，并通过分光光度计在OD 415至650处进行分析。将显现最高滴度的抗CD19抗体的小鼠用于融合。如下说明进行融合，并通过ELISA测试杂交瘤上清液的抗CD19活性。

产生针对CD19的人类单克隆抗体的杂交瘤的制备：

使用基于标准试验方案，用PEG将自KM-中分离的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合，或使用CytoPulse大腔细胞融合电穿孔仪(Cyto Pulse Sciences，Inc.，Glen Burnie，MD)进行基于电场的电融合。然后对得到的杂交瘤进行筛选来用于产生抗原特异的抗体。用50％PEG(Sigma)将来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与四分之一数目的SP2/0非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)进行融合。以大约1×10⁵/孔将细胞接种于平底微量滴定板中，然后用包含以下成分的选择性培养基培育大约两周：10％胎牛血清、10％P388D1(ATCC，CRL TIB-63)条件培养基、DMEM中的3至5％的Origen(IGEN)(Mediatech，CRL10013，含高葡萄糖，L-谷氨酰胺以及丙酮酸钠)加上5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50mg/ml庆大霉素以及1x HAT(Sigma，CRL P-7185)。1至2周后，用其中HAT被HT替换的培养基培养细胞。然后通过ELISA(如上说明)对各个孔筛选人类抗CD19单克隆IgG抗体。一旦杂交瘤广泛生长，通常在10至14天后监测培养基。再次接种分泌抗体的杂交瘤，再次筛选，并且，如果对人类IgG仍呈阳性，则通过有限稀释将抗CD19单克隆抗体进行亚克隆至少两次。然后将稳定的亚克隆在体外进行培养，以便在组织培养基中产生少量抗体用于进一步表征。

选择杂交瘤克隆21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1以及46E8用于进一步分析。

实施例2：人类单克隆抗体21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1以及46E8的结构表征

使用标准PCR技术从21D4杂交瘤中获得了对21D4以及21D4a单克隆抗体的重链及轻链可变区进行编码的cDNA序列，并使用标准DNA测序技术进行了测序。值得注意的是，21D4杂交瘤产生了抗体，这些抗体具有与两个轻链(SEQ ID NO：8和9)之一配对的重链。两种抗体(即21D4，具有的V_H和V_L序列分别为SEQ ID NO：1和8；以及21D4a，具有的V_H和V_L序列分别为SEQ ID NO：1和9)均与CD19相结合。使用标准PCR技术，分别从21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1以及46E8杂交瘤中获得对47G4、27F3、3C10、5G7、13F1以及46E8单克隆抗体的重链可变区以及轻链可变区进行编码的cDNA序列，并使用标准的DNA测序技术进行了测序。

21D4的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别示于图1A以及SEQID NO：59及1中。

21D4的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别示于图1B以及SEQID NO：66及8中。

21D4重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列的比较证明21 D4重链利用来了自人类种系V_H 5-51的V_H区段、来自人类种系3-10的D区段、以及来自人类种系JH 4b的J_H区段。21D4 V_H序列与种系VH 5-51序列的比对示于图8。使用CDR区域测定的Kabat***对21D4 V_H序列进一步分析，得到分别如在图1A及8，以及SEQ ID NO：16、23及30中所示的重链CDR1、CDR2以及CD3区域的示意图。

21D4轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明21D4轻链利用了来自人类种系V_K L18的V_L区段以及来自人类种系JK 2的J_K区段。21D4 V_L序列与种系V_K L18序列的比对示于图15。使用CDR区域测定的Kabat***对21D4 V_L序列进一步分析，得到分别如在图1B及15，以及SEQ ID NO：37、44及51中所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区域的示意图。

21D4a的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别示于图1A以及SEQID NO：59及1中。

21D4a的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别示于图1C以及SEQID NO：67及9中。

21D4a重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列的比较证明21D4a重链利用了来自人类种系V_H 5-51的V_H区段、来自人类种系3-10的D区段、以及来自人类种系JH 4b的J_H区段。21D4a V_H序列与种系VH 5-51序列的比对示于图8。使用CDR区域测定的Kabat***对21D4a V_H序列进一步分析，得到分别如在图1A及8，以及SEQ ID NO：16、23及30中所示的重链CDR1、CDR2以及CD3区域的示意图。

21D4a轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明21D4a轻链利用了来自人类种系V_K L18的V_L区段以及来自人类种系JK 3的J_K区段。21D4a V_L序列与种系V_K L18序列的比对示于图16。使用CDR区域测定的Kabat***对21D4a V_L序列进一步分析，得到分别如在图1C及16，以及SEQ ID NO：37、44及52中所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区域的示意图。

47G4的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别示于图2A以及SEQID NO：60及2中。

47G4的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别示于图2B以及SEQID NO：68及10中。

47G4重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列的比较证明47G4重链利用了来自人类种系V_H 1-69的V_H区段、来自人类种系6-19的D区段、以及来自人类种系JH 5b的J_H区段。47G4 V_H序列与种系VH 1-69序列的比对示于图9。使用CDR区域测定的Kabat***对47G4 V_H序列进一步分析，得到分别如在图2A及9，以及SEQ ID NO：17、24及31中所示的重链CDR1、CDR2以及CD3区域的示意图。

47G4轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明47G4轻链利用了来自人类种系V_KA27的V_L区段以及来自人类种系JK 3的JK区段。47G4 V_L序列与种系V_K A27序列的比对示于图17。使用CDR区域测定的Kabat***对47G4 V_L序列进一步分析，得到分别如在图2B及17，以及SEQ ID NO：38、45及53中所示的轻链CDR1、CDR2以及CDR3区域的示意图。

27F3的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别示于图3A以及SEQID NO：61及3中。

27F3的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别示于图3B以及SEQID NO：69及11中。

27F3重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列的比较证明27F3重链利用了来自人类种系V_H 5-51的V_H区段、来自人类种系6-19的D区段、以及来自人类种系JH 6b的J_H区段。27F3 V_H序列与种系V_H 5-51序列的比对示于图10。使用CDR区域测定的Kabat***对27F3 V_H序列进一步分析，得到分别如在图3A及10，以及SEQ ID NO：18、25及32中所示的重链CDR1、CDR2以及CD3区域的示意图。

27F3轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明21F3轻链利用了来自人类种系V_K L18的V_L区段以及来自人类种系JK 2的J_K区段。27F3 V_L序列与种系V_K L18序列的比对示于图18。使用CDR区域测定的Kabat***对27F3 V_L序列进一步分析，得到分别如在图3B及18，以及SEQ ID NO：39、46及54中所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区域的示意图。

3C10的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别示于图4A以及SEQID NO：62及4中。

3C10的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别示于图4B以及SEQID NO：70及12中。

3C10的重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列的比较证明3C10重链利用了来自人类种系V_H 1-69的V_H区段、来自人类种系1-26的D区段、以及来自人类种系JH 6b的J_H区段。3C10 V_H序列与种系VH 1-69序列的比对示于图11。使用CDR区域测定的Kabat***对3C10 V_H序列进一步分析，得到分别如在图4A及11，以及SEQ ID NO：19、26及33中所示的重链CDR1、CDR2以及CD3区域的示意图。

3C10轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明3C10轻链利用了来自人类种系V_K L15的V_L区段以及来自人类种系JK 2的J_K区段。3C10 V_L序列与种系V_K L15序列的比对示于图19。使用CDR区域测定的Kabat***对3C10 V_L序列进一步分析，得到分别如在图4B及19，以及SEQ ID NO：40、47及55中所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区域的示意图。

5G7的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别示于图5A以及SEQ IDNO：63及5中。

5G7的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别示于图5B以及SEQ IDNO：71及13中。

5G7重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列的比较证明5G7重链利用了来自人类种系V_H 5-51的V_H区段、来自人类种系3-10的D区段、以及来自人类种系JH 6b的J_H区段。5G7 V_H序列与种系V_H 5-51序列的比对示于图12。使用CDR区域测定的Kabat***对5G7 V_H序列进一步分析，得到分别如在图5A及12，以及SEQ ID NO：20、27及34中所示的重链CDR1、CDR2以及CD3区域的示意图。

5G7轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明5G7轻链利用了来自人类种系V_K L18的V_L区段以及来自人类种系JK 1的J_K区段。5G7 V_L序列与种系V_K L18序列的比对示于图20。使用CDR区域测定的Kabat***对5G7 V_L序列进一步分析，得到分别如在图5B及20，以及SEQ ID NO：41、48及56中所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区域的示意图。

13F1的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别示于图6A以及SEQID NO：64及6中。

13F1的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别示于图6B以及SEQID NO：72及14中。

13F1重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列的比较证明13F1重链利用了来自人类种系V_H 5-51的V_H区段、来自人类种系6-19的D区段、以及来自人类种系JH 6b的J_H区段。13F1 V_H序列与种系V_H 5-51序列的比对示于图13。使用CDR区域测定的Kabat***对13F1 V_H序列进一步分析，得到分别如在图6A及13，以及SEQ ID NO：21、28及35中所示的重链CDR1、CDR2以及CD3区域的示意图。

13F1轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明13F1轻链利用了来自人类种系V_K L18的V_L区段以及来自人类种系JK 2的J_K区段。13F1 V_L序列与种系V_K L18序列的比对示于图21。使用CDR区域测定的Kabat***对13F1 V_L序列进一步分析，得到分别如在图6B及21，以及SEQ ID NO：42、49及57中所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区域的示意图。

46E8的重链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别示于图7A以及SEQID NO：65及7中。

46E8的轻链可变区的核苷酸及氨基酸序列分别示于图7B以及SEQID NO：73及15中。

46E8重链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白重链序列的比较证明46E8重链利用了来自人类种系V_H 5-51的V_H区段、来自人类种系6-19的D区段、以及来自人类种系JH 6b的J_H区段。46E8 V_H序列与种系V_H 5-51序列的比对示于图14。使用CDR区域测定的Kabat***对46E8 V_H序列进一步分析，得到分别如在图7A及14，以及SEQ ID NO：22、29及36中所示的重链CDR1、CDR2以及CD3区域的示意图。

46E8轻链免疫球蛋白序列与已知的人类种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明46E8轻链利用了来自人类种系V_K L18的V_L区段以及来自人类种系JK 2的J_K区段。46E8 V_L序列与种系V_K L18序列的比对示于图22。使用CDR区域测定的Kabat***对46E8 V_L序列进一步分析，得到分别如在图7B及22，以及SEQ ID NO：43、50及58中所示的轻链CDR1、CDR2以及CD3区域的示意图。

实施例3：抗CD19人类单克隆抗体的结合特异性以及结合动力学的表征

在这个实例中，通过ELISA分析检查了抗CD19抗体21D4以及47G4的结合亲和力。

通过ELISA测定结合特异性

用PBS中的1.0μg/ml的50μl经纯化的全长CD19-Fc融合蛋白对微量滴定板进行包被，并接着用PBS中的150μl的1％牛血清白蛋白进行封闭。将这些板孵育30分钟至1小时，并洗涤三次。向每个孔中加入HuMAb抗CD19抗体47G4的稀释液，并在37℃下孵育1小时使用一种已知的小鼠抗CD19抗体作为阳性对照。用PBS/吐温对滴定板进行洗涤，并接着用缀合了辣根过氧化物酶的山羊抗人类IgGκ特异的第二试剂在37℃孵育1小时。洗涤后，用ABTS底物(1.46mMol/L)对这些板进行显影，并在490nm的OD下进行分析。结果描绘于图23中。CD19 HuMAb 47G4与人类CD19肽特异地结合。

抗CD19抗体的表位作图

使用流式细胞术确定抗CD19 HuMAb的表位分类。通过用0.3μg/ml经生物素化的21D4或21D4a抗CD19人类抗克隆抗体孵育Raji B肿瘤细胞，洗涤，并接着通过加入冷的抗CD19人类单克隆抗体来评估抗CD19人类单克隆抗体21D4、21D4a、3C10、5G7、5G7-N19K、5G7-N19Q以及13F1的表位结合。使用同种型对照抗体作为阴性对照。用FITC标记的抗人类IgG Ab检测结合。使用FACScan流式细胞术(Becton Dickinson，SanJose，CA)进行流式细胞术分析。结果示于图24A及B所示。数据分析表明，抗CD19抗体21D4、21D4a、3C10、5G7以及13F1竞争相同的表位区域。

实施例4：CD19抗体与源自B细胞的肿瘤细胞系的结合

通过流式细胞术评估了CD19 HuMAb与B细胞肿瘤系Raji以及Daudi，或者与CHO-CD19转染细胞系的结合。用包含编码跨膜形式的CD19的全长cDNA的表达质粒转染CHO细胞。用以下CD19 HuMAb之一孵育Raji、Daudi以及CD19-CHO细胞系：21D4、21D4a、47G4、5G7、5G7-N19K、5G7-N19Q、3C10或13F1。使用一种已知的小鼠抗CD19抗体作为阳性对照。洗涤细胞，并通过藻红蛋白标记的抗人类或抗小鼠二级抗体进行检测，并通过流式细胞术进行分析。与CHO-CD19细胞系、DaudiB细胞系、Raji B细胞系结合的结果，以及针对Raji B细胞系的扩大的结合组分别示于图25A、25B、25C以及25D中。人类抗CD19单克隆抗体21D4以及47G4与CHO-CD19细胞系相结合。人类抗CD19单克隆抗体21 D4、21D4a、47G4、5G7、5G7-N19K、5G7-N19Q、3C10以及13F1与Raji B细胞系相结合。抗CD19 HuMAb抗体21D4、21D4a、3C10、5G7、5G7-N19K、5G7-N19Q、以及13F1已计算的EC₅₀值分别为0.1413、0.1293、0.2399、0.1878、0.2240、0.2167以及0.2659。47G4还显示出与Daudi B肿瘤细胞系相结合。通过染色的几何平均荧光强度(GMFI)的测定显示了所有结果。这些数据表明，CD19蛋白表达于B细胞起源的肿瘤细胞系的表面上，并且抗CD19 HuMAb抗体21D4、21D4a、47G4、5G7、5G7-N19K、5G7-N19Q、3C10以及13F1与在细胞表面上表达的CD19相结合。

实施例5：抗CD19人类抗体21D4以及47G4与Raji B肿瘤细胞的斯卡查德结合分析

Raji细胞从ATCC(保藏号CCL-86)中获得，并生长于含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI中。用含有10％FBS的RPMI在4℃下洗涤细胞两次，并在含有10％胎牛血清的RPMI培养基中将细胞调整为4×10⁷个细胞/ml(结合缓冲液包含24mM Tris pH7.2、137mM NaCl、2.7mN KCl、2mM葡萄糖、1mM CaCl₂、1mM MgCl₂、0.1％BSA)。用溶于水中的1％脱脂奶粉对Millipore板(MAFB NOB)进行包被，并在4℃下保存过夜。用结合缓冲液洗涤这些板，并将25μl处于结合缓冲液中的未标记抗体(1000倍过量)加至Millipore 96孔玻璃纤维过滤板(非特异性结合NSB)的对照孔中。将25微升缓冲液单独加至最大结合对照孔(总结合)中。加入25μl不同浓度的¹²⁵I-抗CD19抗体21D4或47G4，以及25μl处于结合缓冲液中的Raji细胞(4×10⁷个细胞/ml)。将板在摇床上在4℃下以200RPM孵育2小时。孵育完成后，用0.2ml冷的洗涤缓冲液(24mM Tris pH7.2、500mM NaCl、2.7mN KCl、2 mM葡萄糖、1mM CaCl₂、1mM MgCl₂、0.1％BSA)将Millipore板洗涤3次。除去滤器并用γ计数器进行计数。使用Prism软件(San Diego，CA)，用单位点结合参数进行平衡结合的评估。使用以上斯卡查德结合测定，抗体对Raji细胞的K_D约为2.14nM(21D4)以及12.02nM(47G4)。

实施例6：抗CD19单克隆抗体的内化

使用Hum-Zap内化测定法测试了抗CD19 HuMAb内化至表达CD19的Raji B肿瘤细胞或转染了CD19的CHO细胞中的能力。Hum-Zap通过一种二级抗体与缀合了细胞毒素皂草毒蛋白的人类IgG以亲和力相结合对人类一级抗体的内化进行了测试。

在100μl孔中以1.0×10⁴个细胞/孔接种CHO-CD19或Raji B肿瘤细胞系，过夜或第二天培养两个小时。向孔中加入抗CD19抗体21D4或47G4，起始浓度为30nM，并以1∶3的连续稀释度进行滴定。使用对CD19非特异的一种人类同种型对照抗体作为阴性对照。以11nM的浓度加入Hum-Zap(Advanced Targeting Systems，San Diego，CA，IT-22-25)，并将板孵育48小时。然后用1.0μCi的³H-胸苷对板脉冲18至24小时，收获并在Top Count Scintillation Counter(Packard Instru ments，Meriden，CT)中进行读数。CHO-CD19以及B肿瘤细胞的内化结果分别示于图26A及26B中。在CHO-CD19细胞上仅测试HuMAb 47G4。抗CD19抗体47G4显示CHO-CD19细胞上³H-胸苷掺入的抗体浓度依赖性下降。21D4以及47G4 HuMAb均表现出Raji B肿瘤细胞上的³H-胸苷掺入的抗体浓度依赖性下降。这个数据表明抗CD19抗体21D4以及47G4内化进入表达CD19的CHO-CD19转染细胞以及B肿瘤细胞中。

实施例7：缀合细胞毒素的抗CD19抗体的细胞杀伤作用的评估

在这个实施例中，在胸苷掺入测定中，测试缀合细胞毒素的抗CD19单克隆抗体杀死CD19阳性细胞系的能力。在这个实验中使用了细胞毒素N1。

抗CD19单克隆抗体通过连接体与细胞毒素相缀合，该连接体例如肽基、腙或二硫化物连接体。阳性表达CD19的Raji细胞系以2.5×10⁴个细胞/孔接种3小时。向孔中加入抗CD19抗体-细胞毒素缀合物，起始浓度为30nM，并以1∶3的连续稀释度进行滴定。使用对CD19非特异性的同种型对照抗体作为阴性对照物。使用10倍过量的冷抗体(21D4a或同种型对照抗体)来竞争结合。将板孵育69小时。然后用1.0μCi的³H-胸苷对板脉冲24小时，收获并在Top Count Scintillation Counter(PackardInstruments，Meriden，CT)中进行读数。结果与EC50值一起显示于图27A以及B中。这个数据证明抗CD19抗体21D4杀死Raji B细胞肿瘤细胞。

实施例8：使用抗CD19抗体治疗体内B细胞肿瘤

在这个实施例中，使用裸露的抗CD19 21D4抗体或缀合了细胞毒素的抗CD19抗体21D4，对植入了癌性B细胞肿瘤的SCID小鼠进行体内治疗，以检查这些抗体在体内对肿瘤生长的作用。在这个实验中使用了细胞毒素N1。

如以上说明制备缀合了细胞毒素的抗CD19抗体。使用缺乏功能性B及T淋巴细胞的重度联合免疫缺损(SCID)小鼠来研究B细胞恶性肿瘤。经静脉内注射来自Ramos B肿瘤细胞系的细胞。用19.6mg/kg的缀合了细胞毒素的抗CD19抗体或30mg/kg的裸露的抗CD19抗体对小鼠进行治疗。使用同种型对照抗体或配制缓冲液作为阴性对照物。将同种型对照物与通过N1中连接体的裂解而释放的游离毒素相缀合。用大约200μl包含抗体或运载体的PBS对这些动物通过腹膜内注射进行给药。在第7天将该抗体-细胞毒素缀合物作为单次剂量进行注射，而在第1天该裸露的抗体作为单次剂量预防模型进行注射，或者在第7、14和21天作为治疗模型进行注射。每天监测这些小鼠的后腿瘫痪，持续大概6周。使用电子测径器对肿瘤进行三维测量(高×宽×长)，并计算出肿瘤的体积当出现后腿瘫痪后，对小鼠实施安乐死。

如通过Kaplan-Meier分析所记录(图28)，用预防性施用的缀合了细胞毒素的抗CD19抗体、裸露的抗CD19抗体或作为治疗方案给予的抗CD19抗体进行治疗后，平均存活时间增加。在平均存活时间中所显示增加最大的是使用裸露的抗CD19抗体的预防性治疗。

还测量了体重的变化，并将其计算成体重的百分比变化。数据显示在图29A及29B中。在30天的时间内，使用一种细胞毒素-缀合物抗体体重变化出现净增长，而使用抗体以及细胞毒素(未缀合)则出现净减少。使用预防性裸露的抗CD19抗体或抗CD19抗体治疗方案均出现体重变化的净增加。

实施例9：使用裸露的抗CD19抗体对体内肿瘤异种移植模型的治疗

用裸露的抗CD19抗体对植入了淋巴瘤肿瘤的小鼠进行体内治疗，以检查这些抗体在体内对肿瘤生长的影响。

使用标准的实验室操作在体外扩增ARH-77(人类B淋巴母细胞白血病；ATCC保藏号CRL-1621)以及Raji(人类B淋巴细胞伯基特淋巴瘤；ATCC保藏号CCL-86)细胞。6至8周龄的雄性CB17.SCID小鼠(Taconic，Hudson，NY)每只小鼠在右侧腹经皮下植入了在0.2 ml的PBS/Matrigel(1∶1)中的5×10⁶个ARH-77或Raji细胞。对小鼠称重，并在植入后，用电子测径器每周两次对肿瘤进行三维测量。肿瘤体积被计算成高×宽×长/2。将具有平均80mm³的ARH-77肿瘤以及平均170mm³的Raji肿瘤的小鼠随机分到治疗组中。在0天用PBS运载体、同种型对照抗体或裸露的抗CD19 HuMAb 2H5对小鼠经腹膜内进行给药。当肿瘤达到肿瘤终点(2000mm³)时对小鼠实施安乐死。结果示于图30A(ARH-77肿瘤)以及图30B(Raji肿瘤)中。裸露的抗CD19抗体21D4延长了达到肿瘤终点体积(2000mm³)的平均时间，并减缓了肿瘤生长进程。因此，仅用抗CD19抗体治疗对于肿瘤生长具有直接的体内抑制作用。

实施例10：非岩藻糖基化的HuMAb的产生

已经证实具有减少量的岩藻糖残基的抗体提高该抗体的ADCC能力。在这个实施例中，已经产生缺少岩藻糖基残基的抗CD19 HuMAb 21D4。

用表达抗体21D4的重链以及轻链的载体对缺乏岩藻糖转移酶基因FUT 8的CHO细胞系Ms704-PF(Biowa，Inc.，Princeton，NJ)进行电穿孔。通过在具有6mM L-谷氨酰胺以及500μg/ml G418(Invitrogen，Carlsbad，CA)的Ex-Cell 325-PF CHO培养基(JRH Biosciences，Lenexa，KS)中生长对药物抗性克隆进行选择。通过标准的ELISA测定针对IgG表达对这些克隆进行筛选。

通过CE-LIF对Mab的寡糖的表征

通过毛细管电泳激光诱导荧光(cLIF)(Chen and Evangelista(1998)Electrophoresis 15：1892)对来自CHO岩藻糖基化细胞系的抗CD19抗体以及源自Ms704-PF的抗CD19抗克隆抗体样品所衍生的N-连接的寡糖进行比较分析。通过用12.5 mU PNGaseF(Prozyme)在40℃下过夜孵育IgG样品(100μg)，从该样品中释放经纯化抗体的N-连接的寡糖。在所用条件下，从在CHO岩藻糖基化及非岩藻糖基化的细胞中所表达的HuMAb21D4的Fc部分中释放N-连接的聚糖。用乙醇沉淀去除MAb蛋白后，通过真空离心对包含聚糖的上清液进行干燥，并在温和的还原氨基化条件(15％乙酸和1M氰基硼氢化钠的THF(Sigma)溶液)下将干燥产物重悬于19mM的8-氨基芘-1，3，6-三磺酸盐(APTS)(Beckman)中，在氨基化条件下岩藻糖残基的去唾液酸化作用以及损失被最小化。使聚糖标记反应在40℃下持续过夜，然后将样品用水稀释25倍。使用了有效长度50cm、内径50μm的N-CHO涂覆的毛细管(Beckman)，在具有相反极性的P/ACEMDQ CE***(Beckman)上将APTS标记的聚糖应用至带有激光诱导的荧光的毛细管电泳。对样品进行压力(8秒)注射，并在20℃使用糖类分离凝胶缓冲液(Carbohydrate Separation Gel Buffer)(Beckman)在25kV下分离20分钟。使用激光诱导荧光检测***(Beckman)监测分离，该***具有3mW氩离子激光器以及488nm的激发波长及520nm的发射波长(Ma and Nashabeh(1999)Anal.Chem.71：5185)。与Ms704-PF细胞系相比，在从岩藻糖基化细胞系处获得的抗体中观察到寡糖特性曲线中的差异，这种差异与在源自Ms704-PF的抗CD19抗体中不存在岩藻糖残基相一致。

用HPAE-PAD通过HPLC进行单糖分析

使用2N TFA(用于估计中性糖)或6N HCl(用于估计氨基糖)使IgG样品(200μg)在100℃下经受酸水解4h。在HPAE-PAD(Dionex)进行分析之前，将样品在环境温度下通过真空离心进行干燥，并重溶于200μl水。使用带有预柱Amino Trap以及Borate Trap的CarboPac PA10 4×250mm柱(Dionex)对单糖进行分离。操作根据Dionex Technical Note(Dionex技术说明)53进行。使用单糖标准品(Dionex)确定单糖峰身份以及相对丰度。

还使用标准毛细管等电聚焦试剂盒测定(Beckman Coulter)对非岩藻糖基化的抗CD19 21D4抗体进行了测试。该测定返回观察到的pI值是：pH8.45(岩藻糖基化的21D4)；8.44和8.21(岩藻糖基化的21D4a)；以及8.52和8.30(非岩藻糖基化的21D4抗体)。

实施例11：抗CD19抗体的ADCC活性评估

在这个实例中，在荧光细胞毒性测定法中测试了岩藻糖基化以及非岩藻糖基化的抗CD19单克隆抗体在效应细胞的存在下经抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)杀死CD19阳性细胞的能力。

按照以上说明的方法制备了非岩藻糖基化的人类抗CD19单克隆抗体21D4。如下从全血中制备人类效应细胞。通过标准菲可帕克分离从肝素化的全血中纯化了人类外周血单核细胞。将细胞重悬于含有10％FBS(培养基)以及200U/ml人类IL-2的RPMI1640培养基中，并在37℃下孵育过夜。第二天，收集细胞并用培养基洗涤一次，并以2×10⁷个细胞/ml的密度进行重悬。用BATDA试剂(Perkin Elmer，Wellesley，MA)在每1×10⁶个靶细胞/mL 2.5μl BATDA的情况下在补充有2.5mM丙磺舒(测定介质)的培养基中在37℃下孵育阳性CD19靶细胞20分钟。用含有20mMHEPES以及2.5mM丙磺舒的PBS洗涤靶细胞四次，离心并使终体积为在测定介质中1×10⁵个细胞/ml。

如下使用Delfia荧光发射分析针对岩藻糖基化以及非岩藻糖基化的人类抗CD19单克隆抗体21D4的抗体特异性ADCC而测试CD19阳性细胞系ARH-77(人类B淋巴母细胞白血病；ATCC保藏号CRL-1621)。将靶细胞系ARH77(100μl被标记的靶细胞)与50μl效应细胞以及50μl的21D4或非岩藻糖基化的21D4抗体一起孵育。整个实验中所使用的靶细胞与效应细胞的比率为1∶50。使用人类IgG1同种型对照物作为阴性对照。在2100rpm脉冲离心以及在37℃下孵育一小时后收集上清液，再次快速离心，并将20μl上清液转移至平底板中，向板中加入180μl的Eu溶液(Perkin Elmer，Wellesley，MA)，并在Fusion Alpha TRF平板读数仪(Perkin Elmer)中进行读数。裂解％计算如下：(样品释放量-自发释放量＊100)/(最大释放量-自发释放量)，其中自发释放量是来自仅含有靶细胞的孔的荧光，而最大释放量是来自含有靶细胞并已用3％来苏尔处理的孔的荧光。ARH-77细胞系的细胞毒性特异性裂解％示于图31。阳性表达CD19的细胞系ARH-77显示HuMAb抗CD19抗体21D4的抗体介导的细胞毒性以及与抗CD19抗体21D4的非岩藻糖基化形式相关的特异性裂解的增加的百分比。这个数据证明，非岩藻糖基化的HuMAb抗CD19抗体显示出了对表达CD19阳性细胞的提高的特异性细胞毒性。

实施例12：通过差示扫描量热法测定抗CD19单克隆抗体的热稳定性

使用抗CD19抗克隆抗体的解链温度的量热分析，比较抗CD19抗克隆抗体的热稳定性。

在与自动进样器(MicroCal LLC，Northampton，MA，USA)相组合的VP-Capillary DSC差示扫描微量热计平台上进行解链温度^TM的量热测量。样品池的体积是0.144mL。通过以1℃/min的速率将浓度为2.3μM的样品从30℃加热至95℃，获得糖基化以及去糖基化形式抗体的的变性数据。蛋白样品存在于pH7.4的磷酸缓冲盐水(PBS)中。在参比池中使用同样的缓冲液以通过比较获得摩尔热容量。使用软件Origin v7.0，基于种2-态模型对所观察到的热图进行基线校正以及标准化数据分析。数据示于表2。

表2.抗CD19抗体的热稳定性测量

克隆热稳定性Tm1(℃)

21D4 68.7

21D4a 69.7

5G7 68.5

5G7 IgG4 67.4

13F1 IgG4 68.4

46E8 66.4

47G4 67.2

实施例13：糖基化位点的评估

通过序列分析发现HuMAb抗CD19抗体5G7在可变区中具有N-X-S/T糖基化基序。N-连接序列位点(N-X-S/T)的存在是必要但对于碳水化合物添加到Mab上而言不是足够的。即，可能具有N-X-S/T序列，该序列由于蛋白质折叠以及溶剂可及性而实际上并未添加碳水化合物。通过LC-MS以及Western分析对5G7的可变区中的糖基化位点的确认进行了检查。

液相色谱-质谱(LC-MS)是测定蛋白质(如抗体)质量的标准工具。分析之前，通过用12.5mU PNGaseF(Prozyme)在40℃下过夜孵育IgG样品(100μg)，从该样品中释放抗CD19 HuMAb 5G7以及13F1的N-连接的寡糖。在所用的条件下，来自该HuMAb的Fc部分的N连接的聚糖被释放。对于克隆5G7而言，我们观察到两个高丰度的质量，一个(49,855Da)对应于用PNGaseF消化以去除恒定区中保守的N-连接位点(N297)上的糖之后的预测质量，而第二个质量(52,093 Da)与碳水化合物在第二个位点上的添加一致。我们已经发现，Fab区域的聚糖不被PNGaseF消化而除去；因此，这个数据支持在克隆5G7的可变区中存在碳水化合物。对于克隆13F1，所观察到的质量与没有附着碳水化合物的蛋白序列的预测质量相匹配。

为了确认以上结果，我们用碳水化合物特异的染色方法在克隆5G7以及13F1的Fab片段上完成蛋白质印迹测定。Fab以及Fc片段是通过向25μg的IgG样品(包含1 mM半胱氨酸)中添加1.25μg被激活的木瓜蛋白酶而产生的。样品在40℃下孵育4h，并用30mM碘乙酰胺终止反应。通过4％至20％的Tris-Glycine SDS-PAGE对样品进行分析，然后将样品电印迹至PVDF膜上。使用Gel CodeGlycoprotein Staining Kit(Pierce)，按照生产商建议的实验方案进行印迹的碳水化合物特异性染色。结果在5G7抗体中检测到了Fab糖基化，但在13F1抗体中则没有。这些结果表明5G7抗体在Fab区域内是被糖基化的。

如以上所述，抗CD19单克隆抗体5G7包含具有糖基化位点的可变区。因为可变区中的糖基化位点可能导致该抗体的免疫原性增加，或由于抗原结合发生改变而导致pK值改变，所以对可变区N-X-S/T糖基化基序的序列进行突变以减少糖基化可能是有利的。使用标准的分子生物学技术，对5G7抗体序列进行了修饰，将在位置19开始的N-I-S序列改变为K-I-S(5G7-N19K)或Q-I-S(5G7-N19Q)。

实施例14：通过荧光光谱法测量抗CD19单克隆抗体的稳定性

通过荧光光谱学测量化学变性的中点，比较了抗CD19单克隆抗体的稳定性。

在带有Micromax板读数器的SPEX Fluorolog 3.22(SPEX，Edison，NJ)上进行化学变性的荧光测量。在抗体样品上进行测量，这些抗体样品已被置于PBS缓冲液中的16种不同浓度的盐酸胍中24小时以使其达到平衡。在黑色低体积非结合表面的384孔板(Corning，Acton，MA)中进行测量，并且需要在12μL的孔中加入2μM抗体。在280nm处激发荧光，并在300至400nm之间测量发射光谱。扫描速度是1秒/nm，并且狭缝设置为5nm带通。使用PBS进行缓冲液空白值，并从数据中自动将其扣除。数据显示于表3中。

表3.抗CD19抗体的荧光稳定性

克隆解折叠中点(M) 聚集峰(M)

21D4 3.01

21D4a 2.97

5G7 2.91

5G7 IgG4 2.63

27F3 2.77

13F1 IgG4 2.58 2.29

46E8 2.43 2.16

47G4 1.68

实施例15：使用抗CD19抗体治疗体内B细胞Raji肿瘤

在这个实施例中，使用裸露的抗CD19抗体或缀合了细胞毒素的抗CD19抗体对植入了癌性B细胞肿瘤的SCID小鼠进行体内治疗，以检查这些抗体在体内对肿瘤生长的作用。

缀合了细胞毒素的抗CD19抗体21D4如以上说明进行了制备。在这个实施例中测试了抗CD19-N1缀合物以及抗CD19-N2缀合物。使用缺乏功能性B及T淋巴细胞的重度联合免疫缺损(SCID)小鼠来研究B细胞恶性肿瘤。经皮下注射来自Raji B肿瘤细胞系的细胞。使用30mg/kg抗体或0.3微摩尔/kg(细胞毒素)抗体-细胞毒素缀合物治疗这些小鼠。使用同种型对照抗体或配制缓冲液作为阴性对照物。用大概200μl包含抗体或运载体的PBS通过经腹膜内注射对这些动物给药。这些抗体作为单次剂量(SD)在第0天进行注射，或者作为重复剂量(RD)在第0、7以及14天进行注射。每天使用电子测径器监测小鼠的肿瘤生长，对肿瘤进行三维测量(高×宽×长/2)，并计算肿瘤体积。当肿瘤达到肿瘤终点(2000mm³)或者所述小鼠体重下降大于20％时，对小鼠实施安乐死。结果显示在图32中。在每种情况下，与阴性对照物相比，抗CD19抗体显示了更小的肿瘤体积，其中与用裸露的抗体治疗相比细胞毒素缀合物的抗体显示更小的肿瘤体积。

还测量了体重的变化，并将其计算为体重的百分比变化。结果显示在图33中。结果显示使用细胞毒素缀合物抗体体重呈现净下降变化，而使用运载体或裸露的抗体体重呈现净增长。

实施例16：猕猴中的B细胞研究

在这个实例中，经静脉对猕猴注射亲代的抗CD19抗体21D4或非岩藻糖基化(nf)的抗CD19抗体21D4。给药后测定了绝对的白细胞计数以及白细胞亚群，并与给药前的值进行比较。

采自猕猴的血液样品用亲代CD19抗体或nf抗CD19抗体进行染色，并使用标准的方法通过FACS分析。本研究中所包括的来自所有猴子的B细胞对亲代以及nf抗CD19抗体染色均呈阳性。每组包括两只雄猴以及两只雌猴。在第7天以及给药前采集血液样品。在隐静脉中进行缓慢的一次性静脉内注射，并给予动物1mg/kg的亲代或nf抗CD19抗体。给药后24小时、48小时、72小时以及第7、14、21以及28天采集血液样品。采集的血液样品用于PK测定、血液学研究和用于流式细胞术。在每个时间点监测来自血液的以下细胞表面抗原：CD2阳性/CD20阳性(所有淋巴细胞)、CD20阳性(B-淋巴细胞)、CD3阳性(T-淋巴细胞)、CD3阳性/CD4阳性(T辅助淋巴细胞)、CD3阳性/CD8阳性(T细胞毒性淋巴细胞)、CD3阴性/CD16阳性(NK细胞)、CD3阴性/CD14阳性(单核细胞)。

图34显示与平均第7天以及给药前的值相比CD20阳性细胞的数目的变化。当在24小时后亲代抗CD19抗体诱导CD20阳性B细胞的数目下降55％，而非岩藻糖基化抗体产生了更深度的抑制作用，B细胞计数下降大约90％。在nf抗CD19组中，B细胞计数在治疗后第2、3和7天仍保持在这一水平，而亲代抗体则开始返回基线。图35显示了各个猴中的每只的CD20阳性细胞距基线的变化％。与亲代抗CD19抗体相比，用nf抗CD19抗体治疗的所有四只猴均表现出CD20阳性细胞％的更加显著的下降。综合这些数据表明，与亲代抗体相比，nf抗CD19抗体在清除循环的B细胞方面更为有效。

实施例17：抗CD19抗体的免疫组织化学研究

为了评估HuMab抗CD19的组织结合特征，在一系列正常(非肿瘤性)人类组织(包括脾脏、扁桃腺、小肠、小脑、大脑、心脏、肝脏、肺、以及肾(每种组织1至2个样品))，以及B细胞瘤(包括慢性淋巴细胞白血病、滤泡型淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、以及弥漫性大B细胞淋巴瘤(每种组织1至2个样品))中检验了FITC缀合的21D4(21D4-FITC，F∶P＝4)以及非岩藻糖基化21D4(nf21D4)(nf21D4-FITC，F∶P＝3)。非岩藻糖基化21D4抗体如以上所说明进行制备。FITC缀合的Hu-IgG₁(Hu-IgG₁-FITC)用作同种型对照抗体。

速冻且OCT包埋的正常以及淋巴瘤组织购自Cooperative HumanTissue Network(Philadelphia，PA)或National Disease Research Institute(Philadelphia，PA)。将5μm恒冷箱切片在室温下用丙酮固定10分钟，并且在-80℃下保存直到使用。按照我们的常规实验方案使用EnVision+***(Dako.Carpinteria，CA)进行间接过氧化物酶免疫染色。简单而言，载玻片用PBS(Sigma，St.Loui，MO)洗涤两次，并接着用Dako EnVision+***中提供的过氧化物酶封闭剂孵育10分钟。用PBS洗涤两次后，将载玻片用补充1％人类γ球蛋白以及1mg/ml热聚集的人类IgG的Dako蛋白封闭剂孵育20分钟，以封闭非特异性结合位点。随后，将一级抗体(21D4-FITC和nf21D4-FITC，浓度为0.4或2μg/ml)或同种型对照物(Hu-IgG1-FITC，浓度为0.4或2μg/ml)应用到切片上，并孵育1小时。用PBS洗涤三次后，将载玻片用小鼠抗FITC抗体(20μg/ml)孵育30分钟。用PBS洗涤三次后，载玻片用Dako EnVision+***中提供的过氧化物酶缀合的抗小鼠IgG聚合物孵育30分钟。最后，载玻片按以上方法洗涤，并与Dako EnVision+***中提供的DAB底物-色原溶液反应6分钟。然后遵照常规组织学程序，载玻片用去离子水洗涤、用Mayer′s苏木精(Dako)复染、脱水、清洁，并用Permount(Fischer Scientific，Fair Lawn，NJ)封片。

在淋巴组织或富含淋巴的组织(脾脏、扁桃体以及小肠)以及淋巴瘤组织中均观察到了21D4-FITC以及nf21D4-FITC的特异性染色。在脾脏以及扁桃体中，强的特异性染色主要分布于B细胞区域，即脾脏的淋巴小结、外套层以及扁桃体的生发中心。在小肠中，强的特异性免疫反应主要定位于淋巴集结或淋巴样聚集体中，以及在粘膜固有层中弥漫性淋巴细胞中从弱到强的染色。滤泡型淋巴瘤和边缘区淋巴瘤的肿瘤细胞中也显示出强染色，以及慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤以及套细胞淋巴瘤中显示中等到强的染色。

当用21D4-FITC或nf21D4-FITC染色时，除了肺和肾组织中的局部淋巴样细胞或聚集体外的一些染色外，在正常的小脑、大脑、心脏、肝脏、肺以及肾组织中未观察到有意义的染色。此外，对这些组织进行了高达10μg/ml的更高浓度的染色。类似地，与同种型对照抗体相比，也没有观察到特异性染色。

21D4-FITC与nf21D4-FITC的比较显示了在所有组织中相似的染色模式。该特异染色在0.4μg/ml达到饱和或者接近饱和。然而，21D4-FITC的染色强度比nf21D4-FITC强大约0.5至1个等级。这可能部分是由于21D4-FITC的更高F∶P比率(4对3)。

实施例18：抗CD19抗体的细胞杀伤评估

在这个实施例中，在胸苷掺入测定法中测试了仅抗CD19单克隆抗体或与细胞毒素相缀合的抗CD19单克隆抗体杀伤CD19阳性细胞系的能力。

将抗CD19单克隆抗体通过连接体与细胞毒素(N1)相缀合，这些连接体为例如肽基、腙或二硫化物连接体。表达CD19阳性的Raji或SU-DHL-6细胞系以1×10⁴个细胞/孔接种。向孔中仅加入抗CD19抗体或加入抗CD19抗体-细胞毒素缀合物，起始浓度为30nM，并以1∶3的连续稀释度(8次稀释)进行滴定。将对CD19非特异性的同种型对照抗体用作阴性对照物。将板孵育69小时。然后用0.5μCi的³H-胸苷对板脉冲24小时，收获并在Top Count Scintillation Counter(Packard Instruments，Meriden，CT)中进行读数。结果与EC50值一起显示于图36中。图36A显示了Raji细胞上的裸露的抗体。图36B显示了SU-DHL-6细胞上的裸露的抗体。图36C显示了SU-DHL-6细胞上的细胞毒素缀合的抗CD19抗体。这个数据表明，抗CD19抗体21D4结合并杀死Raji B细胞肿瘤细胞，并对SU-DHL-6细胞有出乎意料的高水平的细胞杀伤。

实施例19：B细胞清除研究

为了确定抗CD19抗体是否能清除B细胞，设置了全血B细胞清除测定。

人类全血购自AllCells Inc.(Berkeley，CA)，并在同一天在室温下递送。2ml的全血在不存在或存在1至30mg/ml所指明的抗体下或PBS(作为未治疗组)中孵育。将血-抗体混合物在37℃、5％CO₂条件下孵育过夜。在实验的那天，该血液用RBC裂解缓冲液以1∶10的比例通过孵育10分钟后离心裂解两次。第二次离心后，细胞沉淀物用FACS缓冲液(PBS，加钙和镁，以及2％FBS以及20％乙二胺四乙酸)洗涤一次，并接着使用标准的流式细胞术实验方案进行FACS染色，用抗CD3抗体(BectonDickinson)作为T细胞标记物，以及抗CD22抗体(Becton Dickinson)作为B细胞标记物。将细胞在冰上孵育20分钟，然后进行最后的洗涤，并重悬于FACS缓冲液中的5mg/ml碘化丙锭溶液(Sigma)中。使用FASCalibur***以及CellQuest软件(Becton Dickinson)通过流式细胞术收集数据，并使用淋巴细胞大小门控，通过FlowJo软件分析数据。百分比变化按以下方法确定：未治疗组中的阳性B细胞％减去抗体治疗组中的阳性B细胞％，除以未治疗组中的阳性B细胞％，乘以100。结果显示在表4中。对于健康捐血者，血液在过夜孵育(无抗体)后血液中仍保留8.7％的B细胞。与未治疗、无抗体的组相比，将全血与30mg/ml阳性对照Rituxan孵育导致B细胞数量减少46％。用非岩藻糖基化(nf)抗CD19抗体21D4治疗的组对B细胞清除具有显著的作用，抑制B细胞大约40％。亲代抗体21D4对B细胞计数具有中等的影响。

表4.全血中的B细胞清除

样品％阳性(CD22) ％变化

无抗体 8.7 --

同种型对照物 7.5 14.2

4.7 46.3

亲代抗CD19mAb 7.0 20.0

Nf抗CD19mAb 5.2 40.5

实施例20：抗CD19免疫连接物在皮下异种移植模型中的体内功效

为了确定抗CD19免疫连接物是否能在体内抑制或减缓肿瘤生长，对SCID小鼠中的皮下异种移植模型进行了测试。SCID小鼠每只经皮下植入了在0.1ml PBS以及0.1ml基质胶(matrigel)中的1×10⁷个Raji细胞。监测肿瘤的形成直到经测量平均肿瘤体积(使用精密测径器)达到大约50mm³。用以下物质之一的单次剂量治疗八只荷瘤小鼠组：(a)运载体对照物；(b)同种型对照物；(c)抗CD19抗体21D4；或(d)免疫连接物抗CD19-N2，使用抗体21D4。对小鼠经腹膜内(i.p.)给予免疫连接物抗CD19-N2(MEDX-2338)以及同种型对照物N2(IgG-N2)，剂量为0.3μmol/kg的N2等同物。抗CD19抗体的给药剂量为25.7mg/kg(即，对免疫连接物CD19-N2所用的N2等同物的等同蛋白剂量)。在实验过程中用精密测径器测量来监测肿瘤生长。如图37中明显可见的，与当只用对照物或抗CD19抗体治疗时具有肿瘤大小不断增长的小鼠相比，用免疫连接物CD19-N2的单次剂量治疗导致10天内小鼠无肿瘤(并且直到60天仍然无肿瘤)。

实施例21：抗CD19免疫连接物在伯基特淋巴瘤模型中的体内功效

为了确定抗CD19免疫连接物是否能在体内以剂量依赖性方式抑制或减缓肿瘤生长，对皮下伯基特淋巴瘤SCID小鼠模型进行了测试。SCID小鼠每只经皮下植入了在0.1ml PBS以及0.1ml基质胶中的1×10⁷个Raji细胞。监测肿瘤的形成直到测量平均肿瘤体积(使用精密测径器)达到大约70mm³。用以下物质之一治疗八只荷瘤小鼠的多个组：(a)运载体对照物；(b)抗CD19抗体21D4；或(c)免疫连接物抗CD19-N2，使用抗体21D4。每组小鼠经腹膜内给予两个剂量的免疫连接物CD19-N2，相隔一周，按以下剂量之一进行给药：0.3μmol/kg、0.1μmol/kg、0.03μmol/kg、以及0.01μmol/kg的N2等同物。抗CD19抗体的给药剂量为25mg/kg(即，对免疫连接物CD19-N2所用的N2等同物的等同蛋白剂量)。在实验过程中用精密测径器测量来监测肿瘤生长。从图38中明显可见，肿瘤体积以剂量依赖性方式减小，使用0.3μmol/kg的免疫连接物CD19-N2时，到第20至30天得到无肿瘤小鼠，相比之下，使用较低剂量时，肿瘤体积增加。

实施例22：抗CD19免疫连接物在***模型中的体内功效

为了确定抗CD19免疫连接物是否能在体内以剂量依赖性方式抑制或减缓肿瘤生长，对皮下伯基特淋巴瘤SCID小鼠模型进行了测试。

SCID小鼠每只通过尾静脉经静脉内植入了在0.1ml PBS中的1×10⁶个Raji细胞。植入一周后，用以下物质之一的单次剂量治疗六只荷瘤小鼠组：(a)运载体对照物；(b)抗CD19抗体21D4；或(c)免疫连接物抗CD19-N2，使用抗体21D4。每组小鼠经腹膜内施用以下剂量之一的免疫连接物CD19-N2：0.3μmol/kg或0.1μmol/kg的N2等同物。抗CD19抗体的给药剂量为30mg/kg(即，对免疫连接物CD19-N2所用的N2等同物的等同蛋白剂量)。实验过程中通过测量后腿瘫痪(因Raji细胞侵入中枢神经***而造成的)的形成对肿瘤生长进行了监测。从图39中显然可以看出，当用0.3μmol/kg的免疫连接物CD19-N2进行治疗时，没有小鼠形成后腿瘫痪，而当用0.1μmol/kg的免疫连接物CD19-N2进行治疗时，15％的小鼠没有形成后腿瘫痪。与此相反，用抗CD19单独治疗的所有小鼠均在植入后50天内形成后腿瘫痪。

实施例23：猕猴中单次剂量药理学

为了评估抗CD19抗体21D4的药理学，对猕猴给予0.01、0.1、1或10mg/kg的非岩藻糖基化(NF)抗体的单次静脉内注射。通过FACS对CD20阳性B细胞进行了评估。将100-μL等分的每个血液样品置于洁净的被标记的试管中，并且加入适当量的可商购的荧光染料标记的抗CD20抗体。该等分试样在室温下孵育大概30分钟并且避光。标记之后，加入可商购的裂解液以除去血红细胞，并将剩余的完整细胞(大概1到2×10⁶个细胞/mL)立即进行分析，或者在大概4℃下保存直至分析(血液收集后不超过120小时)。将该悬浮液缓慢升温至室温然后立即用于分析。

施用21D4后，B细胞(CD20阳性)以剂量依赖性方式减少(图40A)，其中在0.01mg/kg时清除最少或者无清除。施用0.1mg/kg后，B细胞下降到基线的16％至32％。给药56天后看到B细胞的恢复。在这项研究中，B细胞清除的量级以及时长与注射0.1mg/kg利妥希玛相似(图40B)。

给予1mg/kg的21D4后，B细胞最少时为基线的3％到9％。在4只动物中，有2只在给药36天后B细胞开始恢复，并在给药后7个月内完全恢复。在其他两只动物中，B细胞在给药后6到11周开始恢复，并在给药后7个月是基线的56％和58％。

给予10mg/kg 21D4后B细胞的减少与给予1mg/kg后相似(3％到11％与3％到9％进行比较)。在这项研究中，给药15天后，对4只动物进行尸体剖检。试验品相关的发现局限于4只动物中有2只出现轻度脾淋巴滤泡萎缩。这表现为以下特征：几乎没有可识别的生发中心，并且淋巴样滤泡(B细胞在脾内的主要位置)的尺寸减小。其他组织(下颌骨以及肠系膜***以及肠相关的淋巴组织)中的淋巴样滤泡则未受到类似影响。另外两只动物保持到恢复期，且在给药后20周内，B细胞恢复至＞基线的75％。这些动物在第184天进行尸体剖检，且显微镜病理评估未见脾脏或***中有药理学作用。因此，将NF 21D4施用至猕猴耐受良好，并得到了清除CD19阳性B细胞的预期的药理学作用。

实施例24：猕猴中多剂量药理学

每月施用一次10mg/kg(x3)的非岩藻糖基化(NF)21D4，至第85天时，6只动物中有4只的B细胞计数是＜基线的5％。在其他2只动物中，第1次给药后的B细胞是＜基线的10％。在这些动物中，有1只动物的B细胞在第29天增加到基线的17％，并接着保持稳定至第85天。在另一只动物中，B细胞计数在第71天增加到基线的69％。整个研究中测量了IgG和IgM水平，并且它们不受施用NF 21D4的影响。在第92天，对6只动物中的4只进行尸体剖检。组织学的发现包括脾脏(4只动物中的2只)以及肠系膜***(4只动物中的1只)中出现轻度到中度的淋巴样滤泡萎缩。这表现为以下特征：几乎没有可识别的生发中心，并且淋巴样滤泡(B细胞在脾脏内的主要位置)的尺寸减小。剩余2只动物保持到恢复期。B细胞计数在第169天开始增加，并且在第225天为基线的31％以及38％。监测这些动物直至B细胞计数＞基线值的75％。

每周施用一次1、10或50mg/kg也导致B细胞数显著下降；最低时是＜基线的16％。在第30天每组取6只动物进行尸体剖检，并且组织学的发现包括，18只动物中有10只动物的脾脏中出现轻度到中度的淋巴样滤泡弥漫性萎缩。还在大多数动物中看到脾脏、***、以及骨髓中CD20阳性淋巴细胞的减少。

实施例25：抗CD19-毒素A对肿瘤生长的体内抑制

这个实施例使用三种人类淋巴瘤模型(SCID小鼠中的Raji以及Daudi，以及Es1^e裸鼠中的Ramos)证明抗CD19-细胞毒素A缀合物作为针对淋巴瘤的靶向治疗剂的效用。细胞毒素A的结构示于图46中。

这些动物模型用于测试抗CD19-细胞毒素A缀合物在体内的功效。CD19抗体21D4的细胞毒素缀合物此处称作CD19-细胞毒素A，它包含连接至细胞毒素A的CD19抗体21D4。细胞毒素A及其制备进一步说明于2006年12月28日提交的美国申请系列号60/882,461、以及2007年11月30日提交的美国申请系列号60/991,300，它们的全部内容特别并入本文作为参考。该细胞毒素A处于前体药物形式，并且不仅需要从抗体中释放以发挥活性，还需要切割4’氨基甲酸酯基团来释放活性部分。

为了证明抗CD19-细胞毒素A在Raji淋巴瘤模型中的活性，在荷有皮下Raji异种移植物的SCID小鼠中进行了治疗研究。将Raji细胞(在0.1mlPBS以及0.1ml Matrigel^TM中1000万个细胞/小鼠)经皮下植入到SCID小鼠中，并且当肿瘤达到190mm³的平均大小时，8只小鼠的多个组通过腹膜内注射单次剂量的抗CD19细胞毒素A进行治疗，剂量为0.03、0.1或0.3μmol/kg体重。此外，仅用运载体、或者同种型对照抗体细胞毒素A缀合物(以0.1或0.3μmol/kg体重)注射对照组。在这项研究的整个过程中记录肿瘤体积(LWH/2)以及小鼠的体重，持续进行到给药后63天。结果示于图41以及42中。图41在单一的曲线图中描绘了结果，并且图42描绘了包括同种型对照物的结果。这些结果证明，该抗CD19-细胞毒素A缀合物在淋巴瘤的治疗中是有效的，并且该治疗是剂量依赖性的。

使用Ramos异种移植物进行第二个淋巴瘤模型的研究。将Ramos细胞(在0.1ml PBS以及0.1ml Matrigel^TM中1000万个细胞/小鼠)经皮下植入到Es1^e裸鼠中(Jackson Laboratory)，并且当肿瘤达到110mm³的平均大小时，10只小鼠的多个组通过腹膜内注射单次剂量(0天)或重复剂量(0、11以及25天)的抗CD19细胞毒素A(以0.3μmol/kg体重的剂量)进行治疗。此外，仅用运载体、仅用抗CD19抗体、或者同种型对照抗体细胞毒素A缀合物以0.3μmol/kg体重的剂量对多个对照组进行注射。在这项研究的整个实验过程中记录肿瘤体积(LWH/2)以及小鼠的体重，持续进行到给药后60天。结果示于图43中。这些结果证明，该抗CD19-细胞毒素A缀合物在治疗这种动物模型中的淋巴瘤也是有效的。

使用Daudi异种移植物进行第三个淋巴瘤模型的研究。将Daudi细胞(在0.1ml PBS以及0.1ml Matrigel^TM中1000万个细胞/小鼠)经皮下植入到SCID小鼠中，并且当肿瘤达到70mm³的平均大小时，8只小鼠的多个组通过经腹膜内注射单次剂量的抗CD19细胞毒素A(以0.1或0.3μmol/kg体重的剂量)进行治疗。此外，仅用运载体、仅用抗CD19抗体(与0.3μmol/kg抗CD19-细胞毒素A的剂量相匹配)、或者用同种型对照抗体细胞毒素A缀合物(以0.1或0.3μmol/kg体重)对多个对照组进行注射。在这项研究的整个实验过程中记录肿瘤体积(LWH/2)以及小鼠的体重，持续进行到给药后58天。结果示于图44中。这些结果证明，该抗CD19-细胞毒素A缀合物在治疗这种动物模型中的淋巴瘤中也是有效的。

实施例26：抗CD19-N2对肿瘤生长的体内抑制

这个实施例证明了抗CD19-N2在SU-DHL-6淋巴瘤模型中的功效。CD19抗体21D4的细胞毒素缀合物此处被称作CD19-N2，它包含连接至N2的CD19抗体21D4。

在荷有皮下SU-DHL-6异种移植物的SCID小鼠中进行了治疗研究。将SU-DHL-6细胞(在0.1ml PBS以及0.1ml Matrigel^TM中1000万个细胞/小鼠)经皮下植入到SCID小鼠中，并且当肿瘤达到140mm³的平均大小时，10只小鼠的多个组通过经腹膜内注射单次剂量的抗CD19-N2(以0.1或0.3μmol/kg体重)进行注射。此外，仅用运载体，或者用同种型对照抗体N2缀合物(以0.1或0.3μmol/kg体重)对对照组进行注射。在这项研究的整个实验过程中记录肿瘤体积(LWH/2)以及小鼠的体重，持续进行到给药后64天。结果示于图45。这些结果证明该抗CD19-N2缀合物在淋巴瘤治疗中是有效的且是选择性的，并且该治疗是剂量依赖性的。

序列表概述

SEQID NO：	序列	SEQID NO：	序列
				1	V_H氨基酸21D4 & 21D4a	41	V_KCDR1氨基酸5G7
2	V_H氨基酸47G4	42	V_K CDR1氨基酸13F1
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				23	V_H CDR2氨基酸21D4 &21D4a	63	V_H核苷酸5G7
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				101	肽连接体

序列表

<110>梅达雷克斯公司

<120>结合CD19的人类抗体及其用途

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<150>US 60/991,700

<151>2007-11-30

<160>102

<170>PatentIn版本3.4

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<213>人

<400>56

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Trp Thr

1 5

<210>57

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>57

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His Thr

1 5

<210>58

<211>9

<212>PRT

<213>人

<400>58

Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His Thr

1 5

<210>59

<211>363

<212>DNA

<213>人

<400>59

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60

tcctgtaagg gttctggata cagctttagc agcagctgga tcggctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg atgactctga taccagatac 180

agtccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag gaccgcctac 240

ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacatgtt 300

actatgattt ggggagttat tattgacttc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360

tca 363

<210>60

<211>357

<212>DNA

<213>人

<400>60

caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg actctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag gacttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac aacaaactac 180

gcacagcagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagtctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagaagca 300

gtagctgcgg actggttaga cccctggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357

<210>61

<211>372

<212>DNA

<213>人

<400>61

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60

tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180

agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240

ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacagggg 300

tatagcagtg gctgggactc ctactacggt atgggcgtct ggggccaagg gaccacggtc 360

accgtctcct ca 372

<210>62

<211>369

<212>DNA

<213>人

<400>62

caggtccagct ggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatacta tcaactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcattccta tctttggtat acctaactac 180

gcacagaagt tccagggtag agttacgatt accgcggacg aatccacgaa cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag agctgaggac acggccgttt attactgtgc gagagccagt 300

ggtgggagcg cggactattc ctacggtatg gacgtctggg gccaagggac cgcggtcacc 360

gtctcctca 369

<210>63

<211>363

<212>DNA

<213>人

<400>63

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaacatc 60

tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180

agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcaa caccgcctac 240

ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagaggggtt 300

tctatgattt ggggagttat tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360

tca 363

<210>64

<211>372

<212>DNA

<213>人

<400>64

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgcagatc 60

tcctgtaagg gttctggata cacctttacc aactactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180

agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240

ctacagtgga gcggcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacaggga 300

tatagcagtg gctggcgctc ctactacggt atgggcgtct ggggccaagg gaccacggtc 360

accgtctcct ca 372

<210>65

<211>372

<212>DNA

<213>人

<400>65

gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgcagatc 60

tcctgtaagg gttctggata cacctttacc aactactgga tcgcctgggt gcgccagatg 120

cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180

agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240

ctacagtgga gcggcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagacaggga 300

tatagcagtg gctggcgctc ctactacggt atgggcgtct ggggccaagg gaccacggtc 360

accgtctcct ca 372

<210>66

<211>321

<212>DNA

<213>人

<400>66

gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgtacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggagatcaa a 321

<210>67

<211>321

<212>DNA

<213>人

<400>67

gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccattcac tttcggccct 300

gggaccaaag tggatatcaa a 321

<210>68

<211>324

<212>DNA

<213>人

<400>68

gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacgatt cactttcggc 300

cctgggacca aagtggatat caaa 324

<210>69

<211>321

<212>DNA

<213>人

<400>69

gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgtacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggagatcaa a 321

<210>70

<211>321

<212>DNA

<213>人

<400>70

gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagt cacc 60

atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120

gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttacta ctgccaacag tataagagat acccgtacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggagatcaa a 321

<210>71

<211>321

<212>DNA

<213>人

<400>71

gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt acccgtggac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210>72

<211>321

<212>DNA

<213>人

<400>72

gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctcacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggagatcaa a 321

<210>73

<211>321

<212>DNA

<213>人

<400>73

gccatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gggcattagc agtgctttag cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagctc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tttaatagtt accctcacac ttttggccag 300

gggaccaagc tggagatcaa a 321

<210>74

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>74

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210>75

<211>98

<212>PRT

<213>人

<400>75

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210>76

<211>95

<212>PRT

<213>人

<400>76

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro

85 90 95

<210>77

<211>95

<212>PRT

<213>人

<400>77

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala ValTyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser

85 90 95

<210>78

<211>95

<212>PRT

<213>人

<400>78

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro

85 90 95

<210>79

<211>556

<212>PRT

<213>人

<400>79

Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met

1 5 10 15

Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp

20 25 30

Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln

35 40 45

Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu

50 55 60

Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile

65 70 75 80

Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu

85 90 95

Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr

100 105 110

Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp

115 120 125

Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro

130 135 140

Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala

145 150 155 160

Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro

165 170 175

Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro

180 185 190

Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser

195 200 205

Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser

210 215 220

Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp

225 230 235 240

Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala

245 250 255

Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu

260 265 270

Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly

275 280 285

Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu

290 295 300

Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg

305 310 315 320

Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val

325 330 335

Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu

340 345 350

Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala

355 360 365

Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp

370 375 380

Val Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly

385 390 395 400

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu

405 410 415

Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu

420 425 430

Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly

435 440 445

Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu

450 455 460

Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser

465 470 475 480

Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly

485 490 495

Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln

500 505 510

Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala

515 520 525

Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp

530 535 540

Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg

545 550 555

<210>80

<211>13

<212>PRT

<213>人

<400>80

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210>81

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>81

Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10 15

<210>82

<211>18

<212>PRT

<213>人

<400>82

Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp ValTrp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

1 5 10 15

Ser Ser

<210>83

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>83

Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210>84

<211>12

<212>PRT

<213>人

<400>84

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210>85

<211>12

<212>PRT

<213>人

<400>85

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

1 5 10

<210>86

<211>12

<212>PRT

<213>人

<400>86

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210>87

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>87

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210>88

<211>4

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽连接体

<400>88

Ala Leu Ala Leu

1

<210>89

<211>4

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽连接体

<400>89

Ala Leu Ala Leu

1

<210>90

<211>4

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽连接体

<400>90

Gly Phe Leu Gly

1

<210>91

<211>4

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽连接体

<400>91

Pro Arg Phe Lys

1

<210>92

<211>4

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽连接体

<400>92

Thr Arg Leu Arg

1

<210>93

<211>4

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽连接体

<400>93

Ser Lys Gly Arg

1

<210>94

<211>4

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽连接体

<400>94

Pro Asn Asp Lys

1

<210>95

<211>6

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽连接体

<400>95

Pro Val Gly Leu Ile Gly

1 5

<210>96

<211>5

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽连接体

<400>96

Gly Pro Leu Gly Val

1 5

<210>97

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽连接体

<400>97

Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln

1 5

<210>98

<211>4

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽连接体

<400>98

Pro Leu Gly Leu

1

<210>99

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽连接体

<400>99

Gly Pro Leu Gly Met Leu Ser Gln

1 5

<210>100

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽连接体

<400>100

Gly Pro Leu Gly Leu Trp Ala Gln

1 5

<210>101

<211>4

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽连接体

<400>101

Leu Leu Gly Leu

1

<210>102

<211>4

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽连接体

<400>102

Ala Leu Ala Leu

1

Claims

1.体外抑制表达CD19的肿瘤细胞的生长的方法，该方法包括将该表达CD19的肿瘤细胞与抗体-配偶体分子缀合物相接触，使得该表达CD19的肿瘤细胞的生长受到抑制，其中所述抗体-配偶体分子缀合物包含：

(a)单克隆抗体或其抗原结合部分，其特异性结合CD19，其中所述抗体或其抗原结合部分包含：

(i)具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO：51所示的氨基酸序列的轻链CDR3；或

(ii)具有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列的重链CDR1、具有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列的重链CDR2、具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列的重链CDR3、具有SEQ ID NO：37所示的氨基酸序列的轻链CDR1、具有SEQ ID NO：44所示的氨基酸序列的轻链CDR2和具有SEQ ID NO：52所示的氨基酸序列的轻链CDR3；

(b)配偶体分子，其中所述配偶体分子是治疗剂。

2.权利要求1的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分包含具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的轻链可变区。

3.权利要求1的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分包含具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的轻链可变区。

4.权利要求1的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分是人抗体或其部分。

5.权利要求1的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分是IgG1或IgG4同种型的全长抗体或其部分。

6.权利要求1的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分是非岩藻糖基化的。

7.权利要求1的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分表现出针对表达CD19的细胞的抗体依赖性细胞毒作用。

8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述治疗剂是细胞毒素。

9.权利要求1-7任一项的方法，其中所述治疗剂是放射性同位素。

10.权利要求1-7任一项的方法，其中所述配偶体分子通过化学连接体缀合到所述抗体或其抗原结合部分。

11.权利要求10的方法，其中所述化学连接体是肽基连接体、肼连接体或二硫化物连接体。

12.抗体-配偶体分子缀合物在制备抑制受试者中表达CD19的肿瘤细胞的生长的药物中的用途，其中所述抗体-配偶体分子缀合物包含：

(b)配偶体分子，其中所述配偶体分子是治疗剂。

13.抗体-配偶体分子缀合物在制备清除受试者体内B细胞恶性肿瘤的表达CD19的B细胞的药物中的用途，其中所述抗体-配偶体分子缀合物包含：

(b)配偶体分子，其中所述配偶体分子是治疗剂。

14.抗体-配偶体分子缀合物在制备抑制受试者中表达CD19的B细胞恶性肿瘤中肿瘤生长的药物中的用途，其中所述抗体-配偶体分子缀合物包含：

(b)配偶体分子，其中所述配偶体分子是治疗剂。

15.权利要求14的用途，其中所述B细胞恶性肿瘤是非霍奇金淋巴瘤。

16.权利要求14的用途，其中所述B细胞恶性肿瘤是套细胞淋巴瘤。

17.权利要求12-16任一项的用途，其中所述抗体或其抗原结合部分包含具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的轻链可变区。

18.权利要求12-16任一项的用途，其中所述抗体或其抗原结合部分包含具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的轻链可变区。

19.权利要求12-16任一项的用途，其中所述抗体或其抗原结合部分是人抗体或其部分。

20.权利要求12-16任一项的用途，其中所述抗体或其抗原结合部分是IgG1或IgG4同种型的全长抗体或其部分。

21.权利要求12-16任一项的用途，其中所述抗体或其抗原结合部分是非岩藻糖基化的。

22.权利要求12-16任一项的用途，其中所述抗体或其抗原结合部分表现出针对表达CD19的细胞的抗体依赖性细胞毒作用。

23.权利要求12-16任一项的用途，其中所述治疗剂是细胞毒素。

24.权利要求12-16任一项的用途，其中所述治疗剂是放射性同位素。

25.权利要求12-16任一项的用途，其中所述配偶体分子通过化学连接体缀合到所述抗体或其抗原结合部分。

26.权利要求25的用途，其中所述化学连接体是肽基连接体、肼连接体或二硫化物连接体。