CN101633891B - 漏声表面波核酸传感器杂交反应终点的判定方法 - Google Patents
漏声表面波核酸传感器杂交反应终点的判定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101633891B CN101633891B CN2009101047305A CN200910104730A CN101633891B CN 101633891 B CN101633891 B CN 101633891B CN 2009101047305 A CN2009101047305 A CN 2009101047305A CN 200910104730 A CN200910104730 A CN 200910104730A CN 101633891 B CN101633891 B CN 101633891B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- minute
- lsaw
- sensor
- phase
- hybridization
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种漏声表面波核酸传感器杂交反应终点的判定方法,当传感器采集的相位值在第(n-9)分钟至第n分钟内的相位变化差值不超过0.2deg时,则判定第n分钟为杂交反应终点;其计算公式为:ΔP=|pn-P(n-9)|≤0.2deg,式中ΔP表示相位变化差值,Pn表示第n分钟的相位值,P(n-9)表示第(n-9)分钟的相位值,n为不小于9的正整数;本发明为LSAW核酸传感器杂交反应终点的判定提供了一种统一、客观、科学的方法,可以避免传统目测判定中主观因素造成的人为误差,极大地提高传感器的检测准确性、重复性和灵敏度,且具有简便、快速、实时的特点,有着重要的实际应用价值,为后期自动判读软件的编写和传感器的临床应用奠定了坚实的基础。
Description
技术领域
本发明涉及核酸传感器杂交反应终点的判定方法,特别涉及漏声表面波(leaky surface acoustic wave,LSAW)核酸传感器杂交反应终点的判定方法。
背景技术
随着分子生物学技术的发展,基因快速检测已成为临床病原学早期诊断的重要手段之一。核酸传感器由于具有高效、灵敏、特异、结构小巧、经济实用等特点,将在基因快速检测中发挥重要作用。
LSAW核酸传感器是利用压电晶体的特殊切向(如Y方向切割36度旋转,X方向传播的LiTaO3晶体)激励出LSAW,当LSAW传播路径表面的质量负载发生微小改变即晶体表面固定的探针与靶序列发生杂交反应时,晶体表面的边界条件将发生改变,导致LSAW传播的相位发生相应改变,此时从传感器输出换能器提取的电信号的相位变化,即可敏感地检测出与晶体表面固定的探针发生特异性反应的靶序列。
科学准确地进行杂交反应起点和终点的判定,是LSAW核酸传感器应用于生物医学检测的基础。只有在正确地判断杂交反应起点和终点的前提下,才能得到准确的检测数据,才能准确反映数据本身代表的生物学意义,进而进行各种分析统计。
在杂交反应初始阶段,探针和靶序列的结合使传感器的质量负载发生改变,传感器的相位变化增大,随着杂交反应的进行,探针和靶序列的结合逐渐达到饱和,在反应终点附近,传感器的相位变化趋于平稳。在检测过程中,影响传感器相位变化的因素众多,使传感器相位曲线的形态呈多样性表现,这给杂交反应终点的判定带来一定的困难。此外,传统的杂交反应终点的判断主要依靠目测,往往造成检测结果的人为误差,从而极大地影响了传感器检测结果的准确性和重复性。
文献报道了压电核酸传感器杂交反应终点的两种判定方法:基于指数衰减模型的最大拟合曲率法(Method-maximal curvature of fitting curve,MCF)和反S曲线拟合法(inverse S-fitting determination method,ISF)。MCF法判断结果存在尾段飘逸现象,即当杂交反应的检测数据末段长度不同时,结果会发生偏差,因此,该法并不完全符合传感器在杂交反应中的响应规律,这将明显影响杂交反应终点的判定,从而影响检测结果的准确性和重复性。ISF法直接采用将原检测数据末段延长或删减若干的办法,避免了仪器和传感器本身质量差异、操作方法差异等因素对终点判定的干扰,使终点判定误差只来源于判断模型,从而使检测结果的准确性大大提高,但ISF法采用二次函数拟合,计算繁琐复杂,且不能在传感器检测过程中实时使用,使其实用性和简便性大打折扣。
因此,建立一种简便快速、实时准确的LSAW核酸传感器杂交反应终点的判定方法具有重要意义。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种简便快速、实时准确的LSAW核酸传感器杂交反应终点的判定方法,可以避免目测判定中主观因素造成的人为误差,极大地提高传感器检测的准确性、重复性和灵敏度。
为达到此目的,本发明的LSAW核酸传感器杂交反应终点的判定方法,当传感器采集的相位值在第(n-9)分钟至第n分钟内的相位变化差值不超过0.2deg时,则判定第n分钟为杂交反应终点;其计算公式为:ΔP=|Pn-P(n-9)|≤0.2deg,式中ΔP表示相位变化差值,Pn表示第n分钟的相位值,P(n-9)表示第(n-9)分钟的相位值,n为不小于9的正整数。
本发明的有益效果在于:本发明为LSAW核酸传感器杂交反应终点的判定提供了一种统一、客观、科学的方法,可以避免传统目测判定中主观因素造成的人为误差,极大地提高传感器的检测准确性、重复性和灵敏度,且具有简便、快速、实时的特点,有着重要的实际应用价值,为后期自动判读软件的编写和传感器的临床应用奠定了坚实的基础。
附图说明
图1为LSAW核酸传感器对HPV基因的实时检测结果;
图2为LSAW核酸传感器对阴性对照实验的实时检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。
一、实验材料
1、双端对谐振型LSAW传感器
在同一块LiTaO3晶体上制备检测和参比两个通道,每个通道由一个LSAW谐振器构成。LiTaO3晶体为Y方向切割36度旋转、X方向传播LSAW。金膜和LiTaO3晶体之间是金属铬。叉指换能器是用真空镀膜的方法先在基片表面镀制一层金属膜,再利用光刻技术刻出叉指电极的图形。
2、数据采集***及相位记录分析软件
使用多功能网络分析仪(日本ADVANTEST公司R3767CG型)采集实验数据;自行研发的相位记录分析软件BSMS 1.0具有实时记录变化,自动绘制相位变化趋势图及分析结果等功能。
3、主要试剂
人***状瘤病毒(HPV)基因双体肽核酸(bis-PNA)探针序列:5′-SH-(CH2)6-(Lys)3-ttttcttcct-(egl)3-tccttctttt-Lys-3’(SH为巯基,Lys为赖氨酸,egl为linker分子),由成都川抗派德生物医药科技有限公司合成。
pBR322-HPV18质粒购自ATCC公司;质粒抽提试剂盒购自博大泰克公司;胶回收试剂盒购自Omega公司;限制性核酸内切酶EcoR I购自TaKaRa公司。
PBS缓冲液:Na+浓度为20mmol/L,pH为6.6,含有浓度为1mmol/L的乙二胺四乙酸。piranha液:将质量百分浓度为30%的过氧化氢和浓H2SO4按体积比为1∶3混匀即得。
二、实验方法
1、LSAW传感器晶振金膜表面的预处理
在LiTaO3晶振金膜表面滴加少许piranha液,浸泡10分钟,超纯水反复清洗,再依次用浓度为1mol/L的NaOH和浓度为1mol/L的HCl各浸泡10分钟,超纯水反复清洗,氮气吹干,备用。
2、LSAW传感器的稳定性检测
将预处理后的LSAW传感器以同轴电缆线联入多功能网络分析仪,室温下检测两个谐振器的***损耗,将两个谐振器的***损耗调整至最小。
3、LSAW传感器对HPV基因的实时检测
(1)HPV基因的抽提:pBR322-HPV18质粒含有HPV基因,用质粒抽提试剂盒抽提pBR322-HPV18质粒,所得质粒用EcoR I酶切,酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,用胶回收试剂盒切胶回收纯化HPV基因,具体操作按试剂盒说明书进行。
(2)HPV基因bis-PNA探针的固定:将LSAW传感器在空气中稳定30分钟后,检测通道和参比通道各加入PBS缓冲液20μL,稳定30分钟,检测通道再加入终浓度为2μmol/L的HPV基因bis-PNA探针5μL,室温下反应1小时使探针固定在金膜表面,吸干溶液,去离子水清洗3次,氮气吹干,备用。参比通道不固定任何探针。
(3)HPV基因的实时检测:将固定有HPV基因bis-PNA探针的LSAW传感器在空气中稳定至平衡,检测通道和参比通道各加入PBS缓冲液20μL,稳定10分钟,再各加入终浓度为100μg/L的HPV基因25μL进行杂交反应,同时进行阴性对照实验(两通道各加入PBS缓冲液25μL),计算机自动采集两个通道的相位变化数据。
三、实验结果及杂交反应终点的判定
在杂交反应初始阶段,探针和靶序列的结合使传感器的质量负载发生改变,传感器的相位变化增大,随着杂交反应的进行,探针和靶序列的结合逐渐达到饱和,在反应终点附近,传感器的相位变化趋于平稳,提示杂交反应完成,这为杂交反应终点的判定提供了特征性指标。从理论上讲,当杂交反应达到平衡时,传感器采集到的相位信号应该稳定不变,也就是说,在单位时间内相位变化值应该为零。但实际上,由于传感器在反应终点附近采集到的相位信号受自身***噪声、检测环境等多种因素的影响,在现有技术条件下还不能保证反应终点的相位变化值为零。因此,本发明引入某时间段内相位变化差值(ΔP)的概念来判定杂交反应的终点。选择适当的ΔP值范围作为杂交反应终点的判定标准极为重要,如果此标准设定过低,则杂交反应已完成却不能及时判定终点,从而使检测时间过长,降低工作效率,无法达到快速检测的目的。相反,如果此标准设定过高,则杂交反应还未完成时就被错误地判定为到达终点,从而影响检测结果的准确性。
为了获得LSAW核酸传感器的本底相位变化值,发明人重复进行了多次阴性对照实验,即在LSAW传感器表面固定HPV基因bis-PNA探针,待传感器在气相中的相位变化平稳后,再加入PBS缓冲液,由于没有相应的靶序列与HPV基因bis-PNA探针发生杂交反应,故传感器采集到的相位信号为传感器在气相和液相中的本底相位变化值。实验结果显示,以均值±2倍标准偏差计,LSAW核酸传感器在气相和液相中的本底相位变化值不超过0.2deg。根据上述实验结果,最终确定:当传感器采集的相位值在第(n-9)分钟至第n分钟内的相位变化差值不超过0.2deg时,则判定第n分钟为杂交反应终点;其计算公式为:ΔP=|Pn-P(n-9)|≤0.2deg,式中ΔP表示相位变化差值,Pn表示第n分钟的相位值,P(n-9)表示第(n-9)分钟的相位值,n为不小于9的正整数。
根据上述计算公式,发明人编写了LSAW核酸传感器杂交反应终点的自动判读软件,并将其嵌入MATLAB程序中,实现了杂交反应终点的简便快速、实时准确判定。在检测过程中,传感器每采集1次相位值Pt,都会与9分钟前采集的相位值P(t-9)进行比较,即第11分钟的相位值与第2分钟的相位值进行比较,第12分钟的相位值与第3分钟的相位值进行比较,以此类推,当第(n-9)分钟至第n分钟内的ΔP值不超过0.2deg时,即判定杂交反应到达终点,***指示灯变成绿色并自动鸣笛报警。
图1为LSAW核酸传感器对HPV基因的实时检测结果,其中A为传感器采集的原始相位信号,B为原始相位信号的拟合曲线,C为ΔP值变化曲线;可见在杂交反应过程中ΔP值呈逐渐减小趋势,在反应至第50分钟时,第41分钟至第50分钟内的ΔP值不超过0.2deg,判定第50分钟为杂交反应终点。图2为LSAW核酸传感器对阴性对照实验的实时检测结果,其中A为传感器采集的原始相位信号,B为原始相位信号的拟合曲线,C为ΔP值变化曲线;可见传感器在气相和液相中的本底相位变化值不超过0.2deg,ΔP值不超过0.2deg。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (1)
1.漏声表面波核酸传感器杂交反应终点的判定方法,其特征在于:当传感器采集的相位值在第(n-9)分钟至第n分钟内的相位变化差值不超过0.2deg时,则判定第n分钟为杂交反应终点;其计算公式为:ΔP=|Pn-P(n-9)|≤0.2deg,式中ΔP表示相位变化差值,Pn表示第n分钟的相位值,P(n-9)表示第(n-9)分钟的相位值,n为不小于9的正整数。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2009101047305A CN101633891B (zh) | 2009-08-28 | 2009-08-28 | 漏声表面波核酸传感器杂交反应终点的判定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2009101047305A CN101633891B (zh) | 2009-08-28 | 2009-08-28 | 漏声表面波核酸传感器杂交反应终点的判定方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101633891A CN101633891A (zh) | 2010-01-27 |
CN101633891B true CN101633891B (zh) | 2012-07-11 |
Family
ID=41593230
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2009101047305A Expired - Fee Related CN101633891B (zh) | 2009-08-28 | 2009-08-28 | 漏声表面波核酸传感器杂交反应终点的判定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101633891B (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1522492A (zh) * | 2002-04-15 | 2004-08-18 | 松下电器产业株式会社 | 表面声波器件及利用其的移动通信设备和传感器 |
CN1844909A (zh) * | 2006-02-27 | 2006-10-11 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 漏声表面波传感器 |
-
2009
- 2009-08-28 CN CN2009101047305A patent/CN101633891B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1522492A (zh) * | 2002-04-15 | 2004-08-18 | 松下电器产业株式会社 | 表面声波器件及利用其的移动通信设备和传感器 |
CN1844909A (zh) * | 2006-02-27 | 2006-10-11 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 漏声表面波传感器 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101633891A (zh) | 2010-01-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US5112455A (en) | Method for analytically utilizing microfabricated sensors during wet-up | |
CN1910452B (zh) | 用声表面波传感器检测化学或生物介质的量的方法和*** | |
CN101983333B (zh) | 生物传感器***、传感器芯片及血液试样中的分析物浓度的测定方法 | |
CN101458230A (zh) | 多通道声表面波化学传感*** | |
CN106442659B (zh) | 基于苯胺沉积的电化学传感电极定量检测8-OhdG活性的方法 | |
CN109342526A (zh) | 一种电化学适体传感器检测黄曲霉毒素b1的方法 | |
CN102175742B (zh) | 新型抗生素纳米生物传感器的制备方法 | |
JP2014521062A (ja) | 校正不要分析による活性濃度の決定方法 | |
CN104459313A (zh) | 一种双谐振元石英晶体微天平的信号采集装置及方法 | |
CN111189892B (zh) | 一种基于DGT技术检测土壤氧化还原电位Eh变化的方法 | |
CN107064258B (zh) | 基于dna产生电信号及其自组装放大信号的电化学适配体传感器测定her2的方法 | |
CN101633891B (zh) | 漏声表面波核酸传感器杂交反应终点的判定方法 | |
CN109613123B (zh) | 一种生物质炭材料吸附性能检测装置及方法 | |
US20110236877A1 (en) | Biosensor and method using the same to perform a biotest | |
CN101051052A (zh) | 高精度液态乙醇浓度在线检测方法与装置 | |
CN103995050A (zh) | 一种声表面波葡萄糖传感器及其制作方法 | |
CN108490046A (zh) | 一种用于快速检测非稳定物质的电化学传感器及利用其快速定量检测atp的方法 | |
Frense et al. | Label-free impedimetric biosensor for thrombin using the thrombin-binding aptamer as receptor | |
CN102410991A (zh) | 光波导生物化学传感器及其制备方法 | |
CN103616431B (zh) | 血清总胆汁酸检测试剂盒及其使用方法 | |
CN104237354A (zh) | Ndm-1 dna探针修饰的电极及其制备方法和应用 | |
CN104049010A (zh) | 一种用于检测待测溶液中细胞凋亡程度的方法 | |
CN106525915B (zh) | 基于支持向量机的泡沫石墨烯传感器样本检测方法和*** | |
CN101633892A (zh) | 漏声表面波核酸传感器杂交反应起点的判定方法 | |
CN111982992B (zh) | 葡萄糖宽范围高精度自动检测方法和*** |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120711 Termination date: 20210828 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |