CN101624472A - 一种细胞培养用大孔微载体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种以丝素蛋白为主要原料制备而成的丝素/壳聚糖大孔微载体及制备方法和用途。大孔微载体呈球形，直径为200－500μm，孔径为40－80μm，由丝素蛋白和壳聚糖在交联剂的作用下制得。本发明提供的丝素/壳聚糖大孔微载体以丝素作为主要成分，因为丝素蛋白具备良好的生物相容性和降解缓慢的特性，以及在湿态下有着优良的力学性能，所以可以较长时间维持微载体的结构，既可支持大量细胞生长，又能长期维持细胞活性和功能，在动物细胞长时间高密度培养中有独特的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于大规模培养动物细胞的大孔微载体及制备方法和用途，具体涉及一种以丝素蛋白为主要原料制备而成的丝素/壳聚糖大孔微载体及制备方法和用途。
背景技术
微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。大孔微载体将细胞固定在孔内生长，能最大限度地扩大比表面积，与其他方法相比，它的比表面积更大，是实心微载体的几倍甚至几十倍；细胞在孔内生长，受到保护，剪切损伤小；细胞三维生长，细胞密度将进一步提高，细胞密度是实心微载体的10倍以上，有的可达108个/ml；大孔微载体除了利于细胞高密度放大培养外，在外源蛋白的长期高表达方面也具有明显的优势，适合于蛋白质生产和产物分泌；另外，大孔微载体与种子细胞共培养，形成的复合体可看作许多的微组织，这为体外组织构建提供了新的思路。
大孔微载体培养是高密度悬浮培养肝细胞的理想方法之一，许多研究机构都在研究性能价格比较高的微载体。然而现有的微载体不能长期维持细胞生长，细胞易受机械损伤，放大培养时细胞容易脱落且贴壁不均匀，为此有必要提供一种新型微载体以克服现有技术中存在的缺陷。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种大孔微载体，其以生物相容性良好的丝素蛋白、壳聚糖为原料，从而制备出一种既具有细胞亲和性，有助于细胞黏附，支持大量细胞生长，又能长期维持细胞活性和细胞功能且成本低廉的能够用于大规模培养细胞的大孔微载体。
本发明的另一目的在于提供上述大孔微载体的制备方法，该方法操作简单，原料成本低，可被广泛使用。
本发明的又一目的在于提供上述大孔微载体在大规模动物细胞培养中的应用。
为实现上述目的，本发明提供一种大孔微载体，该大孔微载体呈球形，直径为200-500μm，孔径为40-80μm，其是由丝素蛋白和壳聚糖在交联剂的作用下制得的。
在本发明的实施方式中，可通过下述方法制备所述大孔微载体，该方法包括：
(a)将丝素蛋白溶液与壳聚糖醋酸溶液按比例混合，使得产生终浓度为4-10w/v％的丝素-壳聚糖混合溶液；
(b)将所述丝素-壳聚糖混合溶液加入含乳化剂的油相中，得到白色乳液；并向该白色乳液中缓慢加入交联剂，充分搅拌使水相交联固化；
(c)将步骤(b)中的白色乳液加入搅拌状态的pH为9-10的极性溶剂中，并继续搅拌30-60分钟，过滤得到互不粘连的微球；
(d)固化所述微球并除去表面的油相，筛滤得到200-500μm的微球；
(e)除去微球中的残留的交联剂，并冷冻干燥，得到所述大孔微载体。
在优选的实施方式中，步骤(b)中加入的交联剂的量为每克干重的微载体加入1-2ml的2.5％戊二醛溶液。
优选地，所述乳化剂为司班80，油相为液体石蜡；其中司班80、液体石蜡的体积比为3∶100至5∶100。所述交联剂优选为戊二醛。所述极性溶剂选自异丙醇、丙酮和乙醇等。
在优选的实施方式中，步骤(c)中所述搅拌为250-400转/分的恒速搅拌。
优选地，在步骤(d)中，通过用所述极性溶剂、石油醚和水洗涤来除去所述油相。
优选地，在步骤(e)中，通过将微球在甘氨酸溶液中浸泡2-4个小时而除去残留的交联剂。
在本发明的另一个实施方式中，在所述步骤(e)之后还包括消毒步骤。所述消毒步骤为以钴60-γ射线辐照，或者是在将大孔微载体以蒸馏水或PBS溶液溶胀后高温灭菌。
本发明提供的丝素/壳聚糖大孔微载体以丝素作为主要成分，因为丝素蛋白具备良好的生物相容性和降解缓慢的特性，以及在湿态下有着优良的力学性能，所以可以较长时间维持微载体的结构，既可支持大量细胞生长，又能长期维持细胞活性和功能，在动物细胞长时间高密度培养中有独特的作用。
附图说明
图1-图2显示了本发明的丝素/壳聚糖大孔微载体的扫描电镜图片；
图3、图4分别显示本发明的丝素/壳聚糖大孔微载体与肝细胞CL-1在微重力旋转培养体系中共培养的第3天和第7天取样的细胞在倒置显微镜下观察到的肝细胞在材料上的黏附情况；
图5-图6显示本发明的丝素/壳聚糖大孔微载体与肝细胞CL-1在微重力旋转培养体系中共培养的第4天取样的细胞的MTT染色法检测细胞活力的图片。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的方法，下面将通过实施例和实验证据进一步阐述本发明及其优势。在详细描述以下实施例和实验之前，首先需要定义和澄清一些术语。
丝素蛋白是一种无生理活性的天然结构性蛋白，主要由三种简单的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，它们占蛋白总量的大概85％。丝素蛋白有良好的生物相容性，无毒，无刺激性；丝素蛋白有结晶区和非结晶区混合结构存在，整体上带负电，丝素非结晶区有许多碱性氨基酸，对细胞有一定程度的吸附作用，故能吸收细胞附着在其上面。正是由于具有上述性质，丝素蛋白在生物医用领域得到了日益广泛的应用。而将其用于细胞培养的基质，或对一些生物高分子进行修饰，改善它们的生物性能，使其适用于组织工程，更是近年来丝素蛋白研究的热点。上述优异的生物学特性为丝素蛋白成为细胞培养和组织工程支架材料的应用建立了坚实的基础。
壳聚糖是近年来在生物医药、组织工程领域得到广泛应用的一种天然生物高分子，其具有生物功能性、生物相容性、低毒性及几乎无过敏性等特性。
将丝素与壳聚糖复合制成多孔的微载体，这样就进一步增大了细胞附着的表面积。本发明提供的方法以丝素蛋白为主要原料，通过乳化-化学交联法制备出丝素、壳聚糖复合微球，然后用极性溶液处理，诱导丝素蛋白发生构象改变，使之不再溶于水，达到水稳定，得到了互不粘连的胶珠，然后冷冻干燥，制备出了具有多孔结构的大孔微载体。它价格低廉，细胞在其上附着和生长较好，是一种较为理想的载体材料。
以下通过具体实施例进一步详细说明本发明的细节。本发明提供的可用于大规模培养细胞的丝素/壳聚糖大孔微载体，可通过如下方法得到。
实施例一
1)丝素蛋白溶液的制备：将75g生蚕丝在4L的5g/L的碳酸钠溶液中煮沸1小时，然后用大量去离子水清洗以去除丝胶蛋白，60-70℃下烘干，获丝素蛋白。将适量丝素蛋白在80±2℃下溶解在氯化钙/水/乙醇(摩尔比1∶8∶2)三元溶液中，在室温条件下去离子水透析3d，去除溶液中的盐和乙醇，过滤去除不溶的杂质，制备出丝素蛋白的水溶液。将丝素蛋白水溶液在50±2℃、60转/分搅拌浓缩，获得浓度约7-10w/v％的丝素蛋白溶液；
2)丝素-壳聚糖混合溶液的制备：配制4w/v％的壳聚糖醋酸水溶液，配制丝素-壳聚糖混合溶液，丝素蛋白、壳聚糖质量比为7∶3，终浓度为5w/v％；
3)取一定量160ml的液体石蜡加入至500ml烧杯中，然后加入6.4ml司班80，混合均匀后以250转/分恒速搅拌，缓慢滴加40ml丝素-壳聚糖混合溶液，在室温下继续恒速搅拌45分钟，得到白色乳液，向上述乳液中缓慢加入2.5ml 2.5％戊二醛溶液，继续搅拌3小时，使水相交联固化；
4)取100ml的异丙醇溶液，往其中加入相同体积的去离子水，再滴加NaOH稀溶液，调节PH至9-10；
5)将4)中溶液以250转/分搅拌，将3)中的白色乳液缓慢加入其中，继续搅拌45分钟。然后过滤，得到互不粘连的微球，将微球置于4℃冰箱中6小时，使微球充分固化；
6)将微球用4)中异丙醇溶液、石油醚、去离子水洗涤，去除表面的油相；然后筛分出200-500μm的微球；
7)将筛分后的微球，用5g/L的甘氨酸溶液浸泡2小时，除去未反应的戊二醛；再用大量蒸馏水洗涤；
8)将充分洗涤干净的微球置于-20℃冰箱中，冷冻48小时，然后冷冻干燥，得到大孔微载体；将大孔微载体分装后，钴60-γ射线辐照消毒，备用。
实施例二
1)丝素蛋白溶液的制备：将75g生蚕丝在4L的5g/L的碳酸钠溶液中煮沸1小时，然后用大量去离子水清洗以去除丝胶蛋白，60-70℃下烘干，获丝素蛋白。将适量丝素蛋白在80±2℃下溶解在氯化钙/水/乙醇(摩尔比1∶8∶2)三元溶液中，在室温条件下去离子水透析3d，去除溶液中的盐和乙醇，过滤去除不溶的杂质，制备出丝素蛋白的水溶液。将丝素蛋白水溶液在50±2℃、50-60转/分搅拌浓缩，获得浓度约7-10w/v％的丝素蛋白溶液；
2)丝素-壳聚糖混合溶液的制备：配制4w/v％的壳聚糖醋酸水溶液，配制丝素-壳聚糖混合溶液，丝素蛋白、壳聚糖质量比为6∶4，终浓度为4w/v％；
3)取一定量160ml的液体石蜡加入至500ml烧杯中，然后加入6.4ml司班80，混合均匀后以300转/分恒速搅拌，缓慢滴加40ml丝素-壳聚糖混合溶液，在室温下继续恒速搅拌45分钟，得到白色乳液，向上述乳液中缓慢加入3ml 2.5％戊二醛溶液，继续搅拌3小时，使水相交联固化；
4)取100ml的异丙醇溶液，往其中加入相同体积的去离子水，再滴加NaOH稀溶液，调节PH至9-10；
5)将4)中溶液以300转/分搅拌，将3)中的白色乳液缓慢加入其中，继续搅拌45分钟。然后过滤，得到互不粘连的微球，将微球置于4℃冰箱中8小时，使微球充分固化；
6)将微球用如步骤4)所述已稀释的异丙醇溶液、石油醚、去离子水洗涤，去除表面的油相；然后筛分出200-400μm的微球；
7)将筛分后的微球，用5g/L的甘氨酸溶液浸泡4小时，除去未反应的戊二醛；再用大量蒸馏水洗涤；
8)将充分洗涤干净的微球置于-20℃冰箱中，冷冻48小时，然后冷冻干燥，得到大孔微载体；将大孔微载体分装后，以蒸馏水或PBS溶液溶胀后高温灭菌，备用。
实施例三
1)丝素蛋白溶液的制备：将75g生蚕丝在4L的5g/L的碳酸钠溶液中煮沸1小时，然后用大量去离子水清洗以去除丝胶蛋白，60-70℃下烘干，获丝素蛋白。将适量丝素蛋白在80±2℃下溶解在氯化钙/水/乙醇(摩尔比1∶8∶2)三元溶液中，在室温条件下去离子水透析3d，去除溶液中的盐和乙醇，过滤去除不溶的杂质，制备出丝素蛋白的水溶液。将丝素蛋白水溶液在50±2℃、60转/分搅拌浓缩，获得浓度约7-10w/v％的丝素蛋白溶液；
2)丝素-壳聚糖混合溶液的制备：配制4w/v％的壳聚糖醋酸水溶液，配制丝素-壳聚糖混合溶液，丝素蛋白、壳聚糖质量比为5∶5，终浓度为4w/v％；
3)取一定量150ml的液体石蜡加入至500ml烧杯中，然后加入6ml司班80，混合均匀后以300转/分恒速搅拌，缓慢滴加30ml丝素-壳聚糖混合溶液，在室温下继续恒速搅拌45分钟，得到白色乳液，向上述乳液中缓慢加入3ml2.5％戊二醛溶液，继续搅拌3小时，使水相交联固化；
4)取100ml的异丙醇溶液，往其中加入100ml的去离子水，再滴加NaOH稀溶液，调节PH至9-10；
5)将4)中溶液以300转/分搅拌，将3)中的白色乳液缓慢加入其中，继续搅拌45分钟。然后过滤，得到互不粘连的微球，将微球置于4℃冰箱中6小时，使微球充分固化；
6)将微球用如步骤4)所述已稀释的异丙醇溶液、以及石油醚、去离子水洗涤，去除表面的油相；然后筛分出200-500μm的微球；
7)将筛分后的微球，用5g/L的甘氨酸溶液浸泡3小时，除去未反应的戊二醛；再用大量蒸馏水洗涤；
8)将充分洗涤干净的微球置于-20℃冰箱中，冷冻72小时，然后冷冻干燥，得到大孔微载体；将大孔微载体分装后，钴60-γ射线辐照消毒，备用。
实施例四
将上述实施例所得大孔微载体，灭菌后，以PBS洗涤3次，然后基础培养基浸泡过夜，以使材料充分溶胀；扫描电镜(SEM)图片显示在图1和图2中，可见微载体表面呈多孔结构，孔径约40-80μm，开口向外，呈喇叭状，孔的分布较均匀。
将充分溶胀后的大孔微载体，与CL-1细胞加入微重力旋转培养***(RCCS)中；旋转培养，于不同时间段取样在倒置显微镜下观察肝细胞在材料上的黏附情况。图3为培养第三天、图4为培养第七天取样，可见所有微载体上均黏附了细胞，肝细胞呈多细胞聚集的团块，由于丝素/壳聚糖大孔微载体表面的多孔结构，使细胞附着较牢固，且肝细胞能够进入孔中生长，细胞呈三维培养时表现的形貌——球状；图5、图6为培养第4天MTT染色法检测细胞活力的图片(倒置显微镜下观察X 40)，可见MTT被细胞内线粒体上的琥珀酸脱氢酶还原成难溶性的蓝紫色结晶物，沉积在细胞内或细胞周围，使活细胞显蓝黑色，而死亡细胞则不着色；通过染色发现，细胞-材料复合体整体均质性好、细胞活性高。
虽然本发明已经参考具体的实施方式进行描述，但是本领域技术人员通过阅读上述描述后，将可以对本发明做出显而易见的修改和修饰，而不违背本发明的意图和本质。本发明有意将这些修改和修饰包括在权利要求的范围内。
Claims (12)
1.一种大孔微载体，该大孔微载体呈球形，直径为200-500μm，孔径为40-80μm，由丝素蛋白和壳聚糖在交联剂的作用下制得。
2.一种制备权利要求1所述的大孔微载体的方法，该方法包括：
(a)将丝素蛋白溶液与壳聚糖醋酸溶液按比例混合，使得产生终浓度为4-10w/v％的丝素-壳聚糖混合溶液；
(b)将所述丝素-壳聚糖混合溶液分散进入含乳化剂的油相中，得到白色乳液；并向该白色乳液中缓慢加入交联剂，充分搅拌使水相交联固化；
(c)将步骤(b)中的白色乳液加入搅拌状态的pH为9-10的极性溶剂中，并继续搅拌30-60分钟，过滤得到互不粘连的微球；
(d)并除去所述微球表面的油相，筛滤得到200-500μm的微球；
(e)除去微球中残留的交联剂，并冷冻干燥，得到所述大孔微载体。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述乳化剂为司班80等，其中司班80、液体石蜡的体积比为3∶100至5∶100。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述交联剂优选为戊二醛。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述极性溶剂选自异丙醇、丙酮和乙醇。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)中加入的交联剂的量为每克干重的微载体加入约2ml的2.5％戊二醛溶液。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述搅拌为250-400转/分的恒速搅拌。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，通过用所述极性溶剂、石油醚和水洗涤来除去所述油相。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(e)中，通过将微球在甘氨酸溶液中浸泡2-4个小时而除去残留的交联剂。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(e)之后还包括消毒步骤。
11.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述消毒步骤为以钴60-γ射线辐照，或者将大孔微载体以蒸馏水或PBS溶液溶胀后高温灭菌。
12.权利要求1所述的大孔微载体在大规模动物细胞培养中的应用。
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