CN115697078A - 用于合成适用于在大规模生产培养肉中使用的可食用且可灭菌的多孔3d支架的方法 - Google Patents

用于合成适用于在大规模生产培养肉中使用的可食用且可灭菌的多孔3d支架的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于大规模合成可食用且可热蒸汽灭菌的大孔三维(3D)支架的方法，所述支架包含具有相互连通的孔的生物相容性聚合物作为用于贴壁细胞生长、增殖和分化的支持材料，所述支架可以用于获得具有营养成分的组织和/或培养肉。这些支架适用于支持用于生物医学或食品应用的细胞组织生长。

Description

用于合成适用于在大规模生产培养肉中使用的可食用且可灭 菌的多孔3D支架的方法
技术领域
本发明涉及用于大规模合成可食用且可灭菌的大孔三维(3D)支架的方法，所述支架包含具有相互连通的孔的生物相容性聚合物作为用于贴壁细胞生长、增殖和分化的支持材料，所述支架可以用于体外工程化组织，其在本领域中也被称为培养肉(culturedmeat)、养殖肉(cultivated meat)、基于细胞的肉、细胞肉和/或清洁肉(clean meat)。这些支架适用于支持用于生物医学应用或食品应用的细胞组织增殖。
背景技术
人口增长预期持续增长(到2050年达到9,770百万，以及在本世纪之交达到11,180百万)，将带来更多的废物产量，并且人类的营养需求将如同我们一样增长。肉在蛋白质食品中占有重要地位。
在过去的40年里，全球的肉产量已经显著增长，主要是由于国家的发展。该增长已经限制了生产***，从而在自然资源(土地和水)、人类健康(流行病)和动物福祉(动物痛苦)方面不利地影响环境，由于这一点，培养肉的消费通过帮助创建更加可持续的***而显著地有助于养活地球上的所有居民。FAO估计，在接下来的40年里，对动物蛋白的需求将继续增长，进而满足该需求的挑战也将持续增加。如果不与新策略(例如培养肉或通过体外培养先前从动物中提取的肌肉细胞而生产的肉)相结合，则当前的生产模式将无法满足该需求。因此，对由活的动物生产的肉的替代品的需求需要解决方案。
对培养肉进行的大多数研究可以被认为是组织工程的变体或应用，所述组织工程是通过结合细胞、材料和工程工具试图设计用于修复、替代或再生受损组织的功能性生物结构的生物医学学科。在该领域取得的进展主要基于在各种生物医学应用例如骨组织、心脏组织、肝组织等的再生中使用三维支架/结构进行组织增殖。
专利申请US 2006/0121006 A1涉及使用培养动物细胞来生产营养产品或治疗产品，其中所述细胞源自稀有物种或濒危物种。还包括适用于人类和非人类消费的无论是作为食品还是作为食品补充剂的包含肉的可食用产品。本发明还涉及在将细胞添加到所述产品之前使用大规模培养方法来增殖细胞的用途。本发明涵盖用于制造所述产品的方法、所述产品本身和所述产品的使用方法。示出优选培养锚定于支持体特别是呈不同材料的显微结构(微球、纤维等)形式的支持体例如胶原、几丁质、聚苯乙烯、聚酯或聚丙烯的细胞，这种选择将取决于产品的最终用途以及显微结构是否能保留在最终产品中。
基于天然聚合物的支架已经对医疗和制药应用显示出巨大的潜力。与由合成聚合物形成的基体相比，由这些生物聚合物(一些具有水凝胶行为能力)形成的基体在生物相容性和可生物降解性方面提供了一系列优点。由于生物聚合物水凝胶的固有特性例如其巨大的吸水(溶胀/水合)能力，其能够以受控的方式有效地包封和释放各种疏水性和亲水性治疗分子，包括核酸、蛋白质、抗体等。在生物医学应用中，它们已经被用于例如细胞包封。通常在凝胶化过程(形成水凝胶)之前将细胞与聚合物溶液混合。该方法使得可以将单个细胞或不同细胞类型的混合物包封在一定体积的聚合物材料(球形和纤维形式二者)中。细胞包封的主要限制是保持适当的扩散平衡以将氧气和营养物输送至细胞，由于这一点，已经开发了增加水凝胶的孔隙度和渗透性的策略，从而产生多孔水凝胶。这些水凝胶的内部多孔结构使得能够实现细胞黏附和增殖。
支持不同类型的细胞的增殖以产生不同种类的组织的大孔3D支架的生产对于许多广泛应用例如再生医学(骨组织、***、肌肉组织……)或近来生产培养肉等来说是至关重要的，尽管工作主要以小规模和基础研究进行。通常，再生医学研究已经提出，预期用于组织再生的聚合物基体随着新组织形成而缓慢降解。
如先前所提及的，生物制造(biofabrication)/生物制造(biomanufacturing)中的发展领域旨在在不杀死动物的情况下生产用于人类消费的动物产品(即，培养肉)。因此，其分担了生产大量细胞的挑战，并且为支架增加了其他挑战。因此，开发具有可以包括以下的特征的新支架将是有益的：(1)支架应是可食用的，使得其可以引入到最终的可食用产品中(例如，对于其形成，不使用合成材料，不使用有毒化学品)；(2)支架需要由不含动物的成分形成，以确保最终产品保持其不杀死动物的特性(例如，没有胶原、明胶等)；(3)支架的生产需要是可扩展的和低成本的；以及(4)支架可以为最终产品带来另外的特性(例如，味觉益处、口感、健康益处即纤维含量更高等)。
使用支架技术来支持大规模培养肉生长的主要挑战之一是支架与大规模生物反应器中所使用的灭菌技术的相容性。灭菌过程是基于蒸汽、压力和时间的组合，并且在高温和高压下操作以杀死微生物和孢子。本领域已知的支架不适用于在不失去其用于组织工程的特性的情况下完成该过程。
鉴于对直接从动物获得的肉的替代品的需求不断增长，开发如下用于获得可用于获得营养组织(也被称为培养肉)的可食用、可灭菌的3D大孔支架的新方法将是令人感兴趣的：克服了上述限制，主要是当使这些支架经受大规模培养生物反应器中所使用的灭菌技术时，所获得的支架保持其特性，例如孔的机械强度、孔隙度和相互连通性。
发明内容
本发明描述了用于获得可灭菌的大孔3D支架的方法，所述支架包含至少一种生物相容性聚合物并且还具有相互连通的孔，其中可通过本文所公开的方法获得的可灭菌的大孔3D支架可以用作用于贴壁细胞生长、增殖和分化的支持材料，并且还可以应用于也被技术人员命名或已知为适用于人类消费和/或组织再生应用的培养肉、养殖肉、基于细胞的肉、细胞肉和/或清洁肉的工程化组织的生物制造。
本发明的方法允许在不失去其作为用于细胞增殖的支架的特性，例如机械强度、孔隙度和孔的相互连通性的情况下获得可灭菌的支架。灭菌步骤之后获得的支架的组成和结构对于细胞黏附是足够的，并且交联和灭菌步骤不仅不会因可能的降解/变性而改变材料的适用性，而且甚至改善了用于支持细胞增殖的机械特性。
灭菌方法(优选通过热蒸汽)通常用于医疗保健设施以及制药工业中的细胞培养生产，这具有与新兴的培养肉工业相似的要求。因此，对于该目的，通过本发明的方法获得的支架可以通过本领域已知的任何技术进行灭菌，但优选通过热蒸汽进行灭菌。因此，该支架便于将其引入到需要低成本和大量生产的工业过程中，因为它们可以在大型生物反应器内使用，同时仍然使用在生物反应器或发酵罐中(优选在不锈钢生物反应器或发酵罐中)已经实施的常见的低成本灭菌程序。
因此，在第一方面中，本发明涉及用于获得可灭菌的大孔三维(3D)支架的方法(在下文中为本发明的方法)，所述支架包含至少一种相互交联的生物相容性聚合物的网络，其中所述方法包括以下步骤：
a)制备至少一种生物相容性聚合物的溶解液，
b)将步骤a)的溶液倒入模具中并将其冷冻；优选在低于溶液的冷冻温度的温度下冷冻，
c)将步骤b)中获得的冷冻支架冻干，
d)使步骤c)的经冻干的支架固化，以及
e)对支架进行灭菌，优选通过热蒸汽进行灭菌。
如本文所用，可在整个本公开中互换使用的术语“支架”或“支持体”涉及允许细胞附着和增殖的3D基体或材料，或者根据本发明的其他化合物例如添加剂。如本文所使用的“附着(attachment)”、“附着(attach)”或“附着(attaches)”是指直接或间接黏附至支架的细胞以及黏附至其他细胞的细胞。
如本文所用，术语“生物相容性聚合物”是指例如对生物***无毒和/或与生物过程一致的合成或天然材料/聚合物。在这方面，聚合物材料的生物相容性表示对活细胞、组织、器官和/或生物***的免疫排斥、损伤、损害和/或毒性最小、可忽略或没有风险。
在一个优选实施方案中，生物相容性聚合物为天然聚合物。在一个说明性实施方案中，天然聚合物为能够在不降解和/或不变性的情况下抵抗高压和高温下的灭菌过程的任何天然聚合物。因此，天然聚合物或其任何衍生物为例如但不限于多肽、多核苷酸、天然树脂、橡胶、天然聚酯和多糖。在一个更优选实施方案中，天然聚合物选自由以下组成的列表：藻酸盐、壳聚糖、淀粉、葡聚糖、普鲁分支葡聚糖、肝素、硫酸肝素、纤维素、半纤维素、葡甘露聚糖、琼脂、黄原胶、瓜尔胶、硫酸软骨素、明胶、几丁质、多糖、糖胺聚糖、或其任意组合。在一个更优选实施方案中，天然聚合物选自壳聚糖和/或藻酸盐。
在使用明胶作为天然聚合物的特定情况下，其是不可通过热蒸汽和高压灭菌的，因为如果进行这些程序，其会部分水解和变性。在该天然聚合物等在支架内以少量与其他生物聚合物例如壳聚糖混合的情况下，支架特性的改变是最小的，仍然保持其黏附特性。
这些天然聚合物可以直接使用而无需任何来自商业来源的处理，或者替代地可以在用于改善本发明的支架的特性之前在支架生产的任何步骤中进行化学修饰。如本文所用，术语“衍生物”是通过化学改变化合物的一部分而获得的但具有与原始化合物相同或甚至更好的特性的类似化合物。因此，本发明的天然聚合物的衍生物是指化学修饰，包括引入不同的基团，例如氨基、醛基、羧酸基、酰胺基、酮基、酯基、烷氧基、硫酸酯基、磷酸酯基等。
通过本发明的方法获得的支架可以包含以上所提及的天然聚合物，其具有由经诸如美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug Administration，FDA)和欧洲食品***(European Food Safety Authority，EFSA)的主管机构批准用于食品用途的天然生物聚合物构成的优点。在这种意义上，用于本发明的支架的可食用、可灭菌且生物相容性的聚合物被设计成使得支架是可食用的并且不必从最终产品中提取，即为了避免收集过程。
如本文所用，术语“可食用的”是指材料优选食品材料预期用于口腔接触或通过进食消耗。
在本发明中，非常推荐避免使用选自由以下组成的列表的天然聚合物：胶原、白蛋白(所有类型和形式)、酪蛋白、透明质酸、纤维蛋白、纤连蛋白和弹性蛋白等，因为它们不适用于热蒸汽或高压灭菌过程。
在另一个优选实施方案中，生物相容性聚合物为合成聚合物或其任何变体。合成聚合物的实例包括但不限于来自微生物或通过化学合成技术制备的合成多肽，由从微生物中提取获得的或由其单体例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚羟基链烷酸酯通过化学合成制备的生物酯，或者由通常公认的天然单体例如单糖(例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、或者任何衍生物或变体例如糖胺、氨基糖、…等)、氨基酸或任何衍生物、核苷酸或任何衍生物、脂肪酸或任何衍生物、或其任意组合制备的任何其他合成聚合物。
在一个更优选实施方案中，生物相容性聚合物或其任何衍生物的分子量(Mw)在1000Da至5000000Da，优选地10000Da至1000000Da，更优选地100000Da至500000Da的范围内。
在一个更优选实施方案中，将所选择的生物相容性聚合物(优选如以上步骤a)中所提及的天然聚合物)以所需浓度溶解在选自由以下组成的列表的溶剂中：水溶液、有机溶剂、培养基、或其任意组合。
在另一个优选实施方案中，有机溶剂选自由以下组成的列表作为纯溶剂或以任何合适的比率在水溶液中作为助溶剂：乙醇、二
Figure BDA0003983803940000061
烷、丙酮、乙酸、异丙醇、乙腈、二甲基亚砜、三氟乙酸，或者任何其他溶剂。
在另一个优选实施方案中，培养基是指在所选择的细胞可以生长的条件下支持细胞存活的包含营养物的溶液。合适的培养基的实例选自市售的经典培养基例如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，MEM)或其任何变体，包括对于所使用的各细胞类型具体限定的培养基。在这个意义上，技术人员知道什么特异性培养基适用于所使用的各细胞类型。
在另一个优选实施方案中，本发明的生物相容性聚合物或其任意组合的浓度在0.5％至16％(w/w)，优选地1％至8％，更优选地1.5％至4％的范围内，或者替代地，当最终支架中存在多于一种生物相容性聚合物时以任何可能的相对比率。
在另一个优选实施方案中，包含溶剂和生物相容性聚合物的溶液的pH可以为中性的，或者可以为可以在1至14，优选地2至10的范围内的pH，从而根据所使用的聚合物提高聚合物的溶解度。
为了改善所选择的生物相容性聚合物的溶解度，可以将步骤a)的温度从室温升高直到180℃。在一个优选实施方案中，温度在22℃至70℃，更优选地30℃至70℃，还更优选地35℃至65℃的范围内。
为了提供具有改善的特性的支架，可以与具有高营养价值或者为最终产品提供改善的质地或添加风味的其他分子/物质/生物分子形成和/或组合。为了做到这一点，任选地，在步骤a)中，可以向溶液中添加能够修饰或包被(coat)待获得的支架的表面的任何化合物、物质或生物分子。这些化合物或物质还可以提高可以用支架接种和培养的未来细胞的黏附特性和增殖。这些物质为所谓的细胞黏附分子，例如免疫球蛋白-超家族、钙黏着蛋白(E-、N-、P-、…)、选择蛋白(P-、E-、L-、…)或整联蛋白；纤连蛋白、聚-L-鸟氨酸、胶原、玻连蛋白、凝集素、聚鸟氨酸、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、环肽、含RGD的肽(Arg-Gly-Asp)、含RGDS的肽(Arg-Gly-Asp-Ser)，或者被本领域专家认可的促进细胞黏附至支架的任何其他化合物或物质。
被本领域任何专家认可的任何技术均可以用于进行三维多孔支架的表面修饰，但是优选使用将支架浸入以任何浓度溶解待黏附的试剂的水溶液或有机溶剂中，从而保持其初始形状和尺寸或者略微改变其尺寸。如果需要的话，将溶液的温度控制在22℃至180℃之间以改善表面修饰过程。根据支架孔隙度、温度、待黏附的分子/物质的浓度以及分子/物质的种类，过程时间将持续1分钟至72小时。
控制表面修饰的条件以获得包被程度为0.000001％至100％的三维多孔支架。
为此，在本发明的方法的另一个优选实施方案中，还可以向步骤a)中添加选自添加剂、生物活性分子和/或交联剂、或者其任意组合的至少一种分子/物质/生物分子，以简化本文所公开的可灭菌的3D大孔支架的制造过程。
因此，在另一个优选实施方案中，本发明的方法还包括生物活性配体，所述生物活性配体可以被任选地添加至本发明的方法的步骤a)中或任选地在本发明的方法的步骤c)之后添加。生物活性配体特异性地与一种或更多种细胞生物分子相互作用或者结合与分布在支架内的细胞的生物分子或在支架内增殖或迁移到支架中的细胞的生物分子相互作用的生物分子。这样的相互作用对于指导细胞命运或诱导细胞以形成组织是有效的。这些化合物或物质还可以提高可以用支架接种和培养的未来细胞的黏附特性和增殖。生物活性配体的身份将取决于靶细胞的身份，以及合适的生物活性配体的一些实例包括：羧基、胺、酚、胍、硫醇、吲哚、咪唑、羟基、硫酸根、降冰片烯、马来酰亚胺、层粘连蛋白、纤维蛋白原、肽序列，黏附分子例如免疫球蛋白-超家族、钙黏着蛋白(E-、N-、P-、…)、选择蛋白(P-、E-、L-、…)或整联蛋白、纤连蛋白、聚-L-鸟氨酸、胶原、玻连蛋白、凝集素、聚鸟氨酸、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、环肽、含RGD的肽、含RGDS的肽，或者被本领域专家认可的促进细胞黏附至支架的任何其他化合物或物质。优选地，本公开的生物活性分子是指在不显著影响其促进细胞黏附的能力的情况下抵抗灭菌过程的那些物质。在一个优选实施方案中，生物活性分子为聚-L-赖氨酸，更优选为聚-ε-赖氨酸(聚-ε-赖氨酸)。
聚-ε-赖氨酸(ε-聚-L-赖氨酸，EPL)是天然存在的抗菌阳离子肽，是可溶于水、可食用、可生物降解的并且对人类和环境无毒的L-赖氨酸的均聚物。聚-ε-赖氨酸通常被用作天然食品防腐剂、乳化剂，以及用于药性化妆品和制药工业。在这个意义上，聚-ε-赖氨酸通常被用于食品应用例如煮熟的米饭、煮熟的蔬菜、汤、面条、切片鱼(寿司)和肉。
这是第一次将聚-ε-赖氨酸用作生物活性分子，优选地用作用于在体外细胞培养中改善细胞黏附的生物活性配体。如本发明中所使用的，聚-ε-赖氨酸不仅存在于本发明的支架的表面上，而且存在于其内部，是支架的整体3D结构的一部分，从而允许并改善其上的细胞黏附。此外，由于聚-ε-赖氨酸针对酵母、真菌和细菌的天然抗菌活性，有助于抑制这样的病原微生物在本发明的支架中的生长。
此外，聚-ε-赖氨酸对于食品工业来说已经是可大量且低价获得的，从而使其在培养肉的生产中工业化使用。因此，该特性与特征在于可灭菌优选通过热蒸汽灭菌而不会使所选择的用于其组成的生物相容性聚合物降解和/或变性的本发明的支架的出乎意料的优点相结合，使得它们适合在如先前所提及的需要非常低的生产成本的大规模工业反应器中生产。
添加剂包括但不限于具有高营养价值或者为根据本发明的最终产品提供改善的质地或添加风味的分子/物质，此外是在不显著影响其促进细胞黏附的能力的情况下抵抗灭菌过程的那些物质。添加剂选自由以下组成的列表：调味剂；增味剂；着色剂；增色剂；盐；酸度调节剂；增稠剂；乳化剂；稳定剂；营养强化剂，例如维生素、氨基酸、纤维；低聚果糖；菊粉；β胡萝卜素；ω脂肪酸；螺旋藻；益生菌；益生元；皂苷；抗氧化剂；必需脂肪酸；矿物质；等等；或其任意组合。所选择的用于本发明的支架的添加剂优选来自天然来源(origin)或来源(source)。此外，术语添加剂还涵盖提高可以接种在支架中的未来细胞的黏附特性和增殖的化合物。
合适的交联基团的实例为羟基、羰基、醛基、羧酸酯基、碳酸酯基、羧基或衍生物、羧酰胺基、亚胺基、酰亚胺基、硫醇基和/或任何其他基团、聚电解质、或其任意组合。
在另一个优选实施方案中，添加剂、黏附分子和/或交联剂可以通过物理吸附或化学吸附附着或黏合至支架的表面。通过添加添加剂、黏附分子和/或交联剂进行的表面修饰过程不限于3D多孔支架的外部部分，而由于其固有的孔隙度和3D，表面修饰被扩展至所有表面：i)易于发生修饰的表面，和ii)甚至在最内部部分中的表面。
在另一个优选实施方案中，还向本发明的方法的步骤a)的溶液中添加交联剂。在生产过程期间，向步骤a)的溶液中添加交联剂提高了支架的机械特性、热特性和/或稳定性特性。由此形成的交联可以通过化学作用例如可能需要交联剂的共价键获得，或者其可以通过以下来获得：所使用的聚合物的官能团之间的化学反应；诸如通过产生非共价键的物理方法；或酶促。交联过程可以通过被本领域专家认可的任何技术来进行，例如：溶液、紫外线处理、γ辐射、电子束、热处理、压力、化学处理、酶处理等。
交联的条件被控制成使得所获得的3D大孔支架中的交联度在0.0001％至100％的范围内。使交联的支架经受不同阶段的中和、充分洗涤(水溶液和/或其他溶液)、干燥和冷冻-冻干，以除去最终支架中的任何不期望的衍生物。
将本发明的方法的步骤a)中获得的还包含选自添加剂、生物活性分子和/或交联剂、或其任意组合的至少一种分子/物质/生物分子的溶液洗涤、过滤和/或离心，以消除任何未溶解的固体和/或化合物，并且进一步除去气泡。
在获得步骤a)的溶液之后，需要使其符合期望的形状和尺寸。因此，在本发明的方法的步骤b)中，可以将溶解液倒入模具中，之后使其经受冷冻过程，或者另外的可能是使用其他构造技术，例如经由在冷冻温度下直接挤出形成形状。根据ASTM国际标准组织，挤出是对其中将材料通过喷嘴或孔口选择性地分配的特定3D打印过程给定的正式名称。
在使用模具的情况下，模具可以被选择成赋予支架所期望的形状。在一个优选实施方案中，本发明的支架的形状可以是规则的(例如，圆柱形、球形、圆形、矩形、正方形、金字塔形、棱柱形、锥形等)或者不规则的。在另一个优选实施方案中，模具的尺寸在100μm×100μm至10cm×10cm(a×b)，优选地1mm×1mm至5mm×5mm，更优选地1cm×1cm至3cm×3cm的范围内变化，以提高细胞增殖和组织形成。尺寸可以在所述范围内以其中a不同于b的不规则的形状变化。例如，图1示出了具有圆柱形形状的支架的变化。这些形状中的任一者均可以是多孔的。
在通过挤出获得本发明的支架的构造的特定实施方案中，将步骤a)的溶液保持在0℃至5℃的范围内的低温下，之后泵入挤出机中并打印到其中液滴立即冷冻的-15℃至-80℃的冷冻表面，如图2中所示。图2的插图示出了通过挤出获得的通过本发明的方法获得的支架的光学图像。
如以上所提及的，具有许多将决定通过本发明的方法获得的支架的最终特性的变量，包括交联度、生物相容性聚合物溶液的组成(即，是否具有单一聚合物或其混合物)、胶凝温度以及冷冻过程的时间和温度。
在这种意义上，本发明的支架的最终孔尺寸受本发明的方法的步骤a)中所使用的聚合物的浓度影响。此外，具有高聚合物浓度的具有水凝胶行为的聚合物产生较小的孔尺寸。在这种情况下，3D多孔支架的生产过程产生50μm至10.000μm，优选地100μm至1000μm，更优选地100μm至500μm的范围内的纵向孔尺寸。在特定实施方案中，平均纵向孔尺寸在50μm至1000μm、100μm至1000μm、或100μm至500μm的范围内。为了获得大孔，可以在本发明的用于生产支架的方法中使用特定的模具，这使得可以获得横向孔。横向大孔的平均尺寸在1μm至10000μm的范围内，并且优选这些横向大孔沿着支架的所有体积定位。
通过形成水晶体(溶剂)获得的纵向孔的排列与横向大孔一起使得能够获得具有相互连通和分层次的多孔结构的水凝胶。
此外，通过冷冻技术形成多孔支架时要考虑的一个重要因素是所使用的生物相容性聚合物的重量/体积百分比。在一个优选实施方案中，所选择的生物相容性聚合物的重量/体积百分比在0.5％至16％的范围内。在另一个优选实施方案中，在水溶液、有机溶剂、培养基、或其任意组合中，重量/体积百分比在1％至8％的范围内，更优选在1.5％至4％的范围内，还更优选为1.5％。
通过冷冻技术形成多孔支架时(优选在用于获得溶解液的步骤a)中以及在冷冻步骤b)中)要考虑的另一个重要因素是温度。在这个意义上，当冷冻在非常低的温度下，优选在-15℃至-80℃的范围内的温度下进行时，溶剂结晶更快，引起较小溶剂晶体成核。通常，凝胶溶液在-5℃至-20℃的范围内的温度下冷冻。在这些温度下，高百分比的溶剂结晶；然而，一部分凝胶保持液体状态。当溶剂结晶时，聚合物组分集中在液体微相中，而不是保留在结晶的宏观相中。因此，随着溶剂的结晶增加，液体微相变得更加集中，产生更致密且更薄的孔壁。本发明的方法中所使用的温度(优选在-20℃至-80℃的范围内的温度)被认为是用于形成本发明的支架的有效冷冻温度。
在将溶液倒入模具中之后，如果需要的话，将这些静置以达到室温。在另一个优选实施方案中，将包含溶液的模具在-20℃至-80℃的范围内的温度下冷冻优选16小时至48小时的一段时间。与其他形成大孔结构的技术相比，在低于溶解液的冷冻温度的温度下形成的这些大孔3D支架显示出易于形成，这使得它们容易扩展至工业生产。此外，在低于溶剂的凝固点的温度下获得大孔避免了某些风险，例如某些致孔剂(porogenous agent)的细胞毒性，如在使用其他技术形成3D结构的情况下。为了获得更大的孔尺寸，可以使用特定的模具，这使得可以获得微米至毫米范围内的横向孔(沿着支架的所有体积)。通过形成溶剂晶体而获得的纵向孔的排列与横向孔一起使得能够获得具有相互连通和分层次的多孔结构的水凝胶。
在本发明的方法的另一个步骤中，步骤c)的冻干在如下冷凝器中进行优选16小时至96小时，优选地24小时至72小时，更优选地18小时至24小时的范围内的一段时间：温度在25℃至-100℃，优选地25℃至-100℃，更优选地20℃至-50℃，并且更优选地-15℃至-45℃的范围内，以及压力为0.01Pa至0.026Pa(1×10-4毫巴至2.6×10-4毫巴)，更优选地100Pa至40Pa(1毫巴至0.4毫巴)，更优选地20Pa至40Pa(0.2毫巴至0.4毫巴)。冻干过程中所使用的参数例如时间、温度和压力以使支架失去至少98％的初始水的方式选择。参见图3，其中水的相图示出了冻干发生时的三相点。为了帮助升华，可以将冻干的架子加热直至20℃。建议样品与冷凝器之间的温差为15℃至20℃。
在一个更优选实施方案中，在将支架冻干之后，如果需要的话，可以任选地使其经受不同的中和步骤，例如：充分洗涤(水溶液和/或其他溶液)，以除去最终支架中任何不期望的衍生物。出于储存目的，如果需要的话可以任选地使该支架经受后续的干燥和冷冻-冻干。
在本发明的方法的另一个优选实施方案中，还可以向所获得的经冻干的支架中添加如以上所提及的选自添加剂、生物活性分子和/或交联剂、或者其任意组合的至少一种分子/物质/生物分子，以提供具有本文所提及的优点的新支架。
在另一个优选实施方案中，在获得包含以上提及的分子/物质/生物分子的经冻干的支架之后，所述方法还包括洗涤支架并且任选地重复步骤b)至步骤c)，只要是技术人员认为必要的次数即可。
之后，使经冻干的支架经受固化程序，优选经受热固化程序，以诱导支架的组分的重组，并且促进或提高其最终产品的机械特性、热特性和/或稳定性特性。
在一个优选实施方案中，热处理包括在30℃至180℃，优选地50℃至130℃，更优选地60℃至100℃的范围内的温度下使经冻干的支架固化1分钟至48小时，优选地30分钟至8小时，更优选地1小时至5小时的一段时间。所选择的温度和时间应防止支架的聚合物组分和/或支架的生产中所使用的不同添加剂例如细胞黏附剂、交联剂等分解。
通常，将经冻干的支架在烘箱中固化。在烘箱中的固化过程期间，通风程度和相对湿度通过引入内部调节***来控制。
通过本文所提及的方法获得的3D大孔支架在细胞接种过程之前进行灭菌。灭菌过程通过处理支架(优选通过物理灭菌、化学灭菌或本领域已知的并且经食品和生物医学领域的监管机构批准的任何其他方法)来进行。
特别地，物理灭菌过程包括热蒸汽、干热、间歇灭菌法、和电离辐射或非电离辐射例如用于表面的UV辐射、用于液体的x射线，尽管该程序非常昂贵且存在安全问题。
在一个优选实施方案中，对于液体和设备的经济大规模灭菌，物理灭菌过程为热蒸汽。在用热蒸汽灭菌时，温度在110℃至140℃的范围内，以及时间为5分钟至40分钟。化学灭菌过程还包括通过应用醇类例如70％乙醇-水(pH＝2)、醛类、酚类、环氧乙烷(气体)、过氧化氢、3％次氯酸钠等进行的灭菌。
因此，通过本发明的方法获得了可以由至少一种生物相容性聚合物构成，优选地由经批准用于食品用途的生物相容性天然聚合物或其混合物构成的具有3D结构和大表面积的支架，所述支架可以在培养肉的生产中用作动物细胞用支持体，即使在大规模生物反应器中也可以如此，并且所述支架由于由经批准用于食品用途的天然生物聚合物构成而可以保留在最终产品中。此外，所获得的支架被/可以被灭菌(优选通过热蒸汽)而不会失去其任何特性。在这个意义上，本发明的方法适用于整合到培养肉生产线上，从而有助于生产可以稍后在培养肉生产过程中例如在生物反应器内使用的支架。
因此，在第二方面中，本发明涉及通过本发明的方法获得的支架，在下文中为本发明的支架。
在一个优选实施方案中，支架为包含至少一种生物相容性聚合物的网络的可食用且可灭菌的大孔3D组织工程支架，如以上所提及的。
使用支架技术来支持大规模培养肉生长的主要挑战之一是支架与大规模生物反应器中所使用的灭菌技术的相容性，如先前所提及的。因此，通过本发明的方法获得的支架适合于对于大量生产食品产品实现成本有效的过程。如前文所提及的，灭菌过程是基于蒸汽、压力和时间的组合。灭菌过程在高压釜或生物反应器中在121℃(250℉)至134℃(273℉)的范围内的温度下以及在0.5巴至1.05巴的范围内的压力下通过热蒸汽进行10分钟至60分钟的范围内的时间，更优选地，通过热蒸汽进行的灭菌在至少121℃的温度下以及在1.05巴的压力下进行20分钟，以杀死微生物和孢子。本领域已知的支架不适用于在不失去其用于组织工程的特性的情况下完成该过程。
相反，本发明的支架具有可灭菌的出乎意料的优点，因为所选择的用于其组成的生物相容性聚合物能够在不降解和/或变性的情况下在高温下抵抗高的水蒸汽压力。重要的是要注意，本发明的支架在经受灭菌过程之后保持其组成和结构完整，从而允许适当的细胞黏附和网状化。此外，本发明的支架的灭菌过程不仅不会因可能的降解和/或变性而改变材料的适用性，而且甚至改善了用于支持细胞增殖的机械特性。因此，本发明的支架可以是在不损失其作为细胞增殖用支架的特性的情况下可通过本领域技术人员已知的任何方法(包括热蒸汽)灭菌的，从而便于其引入到需要低成本和大量生产的工业过程中。
通过本发明的方法获得的包含以上所提及的添加剂和/或交联剂化合物的支架还可以包含均匀分布在整个支架中的活细胞，优选非人类活细胞。
用于沿着本发明的支架进行培养以提供具有高营养成分的组织和/或本文所述的培养肉的细胞可以包括但不限于例如肌肉细胞，优选平滑肌细胞；骨骼肌细胞；基质细胞；内皮细胞；卫星细胞；成纤维细胞；成肌细胞，脂肪细胞例如脂肪细胞祖细胞(adipocyteprogenitor cell)；心肌细胞；肝细胞等。由于其结构，本发明的支架使得能够实现不同细胞类型例如尤其是成肌细胞/肌管/成纤维细胞(肌肉细胞)、脂肪细胞(adipocyte)(脂肪细胞(adipose cell))的增殖和分化，从而产生适用于人类消费的具有最终消费者所期望的蛋白质-脂肪含量的培养肉作为最终产品。
在另一个优选实施方案中，沿着支架培养的活细胞系可以从各种动物来源例如但不限于以下中获得：哺乳动物，例如猪、牛、羊、马、狗、猫；禽类；爬行动物；鱼；两栖动物；甲壳类动物；头足类动物等。这为巨大的市场打开了大门，因为其为最终消费者提供了非常多样化的产品(offering)。
在另一个优选实施方案中，将支架用细胞培养基饱和，以便于细胞增殖或存活，即细胞生长培养基。在一些实施方案中，支架可以用预期用于递送至食物(优选肉)的生物分子或其他材料浸渍。在一个更优选实施方案中，细胞生长培养基为在选择的细胞可以生长的条件下支持细胞存活的包含营养物的任何合适的培养基。合适的培养基的实例选自任何市售的经典培养基例如Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，MEM)及其任何变体，或者对于所使用的各细胞类型具体限定的培养基。
通过本发明的方法获得的可食用且可灭菌的支架适用于营养成分的组织和/或用于人类消费的培养肉的生物制造。虽然本文所述的支架及其形成和使用方法主要涉及可食用的工程肉产品，但是这样的支架还可以在其中期望在不存在来源于动物的产品的情况下进行细胞扩增的动物(特别是人类)细胞治疗和再生医学中找到应用。例如，本文描述了用于形成培养肉产品的可食用且可灭菌的大孔3D组织工程支架。
此外，由于通过本发明的方法获得的支架的高度大孔结构允许输送营养物，从而便于细胞黏附和增殖，并且产生可以随后加工成所制备的用于消费的食品的原材料。此外，支架使细胞分布在完整的3D空间中。迄今为止，这些支架从未被设想用于该目的，因为大规模培养肉生产技术正处于其早期。用于生产培养肉的这些支架的构思是新颖的，并且用于获得呈高度多孔可食用且可灭菌的支架的这种形式的支架的材料的应用也是新颖的。
因此，如以上所提及的用于本发明的支架的生物相容性聚合物以及因此包含其的本发明的支架具有以下优点：
(i)其也被用作黏合剂，从而使生长的肉的质地和密实度更优。
(ii)其改善了消化过程阶段中营养物的分散、生物利用度和吸收；
(iii)考虑到生物相容性聚合物可以为具有水凝胶特性的生物聚合物，
细胞所生长的支架还可以提供味道和触感令人愉悦的质地；
(iv)其还可以充当增味剂和增色剂，因为其本身充当类似于药物释放***(载体)的释放***；
(v)其还充当用于某些营养药物和/或游离氨基酸的选择性递送***，从而为使用这些可食用结构作为维生素、矿物质、核酸或其他生物分子的可能载体开辟了广泛的可能性。
本发明的支架满足组织工程的基本要求，包括：高度相互连通的大孔促进营养扩散并便于细胞增殖、扩散、迁移和细胞-细胞通信也就是细胞迁移，大的内表面积产生大的细胞增殖能力，以3D方式分布细胞便于营养输送，支持细胞迁移和增殖，并且便于对组织的新生产的机械支持。
如上所述，本发明的支架适用于多种应用，包括再生医学和组织工程。所述支架作为组织工程是特别有用的。因此，其可以用来便于细胞增殖和组织形成。大孔隙度适用于允许细胞迁移、细胞内基质的形成、营养物的供应、血管生成等。如本文所提及的支架材料是生物相容的。
此外，本发明的支架与不同类型的反应器或生物反应器甚至其中将施加电流以刺激细胞增殖的反应器或生物反应器相容，因此，本发明的支架也是导电的。
因此，在另一个方面中，本发明涉及本发明的支架在由培养细胞形成培养肉产品中的体外用途。
在一个优选实施方案中，培养肉的特征在于培养细胞选自由以下组成的列表：哺乳动物、禽类、鱼、爬行动物、甲壳类动物、头足类动物和两栖动物。
在另一个优选实施方案中，培养肉的特征在于细胞优选为肌肉细胞，并且任选地，还包含多个卫星细胞、基质细胞、成肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞、肝细胞、心肌细胞、或其任意组合。
在另一个优选实施方案中，培养肉的特征在于还包含脂肪细胞、卫星细胞、成纤维细胞、成肌细胞、或其任意组合。
在另一个优选实施方案中，培养肉的特征在于还包含选自由以下组成的组中的至少一种添加剂：调味剂、增味剂、着色剂、增色剂、营养强化剂、或其任意组合。
在另一个方面中，本发明还涉及通过用本发明的支架培养活细胞，优选活肌肉细胞来形成培养肉的方法，其中培养在合适的生物反应器中以及在合适的营养培养基的存在下进行。
此外，一个特别创新的事实是，本发明的支架可以充当用于多种食物补充剂例如纤维、维生素、氨基酸等的载体，并且其在不失去组织工程支架特性的情况下适用于灭菌过程。
因此，在另一个方面中，本发明涉及本发明的支架作为载体的用途。
在本文中，术语“包括”及其派生词(例如“包含”等)不应以排他性的含义理解，即，这些术语不应被解释为排除所描述和限定的内容可以包括另外的要素、步骤等的可能性。
另一方面，本发明显然不限于本文所述的具体实施方案，而是还涵盖在本发明的如权利要求中所限定的一般范围内可以被本领域技术人员考虑的任何变化(例如，关于材料、尺寸、组分、配置等的选择)。
附图说明
为了完成描述并且为了对本发明提供更好的理解，提供了一组附图。所述附图形成说明书的组成部分，并且举例说明了本发明的实施方案，其不应被解释为限制本发明的范围，而仅仅作为本发明可以如何实施的实例。附图包括以下图：
图1.通过模制形成的不同高度和直径的圆柱形支架。分别对应于实施例1、实施例2和实施例3的支架a)、支架b)和支架c)。
图2.挤出到冷冻表面的示意性描述。入口示出了通过该方法可以生产的最终丸粒。
图3.水的示出三相点的相图；其中冻干过程将在该三相点以下发生。
图4.实施例1(4a)、实施例2(4b)和实施例3(4c)的多孔支架在细胞接种之前的扫描电子显微镜(SEM)图像。在实施例1(4d)、实施例2(4e)和实施例3(4f)的支架上的组织增殖。
图5.实施例1中所公开的支架在灭菌过程之前(A)和之后(B)的汞(Hg)孔隙度测定法研究。总孔隙度和总表面积的数据。
图6.实施例2中所公开的支架在灭菌过程之前(A)和之后(B)的汞(Hg)孔隙度测定法研究。总孔隙度和总表面积的数据。
图7.实施例3中所公开的支架在灭菌过程之前(A)和之后(B)的汞(Hg)孔隙度测定法研究。总孔隙度和总表面积的数据。
图8.FTIR(傅里叶变换红外光谱)。分别对应于来自实施例1(8A)、实施例2(8B)和实施例3(8C)的支架的样品在灭菌程序之前(上端的线)和之后(下端的线)的光谱。
图9.图示出了与初始葡萄糖(图例中的初始)和在不存在本发明的支架的情况下的细胞培养对照(图例中的对照)相比，被接种在本发明的实施例1至3中获得的支架中的哺乳动物细胞在不同测定时间(以天表示)下的葡萄糖消耗(以g/L表示)(图例中的实施例1、实施例2和实施例3)。
实施例
以下是本发明的通过由本发明人进行的测定的实施例，这些实施例证明了本发明的产品的有效性。以下实施例用于举例说明本发明，并且不得被认为是限制其范围。
实施例1.通过本发明的方法合成包含壳聚糖作为生物相容性聚合物的支架
在对其他生物相容性聚合物及其混合物同样有效的可食用且可灭菌的大孔3D支架的典型生产方法中，将市售MEM Eagle(最低必需培养基Eagle，Minimum EssentialMedium Eagle)(w/Earle的BSS、w/非必需氨基酸和L-谷氨酰胺、呈粉末的w/o钙(在0mg至600mg的范围内，以实现相对于壳聚糖重量的0％至200％，更优选75mg，以实现相对于壳聚糖重量的10％))溶解在乙酸(0.1M，50mL)中，并在搅拌的同时缓慢添加壳聚糖(750mg，1.5％)。将混合物搅拌直到获得均匀的溶液(65℃，2小时)，并将溶液倒入模具中以得到期望的形状和尺寸。将所有样品在-20℃下冷冻24小时，并在-40℃下、在0.263毫巴的压力下冻干持续72小时。
这是用于制造具有受控形状的支架的方法，所述受控形状将由进行该过程的容器决定。
将支架从模具中取出，并在不通风的情况下放入135℃的烘箱中持续1小时(固化通过将烘箱在45℃下预热来开始，只要烘箱达到135℃就开始计时；1小时之后，将支架在烘箱内静置以达到室温，这花费约1小时30分钟)。在该阶段，将支架用miliQ水(3×100mL持续15分钟)、0.1M NaHCO3(3×100mL持续15分钟)和水(3×100mL持续15分钟)洗涤。
结果表明，通过本发明的方法获得的包含MEM粉末(0％)的支架在其被浸入水中时失去其紧密性(consistency)。因此，似乎该交联温度和时间不足以获得关于机械强度和外观具有期望的特性的支架。然而，结果表明，剩余的包含不同MEM浓度(1％、8％、16％、33％、133％、200％，更优选8％)的支架显示出良好的紧密性，并且未失去它们的形状。这些数据表明，MEM组分也充当给予原本易碎的支架紧密性的交联剂。
之后，将具有8％ MEM浓度的支架在121℃、1.05巴的高压釜中灭菌20分钟并进行测试。支架是稳定的，并且已发生一定程度的交联，因为支架没有过度溶胀，这就是交联减少了溶胀。
用一定重量/体积百分比的壳聚糖聚合物(1.5％)获得的这些支架的大孔隙度可以被控制，并且显示出高孔体积和90％的总孔隙度，从而产生泡沫状样品。如通过数字成像(图1a)和SEM(图4a)可以观察到，优化的支架表现出高体积和1μm至500μm的范围内的尺寸的相互连通大孔隙度。
在图5中，示出了本实施例中获得的支架的Hg(汞)侵入孔隙度分析。使用该技术来分析固体和粉末材料的总连通孔隙度、孔体积、孔尺寸分布和表面积。被称为孔隙率计的仪器利用加压室来迫使汞侵入多孔基底的空隙中。当施加压力时，汞首先填充较大的孔。随着压力增加，填充进行到越来越小的孔。颗粒间孔(单个颗粒之间)和颗粒内孔(颗粒自身内部)二者均可以使用该技术来表征。侵入样品中的汞的体积通过被称为透度计的金属包层毛细管分析单元中的电容变化来监测。样品被保持在透度计单元的一部分中，所述透度计单元可以不同的体积用于容纳粉末或完整的固体块。样品尺寸被限制为约2.5cm长乘以1.5cm宽的尺寸。使用该强有力的技术来分析在对所述块进行灭菌之前(图5A)和之后(图5B)关于支架的多孔性质的变化。如在图5中可以看出，结果表明，总孔体积和总表面积由于来自灭菌步骤的收缩而略微降低。尽管如此，灭菌之后的值更加非常适用于显示出可用于细胞定殖的合适的孔体积范围和高表面积的应用。
为了证明在热蒸汽灭菌程序期间已经发生了可能损害支架对细胞培养的适用性的非化学修饰，通过FTIR(傅里叶变换红外光谱)分析了灭菌之前和之后的支架。FTIR是用于鉴定有机(以及在某些情况下无机)材料的分析技术。该技术测量了样品材料对红外辐射的吸收与波长的关系。红外吸收带确认了分子组分和结构。如在图8A中可以看出，在灭菌过程之前和之后，关于谱带形状和位置没有变化，证明了支架的化学特性的适用性。
实施例2.通过本发明的方法合成包含藻酸盐作为生物相容性聚合物并且包被有聚-ε-赖氨酸的支架。
将浓度为2.0g的藻酸钠盐(Sigma-Aldrich)在剧烈搅拌下缓慢添加至水(200mL)中。将混合物在50℃下搅拌3小时，直到获得均匀、透明且澄清的溶液。将溶液静置以达到室温。
之后，将溶液倒入模具中以得到期望的形状和尺寸。将所有样品在-20℃下冷冻24小时并在-40℃下、在0.263毫巴的压力下冻干72小时。
将获得的经冻干的支架从模具中取出，并在氯化钙在miliQ水(200mL)中的2％水溶液(4g，200mL)(可以使用任何其他水溶液，例如硫酸钙、碳酸钙、葡萄糖酸钙、柠檬酸钙)中浸没15分钟以引发聚合物的交联。在该溶液中，藻酸盐支架立即凝胶化，并将其用miliQ水充分洗涤以除去未结合的钙离子。然后将丸粒在0.2％聚-ε-赖氨酸溶液(在500mL中1.0g)中浸没16小时，然后用miliQ水充分洗涤。将支架再次在-20℃下冷冻24小时，并在-40℃和0.263毫巴的压力下冻干72小时。
之后在不通风的情况下将经冻干的支架在115℃的烘箱中加热1小时(固化通过将烘箱在45℃下预热来开始，只要烘箱达到115℃就开始计时；1小时之后，将支架在烘箱内静置以达到室温，这花费约1小时30分钟)，之后，储存直到使用。
之后，将支架在121℃的高压釜中在1.05巴下灭菌20分钟。
如通过数字成像(图1b)和SEM(图4b)可以观察到，优化的支架显示出高体积和1μm至500μm的范围内的尺寸的相互连通大孔隙度。
如图6中所示，在对所述块进行灭菌之前(图6A)和之后(图6B)，Hg(汞)侵入孔隙度分析表明，总孔体积和总表面积略微降低。尽管如此，灭菌之后的值仍非常适用于显示出可用于细胞定殖的合适的孔体积范围和高表面积的应用。
如在图8B中可以看出，在灭菌过程之前和之后，关于谱带形状和位置没有变化，证明了支架的化学特性的适用性。
实施例3.通过本发明的方法合成包含壳聚糖作为生物相容性聚合物并且包被有聚-ε-赖氨酸的支架
将食品级壳聚糖(9.0g)在40℃下在轻轻搅拌下与乙酸(0.1M，600mL)混合，直到壳聚糖被溶解。在剧烈搅拌下向先前的溶液中分批添加聚-ε-L-赖氨酸(360mg粉末，Mw：1000至300000)，并将混合物温热至65℃持续2小时30分钟，以获得均匀且澄清的溶液。
将先前的溶液静置以达到室温，并将其倒入模具中以得到期望形状和尺寸的支架(图1c)。将模具内的溶液在-20℃下冷冻24小时，并在-40℃和0.263毫巴的压力下冻干72小时。
将支架从模具中取出，并将其用无水乙醇(2升)凝胶化4小时。将支架用高纯水洗涤，并将支架在NaOH溶液(1％)中浸没3小时。将支架用高纯水充分洗涤，直到浸提液(lixiviate)达到中性pH(6.5至7.5)。将如此形成的支架在-20℃下冷冻24小时并冻干(72小时，-40℃以及P＝0.263毫巴)。支架直接使用而无需任何进一步处理，或者替代地可以使其固化。通过在不通风的情况下将经固化的支架引入110℃的烘箱中1小时来使其经受热处理(固化通过将烘箱在45℃下预热来开始，只要烘箱达到110℃就开始计时；1小时之后，将支架在烘箱内静置以达到室温，这花费约1小时30分钟)。之后，将支架在121℃的高压釜中在1.05巴下灭菌20分钟。如通过数字成像(图1c)和SEM(图4c)可以观察到，优化的支架显示出高体积和1μm至500μm范围内的尺寸的相互连通大孔隙度。
如图7中所示，在对所述块进行灭菌之前(图7A)和之后(图7B)，Hg(汞)侵入孔隙度分析表明：总孔体积和总表面积略微降低。尽管如此，灭菌之后的值仍非常适用于显示出可用于细胞定殖的合适的孔体积范围和高表面积的应用。
如在图8C中可以看出，在灭菌过程之前和之后，关于谱带形状和位置没有变化，证明了支架的化学特性的适用性。
实施例4.在生物反应器中用非人类细胞培养通过本发明的方法获得的实施例1至3的支架。
为了验证通过本发明的方法获得的基于壳聚糖的支架(实施例1和实施例3)和基于藻酸盐的支架(实施例2)对于获得培养肉是有用的，本发明人在生物反应器中沿着本发明所提及的支架培养活细胞。
为此，将实施例1、实施例2和实施例3的支架在121℃的高压釜中在1.05巴下灭菌20分钟，并无菌浸入最终体积为2升的培养基(GibcoTM OptiPROTM)中。接着，在所提及的支架中接种已知细胞密度(13.000个细胞/cm2)，并在48小时灌注生物反应器中长时间段(10天或更长)保持培养。接种的细胞为从肌肉活检中获得的并且按照JM Spinazzola等人的Bio Protoc.2017年11月5日；7(21)中描述的方案提取的专有提取物的原代猪成肌细胞。用于细胞充分增殖的培养条件需要保持37℃的温度和7.1至7.4的pH值。此外，保持持续供应气体，使得溶解的氧的浓度在20％至30％的范围内。在10天的时间段之后，将支架从生物反应器中取出并用乙醇脱水以进行SEM(扫描电子显微术)可视化。SEM图像(图4d、4e和4f)分别示出了在实施例1、实施例2和实施例3的支架上的完整组织增殖。
在10天的培育期期间，用具有葡萄糖生物传感器的生物剖面分析仪(BioprofileAnalyzer)测量葡萄糖消耗。葡萄糖生物传感器为在其膜中具有固定化酶的电流式电极。在氧气和被测量的基底的存在下，这些酶膜产生过氧化氢(H2O2)，然后其在保持在恒定电位下的铂阳极上被氧化。所产生的电子流和电流变化与样品葡萄糖浓度成比例。在不同的测定时间下进行测量，作为在本发明的支架上进行的组织的增殖和形成的间接测量。所获得的数据示于图9中。结果表明，播种在本发明的基体中的原代猪成肌细胞随着时间(1至10个测定日)存在葡萄糖消耗，因为与培养基的初始葡萄糖水平(约4g/L)相比，观察到葡萄糖浓度值降低。对每个测定日进行阳性对照。
因此，结果表明，本发明的方法对于获得良好的用于细胞培养以及用于获得体外培养肉的支架是有用的。

Claims (23)

1.用于获得能够灭菌的大孔三维(3D)组织工程支架的方法，所述支架包含至少一种相互交联的生物相容性聚合物的网络，其中所述方法包括以下步骤：
a)制备所述至少一种生物相容性聚合物的溶解液，
b)将步骤a)的溶液倒入模具中并冷冻，优选在低于所述溶液的冷冻温度的温度下冷冻；
c)将步骤b)中获得的冷冻支架冻干；
d)使步骤c)的经冻干的支架固化，以及
e)通过热蒸汽对所述支架进行灭菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物相容性聚合物选自天然聚合物、合成聚合物、或其任何变体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述天然聚合物或其任何变体选自由以下组成的列表：葡聚糖、藻酸盐、壳聚糖、淀粉、肝素、硫酸肝素、普鲁分支葡聚糖、纤维素、半纤维素、葡甘露聚糖、琼脂、硫酸软骨素、明胶、几丁质、多核苷酸、多糖、糖胺聚糖、天然聚酯、或其任意组合，优选地，所述天然聚合物或其任何变体选自壳聚糖和/或藻酸盐。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述合成聚合物或其任何变体选自由以下组成的列表：聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚羟基链烷酸酯、生物酯、或其任意组合。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述聚合物的分子量在1000Da至5000000Da，优选地10000Da至1000000Da，更优选地100000Da至500000Da的范围内。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中在步骤a)中，将所述聚合物溶解在选自由以下组成的列表的溶剂中：水溶液、有机溶剂、培养基、或其任意组合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述聚合物在步骤a)的所述溶液中的重量/体积百分比在0.5％至16％，优选地1％至8％，更优选地1.5％至4％的范围内。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤a)的pH在1至14，优选地2至10的范围内；以及步骤a)的温度在22℃至180℃，优选地30℃至70℃的范围内。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中步骤b)的所述支架通过经由直接挤出对所述溶解液进行模塑或者通过在不同形状和尺寸的模具中模塑来形成。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中步骤b)的所述冷冻温度在-15℃至-80℃的范围内。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤c)的所述冻干在1×10-4毫巴至2.6×10-4毫巴，优选地1毫巴至0.4毫巴，更优选0.263毫巴的范围内的压力下以及在25℃至-100℃，优选地20℃至-50℃，并且更优选地-15℃至-45℃的范围内的温度下进行至少16小时至96小时，优选地24小时至72小时，更优选地18至24的范围内的一段时间。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中步骤d)的固化过程为在30℃至180℃的范围内的温度下进行1分钟至48小时的范围内的一段时间的热固化过程。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中步骤e)的所述灭菌能够任选地通过物理灭菌或化学灭菌，优选物理灭菌过程，来进行。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中还任选地包括：在步骤a)中和/或在步骤c)与步骤d)之间的另外的步骤中，添加至少一种添加剂、至少一种黏附分子、至少一种交联剂和/或其任意组合。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述添加剂选自由以下组成的列表：调味剂、增味剂、着色剂、增色剂、盐、酸度调节剂、增稠剂、乳化剂、稳定剂、营养强化剂、益生菌、益生元、皂苷、抗氧化剂、必需脂肪酸、矿物质、及其任意组合。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述黏附分子选自由以下组成的列表：免疫球蛋白-超家族蛋白质、钙黏着蛋白、选择蛋白或整联蛋白、纤连蛋白、聚-L-鸟氨酸、胶原、玻连蛋白、凝集素、聚鸟氨酸、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、环肽、含RGD的肽、含RGDS的肽、或其任意组合，优选所述黏附分子为聚-ε-赖氨酸。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述交联剂选自由以下组成的列表：胺基、羟基、羰基、醛基、羧酸酯基、碳酸酯基、羧基、羧酰胺基、亚胺基、酰亚胺基、硫醇基、无机离子、及其任意组合。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中还包括洗涤所述支架以及任选地重复所述步骤b)至所述步骤c)。
19.通过根据权利要求1至18中任一项所述的方法获得的能够通过热蒸汽灭菌的且可食用的大孔3D组织工程支架，其包含至少一种生物相容性聚合物的网络。
20.根据权利要求19所述的支架在组织和/或培养肉的生产中的体外用途。
21.根据权利要求20所述的用途，其中所述培养肉包含多个贴壁细胞，优选肌肉细胞，并且任选地，还包含多个卫星细胞、基质细胞、成纤维细胞、成肌细胞、内皮细胞、脂肪细胞、肝细胞、心肌细胞、或其任意组合。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述细胞属于选自由以下组成的列表的动物来源：哺乳动物，优选猪、牛、羊、马、狗、猫；禽类；爬行动物；鱼；两栖动物；甲壳类动物；头足类动物；或其任意组合。
23.根据权利要求19所述的支架作为载体的体外用途。
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