CN101619090A - 用于生物大分子分离纯化的柱切换循环体积排阻色谱*** - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于生物大分子分离纯化的柱切换循环体积排阻色谱***，包括：液相色谱泵，进样阀，三通或四通连接头，切换阀A，切换阀B，体积排阻柱A，体积排阻柱B和检测器。泵、进样阀、体积排阻柱A、切换阀A、体积排阻色谱柱B、检测器、切换阀B和三通或四通连接头通过管路依次相连，通过调节阀A的切换频率或模式可以控制进入循环分离***的生物大分子的数量，调节阀B的切换可以控制生物大分子组分的分离与收集，该***与传统的体积排阻色谱方法相比具有分离能力强、分辨率高等特点，可用于生物大分子样品的分离纯化。同时，该***在构建连续生物大分子多维分离平台中也具有很好的实用价值。

Description

用于生物大分子分离纯化的柱切换循环体积排阻色谱***

技术领域

本发明涉及蛋白分离纯化***，具体地说是一种柱切换循环体积排阻色谱分离***。

背景技术

在生物大分子的分离中，离子交换色谱和体积排阻色谱是最常用的两种分离技术。而体积排阻色谱由于分离条件温和，容易保存生物分子的活性，因此常被用于生物分子的分离与纯化。和其它的分离模式相比，体积排阻色谱被认为是一种分辨率低的液相色谱方法，因此限制了它在生物大分子分离中的应用。为了提高分辨率，通常会采用更长的色谱柱或者使用更细粒径的填料装填的色谱柱，然而柱压太高也使该方法很难付诸于实践。循环体积排阻色谱是一种提高分辨率的液相色谱方法，样品可以在一根色谱柱内进行无数次重复的分离，因此可以说是无限制地增加柱长，从而可以获得很高的分辨率。然而，随着分离时间的增长，谱峰随之展宽，分离开的色谱峰(分子量范围宽的蛋白、核酸等)在多次循环分离后可能还会重叠。

发明内容

为了克服这一缺陷，申请人建立了柱切换循环体积排阻色谱***，该方法是将预分离开的生物大分子捕集在第二根体积排阻色谱柱上，通过控制阀切换，将分子量相似的生物大分子切入循环***中分离，得到满意的分离度后，对分离开的组分进行收集。然而，再从捕集柱切出一小部分进行循环分离，依次类推。这种方法适用实际复杂样品的分离纯化，具有更高的使用价值。

本发明的目的在于提供一种以体积排阻色谱为分离模式的生物大分子分离装置，利用该装置可以分离纯化生物大分子，获得更高纯度的生物大分子，同时还构建连续生物大分子多维分析平台。该装置设计简单，分辨率高，分离效果好，实用性强。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于生物大分子分离纯化的柱切换循环体积排阻色谱***，其特征在于：包括液相色谱泵、切换阀、体积排阻色谱柱A、体积排阻色谱柱B、检测器，它们通过管道以闭合环路的形式相连；

体积排阻色谱柱A一端与进样阀相连、另一端通过一切换阀A分别与体积排阻色谱柱B、检测器相连，进样阀的外端通过泵经三通接头分别与外界的流动相源及检测器出口相连接，

三通接头与检测器的连接管路上设置有切换阀B，检测器通过切换阀B与收集瓶或废液瓶相连。

所述切换阀A为六通阀或十通阀，它分别与体积排阻色谱柱A、体积排阻色谱柱B和检测器相连。

所述进样阀由定量环与六通阀或十通阀组成，进样阀通过六通阀或十通阀串连于体积排阻色谱柱A与泵的连接管路中；所述检测器为紫外检测器、质谱或其他类型检测器。

泵、进样阀、体积排阻柱A、切换阀A、体积排阻色谱柱B、检测器、切换阀B和三通或四通连接头通过管路依次相连，通过控制切换阀A可以控制进入循环分离***的生物大分子的数量，控制阀B的切换可以控制生物大分子组分的分离与收集。

具体分析过程如下：在循环分离前，通过阀A使两根体积排阻色谱柱串联在一起。生物大分子样品首先通过体积排阻色谱柱A分离，然后捕集在体积排阻色谱柱B中，当一小部分生物大分子从体积排阻色谱柱B中被洗脱下来时，切换阀A和阀B，此时泵、体积排阻色谱柱A、检测器通过一个三通或四通连接接头形成一个闭合环路中，此时生物大分子样品可以不断地在该***中分离直至达到满意的分离结果，而其它的样品则被保留在第二根色谱柱中。第一部分生物大分子完成分离后，生物大分子组分被切出***收集下来。另一小部分生物大分子从第二根色谱柱中切出，进行循环分离，依次类推。

生物大分子经体积排阻色谱柱A、体积排阻色谱柱B依次分离后，通过控制切换阀，相似分子量大小的样品依次从体积排阻色谱柱B上切入循环***中，并以体积排阻色谱柱A为分离柱进行循环分离，直至达到满意的分离度。

以体积排阻色谱柱A为分离柱，生物大分子样品以循环分离的方式进行分离。体积排阻色谱柱A的柱体积要小于体积排阻色谱柱B。生物大分子以峰切割的方式从体积排阻色谱柱B中进入循环***。体积排阻色谱柱B具有分离和捕集的双重作用。

本发明所述生物大分子可以为蛋白质或核酸；本发明可以用于生物大分子的分离与纯化，同时可以作为构建连续生物大分子多维分离平台的重要部件。该***与传统的体积排阻色谱方法相比具有分离能力强，分辨率高等特点，可用于生物大分子样品的分离纯化。同时，该***在构建连续生物大分子多维分离平台中也具有很好的实用价值。

本发明的有益效果是：

1.该***采用循环分离的方式，不需要增加柱长或减小粒径，就可以极大提高分辨率，改善分离效果。

2.由于采用体积排阻色谱分离模式，以低盐缓冲溶液为洗脱剂，因此，蛋白在分离纯化后仍然能保持活性。

3.该***采用两根体积排阻色谱柱，其中体积排阻色谱柱A为分离柱，体积排阻色谱柱B为样品捕集柱。蛋白样品通过体积排阻色谱柱A分离后，捕集在体积排阻色谱柱B中，通过从体积排阻色谱柱B切割出小部分的蛋白进入循环***，可以实现对分子量范围很宽的蛋白质的分离纯化。

4.在构建多维生物大分子分离平台时，采用该***作为生物大分子分离的第一维可以保证两维分离的连续性。

5.该***设计简单，分辨率高，分离效果好，实用性强，具有很好的推广价值。

附图说明

图1、柱切换循环体积排阻色谱装置图，(1)、三通接头；(2)、泵；(3)、进样阀；(4)、体积排阻色谱柱A；(5)、切换阀A；(6)、体积排阻色谱柱B；(7)、检测器、(8)、切换阀B，(9)、收集器或废液瓶，(10)、流动相C，(11)、进样针或进样器，(12)、废液瓶A。

图2、串联体积排阻色谱(a)和柱切换循环体积排阻色谱(b，c，d)分离五种标准蛋白。分离条件：色谱柱：SEC SRT-150

和SEC nanofilm-250

流动相C：10mM Tris-HCl+150mM NaCl+5％ACN，流量：150μL/min；检测：215nm.

图3、柱切换体积排阻色谱-反相色谱分离平台装置图，(1)、三通接头；(2)、泵；(3)、进样阀；(4)、体积排阻色谱柱A；(5)、切换阀A；(6)、体积排阻色谱柱B；(7)、检测器A；(8)、切换阀B；(9)、切换阀C；(10)、流动相C；(11)、进样针或进样器；(12)；废液瓶A；(13)、C8捕集柱A；(14)C8捕集柱B；(15)反相色谱柱；(16)、检测器B，(17)、泵B，(18)、流动相D，(19)、废液瓶B，(20)、废液瓶C，(21)、泵C，(22)、泵D。

图4、七种标准蛋白的二维分离图。(a)图为第一维柱切割循环体积排阻色谱分离图。(b)图为第二维反相色谱分离图。第一维分离条件：色谱柱：SEC SRT-150和SEC nanofilm-250

，流动相C：10mM Tris-HCl+150mMNaCl+5％ACN，流动相D：50mM Tris-HCl+2％ACN，流量：150μL/min；检测：215nm.第二维分离条件：流动相：A：2％ACN+0.1％TFA，B：98％ACN+0.1％TFA；梯度：0-1min，0％B，1-3min，0％-20％B，3-14min，20％-80％B，14-15min，80％B，15-15.01min，80％-0％B，15.01-20min，0％B；流量：2mL/min；检测：225nm

具体实施方式

实施例1

如图1所示，一种用于生物大分子分离纯化的柱切换循环体积排阻色谱***，该装置由三通接头1，泵2，进样阀3，体积排阻色谱柱A4，切换阀A5，体积排阻色谱柱B6，检测器7，切换阀B8组成，它们通过管道以闭合环路的形式相连。

体积排阻色谱柱A4一端与进样阀3相连、另一端通过一切换阀A5分别与体积排阻色谱柱B6、检测器7相连；进样阀3的外端进料口通过泵2经三通接头1分别与外界的流动相源及检测器7出口相连接；三通接头1与检测器7的连接管路上设置有切换阀B8，检测器7通过切换阀B8与收集瓶或废液瓶相连。

所述切换阀A5为十通阀，以与体积排阻色谱柱A4连接的接口为①，按顺时针其余接口依次为②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩，接口①与体积排阻色谱柱A4相连、接口②和⑤分别与体积排阻色谱柱B6的两端相连、接口⑥与检测器7相连、接口⑦和⑩间相连通。

所述切换阀B8为十通阀，以与检测器7连接的接口为①，按顺时针其余接口依次为②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩，接口①与检测器7相连、接口②与收集瓶或废液瓶相连、接口⑩与三通接头1的一个接口相连；

所述进样阀3由定量环与十通阀组成，以与体积排阻色谱柱A4连接的接口为①，按顺时针其余接口依次为②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩，接口①与体积排阻色谱柱A4的一端相连、接口②和⑨分别与定量环的两端相连、接口⑩与泵2相连、接口③为进样口、接口⑧外接废液瓶；进样阀通过十通阀串连于体积排阻色谱柱A4与泵2的连接管路中。

由泵2输送流动相C10将注入于定量环中的蛋白样品冲入体积排阻色谱柱A4中，此时切换阀A5切换，使体积排阻色谱柱A4和体积排阻色谱柱B6相连。样品通过串联体积排阻色谱柱得到分离。当样品被洗脱到体积排阻色谱柱B6的柱尾时，控制切换阀A8的切割时间，将一小部分样品切入循环体系中。此时体积排阻色谱柱A4与紫外检测器7相连，切换阀B8处于使紫外检测器7与三通接头1相连的位置。被切入的样品，根据复杂程度在循环体系中进行多次循环体积排阻色谱分离。当达到最佳分离度，切换阀B8切换，被分开的样品得到收集。图2(a)为体积排阻色谱柱A4和体积排阻色谱柱B6串联分离五种标准蛋白混合物；图2(b)，(c)，(d)为使用柱切换循环体积排阻色谱***对五种标准蛋白进行分离检测后得到的色谱图。

实施例2

如图3所示，该装置由三通接头1，泵2，进样阀3，体积排阻色谱柱A4，切换阀A5，体积排阻色谱柱B6，紫外检测器7，阀B8，泵B17，泵C21，泵D22，切换阀C9，C8捕集柱A13，C8捕集柱B14，反相色谱柱15，紫外检测器B16组成。

与实施例1不同之处

所述切换阀B8为十通阀，以与检测器7连接的接口为①，按顺时针其余接口依次为②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩，接口①与检测器7相连、接口⑩与三通接头1的一个接口相连、接口③通过泵B17与外界流动相D18相连，接口②与一切换阀C9相连；

切换阀C9为十通阀，以与切换阀B8连接的接口为①，按顺时针其余接口依次为②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩，接口②和⑤与C8捕集柱A13的两端相连，接口③与⑧相连通，接口④与并联泵C21和泵D22通过管路连接，接口⑥外接废液瓶，接口⑦和⑩与C8捕集柱B14的两端相连，接口⑨外依次连接有反相色谱柱15和紫外检测器B16，紫外检测器B16外接有废液瓶。

由泵2输送流动相C将注入于定量环中的蛋白样品冲入体积排阻色谱柱A4中，此时切换阀A5切换，使体积排阻色谱柱A4和体积排阻色谱柱B6相连。样品通过串联体积排阻色谱柱得到分离。当样品被洗脱到体积排阻色谱柱B6的柱尾时，控制切换阀A8的切割时间，将一小部分样品切入循环体系中。此时体积排阻色谱柱A4与紫外检测器7相连，控制切换阀B8的切换时间，使一部分蛋白(馏分1)进入第二维反相色谱分离***中，另一部分进入循环体系中进行循环体积排阻色谱分离。馏分通过泵B17输送流动相D进入C8捕集柱A13中，由泵C21、泵D22输送反相流动相进行反相洗脱。在循环***中的样品经过一段时间的分离，一部分蛋白样品(馏分2)也被切出循环***通过泵B输送流动相D进入C8捕集柱B14中，当馏分1完成反相色谱分离后，切换阀C12切换，泵C21、泵D22输送反相流动相将C8捕集柱B14中的蛋白样品(馏分2)送入反相色谱柱15中进行反相色谱分离。依次类推。图4为柱切换循环体积排阻色谱-反相色谱分离平台对七种标准蛋白的色谱分离图，其中图4(a)为第一维柱切换循环体积排阻色谱的分离色谱图，Fraction1，Fraction2，.......Fraction13均为切割的蛋白馏分。图4(b)为第二维反相色谱分离图。

Claims (5)

1、一种用于生物大分子分离纯化的柱切换循环体积排阻色谱***，其特征在于：包括液相色谱泵、切换阀、体积排阻色谱柱A、体积排阻色谱柱B、检测器，它们通过管道以闭合环路的形式相连；

体积排阻色谱柱A(4)一端与进样阀(3)相连、另一端通过一切换阀A(5)分别与体积排阻色谱柱B(6)、检测器(7)相连，

进样阀(3)的外端通过泵(2)经三通接头(1)或四通接头分别与外界的流动相源及检测器(7)出口相连接，

三通接头(1)或四通接头与检测器(7)的连接管路上设置有切换阀B(8)，检测器(7)通过切换阀B(8)与收集瓶或废液瓶相连。

2、按照权利要求1所述***，其特征在于：所述切换阀A(5)为六通阀或十通阀，它分别与体积排阻色谱柱A(4)、体积排阻色谱柱B(6)和检测器(7)相连。

3、按照权利要求1所述***，其特征在于：所述进样阀(3)由定量环与六通阀或十通阀组成，进样阀通过六通阀或十通阀串连于体积排阻色谱柱A(4)与泵(2)的连接管路中。

4、按照权利要求1所述***，其特征在于：所述检测器(7)为紫外检测器、示差折光检测器、质谱检测器或其他类型检测器。

5、按照权利要求1所述***，其特征在于：所述切换阀B(8)为六通阀或十通阀，它分别与三通接头(1)、检测器(7)相连，在其中的一个接口通过泵B(17)与流动相D18相连，一个接口与一个切换阀C(9)相连；

切换阀C(9)为十通阀，以与切换阀B(8)连接的接口为①，按顺时针其余接口依次为②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩，接口②和⑤与C(8)捕集柱A(13)的两端相连，接口③与⑧相连通，接口④与并联泵C(21)和泵D(22)通过管路连接，接口⑥外接废液瓶，接口⑦和⑩与C8捕集柱B(14)的两端相连，接口⑨外依次连接有反相色谱柱(15)和检测器B(16)，检测器B(16)外接废液瓶。

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