CN112698043A - 一种血小板抗体检测试剂盒、应用及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及输血检验技术领域，尤其是涉及一种血小板抗体检测试剂盒、应用及检测方法，所述血小板抗体检测试剂盒包括含有U型孔的微孔板和抗人IgG偶联肉眼可辨颜色的微球或微粒制剂。采用肉眼可辨颜色的微球代替红细胞，在复合稳定剂的作用下，能够大大地延长保存时间，实现了与检测产品中其他组分同步购买、储藏和使用，使血小板抗体检测试剂盒成为一个完整的试剂盒，其稳定保存周期可达一年以上，为抗血小板抗体检测产品的生产和运输过程都提供了极大的方便。
Description
技术领域
本发明涉及输血检验技术领域，尤其是涉及一种血小板抗体检测试剂盒、应用及检测方法。
背景技术
血小板输注可用于预防和治疗血小板数量减少或功能缺失患者的出血症状，恢复和维持人体的正常止血和凝血功能。然而，长期的血小板输注可能带来血小板输注无效的严重后果，即连续两次输注足量血小板，患者临床出血症状未见改善，血小板计数未见明显增高。血小板抗原经输血、妊娠及骨髓移植等可刺激机体产生抗血小板抗体致敏血小板并使其破坏，引起血小板减少，导致患者出现瘀点、瘀斑、出血甚至死亡等严重后果。HLA致敏是最常见的血小板输注无效的免疫因素。因此，检测患者是否有抗血小板抗体，可辅助临床采取恰当的预防和治疗措施，特别是能为抗血小板抗体阳性患者进行交叉配型，以筛选血小板相容性供者，可显著减少血小板输注无效症的发生。
抗血小板抗体检测试剂盒为各大医院、血站输血科提供了一个简易、快捷的方法来检测患者血清中是否有抗血小板抗体，可辅助临床采取恰当的预防和治疗措施，特别是能为抗血小板抗体阳性患者进行交叉配型以筛选血小板相容性供者，从而预防血小板输注无效。目前国内外抗血小板抗体检测注要有免疫细胞化学法、微柱凝胶法及固相凝集法三种。免疫细胞化学法由于需要专用仪器、繁琐、耗时，不适于基层开展，微柱凝胶法容易造成结果误差，而固相凝集法因灵敏度，特异性高而前景较好。
检测抗血小板抗体现在商品化的试剂有ELISA类如GTI公司的MACE(筛查并区分HLA+HPA)，PAKAUTO(检测自身抗体)，PAK12(鉴定HPA特异性)；固相红细胞吸附类试剂如Immucor公司的captureP(筛查血小板抗体)，荷兰Sanquin试剂MASPAT(筛查抗体)；免疫荧光技术如Onelambda公司的流式磁珠试剂FlowPRA(可鉴定HLA抗体特异性)。
CaptureP检测原理：CaptureP是一种固相微孔板***，通过血小板与其抗体之间的免疫反应来检测血清或血浆中的抗血小板抗体。微孔板上预先包被有抗血小板单克隆抗体，加入血小板悬液后，通过离心将血小板固定在微孔上，再将低离子强度的缓冲液和患者血清加入到孔内，让血清中的抗体与固定的血小板层充分结合，孵育后洗去未结合的血清，再加入鼠抗人IgG单克隆抗体致敏的红细胞来检测与血小板结合的抗体。当患者血清中抗血小板抗体为阳性时，指示红细胞结合到血小板单层上的IgG抗体上，则显示阳性反应。因此，阳性反应的特点是指示红细胞平铺在反应孔底部表面，而阴性反应是指示红细胞聚集在孔底部中央形成细胞扣。
MASPAT检测原理：抗血小板抗体检测试剂盒(固相凝集法)的检测原理是基于抗原/抗体反应的固相凝集技术。供者血小板通过离心固定在包被有血小板特异性鼠单克隆抗体的微孔内表面，加入1×PBST清洗液洗去未结合的血小板形成血小板单细胞层。将患者血清和LISS(低离子强度溶液)加入相应的微孔中孵育，使患者血清中的抗体与固定的血小板单细胞层结合。孵育结束后，再加入清洗液洗去未结合或非特异性结合的抗体。加入抗人IgG(桥接抗体)和人IgG致敏红细胞后，通过离心微孔板的方法检测样本中与血小板结合的抗体。通过抗血小板抗体检测用指示红细胞(固相凝集法)在微孔中的状态可直接肉眼观察得出抗血小板抗体检测的结果。阳性反应的特点是指示红细胞平铺在反应孔底部表面，而阴性反应是指示红细胞聚集在孔底部中央。
以上固相红细胞吸附类方法均需要抗体致敏的红细胞作为检测***的指示信号。其优点是利用了红细胞肉眼可辨的颜色，信号显示简单、直观；同时作为早期建立起来的免疫分析方法的一个重要组成，这样的信号***简便易得。但其缺陷也同样明显：①首先是效期短，不同于目前常见的信号分子或微粒，红细胞本身是生命单元，保存条件要求高(既不能低温冻存也不能常温保存)，且不能长时间保存，因此以指示红细胞作为检测信号的免疫分析产品如前述的CaptureP和MASPAT产品，指示红细胞只能作为独立的组分保存，效期(仅2个月)显著短于检测试剂盒的其他组分(其他组分的效期通常至少为1年)，这就给实际使用甚至是生产、运输过程造成极大的不便；②其次，红细胞本身不能与检测***中的抗血小板抗体(样本中的目标IgG)结合，因此还需要额外的抗体分子进行桥接——即多效价的抗人IgG(IgM)，增加了检测***的复杂性；③最后，红细胞是生物源材料，在大规模生产时，需要解决稳定的来源及保证来源的生物安全性，这无疑增加了生产的风险和成本。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种血小板抗体检测试剂盒，用来代替现有检测试剂盒，以缓解了现有技术中存在的效期短、反应体系复杂和存在安全风险的技术问题。
本发明的另一目的在于，提供采用上述血小板抗体检测试剂盒进行血小板检测的方法。
为了解决上述技术问题，实现上述目的，本发明特提出以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种血小板抗体检测试剂盒，所述血小板抗体检测试剂盒包括含有U型孔的微孔板和抗人IgG偶联肉眼可辨颜色的微球或微粒制剂。
在可选的实施方式中，所述抗人IgG偶联微球制剂包括均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒和复合稳定剂。
在可选的实施方式中，所述均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒的制备方法包括，肉眼可辨颜色的微球或微粒表面羧酸基团活化处理后与单克隆抗人IgG抗体的Fc段偶联，而后封闭肉眼可辨颜色的微球或微粒表面多余活化羧酸基团位点，再经过至少两步离心得到包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒。
所述肉眼可辨颜色的微球或微粒与单克隆抗人IgG抗体偶联后，至少经过两次离心的目的在于，保证包被了单克隆抗人IgG抗体的微球或微粒与游离的单克隆抗人IgG抗体能够充分分离。
所述肉眼可辨颜色包括能够将微球或微粒与反应体系或反应容器区分的各种颜色，包括但不限于红色、黑色、蓝色、黄色等，甚至可以为荧光微球或微粒。
优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒与单克隆抗人IgG抗体的用量比为1～10：1，包括但不限于1：1、1.5：1、2：1、2.5：1、3：1、3.5：1、4：1、4.5：1、5：1、5.5：1、6：1、6.5：1、7：1、7.5：1、8：1、8.5：1、9：1、9.5：1或10：1，进一步优选为5.2：1。
在可选的实施方式中，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒表面羧酸基团活化处理的方法包括，向肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液中依次加入脂肪酸甲酯磺酸盐、N-羟基丁二酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液，反应结束后离心得到表面羧酸基团活化后的肉眼可辨颜色的微球或微粒。
在可选的实施方式中，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液中含有的肉眼可辨颜色的微球或微粒的质量体积比为(1～5)g：100ml，所述N-羟基丁二酰亚胺溶液浓度为30～80g/L，所述碳二亚胺溶液浓度为30～80g/L，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液、脂肪酸甲酯磺酸盐、N-羟基丁二酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液的体积比为1：(15～30)：(1～5)：(0.1～0.5)。
所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液中含有的肉眼可辨颜色的微球或微粒的质量体积比包括但不限于1g：100ml、1.5g：100ml、2g：100ml、2.5g：100ml、3g：100ml、3.5g：100ml、4g：100ml、4.5g：100ml或5g：100ml。
所述N-羟基丁二酰亚胺溶液浓度包括但不限于30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L或80g/L。
所述碳二亚胺溶液浓度包括但不限于30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、55g/L、60g/L、65g/L、70g/L、75g/L或80g/L。
所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液、脂肪酸甲酯磺酸盐、N-羟基丁二酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液的体积比包括但不限于1：15：1：0.1、1：19：2：0.2、1：23：3：0.3、1：27：4：0.4或1：30：5：0.5。
优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液中含有的肉眼可辨颜色的微球或微粒的质量体积比为2.67g：100ml，所述N-羟基丁二酰亚胺溶液浓度为50g/L，所述碳二亚胺溶液浓度为50g/L，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液、脂肪酸甲酯磺酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和碳二亚胺的体积比为1:21:2:0.1。
在可选的实施方式中，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒的制备材料包括聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或氧化硅中的至少一种。
优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒的粒径为10nm～10μm，包括但不限于10nm、50nm、70nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、3μm、5μm、7μm、9μm或10μm，优选为6μm。
优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒的密度为1～1.2g/cm3，包括但不限于1g/cm3、1.05g/cm3、1.1g/cm3、1.15g/cm3或1.2g/cm3，优选为1.05g/cm3；
优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒为粒径为6μm、密度为1.05g/cm3的聚苯乙烯红色微球。
在可选的实施方式中，所述复合稳定剂包括非离子型去污剂或表面活性剂、惰性蛋白、渗透性保护剂或防腐剂中的至少一种。
优选地，所述非离子型去污剂或表面活性剂包括多元醇类表面活性剂。
优选地，所述非离子型去污剂或表面活性剂在检测信号制剂中的质量体积比为(0.1～0.5)g：100ml，包括但不限于0.1g：100ml、0.2g：100ml、0.3g：100ml、0.4g：100ml或0.5g：100ml，优选为0.1g：100ml。
优选地，所述非离子型去污剂或表面活性剂为Tween20，非离子表面活性剂Tween20能够降低均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒的非特异性吸附。
优选地，所述惰性蛋白在检测信号制剂的质量体积比为(0.1～0.5)g：100ml，包括但不限于0.1g：100ml、0.2g：100ml、0.3g：100ml、0.4g：100ml或0.5g：100ml，优选为0.1g：100ml。
优选地，所述惰性蛋白包括牛血清蛋白或酪蛋白，进一步优选为牛血清蛋白，与其他惰性蛋白相比，牛血清蛋白能够显著降低均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒的非特异性吸附，尤其是，当牛血清蛋白在检测信号制剂的质量体积比为0.1g：100ml时，能够避免假阳性结果的出现。
优选地，所述渗透性保护剂包括氨基酸、四分子胺化合物、多羟基化合物或多糖化合物中的至少一种。
优选地，所述渗透性保护剂在检测信号制剂的质量体积比为(0.5～5)g：100ml，包括但不限于0.5g：100ml、1g：100ml、1.5g：100ml、2g：100ml、2.5g：100ml、3g：100ml、3.5g：100ml、4g：100ml、4.5g：100ml或5g：100ml，优选为1g：100ml。
优选地，所述渗透性保护剂为蔗糖。
优选地，所述防腐剂在检测信号制剂的质量体积比为(0.02～0.1)g：100ml，包括但不限于0.02g：100ml、0.03g：100ml、0.04g：100ml、0.05g：100ml、0.06g：100ml、0.07g：100ml、0.08g：100ml、0.09g：100ml或0.1g：100ml，优选为0.03g：100ml。
优选地，所述防腐剂为ProClin300。
在可选的实施方式中，所述均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒在检测信号制剂中的质量体积比为0.05～0.4g：100ml，包括但不限于0.05g：100ml、0.1g：100ml、0.15g：100ml、0.2g：100ml、0.25g：100ml、0.3g：100ml、0.35g：100ml或0.4g：100ml，优选为0.125g：100ml。
在可选的实施方式中，所述血小板抗体检测试剂盒还包括低离子强度盐溶液、血小板抗体阳性质控、血小板抗体阴性质控、清洗液或封口膜中的至少一种。
低离子强度盐溶液能够降低反应介质的离子强度，使得均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒的表面Zeta电位降低，从而增强单克隆抗人IgG抗体与抗体正电荷间的亲和力，缩短检测所需的孵育时间。
优选地，所述低离子强度盐溶液pH为6.2～6.8，电导率为3.4～4.8mS/cm。
优选地，所述清洗液包括10倍浓度的PBST溶液，在使用过程中PBST溶液的浓度根据实际需求进行相应倍数的稀释。
第二方面，本发明提供了上述血小板抗体检测试剂盒在血小板抗体检测或血液交叉配型中的应用。
第三方面，本发明提供采用前述实施方式任一项所述血小板抗体检测试剂盒进行血小板抗体检测的方法，向血液受体的血清与血液供体的血小板形成的免疫复合物中加入抗人IgG偶联肉眼可辨颜色的微球或微粒制剂，而后通过肉眼观察微球或微粒制剂在含有U型孔的微孔板中的铺展情况判断血液受体的血清中是否含有血液供体的血小板的抗体。
本发明提供的血小板抗体检测试剂盒，含有U型孔的微孔板和抗人IgG偶联肉眼可辨颜色的微球或微粒制剂，采用肉眼可辨颜色的微球代替红细胞，在复合稳定剂的作用下，能够大大地延长保存时间，实现了与检测产品中其他组分同步购买、储藏和使用，使血小板抗体检测试剂盒成为一个完整的试剂盒，其稳定保存周期可达一年以上，为抗血小板抗体检测产品的生产和运输过程都提供了极大的方便。同时本发明提供的肉眼可辨颜色的微球或微粒可以直接用单克隆抗人IgG抗体对其进行均匀包被，与指示红细胞检测体系构建相比，简化了免疫复合物的组成，通过观察微球或微粒制剂在U型孔的聚集和铺展情况即可完成检测结果的判断，简化了检测步骤。此外，本发明提供的肉眼可辨的微球或微粒非生物源材料，不存在生物安全风险，便于大规模生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明试剂盒检测原理与现有MASPAT试剂盒检测原理对比图；
图2为本发明实施例2血小板抗体检测试剂盒与MASPAT试剂盒对比结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
在一个具体实施方式中，本发明提供了一种血小板抗体检测试剂盒，包括含有U型孔的微孔板、低离子强度盐溶液(LISS)、血小板抗体阳性质控、血小板抗体阴性质控、10×PBST清洗液、抗人IgG偶联微球制剂和封口膜，主要组分如表1所示。
表1本发明实施例1中提供的血小板抗体检测试剂盒的主要组分
表中低离子强度盐溶液(10mL×1)的组分包括但不限于甘氨酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或溴甲酚紫中的至少一种，优选地，所述低离子强度盐溶液的组分包括质量体积百分比(g/ml)为1.8％的甘氨酸、10～15mM的磷酸二氢钾、10～15mM的磷酸氢二钠和质量体积百分比(g/ml)为0.002％的溴甲酚紫，进一步优选地，所述低离子强度盐溶液pH为6.2～6.8，电导率为3.4～4.8mS/cm。
表中所述含有U型孔的微孔板包括但不限于常规的96孔板(8孔×12条)，所有的U型孔均包被有血小板特异性单克隆抗体，血小板特异性单克隆抗体可外购也可自行制备，每孔包含血小板特异性抗体250ng，微孔板密封在装有干燥剂的真空塑料袋中。
表中所述阴性质控不含血小板特异性抗体，优选为AB型健康个体血清。
表中所述抗人IgG偶联肉眼可辨颜色的微球或微粒制剂的组成按照质量体积百分比计(g/ml)，优选为0.125％的粒径为6μm、密度为1.05g/cm3的抗人IgG偶联肉眼可辨颜色的微球、0.1％的Tween-20、0.1％的BSA和1％的蔗糖。
本实施方式提供的血小板抗体检测试剂盒的检测原理为：血液供体的血小板通过离心固定在包被有血小板单克隆抗体的微孔内表面，加入PBST清洗液洗去未结合的血小板形成血小板单细胞层。将受体血清和LISS加入相应的微孔中孵育，使受体血清中的抗体与固定的血小板单细胞层结合。孵育结束后，再加入清洗液洗去未结合或非特异性结合的抗体。加入抗人IgG偶联肉眼可辨颜色的微球或微粒制剂后，通过离心微孔板的方法检测血小板结合抗体。通过微球或微粒在微孔中的状态可直接肉眼观察得出血小板抗体检测的结果，阳性反应的特点是红色微球平铺在反应孔底部表面，而阴性反应是红色微球聚集在孔底部中央。反应原理如图1所示，其中A为前述MASPAT试剂盒检测原理图，B为本发明血小板抗体检测试剂盒检测原理图，A中红色椭圆为红细胞，B中红色椭圆为抗人IgG偶联微球，A和B中绿色Y状为抗人IgG，黄色椭圆为血小板，与血小板相连的深棕色Y状为样本中血小板抗体，与血小板相连的浅灰色Y状为微孔板上血小板单克隆抗体，可以看出，本发明提供的抗人IgG偶联肉眼可辨颜色的微球或微粒制剂的反应原理与现有MASPAT试剂盒相比，省略了A中与红细胞相连的浅红色连接分子。
上述实施方式提供的血小板抗体检测试剂盒能够用于血小板抗体检测，具体步骤如下：
(1)制备血小板悬液：
按照以下任一方法制备血小板悬液，方法1：将商品化的冻干血小板稀释后直接使用；方法2：三人份机采血小板等比例混合后用生理盐水进行5倍稀释后使用；方法3：取三人份采血当天8h内EDTA或枸橼酸钠抗凝全血经200g离心5min，取上层富血小板血浆(PRP)等比例混合后使用。
(2)按需从小袋中取出含有U型孔的微孔板，未用的微孔板可保存在装有干燥剂的小袋中。
(3)按10×PBST清洗液与纯水的体积比为1:9的比例稀释10×PBST清洗液为1×PBST清洗液。
(4)用移液器在微孔板的每个孔中加入1滴(50μL)步骤(1)中制得的血小板悬液，其中包括样本孔，阳性质控孔和阴性质控孔。
(5)在50g条件下离心5min，使血小板悬液中的血小板固定到微孔板表面。
(6)用150μL的1×PBST清洗液手工洗板三次，去除未结合的血小板，每次清洗后，慢慢倾倒并将板轻扣到吸水纸上以去掉残留的1×PBST清洗液。
(7)每个孔中加入2滴(100μL)低离子强度盐溶液LISS，低离子强度盐溶液LISS液是紫色的。
(8)在阳性质控孔和阴性质控孔中各加入1滴(50μL)阳性质控和阴性质控。在其它的孔中加入1滴(50μL)待检样本。观察孔内是否变为蓝色，若未变色，则提示质控或样本可能漏加。
(9)将步骤(8)加完样品的微孔板密封后，在37℃孵育30分钟。
(10)按步骤(6)的方法，用150μL的1×PBST清洗液手工洗板5次。
(11)向每孔加入1滴(50μL)抗人IgG偶联肉眼可辨颜色的微球制剂。
(12)将步骤(11)所得微孔板在200g条件下离心5min。
(13)目视判读结果。
上述实施方式提供的血小板抗体检测试剂盒能够用于血液交叉配型，具体步骤如下：
(1)制备供体血小板悬液：
按照以下任一方法制备供体血小板悬液，方法1：效期内的机采血小板用生理盐水进行5倍稀释后使用；方法2：采血当天8h内EDTA或枸橼酸钠抗凝全血经200g离心5min，取上层富血小板血浆(PRP)使用。
(2)按需从小袋中取出微孔板，未用的微孔板条可保存在装有干燥剂的小袋中。
(3)按10×PBST清洗液与纯水的体积比为1:9的比例稀释10×PBST清洗液为1×PBST清洗液。
(4)用移液器在微孔板的每个孔中加入1滴(50μL)步骤(1)中制得的血小板悬液，其中包括样本孔，阳性质控孔和阴性质控孔。
(5)在50g条件下离心5min，使血小板悬液中的血小板固定到微孔板表面。
(6)用150μL的1×PBST清洗液手工洗板三次，去除未结合的血小板，每次清洗后，慢慢倾倒并将板轻扣到吸水纸上以去掉残留的1×PBST清洗液。
(7)每个孔中加入2滴(100μL)低离子强度盐溶液LISS，低离子强度盐溶液LISS液是紫色的。
(8)在阳性质控孔和阴性质控孔中各加入1滴(50μL)阳性质控和阴性质控。在其它的孔中加入1滴(50μL)待检样本。观察孔内是否变为蓝色，若未变色，则提示质控或样本可能漏加。
(9)将步骤(8)加完样品的微孔板密封后，在37℃孵育30分钟。
(10)按步骤(6)的方法，用150μL的1×PBST清洗液手工洗板5次。
(11)向每孔加入1滴(50μL)抗人IgG偶联肉眼可辨颜色的微球制剂。
(12)将步骤(11)所得微孔板在200g条件下离心5min。
(13)目视判读结果。
按以下方法对上述检测结果进行解释：
(1)质控孔检测结果判读：
阴性质控孔：聚苯乙烯红色微球在微孔板底部形成纽扣状。
阳性质控孔：聚苯乙烯红色微球平铺在微孔底部。
(2)样本判读：
阴性反应：聚苯乙烯红色微球在微孔板底部形成纽扣状，表明血清中不存在针对包被血小板的抗体。
阳性反应：聚苯乙烯红色微球铺在微孔底部；
弱阳性反应：聚苯乙烯红色微球结合到部分孔底，且结合区域比阴性对照大。
阳性反应及弱阳性反应均判为阳性，表明血清中存在针对包被血小板的抗体，或交叉配型不合。
本试剂盒用于进行血小板抗体检测及血小板输注前交叉配型，仅限于体外诊断，不用于血源筛查。
本发明血小板抗体检测试剂盒的性能指标主要包括：
(1)阳性符合率
对至少20份阳性样本进行检测，结果应均为阳性。
(2)阴性符合率
对至少20份阴性样本进行检测，结果应均为阴性。
(3)重复性
用同一批次试剂盒，对同一阳性样本连续检测10次，结果应均为阳性；对同一阴性样本连续检测10次，结果应均为阴性。
(4)稳定性
将试剂盒按照产品剩余效期在37℃放置一定天数后，如本发明提供的试剂盒4℃下保存有效期为12个月，在37℃下放置7天后，检测其外观、阳性符合率、阴性符合率和重复性，结果均应符合相应要求。
下面结合附图，对本发明的一些实施方式作详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1
本实施例提供了一种血小板抗体检测试剂盒包括如下组分：
A、低离子强度盐溶液(10mL×1)的组成包括1.8％(g/ml)的甘氨酸、12.5mM磷酸二氢钾、12.5mM磷酸氢二钠、0.002％(g/ml)溴甲酚紫、pH为6.5，电导率为4.2mS/cm。
B、含U型孔的微孔板(96孔，8孔×12条，可拆卸)：所有的U型孔均包被有血小板特异性单克隆抗体，每孔包含血小板特异性抗体250ng。微孔板密封在装有干燥剂的真空塑料袋中。
C、阳性质控(1mL×1)：在阴性质控的基础上含血小板特异性抗体。
D、阴性质控(1mL×1)：不含血小板特异性抗体，为AB型健康个体血清。
E、抗人IgG偶联肉眼可辨颜色的微球或微粒制剂，按照质量百分比计，包括0.125％的粒径为6μm、密度为1.05g/cm3的聚苯乙烯红色微球、0.1％的Tween-20、0.1％的BSA和1％的蔗糖。
聚苯乙烯红色微球与抗人IgG的偶联过程为：本实施例选择粒径为6μm、密度为1.05g/cm3的聚苯乙烯红色微球，往40μL质量体积百分比(g/ml)为2.67％的聚苯乙烯红色微球悬液中依次加入860μL MES pH 6.0、80μL 50mg/mL NHS和4μL 50mg/mL EDC，混匀后于室温条件下静置15分钟，得到组分C，该步骤可以使微球表面的羧酸基基团活化带上NHS酯。组分C在10000g、4℃条件下，离心5min后，弃上清，得到组分D。将组分D用1mL PBS重悬，水浴超声3min得到组分E。往组分E中加入60μL单克隆抗人IgG抗体，混匀，室温轻柔震荡4h后获得组分F，该步骤为偶联步骤。往组分F中加入10μL质量体积百分比(g/ml)为10％的BSA后室温下轻柔震荡过夜后获得组分G，该步骤封闭微球上多余的位点。组分G在10000g、4℃条件下离心5min后，弃上清，加入1mL洗液(PBS、0.1％BSA)洗涤后，再于10000g、4℃条件下离心5min，弃上清，得到组分H，组分H即为均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的聚苯乙烯红色微球。
F、10×PBST清洗液：包括但不限于100mM磷酸氢二钠、20mM磷酸二氢钾、1370mM氯化钠和质量体积百分比(g/ml)为0.5％的Tween-20。
具体地，低离子强度盐溶液(LISS)、血小板抗体阳性质控、血小板抗体阴性质控和抗人IgG偶连微球制剂均为透明玻璃滴管瓶包装，且低离子强度盐溶液为紫色，抗人IgG偶连微球制剂为红色，阳性质控胶头为红色，阴性质控胶头为黑色，各个组分凭肉眼即可快速区分，10×PBST清洗液为合适尺寸的透明塑料瓶包装，便于查看剩余量。
本发明血小板抗体检测试剂盒于2～8℃储存，自检定合格之日起12个月内使用。试剂盒开封后于2～8℃储存，6个月内使用。
实施例2～6
本实施例提供了一种血小板抗体检测试剂盒，组分与实施例1相同，区别仅在于聚苯乙烯红色微球的质量体积百分比(g/ml)分别为0.05％、0.1％、0.2％、0.3％和0.4％。
实验例1
本实验例将上述实施例1提供的血小板抗体检测试剂盒与现有市售的MASPAT kit试剂盒进行血小板抗体检测的对比，具体方法包括：
两者使用相同的血小板悬液检测相同的临床样本，共检测500例临床血液样本，以市售的MASPAT kit试剂盒检测结果为参考标准计算实施例1提供的血小板抗体检测试剂盒的阳性符合率和阴性符合率。
具体实施步骤如下(本试剂盒与MASPAT试剂盒相同的步骤不做特殊说明，仅不同的部分有所说明，除血小板悬液和样本一致外，分别采用各自试剂盒里的组分操作)。
(1)制备血小板悬液：取三个不同O型个体的富血小板血浆(枸橼酸钠抗凝全血经200g/10min离心获得)按等体积混合作为检测的血小板悬液。
(2)按需从小袋中取出微孔板条。
(3)按10×PBST洗液与纯水的体积比为1:9的比例稀释10×PBST洗液为1×PBST洗液。
(4)用移液器在每个孔中(样本孔，阳性质控孔，阴性质控孔)加入1滴(50μL)步骤(1)中的血小板悬液。
(5)在50g条件下离心5min，使血小板固定到微孔板表面。
(6)用150μL的1×PBST洗液手工洗板三次，去除未结合的血小板，每次清洗后，慢慢倾倒并将板轻扣到吸水纸上以去掉残留的1×PBST。
(7)每个孔中加入2滴(100μL)LISS。
(8)在适当的孔中加入1滴(50μL)阳性或阴性质控，在其它的孔中加入1滴(50μL)样本。
(9)将微孔板在37℃孵育30分钟。
(10)按步骤(6)方法，用150μL的1×PBST洗液手工洗板5次。
MASPAT试剂盒检测组立即在每孔中加入1滴(50μL)抗人IgG试剂和1滴(50μL)指示红细胞；在本发明试剂盒检测组每孔中加入1滴(50μL)抗人IgG偶连微球制剂。
(11)将微孔板200g离心5min后肉眼观察结果。
本试验用到的O型抗凝全血和阴阳性临床样本(S1～S500)均来源于吉林大学第一医院。检测结果解释如下：通过指示红细胞或红色微球在微孔中的状态可直接肉眼观察得出血小板抗体检测的结果，阳性反应的特点是指示红细胞或微球平铺在反应孔底部表面，表示样本中存在血小板抗体，而阴性反应是指示红细胞或微球聚集在孔底部中央，表示样本中不存在血小板抗体。本发明试剂盒与MASPAT试剂盒分别同时检测临床样本共500例，结果如表2所示，其中共有阴性样本352例，阳性样本148例，阴性符合率为99.7％，阳性符合率为99.3％，由于检测结果为大量重复篇幅，图2仅列出了部分对比检测结果。
表2本发明血小板抗体检测试剂盒与MASPAT试剂盒对比检测结果
实验例2
本实验例应用实施例1提供的血小板抗体检测试剂盒对上述阴性样本S15临床样本进行10次重复检测，结果全部为阴性，证明实施例1提供的血小板抗体检测试剂盒具有良好的重复性。
实验例3
本实验例将实施例1提供的血小板抗体检测试剂盒在37℃下放置7天后，重新以S15为检测对象，测定实施例1提供的血小板抗体检测试剂盒的阴性符合率和重复性，10次重复检测的结果均为阴性，符合稳定性要求。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，所述血小板抗体检测试剂盒包括含有U型孔的微孔板和抗人IgG偶联肉眼可辨颜色的微球或微粒制剂。
2.根据权利要求1所述的血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，所述抗人IgG偶联肉眼可辨颜色的微球或微粒制剂包括均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒和复合稳定剂。
3.根据权利要求2所述的血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，所述均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒的制备方法包括，肉眼可辨颜色的微球或微粒表面羧酸基团活化处理后与单克隆抗人IgG抗体的Fc段偶联，而后封闭肉眼可辨颜色的微球或微粒表面多余活化羧酸基团位点，再经过至少两步离心得到包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒；
优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒与单克隆抗人IgG抗体的用量质量比为1～10：1，进一步优选为5.2：1。
4.根据权利要求3所述的血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒表面羧酸基团活化处理的方法包括，向肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液中依次加入脂肪酸甲酯磺酸盐、N-羟基丁二酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液，反应结束后离心得到表面羧酸基团活化后的肉眼可辨颜色的微球或微粒。
5.根据权利要求4所述的血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液中含有的肉眼可辨颜色的微球或微粒的质量体积比为(1～5)g：100ml，所述N-羟基丁二酰亚胺溶液浓度为30～80g/L，所述碳二亚胺溶液浓度为30～80g/L，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液、脂肪酸甲酯磺酸盐、N-羟基丁二酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液的体积比为1：(15～30)：(1～5)：(0.1～0.5)；
优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液中含有的肉眼可辨颜色的微球或微粒的质量体积比为2.67g：100ml，所述N-羟基丁二酰亚胺溶液浓度为50g/L，所述碳二亚胺溶液浓度为50g/L，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒悬液、脂肪酸甲酯磺酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和碳二亚胺的体积比为1:21:2:0.1。
6.根据权利要求2所述的血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒的制备材料包括聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或氧化硅中的至少一种；
优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒的粒径为10nm～10μm，优选为6μm；
优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒的密度为1～1.2g/cm3，优选为1.05g/cm3；
优选地，所述肉眼可辨颜色的微球或微粒为粒径为6μm、密度为1.05g/cm3的聚苯乙烯红色微球。
7.根据权利要求2所述的血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，所述复合稳定剂包括非离子型去污剂或表面活性剂、惰性蛋白、渗透性保护剂或防腐剂中的至少一种；
优选地，所述非离子型去污剂或表面活性剂包括多元醇类表面活性剂；
优选地，所述非离子型去污剂或表面活性剂在检测信号制剂中的质量体积比为(0.1～0.5)g：100ml，优选为0.1g：100ml；
优选地，所述非离子型去污剂或表面活性剂为Tween20；
优选地，所述惰性蛋白在检测信号制剂的质量体积比为(0.1～0.5)g：100ml，优选为0.1g：100ml；
优选地，所述惰性蛋白包括牛血清蛋白或酪蛋白，进一步优选为牛血清蛋白；
优选地，所述牛血清蛋白在检测信号制剂的质量体积比为0.1g：100ml；
优选地，所述渗透性保护剂包括氨基酸、四分子胺化合物、多羟基化合物或多糖化合物中的至少一种；
优选地，所述渗透性保护剂在检测信号制剂的质量体积比为(0.5～5)g：100ml，优选为1g：100ml；
优选地，所述渗透性保护剂为蔗糖；
优选地，所述防腐剂在检测信号制剂的质量体积比为(0.02～0.1)g：100ml，优选为0.03g：100ml；
优选地，所述防腐剂为ProClin300；
优选地，所述均匀包被了单克隆抗人IgG抗体的肉眼可辨颜色的微球或微粒在检测信号制剂中的质量体积比为0.05～0.4g：100ml，优选为0.125g：100ml。
8.根据权利要求1～7任一项所述的血小板抗体检测试剂盒，其特征在于，所述血小板抗体检测试剂盒还包括低离子强度盐溶液、血小板抗体阳性质控、血小板抗体阴性质控、清洗液或封口膜中的至少一种；
优选地，所述低离子强度盐溶液的组分包括甘氨酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠或溴甲酚紫中的至少一种；
优选地，所述低离子强度盐溶液的组分包括质量体积百分比(g/ml)为1.8％的甘氨酸、10～15mM的磷酸二氢钾、10～15mM的磷酸氢二钠和质量体积百分比(g/ml)为0.002％的溴甲酚紫；
优选地，所述低离子强度盐溶液pH为6.2～6.8，电导率为3.4～4.8mS/cm；
优选地，所述清洗液包括10倍浓度的PBST溶液。
9.权利要求1～8任一项所述的血小板抗体检测试剂盒在血小板抗体检测或血液交叉配型中的应用。
10.采用权利要求1～8任一项所述血小板抗体检测试剂盒进行血小板抗体检测的方法，其特征在于，向血液受体的血清与血液供体的血小板形成的免疫复合物中加入抗人IgG偶联肉眼可辨颜色的微球或微粒制剂，而后通过肉眼观察微球或微粒制剂在含有U型孔的微孔板中的铺展情况判断血液受体的血清中是否含有血液供体的血小板的抗体。
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