CN101603008B

CN101603008B - 一种正己醇降解菌及其制备方法和应用

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Publication number: CN101603008B
Application number: CN2008102322485A
Authority: CN
Inventors: 师俊玲; 令桢民; 杨保伟
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2008-11-13
Filing date: 2008-11-13
Publication date: 2011-03-23
Anticipated expiration: 2028-11-13
Also published as: CN101603008A

Abstract

本发明公开了一种从自然环境中经过定向诱导培育驯化筛选分离得到白地霉T3d329TF(Galactomyces geotrichum T3d329TF)，于2008年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 208167。该菌株具有降解正己醇的作用，同时，还可以产生多种香气成分。

Description

一种正己醇降解菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种正己醇降解菌及其制备方法和其在降解正己醇、制造香气中的应用。

背景技术

正己醇是属于杂醇油^[1]的香精原料，杂醇油含量高时，会引起类似酒上头等不良症状^[2]。目前正己醇的化学转化途径有：正己醇转化为正戊酸^[3]；正己醇转化为正己酸^[4]或转化为正己醛^[5][6]；正己醇天然品存在于苹果、苦橙、草莓、茶叶、紫罗兰、薰衣草等中，其生物代谢途径有：正己醇经脂肪氧化酶(LOX)作用转化为正己醛，^[7][8]，正己醇经醇酰基转移酶(AAT)作用同乙酸作用可生成乙酸己酯^[9]。但是，这些都是属于植物体内的代谢途径，很难用于生产中。

参考文献

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[9]李大鹏.苹果醇酰基转移酶基因MdAAT2参与酷类香气合成调控机理的研究.山东农业大学博士毕业论文.20051120.中国学位论文全文数据库。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种正己醇降解菌，该菌能够有效地降低酸性环境中的正己醇含量，从而通过生物降解法降低天然苹果香精中的正己醇含量，提高天然苹果香精的质量。

实现上述发明目的的技术方案是一种白地霉T3d329TF(Galactomycesgeotrichum T3d329TF)(以下简称TF菌株，该菌种已于2008年10月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 208167，保藏地址：中国武汉武汉大学。

本发明还有一个目的是菌种CCTCC M 208167在降解正己醇中的应用。

本发明还有一个目的是菌种CCTCC M 208167在制备香气中的应用。

与现技术相比，本发明具有以下优点：

1)本发明将定向诱变与驯化富集技术相结合，提高了正己醇降解菌的分离筛选机率；

2)本发明在正己醇降解用酶的开发利用方面具有较大应用潜力，从而为在工业上实现正己醇的生物降解提供基础；

3)本技术可以实现多种香气成分的正物合成。

附图说明

图1正己醇降解菌驯化富集的工艺流程图。

图2菌株TF在PDA平板上生长3天的菌落照片。

图3菌株TF菌丝(A)、孢子丝(B)、孢子(C)和孢子萌发(D)的照片。

图4菌株TF的nrDNA区全长422bp基因序列。

图5基于菌株TF的26S rDNA D1/D2区基因序列分析得到***发育树。

具体实施方式

以下结合发明人给出的附图和具体试验例及具体实施例来进一步说明本发明TF的有益效果和制备方法。

实施例1 TF菌株的分离、鉴定方法及其生物学特性

1.材料与方法

1.1主要仪器和试剂

GC9800气相色谱分析仪(上海科创色谱仪器有限公司)，PYX-DHS-40x50隔水式电热恒温培养箱(上海市跃进农场医疗器械厂)，SPX-300B-II生化培养箱(上海跃进医疗器械厂)，HWY单层大容量全温度恒温振荡器(上海智诚分析仪器制造有限公司)，SW-CJ-2FD洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，Motic BA 400数码成像光学显微镜(附Motic3.1 Preview Software)。正己醇(色谱纯)(国药集团化学试剂有限公司进口分装)。

1.2培养基

菌种驯化富集培养液：蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖1g，MgSO₄·7H₂O0.5g，KH₂PO₄ 1.0g，NH₄NO₃ 1.0g，K₂HPO₄ 1.0g，NaCl 0.2g，FeCl₃ 0.05g，蒸馏水1000mL，用0.2M pH4.2的柠檬酸缓冲液调pH至3.8-4.0。

MSM培养基：MgSO₄·7H₂O 0.5g，KH₂PO₄ 1.0g，NH₄NO₃1.0g，6.67g/L的CaCl₂溶液3mL，17g/L的FeCl₃溶液3mL，FeSO₄·7H₂O 0.05g，NaNO₃ 1.0g，设计浓度的正己醇(先用0.05％Tween80溶解于一定量无菌水中，再用0.22μm滤膜过滤杀菌后加入培养基中)，蒸馏水1000mL，用HCL和NaOH调节pH至4.4-4.6。

固体MSM培养基：在上述MSM培养基中加入20g/L的琼脂。

纯化及发酵检测培养基：(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和液体马铃薯葡萄糖培养基(PDB)。其中，20％的马铃薯浸汁1000mL，葡萄糖20g，琼脂20g(PDA)或0g(PDB)。

1.3菌种的驯化富集培养、分离筛选及纯化

以苹果园土壤、苹果渣、苹果酒醪为分离源，通过以下方法和步骤进行菌种的驯化富集及分离筛选。

1.3.1正已醇降解菌的驯化富集培养与筛选

按照以下操作进行：(1)在250mL三角瓶中，加入100mL驯化富集培养液(FJ)和一定浓度的正己醇，接入10g菌种分离源，在28℃，150rpm条件下摇床培养。(2)培养1d后，以10％的接种量将培养物接入新鲜的FJ培养液中，并置于20W紫外灯下6cm处照射5min后，放入摇床中进行培养。同时，将剩余的原FJ培养液中的培养物用0.2M pH4.2的柠檬酸缓冲液调pH至3.8-4.0(培养结束后pH一般会上升至4.7-4.8)，置于4℃保存1d，对能够适应pH3.8-4.0的菌种进行初筛，从中吸取0.1mL培养液，涂布于含有与原FJ培养液中同浓度正己醇的MSM固体平板中，在28℃隔水恒温培养箱中培养，挑取在各正己醇浓度下生长的菌落，作为初筛菌种。按照200、400、600、1000、1600、2600、4200ppm的水平依次提高FJ培养液和MSM固体培养基中的正己醇浓度。正己醇浓度每增加一个水平，均重复第(2)步的操作，直至培养液中的正己醇浓度增加至4200ppm，菌种的驯化富集及筛选的具体操作流程见(图1)。

选取能够在4200ppm正己醇存在的条件下仍然能够生长的菌种，作为初筛选菌种。再将其分别接入含4000ppm正己醇的FJ培养液和液体MSM培养基中，培养7d后检验其对正己醇的降解能力。对照为经过相同培养的含同浓度正己醇的无菌体培养液。

1.3.3菌种纯化

选取在液体培养条件下能够显著降解正己醇的菌落，经划线法进行菌种纯化。将纯化后菌种保存在马铃薯培养基上，4℃保存备用。

1.4菌种的鉴定

1.4.1形态观察

将上述纯化后的菌种点接于PDA培养基中央，在28℃培养，定期观察其菌丝颜色、菌丝生长、菌落形态等菌落特征；同时做湿室载片培养，制片后在MoticBA400数码成像光学显微镜下观察拍摄其孢子形成过程、孢子形态与大小、菌丝形态与大小等菌体特征。

1.4.226S rDNA D1/D2区及ITS区序列分析

用BioFlux公司Biospin真菌基因组DNA提取试剂盒提待测菌种的总DNA，用TaKaRa公司的Fungi Identification PCR Kit(D317)试剂盒进行26S rDNA D1/D2区及ITS区全序列PCR扩增，交由上海sunny生物科技有限公司在排除由rRNA多态性引起的序列差异而干扰菌种鉴定结果的条件下，对PCR扩增的特异性产物进行直接测序。

1.4.3序列分析与***树的构建

将测得的碱基序列与NCBI国际核酸序列数据库内资源进行同源序列搜索，采用序列图谱分析软件Chromas，参照正、反向序列图谱，对序列进行人工校对；用ClustalX1.8进行序列比对(alignment)；用MEGA4.02Neighbor-Joining法(NJ)构建***发育树，并进行1000次Bootstrap检验。

1.5正己醇含量的测定

取培养好的培养液，摇匀后吸取5mL，用0.22μm无菌滤膜(醋酸纤维膜)过滤除菌，收集滤液于顶空微萃取瓶中，用气相色谱法测定正己醇含量，以5％(v/v)4-甲基-2-戊醇(丙酮定容)为内标，进行定量分析。按照式(1)计划正己醇的降解率。

正己醇降解率(％)＝(对照中正己醇含量-样品中正己醇含量)/(对照中正己醇含量)×100％　　　　　式(1)

所用气相色谱仪的配置为，DB-WAX-10弹性石英毛细管柱(Φ30×0.25)，检测器FID；检测条件为，流动相N₂，进样量300μL，程序升温：第一阶段，初始温度55℃(3min)，升温速率15℃/min，终止温度200℃(3min)；第二阶段，初始温度0℃(0min)，升温速率0℃/min，终止温度0℃(0min)。

2结果

2.1正己醇降解菌的驯化富集、初筛、分离及纯化

对不同分离源中微生物的驯化富集结果显示，当培养基中正己醇含量比较低时，三种菌种分离源中均有不同形态的菌落生长，但是当培养基中的正己醇含量达到400ppm和600ppm以上时，苹果渣中的3种，苹果酒醪中的2种形态不同的菌落均不能生长。从苹果园的土壤中驯化富集到的1种菌落能够耐受4200ppm的正己醇，经分离纯化后，命名为TF。

2.2菌种形态学分类鉴定

将TF菌种接至PDA平板，28℃培养3d后即可得完整菌落，如图2所示。两者的PDA培养物上均有浓郁的水果香味产生。湿室载片培养的显微观察结果显示两菌的菌丝及孢子的生成过程及形态，如图3和表1所示。

表1　菌株TF的形态学特征

综合对比菌株TF的形态学特征，及其与真菌鉴定手册(1979)上所列菌种的分类依据，可以初步判定菌株TF属于真菌门(Fungi)半知菌类(不完全菌)(Fungi Imperiecti)、丛梗孢目(Moniliales)、从梗孢科(Moniliaceae)从梗孢科单孢亚科(Amerosporoideae of Moniliaceae)、卵形孢霉族(Oosporeae)地霉属(Geotrichum，Lk)。

2.3菌种的分子生物学分类鉴定

检测所得TF菌nrDNA区全长422bp，其基因序列如图4所示。

(clustalX1.8序列比对，MEGA4.02N-J法建树，模型:Kimura-2-Parameter，Gap/MissingData：Pairwise Deletion，Bootstrap值为1000，节间数字代表bootstrap支持值(50％以下未显示)；G.sp-TF为供试菌株G.表示Geotrichum；Ga.代表Galactomyces；Ga.G.代表GalactomycesGeotrichum；Ca.代表Candida；D.代表Dipodascus)

选取同TF菌株nrDNA ITS区同源关系较近的模式菌株及相似菌株，调集他们的nrDNA ITS区序列，利用clustalx1.8做序列比对，利用MEGA4.02N-J法，Kimura-2-Parameter模型对供试菌株的nrDNA ITS区核酸序列构建***发育树，而通过***进化树(图5)可以看出TF菌同Galactomycesgeotrichum isolate GG1(相似度＝100％)，Galactomyces geotrichum strainPY-8(相似度＝99.089％)，Galactomyces geotrichum strain DSM1240(相似度＝98.39％)，G.klebahnii strain KCTC6183(相似度＝95.35％)处于同一类群。通过比对rDNA D1/D2区和ITS区序列绘制的9种红色酵母的***发育树，发现ITS区域的变异性高于D1/D2区序列，但二者结论一致，说明利用ITS区域的序列分类酵母菌的属、种以下水平是可行的，因而可以认定TF与Galactomyes geotrichum(地霉属白地霉)中的Galactomycesgeotrichum isolate GG1为同种。

试验例1　纯菌株TF对正己醇的降解效果

为了检测TF对正己醇的降解效果，进行了正己醇的降解试验，培养刚开始时，在培养基中加入4000ppm的正己醇，培养7天后检测体系中的正己醇含量。为了提高菌种的生长速度与生长量，用基础培养基为PDB。TF对正己醇的降解效果(表2)，表明TF菌在PDB上对正己醇有一定的降解，由表2可以算出，TF在PDB中对正己醇的降解率为(23.823±9.2695)％。

表2　菌株TM和TF对培养基中正己醇的一周降解效果

试验例2　TF菌在液体PDB的产香成分测试

TF菌接种到容器中，静置发酵6天后，通过顶空进样法，用气相-质谱联用法检测其中的挥发气体成分，与对照(未接种微生物的PDB培养基)相比，有差异的组分如表3所示(以物质的相似程度大于50％为数据选择限度)。

表3　TF菌在PDB培养基中新生物质

从表3可以看出，TF菌产香气主要为酯类，其次为醇，酮，酸及其他有机物。

TF菌产生香气成分中酯类主要为从C4～C13的酯类，占总体的27.19％，其他成分为酸，烷烃，烯烃，酚，烟碱，占总体的13.28％。

<110>西北农林科技大学

<120>一种正己醇降解菌及其制备方法和应用

<160>1

<210>1

<211>422

<212>DNA

<213>地霉菌(Geotrichum，Lk)

<400>1

CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAAGAATT60

ATAAATATTTGTGAAATTTACACAGCAAACAATAATTTTATAGTCAAAACAAAAATAATC120

AAAACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGTATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGA180

TATTTCTTGTGAATTGCAGAAGTGAATCATCAGTTTTTGAACGCACATTGCACTTTGGGG240

TATCCCCCAAAGTATACTTGTTTGAGCGTTGTTTCTCTCTTGGAATTGCATTGCTTTTCT300

AAAATTTCGAATCAAATTCGTTTGAAAAACAACACTATTCAACCTCAGATCAAGTAGGAT360

TACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGACCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTC420

AA422

Claims

1.白地霉T3d329TF(Galactomyces geotrichum T3d329TF)CCTCC NO：M 208167。

2.权利要求1所述的白地霉T3d329TF在降解正己醇中的应用。