CN101594785B - 潜在免疫原性降低的乳蛋白水解产物 - Google Patents
潜在免疫原性降低的乳蛋白水解产物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101594785B CN101594785B CN200780047281.4A CN200780047281A CN101594785B CN 101594785 B CN101594785 B CN 101594785B CN 200780047281 A CN200780047281 A CN 200780047281A CN 101594785 B CN101594785 B CN 101594785B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- hydrolysate
- endopeptidase
- lactoprotein
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J3/00—Working-up of proteins for foodstuffs
- A23J3/30—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis
- A23J3/32—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents
- A23J3/34—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes
- A23J3/341—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins
- A23J3/343—Working-up of proteins for foodstuffs by hydrolysis using chemical agents using enzymes of animal proteins of dairy proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C21/00—Whey; Whey preparations
- A23C21/02—Whey; Whey preparations containing, or treated with, microorganisms or enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
- A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
- A23C9/1203—Addition of, or treatment with, enzymes or microorganisms other than lactobacteriaceae
- A23C9/1209—Proteolytic or milk coagulating enzymes, e.g. trypsine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
- A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
- A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21019—Glutamyl endopeptidase (3.4.21.19)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Birds (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Dairy Products (AREA)
Abstract
本发明提供了水解产物组合物,其包含被至少一种蛋白水解酶水解的至少一种乳蛋白或乳清蛋白。所述水解产物降低了乳蛋白或乳清蛋白在易于对所述蛋白产生免疫反应的受试者体内的免疫原性。本发明还提供了所述组合物的制备方法,以及包含所述组合物的食品和非食品。
Description
发明领域
本发明涉及包含经水解的乳蛋白和/或乳清蛋白的组合物及其制备方法。本发明还公开了潜在免疫原性降低的此类蛋白的蛋白水解产物,其用于存在对所述蛋白产生不利免疫应答的风险的应用中。
发明背景
乳(milk)是一种得到广泛应用的产品,其不仅以液态形式作为营养饮料使用,而且还是多种其它产品(例如冰淇淋、酸奶(yogurt)、黄油(butter)、奶油(cream)和干酪(cheese))的基料。另外,乳及其组分还广泛地用作许多食品的营养成分和功能成分。
乳清(whey)是干酪生产的副产物。乳清已经成为多种用途的食品成分或添加剂。常规的干酪生产方法每加工100磅乳仅产生约10磅干酪,但却产生90磅乳清。乳清富含乳糖(lactose,一种天然存在的乳糖(milk sugar)),并且还包含在干酪制备过程中既不凝结也不沉淀而是保持可溶状态的多种蛋白。已知乳清蛋白(whey proteins)的营养高并由此具有一定的价值,但它却以盐、乳糖、蛋白和一些脂质的稀释水溶液的形式存在。
尽管丢弃乳清会受到一定损失,但由于乳清的稀释特性使得一些地方仍然经常把乳清作为废料或废水来处理。在成本允许的情况,可将乳清喷雾干燥或者进行进一步加工以从水中分离蛋白和/或乳糖,并将乳糖和蛋白彼此分离。
可以将乳清或其各种成分加入到多种加工食品中,从而为加工者和消费者提供优异的营养特性和功能特性。
乳清蛋白可以占总乳蛋白的约20%。在干酪生产中,“凝结”后得到的乳清组合物包含蛋白以及乳糖、脂肪和灰分(2-5%)。乳白蛋白(lactalbumin)和乳球蛋白(lactoglobulin)是乳清中的两种主要乳蛋白。已报道所有这些蛋白中以及在乳中发现的其它蛋白都具有潜在免疫原性,例如作为变应原。由于这些蛋白是潜在的免疫原或甚至是变应原,某些消费者可能要避免使用含有乳、乳清或其成分(例如作为乳清蛋白的乳白蛋白和乳球蛋白)的食品和/或化妆品。在一些情况下,职业医生会建议某些消费者不要使用含乳或乳清蛋白的产品。因此,目前需要降低乳蛋白(milk proteins)和乳清蛋白的潜在免疫原性。
发明内容
本发明的一些方面提供了组合物和利用包含水解的乳蛋白和/或乳清蛋白的组合物的方法,所述乳蛋白和/或乳清蛋白被一种或多种蛋白水解酶水解从而降低易于对所述蛋白产生免疫应答(特别是不良免疫应答)的人发生此类免疫应答的风险。
一方面,本发明提供了水解产物,其包含利用至少一种蛋白水解酶水解的至少一种乳蛋白,所述蛋白水解酶优选在谷氨酸或天门冬氨酸残基的位置进行切割。所述水解产物在易于对所述蛋白产生免疫反应的受试者体内具有降低的免疫原性。在某些实施方案中,所述蛋白水解酶为内肽酶。在一个实施方案中,所述内肽酶在谷氨酸残基或天门冬氨酸残基的羧基端进行切割。在一个实施方案中,所述内肽酶来自链霉菌(Streptomyces)、葡萄球菌(Staphylococcus)或杆菌(Bacillus)。
在所述方面的另一个实施方案中,产生水解产物的蛋白为乳清蛋白,或所述蛋白包含至少一种乳白蛋白或乳球蛋白,例如α-乳白蛋白或β-乳球蛋白。
与未水解的蛋白相比,所述水解产物优选富含以谷氨酸残基或天门冬氨酸残基为末端的肽。在一个实施方案中,所述水解产物富含以下肽中的一种或多种:AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO:1)、ILLQKWE(SEQ ID NO:2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO:3)或KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:4)。在另一个实施方案中,所述水解产物富含以下肽中的一种或多种:ELEE(SEQID NO:5)、VATEE(SEQ ID NO:6)、PFTE(SEQ ID NO:7)、NSAEPE(SEQ IDNO:8)、VFGKE(SEQ ID NO:9)、AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO:1)、ILLQKWE(SEQ ID NO:2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO:3)、KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:4)、IQPTPE(SEQ ID NO:10)、LKPTPE (SEQ ID NO:11)、LKPTPEGD(SEQ ID NO:12)、LKPTPEGDLE(SEQ ID NO:13)、TKIPAVFKID(SEQ ID NO:14)或TKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:15);和/或以下肽中的一种或多种:DQAME(SEQ ID NO:16)、GIHAQQKE(SEQID NO:17)、VLNE(SEQ ID NO:18)、VFGKE(SEQ ID NO:19)、RLHSMKE(SEQ ID NO:20)、DIKQME(SEQ ID NO:21)、KHPIKHQGLPQE(SEQ ID NO:22)、RPKHPIKHQGLPQE(SEQ ID NO:23)、PMIGVNQE(SEQ ID NO:24)、GIHAQQKEPMEGVNQE(SEQ ID NO:25)、RYLGYLE(SEQ ID NO:26)、LAYFYPE(SEQ ID NO:27)、FVAPFPE(SEQ ID NO:28)、KTTMPLW(SEQID NO:29)、LFRQFYQLD(SEQ ID NO:30)、FFVAPFPE(SEQ ID NO:31)、NLLRFFVAPFPE(SEQ ID NO:32)或ENLLRFFVAPFPE(SEQ ID NO:33)。
本发明还提供了含乳清蛋白的水解产物,其富含以下肽中的一种或多种:ELEE(SEQ ID NO:5)、VATEE(SEQ ID NO:6)、PFTE(SEQ ID NO:7)、NSAEPE(SEQ ID NO:8)、VFGKE(SEQ ID NO:9)、AQSAPLRVYVE(SEQ IDNO:1)、ILLQKWE(SEQ ID NO:2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO:3)、KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:4)、IQPTPE(SEQ ID NO:10)、LKPTPE(SEQ ID NO:11)、LKPTPEGD(SEQ ID NO:12)、LKPTPEGDLE(SEQ ID NO:13)、TKIPAVFKID(SEQ ID NO:14)或TKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:15)。所述乳清蛋白水解产物在易于对一种或多种乳清蛋白产生免疫应答的个体体内具有降低的免疫原性。
在一个实施方案中,所述含乳清蛋白的水解产物优选富含以下肽中的一种或多种:AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO:1)、ILLQKWE(SEQ ID NO:2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO:3)或KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:4)。该实施方案中的水解产物是通过使用内肽酶而产生的,所述内肽酶优选在谷氨酸残基或天门冬氨酸残基的羧基端进行切割。在一个实施方案中,所述内肽酶的活性不需要金属离子。
本发明还提供了包含乳清蛋白水解产物的食品成分,其中所述乳清蛋白水解产物富含以下肽中的一种或多种:AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO:1)、ILLQKWE(SEQ ID NO:2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO:3)或KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:4)。所提供的食品成分在易于对一种或多种乳清蛋白产生免疫反应的受试者体内具有降低的免疫原性。
本发明还提供了包含乳清蛋白水解产物的加工食品,其中所述乳清蛋白水解产物富含以下肽中的一种或多种:AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO:1)、ILLQKWE(SEQ ID NO:2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO:3)或KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:4)。所述加工食品在易于对一种或多种乳清蛋白产生免疫反应的受试者体内具有降低的免疫原性。
本发明所提供的此类加工食品的实例为婴儿配方食品、运动饮品、含干酪的产品、蛋白补充剂、营养补充剂或膳食替代品。
本发明还提供了包含本文所述任何水解产物的非食物产品。在一些实施方案中,所述非食物产品为用于人类皮肤的化妆品、洗剂或清洁剂。在一个实施方案中,所述非食物产品包含乳清蛋白水解产物,所述水解产物富含以下肽中的一种或多种:AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO:1)、ILLQKWE(SEQID NO:2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO:3)或KTKIPAVFKIDALNE(SEQ IDNO:4);并且所述非食物产品在易于对一种或多种乳清蛋白产生免疫反应的受试者体内具有降低的免疫原性。
本发明还提供了包含至少两种本文所述水解产物的组合物,其中所述每种水解产物均由特异性不同的至少一种不同的酶产生,或者每种水解产物为来自于不同蛋白或蛋白混合物的相同酶产生的水解产物。
上述发明内容以及下文的详细描述和实施例是为了对本发明各实施方案进行举例说明。
附图说明
附图旨在进一步解释或举例说明本发明所述组合物或方法的各个方面,下文将对所述组合物或方法进行更全面的阐述和例证。
图1:显示在用S-Glu或L-Glu处理20hr的过程中,乳清蛋白水解的时间进程的SDS-PAGE分析。泳道(从左至右)1、2、3:S-Glu分别处理2hr、4hr和20hr;泳道4:乳清对照;泳道5、6、7:L-Endo分别处理20hr、4hr和2hr;泳道8:乳清对照;泳道9-10:MW标志物(MW marker,标准蛋白)。
图2:经内肽酶消化的乳清蛋白的典型质谱分析结果。在用L-Glu消化样本20hr时取样。A部分表示样本中各种MW蛋白的检测结果。B部分表示降解产物的相对丰度。
图3:经内肽酶消化的乳清蛋白的典型质谱分析结果。在用S-Glu消化样本20hr时取样。A部分表示样本中各种MW蛋白的检测结果。B部分表示降解产物的相对丰度。
图4:经Endo Glu-肽酶水解的脱脂乳-I(Skim Milk-I)的SDS-PAGE分析结果。泳道(从左至右)1、2、3:S-Endo分别消化2hr、4hr和20hr;泳道5:脱脂乳I对照;泳道7、8、9:L-Endo分别消化2hr、4hr和20hr;泳道10:MW标志物。
图5:经Endo Glu-肽酶水解的脱脂乳-II(Skim Milk-II)的SDS-PAGE分析结果。泳道(从左至右)1、2、3:S-Endo分别消化2hr、4hr和20hr;泳道5:脱脂乳II对照;泳道7、8、9:L-Endo分别消化2hr、4hr和20hr;泳道10:MW标志物。
图6:经Endo Glu水解的酪蛋白(Casein)的SDS-PAGE分析结果。泳道(从左至右)1:MW标志物;泳道2、3、4:S-Endo分别消化2hr、4hr和20hr;泳道5:标志物;泳道6、7、8:L-Endo分别消化2hr、4hr和20hr;泳道10:Sigma酪蛋白C-5890。
具体实施方式
缩写&简称:
cP:厘泊;动力粘度单位;
DFP:二异丙基氟磷酸酯;
EDTA:乙二胺四乙酸;
Endo-Glu:切割多肽中与GLU残基相邻的残基的内肽酶,优选切割GLU残基的羧基端;在本发明中有时也表示为EndoGluC,该酶的切割位点确定位于GLU残基的羧基端;
GMP(s):良好作业规范;
HPLC:高效液相色谱;
hr(s):小时;
IU:国际单位;
LC/MS:液相色谱/质谱联用;
LC/MS/MS:液相色谱/串联质谱联用分析:
L-Endo:来自地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenformis)的Glu-C内肽酶;在本发明中有时也表示为“L-Glu”或“L-MPR”;
MS:质谱,有时用于概括性地涵盖LC/MS联用和LC/MS/MS分析;
MW:分子量;
PMSF:苯甲基磺酰氟;
S-Endo:来自枯草杆菌(Bacillus subtilis)的Glu-C内肽酶;在本发明中有时也表示为“S-Glu”或“S-MPR”。
SDS PAGE:十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳;
Succ-AAPEpNA:琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Glu-对硝基苯胺;
t:时间;
TFA:三氟乙酸;
TP:总蛋白,例如,上清液中的总可溶蛋白;
w/w:质量与质量的比例,通常描述确定百分比的基础;用于表示例如,所加组分的浓度;
w/v:质量与体积的比例,用于确定百分比的另一个基础;用于表示,例如所加组分的浓度。
定义:
本文使用的“蛋白水解产物”是指用蛋白水解酶处理蛋白后得到的产物。根据例如处理条件(例如处理的时长、温度、蛋白浓度以及蛋白水解酶的纯度、浓度和活性),所述蛋白的蛋白水解切割程度可以在最小程度(例如,切割单个蛋白的单个肽键)和广泛程度(例如,切割样本中存在的符合所用蛋白水解酶特异性要求的所有肽键)之间变化。
本文使用的“乳蛋白”涵盖产后雌性哺乳动物乳腺的正常分泌物中所有天然存在的蛋白,或其衍生产物(例如由其制得的部分(fraction)、组分或其部分、组分)。所述乳可以来自任何哺乳动物种类,包括但不限于奶牛、山羊、绵羊、水牛、牦牛、骆驼、美洲驼、羊驼和人。乳蛋白优选来自其乳 得到商用或在各养殖地和各地区得到广泛使用的哺乳动物。需要注意,本文使用的“乳蛋白”涵盖了“蛋白”的单数形式和复数形式,因此,除非另有说明,否则术语“乳蛋白”可以指单个蛋白或一种或多种蛋白的混合物。
“乳清蛋白”涵盖了在“乳清”(干酪制作中从凝乳分离的液体副产物)中发现的任何量的任何蛋白。许多干酪生产中产生的乳清中胶束乳蛋白(例如酪蛋白)的含量都格外低,但可溶蛋白(例如α-乳白蛋白和β-乳球蛋白)的含量相对较高。与上述“乳蛋白”相同,本文所用术语“乳清蛋白”涵盖了“蛋白”的单数形式和复数形式,因此,除非另有说明,否则术语“乳清蛋白”也可以指单个乳清蛋白或一种或多种乳清蛋白的任何混合物。本领域的技术人员可以理解,乳清蛋白实际上是乳蛋白的亚类,因此,除非另有说明,否则术语“乳蛋白”可以包含一种或多种乳清蛋白。乳清组合物可以包含,例如乳、奶油和干酪乳清。可以使用来源于任何干酪的乳清。乳清蛋白可以由任何方法获得,例如过滤、渗析、蒸发和干酪乳清的反渗透,或者通过可以得到通常被称为“乳清蛋白”的蛋白的其它方法。
本文使用的“敏感型”个体为易于对未经水解的所述蛋白产生免疫应答或反应的个体。作为直接或间接食用或接触例如一种或多种乳蛋白和/或乳清蛋白的结果,此类免疫应答或反应可用于测量这些蛋白的免疫原性。此类蛋白在不易对所述蛋白产生此类免疫应答的个体(例如本文有时将其称为对一种或多种乳和/或乳清蛋白“非敏感型”或“不敏感型”的个体)中显示极小的免疫原性乃至没有免疫原性。优选地,此类个体在接触或食用所述蛋白后,不产生明显的免疫反应(免疫应答)。
本文使用的“免疫原性降低”指可测量的免疫应答的任何降低、减少或改善。此类应答的测量可以在体外或体内进行评价。例如,可以直接或间接测量来自个体的生物样本(包括组织、细胞或体液等或其任意组合)的所述应答,或者,可以直接或间接在个体内评价所述应答。然而在本文提供的多个实施方案中,不论在体外还是体内测量,此类应答在数字上的任何降低(或减少)都是足够的,优选降低是一个较实质的降低。当然,本领域技术人员可以理解,生物学数据(例如免疫应答的测量值)在个体内以及个体间可能具有大的差异。例如,当所述应答发生于“敏感型”个体时,优选免疫应答发生实质性地降低(例如降低至少约50%、60%或70%,或甚至约80%或更多)。 更优选地,与对一种或多种未经处理的乳蛋白或乳清蛋白不敏感的个体的免疫应答的测量相比,在使用本文所述蛋白水解产物的此类敏感型个体中仅观察到小的或最小的差异。当免疫应答被认为是不利情况(例如过敏性应答)时是有利的。在此种情况下,敏感型个体免疫应答(或其测量值)可以降低至少约85%-约90%,更优选约90%-约95%,或者甚至更多。在一些情况下,敏感型个体对本文所述蛋白水解产物的应答与非敏感型个体的应答在统计学上并没有显著差异。然而在其它情况下,在“敏感型”个体中与未经水解的蛋白相比免疫应答降低了数倍。例如,应答可以降低约10倍-100倍或者甚至1000倍。更优选地,与个体对未经修饰的蛋白的应答相比,该个体食用或接触本文所述的蛋白水解产物组合物后所产生的免疫应答的测量值降低约1000倍-10,000倍或者甚至100,000倍或更多。
蛋白水解产物
第一个方面,本发明提供了蛋白水解产物,其包含利用至少一种蛋白水解酶水解的至少一种乳蛋白,所述蛋白水解酶优选在谷氨酸残基或天门冬氨酸残基的位置进行切割。在一个实施方案中,所述水解产物在易于对未经水解的所述蛋白产生免疫应答的个体中的免疫原性降低了。
在某些实施方案中,包含至少一种乳蛋白的所述水解产物是被内肽酶水解的。优选所述内肽酶的特异性是有限制的。本领域的技术人员可以理解,对于在食品中的应用,对蛋白质的大量非特异性水解可以产生不期望的特性,例如异味和/或功能丧失。因此,优选用于本发明的内肽酶仅以有限的程度进行切割,例如仅对一种或多种特定氨基酸具有特异性,或者对某些类型的氨基酸具有特异性,其切割位点在羧基端和氨基端中的一端或者两端。
在某些目前优选的实施方案中,所述内肽酶对亲水性氨基酸残基(尤其是谷氨酸残基或天门冬氨酸残基)的羧基端具有特异性。在一个实施方案中,所述内肽酶特异性地在谷氨酸残基和/或天门冬氨酸残基的羧基端进行切割。在另一个实施方案中,所述内肽酶仅在或几乎仅在谷氨酸残基的羧基端进行切割。
在某些实施方案中,所述内肽酶属于丝氨酸蛋白酶家族。该内肽酶至少部分地(如果不是完全)被苯甲基磺酰氟或二异丙基氟磷酸酯抑制。在某些 实施方案中,所述内肽酶来自链霉菌、葡萄球菌或杆菌。另外,所述内肽酶还可以来自适合食品或饲料生产的任何来源。在一个实施方案中,所述内肽酶来自枯草杆菌(bacillus subtillis)或地衣芽孢杆菌。在某些实施方案中,所述内肽酶为来自地衣芽孢杆菌的23.6kDa蛋白,其氨基酸序列在欧洲分子生物学实验室(EMBL)数据库中以EMBL P80057的登录号提供。或者,所述内肽酶是来自枯草杆菌的23.9kDa蛋白,其氨基酸序列在EMBL数据库中以EMBL P39790的登录号提供。在另一个实施方案中,所述酶为满足上述标准的任何内肽酶,前提是其不是美国专利第5,866,357号中公开的内肽酶。
所述蛋白的乳源并不被限定在任何特定的哺乳动物种类,因此,本发明可以使用的乳源包括但不限于:奶牛、山羊、绵羊、水牛、牦牛、骆驼、美洲驼、羊驼和人。在一个实施方案中,所述乳蛋白来源的物种不同于接触或食用所述乳蛋白的个体。在另一个实施方案中,个体对来自于其本身的乳蛋白敏感。因此,所述乳蛋白可以来自于个体相同的物种。在此类实施方案中,所述经修饰的蛋白降低了所述乳蛋白在该个体中的免疫原性。在一个实施方案中,所述个体(在本文中有时被称为“受试者”)为人,所述乳来自其乳经常被人类食用的非人动物物种,例如奶牛、山羊、绵羊或水牛。
在某些实施方案中,所述至少一种乳蛋白是可溶的非胶束蛋白(non-micellar protein)。因此,在此类实施方案中,优选所述乳蛋白不是酪蛋白。在一个实施方案中,所述乳蛋白为可溶蛋白,例如通常在干酪生产中得到的乳清中的一种或多种蛋白。
在特定的实施方案中,所述蛋白包含至少一种乳白蛋白或乳球蛋白。本领域技术人员可以理解,现已在多种哺乳动物的乳中鉴定出多种此类蛋白。其中,常见的乳清蛋白为α-乳白蛋白和β-乳球蛋白,两种均适合用于本发明。可以理解,在用于本发明前通常不将某种乳清蛋白与其它乳清蛋白分离。尽管如此,此类经分离或甚至经纯化的乳蛋白的应用也包含在本发明中。
如上所述,由于此类乳蛋白的潜在免疫原性,期望内肽酶对作为刺激、激发、诱导或增强个体免疫应答的免疫决定簇(例如抗原决定簇)的肽进行切割。此类免疫应答包括但不限于主要受T淋巴细胞控制的免疫应答以及常与免疫***的B淋巴细胞关联的免疫应答。所述免疫应答还包括产生任意类型的抗体的免疫应答。本技术人员可以理解,在多种可测的应答中,在应答性个体对此类蛋白的应答中通常产生Ig-E抗体。
出于本发明的目的,免疫原性的“降低”表示无论体内还是体外免疫应答测量,至少是数字的减小。优选具有统计学显著性的降低,此时该分析才是可能且恰当的。统计分析领域内的技术人员可以理解,可以利用例如学生T检验或适合于数据采集方法学特性和设计的其它任何分析方法进行统计差异的确定。
因此,为了使所述乳蛋白(例如乳清蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白)的潜在免疫原性最小化,优选内肽酶切割存在于所述蛋白中的一个或多个免疫决定簇,例如β-乳球蛋白第55位-98位氨基酸之间的区域。相对于未经水解的蛋白,此切割产生的水解产物富含一种或多种特定肽。在一个实施方案中,所述水解产物富含以下肽中的一种或多种:AQSAPLRVYVE(SEQ IDNO:1)、ILLQKWE(SEQ ID NO:2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO:3)和KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:4)。
在某些实施方案中,与未经水解的蛋白相比,所述水解产物通常富含以谷氨酸残基或天门冬氨酸残基为末端的肽。在一个实施方案中,当所述乳蛋白包含乳清蛋白时,所述水解产物富含以下肽中的一种或多种:ELEE(SEQID NO:5)、VATEE(SEQ ID NO:6)、PFTE(SEQ ID NO:7)、NSAEPE(SEQ IDNO:8)、VFGKE(SEQ ID NO:9)、AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO:1)、ILLQKWE(SEQ ID NO:2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO:3)、KTKIPAVFKIDALNE(SEQID NO:4)、IQPTPE(SEQ ID NO:10)、LKPTPE(SEQ ID NO:11)、LKPTPEGD(SEQ ID NO:12)、LKPTPEGDLE(SEQ ID NO:13)、TKIPAVFKID(SEQ IDNO:14)和TKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:15)。
在一个实施方案中,当所述乳蛋白包含酪蛋白时,所述水解产物可以富含以下肽中的一种或多种:DQAME(SEQ ID NO:16)、GIHAQQKE(SEQ IDNO:17)、VLNE(SEQ ID NO:18)、VFGKE(SEQ ID NO:19)、RLHSMKE(SEQID NO:20)、DIKQME(SEQ ID NO:21)、KHPIKHQGLPQE(SEQ ID NO:22)、RPKHPIKHQGLPQE(SEQ ID NO:23)、PMIGVNQE(SEQ ID NO:24)、GIHAQQKEPMEGVNQE(SEQ ID NO:25)、RYLGYLE(SEQ ID NO:26)、LAYFYPE(SEQ ID NO:27)、FVAPFPE(SEQ ID NO:28)、KTTMPLW(SEQ ID NO:29)、LFRQFYQLD(SEQ ID NO:30)、FFVAPFPE(SEQ ID NO:31)、NLLRFFVAPFPE(SEQ ID NO:32)和ENLLRFFVAPFPE(SEQ ID NO:33)。
本领域技术人员应该注意到,本发明不排除将酪蛋白和乳清蛋白一起用作所述水解产物的来源的情况,在这种情况下,所述水解产物可以富含上述肽(SEQ ID NOs:1-32)中的任意一种或全部的上述肽,或其任意组合。含乳清蛋白的水解产物
本发明还提供了含乳清蛋白的水解产物。所述含乳清蛋白的水解产物富含以下肽中的一种或多种:ELEE(SEQ ID NO:5)、VATEE(SEQ ID NO:6)、PFTE(SEQ ID NO:7)、NSAEPE(SEQ ID NO:8)、VFGKE(SEQ ID NO:9)、AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO:1)、ILLQKWE(SEQ ID NO:2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO:3)、KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:4)、IQPTPE(SEQ IDNO:10)、LKPTPE(SEQ ID NO:11)、LKPTPEGD(SEQ ID NO:12)、LKPTPEGDLE(SEQ ID NO:13)、TKIPAVFKID(SEQ ID NO:14),和TKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:15);并且所述水解产物在易于对一种或多种乳清蛋白产生免疫反应的受试者中的免疫原性降低了。
如以上讨论,所述免疫反应可以涵盖个体对外源蛋白的任何反应。对此类反应的测量可以涵盖所属领域技术人员已知的任何技术(体外、体内、临床或其它技术)。如上所述,“降低”至少表示是数字的减少。优选具有统计学显著性的降低,此时该分析才是可能且恰当的。在一个实施方案中,所述受试者为对来自牛乳的乳清蛋白过敏的人。与未经水解的乳清蛋白相比,所述水解产物的免疫原性的测量值降低了至少约50%。在其它实施方案中,免疫原性的测量值降低约70%、80%或90%或更多。在再另一个实施方案中,免疫原性降低了约10倍-100倍、100倍-1000倍、1000倍-10,000倍或者甚至更多。在一个实施方案中,所述经水解的蛋白组合物在敏感型受试者体内的免疫原性降低,从而使经水解的蛋白在敏感型受试者中的免疫应答与其在非敏感型受试者中的免疫应答之间几乎没有可测得的差异。优选在接触或食用含乳清蛋白的水解产物后,敏感型个体和非敏感型个体之间的免疫应答没有统计学差异。
在某些实施方案中,相对于相应未经处理的乳清蛋白样本,所述含乳清蛋白的水解产物富含以下肽中的一种或多种:AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO:1)、ILLQKWE(SEQ ID NO:2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO:3)和KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:4)。
可以通过使用优选在谷氨酸残基和/或天门冬氨酸残基的羧基端进行切割的一种或多种内肽酶来产生所述含乳清蛋白的水解产物。在具体实施方案中,通过使用其活性的产生不需要金属(即不是严格金属蛋白酶)的内肽酶产生所述含乳清蛋白的水解产物。本领域技术人员可以理解,使用诸如EDTA的金属螯合剂可以帮助确定酶(例如蛋白酶或肽酶)是否需要金属。 蛋白水解产物的应用:
在另一方面,本发明提供了包含如上所述的含乳清蛋白的水解产物或乳蛋白水解产物的食品添加剂、补充剂和成分。
相对于未经水解的蛋白,在此类应用中优选富含一种或多种以下肽的水解产物(优选乳清水解产物):AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO:1)、ILLQKWE(SEQ ID NO:2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO:3)和KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:4)。
所述添加剂在易于对一种或多种乳蛋白或乳清蛋白产生免疫反应的受试者中的免疫原性发生降低。
本发明还提供了包含本发明所述的乳蛋白水解产物或乳清蛋白水解产物的加工食品。优选地,所述水解产物富含以下肽中的一种或多种:AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO:1)、ILLQKWE(SEQ ID NO:2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO:3)、和KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:4);并且所述水解产物在易于对一种或多种乳/乳清蛋白产生免疫反应的受试者体内的免疫原性出现降低。
在某些实施方案中,所述加工食品为婴儿配方食品、运动饮品、含干酪的产品、蛋白补充剂、营养补充剂或膳食替代品。在优选的实施方案中,所述水解产物为乳清蛋白水解产物,且所述受试者对未经水解的乳清蛋白和/或乳白蛋白产生***反应。
本发明提供的组合物的应用也可以与干酪制备结合,这对本领域技术人员是显而易见的。所述组合物特别适合用于各种硬干酪和软干酪的生产。本发明提供的组合物可以用于降低此类产品的免疫原性。可以完全用本发明 提供的经水解的乳来制备干酪,或者在凝结前,可以向用于干酪生产的乳中加入乳蛋白水解产物或乳清蛋白水解产物组合物。此类应用将产生在营养含量和功能特性方面具有优异品质的干酪产品。
类似地,本发明所提供的乳水解产物和乳清水解产物组合物可用于生产其它奶制品,其包括但不限于酸奶、村舍式干酪或酸奶油的生产。本领域技术人员还可以理解,所述水解产物适合用于喷雾干燥、浓缩或其它深加工步骤。喷雾干燥的水解产物特别适合用于目前需要使用乳清固体的应用中。当需要降低免疫原性时,也可将其用作乳固体替代物。
在某些实施方案中,本发明所提供的乳水解产物和乳清水解产物组合物可用于其它食品中,所述食品中通常含有一种或多种在标签上没有标明的乳产品或乳的副产品,或者该产品在提供给消费者时可能没有标签。在一些情况下,即使在标签上列出所述成分,没有***接受营养方面教育的消费者也不能理解所列出的某些成分实际上为含乳蛋白的成分或含乳清蛋白的成分。此类产品对敏感型个体具有实质性的风险,例如可能产生严重过敏反应的个体,并且实际上此类产品可能危及这些个体的生命。本发明提供的组合物易于适合此类应用,并可以用于例如饮料(例如咖啡、茶或其改进品和衍生品、运动饮品等)以及布丁、馅料和点心。人们在很多其它产品中添加少量的乳或乳清成分,从而为加工或消费者接受度提供已知有益的功能性。本发明阐述的水解产物可以容易地取代作为其来源的所述成分。该水解产物优选保留作为其来源的所述成分的功能特性,例如结构、香味、口感、分散度和溶解度等。相对于其它可选物(例如被特异性较低的酶更完全地水解的乳清蛋白),该水解产物还提供改良的风味(例如苦味降低)和优选的发泡特性。在一些实施方案中,与未经水解的蛋白相比,所述经水解的蛋白具有改良的胶凝性、持水性或水结合能力。
在另一个实施方案中,本发明所述的经水解的乳清蛋白或乳蛋白用于制造外用产品,例如洗剂、霜剂、软膏、擦剂(rub)或清洁剂等。因此,本发明也涉及含本文所述的经水解的蛋白组合物的此类产品。此类产品可用于例如治疗目的,例如缓解皮肤干燥、发痒和不适等。除了所述经水解的蛋白组分外,这些产品优选包含作为基质的脂质、蜡、油、油包水乳液或水包油乳液等。通常,所述产品还可以包含一种或多种矫味剂成分以及其它成分,例 如表面活性剂或乳化剂。本发明还提供了包含本文所述乳蛋白水解产物或乳清蛋白水解产物的化妆品和其它外观辅助品或美容辅助品。在一个实施方案中,所述化妆品用于人的面部、面颊、唇部或眼部。在另一个实施方案中,所述产品用于任何身体部位以帮助改善皮肤的化妆效果,例如减少皱纹、痣、雀斑、疤痕和瑕疵等的出现。
制备方法:
可以通过向含乳蛋白或乳清蛋白的液体或半固体中加入一种或多种蛋白水解酶来制备上述水解的乳蛋白和/或乳清蛋白组合物。
所述酶处理可以通过以下方式进行:将蛋白酶或适当的蛋白酶组合(例如一种或多种内切蛋白酶或内肽酶)引入或分散到乳组合物或乳清组合物中,或者引入或分散到本文所述的含乳蛋白和/或乳清蛋白的组合物中,从而使所述酶与所述蛋白底物接触。将所述酶引入到所述蛋白组合物之后,通过将所述混合物保持在适合的条件下(例如适当的持续时间、在适当的温度和pH,并且存在在任何所需辅助因子的条件下),从而发生所述酶反应。可以根据本领域熟知的规则,在适合所选酶(一种或多种酶)的选定条件下,利用上述酶(一种或多种酶)进行乳蛋白组合物或乳清蛋白组合物的处理。本领域技术人员可以理解,当期望的终产品用于人类食用的情况下,所述条件可能需要在所使用的含蛋白物质的保存和处理过程中采用恰当的卫生措施和良好操作规范(GMPs)。类似地,其它非食用产品(例如外用的洗剂或化妆品)可以具有与其制造相关的管理要求。
尽管上文有所阐述,酶处理可以在任何合适的pH(例如pH 2-10、pH 4-9或者pH 5-7)下进行,但是对于本文所阐述的一些酶,可优选使用约pH 7-8。本领域技术人员可以理解,每种酶在pH范围内具有特定的性能,并且可能并非总是有必要或者甚至是期望在酶活性最高的pH下使用该酶。以类似的方式,技术人员可以容易地选择合适的温度或者酶处理步骤的温度。影响温度选择的因子包括但不限于所使用一种或多种酶的热稳定性,所要水解的蛋白以及含所述蛋白的组合物的热稳定性,以及所述酶的相对活性随温度的变化。
任选地,酶处理进行合适的时间后,例如,已发生一定量的蛋白水解(例如,基于诸如功能性特性和免疫原性特性考虑的预定期望量的蛋白水解)后,可以除去酶或降低其活性。可以通过本领域已知的用于除去食品或饲料加工中使用的酶或使其失活的方法,使所述酶部分失活或完全失活。在一个实施方案中,当蛋白水解的程度足以提供本文所述的免疫原性降低的特性时,所述酶被热失活。在另一个实施方案中,利用快速测量法(例如总可溶蛋白%、粘度)对蛋白水解的程度进行监测。当所述快速测量值得到预定的期望读数时,使酶失活。优选所述酶的活性被热失活,更优选将热失活与诸如需要加热的过程、巴氏灭菌或均化处理步骤组合使用。
合适的酶剂量通常在约0.01-0.1%(w/w)的范围内。在多个实施方案中,所述乳蛋白和/或乳清蛋白以例如约1-60%、5-50%、20-40%、10-45%或约10-15%的乳蛋白和乳清蛋白含量存在。因此,酶的剂量可包括以下量,例如,0.1-1.0%、尤其为0.2%(w/w),其对应于2000IU/100g乳蛋白或乳清蛋白。
将在标准条件下每分钟产生1毫摩蛋白水解产物需要的酶量定义为一个IU(国际单位)。用于测定IU的“标准条件”是使用含10-15%乳清蛋白固体的水或脱脂乳、pH7、温度为40℃。如在实施例中的举例说明,在一个实施方案中,所述酶的剂量基于所处理组合物的蛋白含量(w/w)。
或者,可以通过其它方式确定所述酶的剂量,例如通过使用本文所述的其它试验。此类试验都可以提供有关蛋白水解程度(或度)的指示,并包括测定水解百分率、粘度测量、凝胶电泳和质谱。换而言之,也可以根据经验计算或根据其它数据计算在给定的温育时间内产生期望或预定结果所需要的酶量。在一个实施方案中,可以选择酶量以提供特定的粘度降;在另一个实施方案中,选择酶量以产生通过凝胶电泳或质谱(MS)分析测定的某些消化片段。
在一个实施方案中,可以通过蛋白样本的水解度反向计算酶的剂量。“水解度”由蛋白水解酶切割的肽键的数量计算值。在这种情况下,在切割所述乳清蛋白分子中基本所有的谷氨酸和可能的天门冬氨酸残基的情况下获得最大水解度。可以通过本领域已知的方法测定水解度,例如通过使用J.Adler-Nissen,J.Agric.Food Chem.27:1256(1979)中阐述的TNBS(三硝基苯磺酸)试验。
已经使用了测定酶量的其它方法或酶活性试验,例如通过可测底物例如比色底物或人工底物,如Suc-AAPEpNA(琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Glu-p-硝基苯胺)。可以通过获取准确的比活性率计算值并使用标准曲线或预定的转化因子将活性/单位体积的单位转化成酶量,从而进行向活性EndoGluC蛋白酶浓度的转化。例如,对于本文所使用的某些试验,L-MPR的转化因子为0.348U/mg酶,S-MPR的转化因子为0.549U/mg。根据以上阐述,本领域技术人员可以理解如何确定所需的剂量或活性。
所述酶处理可以分批进行,例如在带有搅拌的容器中。所述处理还可以是连续的,例如在一系列带搅拌的釜式反应器中进行。所述处理还可以包括固定酶和各种经修饰的酶的使用,前提是所述固定酶或经修饰的酶的活性保留水解的适当特异性。
实施例
实施例1
利用特异性受限的内肽酶消化乳蛋白:
酶:地衣芽孢杆菌“Endo-Glu”肽酶(“L-Glu”):来自地衣芽孢杆菌的所述酶(“L-MPR”或“Endo-GluC”)在枯草杆菌中表达并从2-14L发酵物中纯化、收集和浓缩。经纯化的酶(纯度>90%)的浓度为25.1mg/mL。该23.6kDA蛋白的序列与灰色链霉菌(Streptomyces griseus)V8蛋白酶以及其它Glu/ASP特异性蛋白酶(例如对Glu-Xaa、ASP-Xaa切割位点具有特异性的蛋白酶)的序列相似。该酶是被EDTA部分抑制的丝氨酸内肽酶,然而却不是金属蛋白酶。该酶的最佳pH为7.5-8左右。离子强度越高,其活性越低。所述酶的序列是已知的并可见于公共数据库。例如,登陆互联网,可在欧洲分子生物学实验室数据库中的UniProtKB/Swiss-Prot原始登录号P80057获得所述酶的序列。参见,″Purification,characterization,cloning,and expression of aglutamic acid-specific protease from Bacillus licheniformis ATCC 14580″J.Biol.Chem.267:23782-23788(1992)。
枯草杆菌“Endo-Glu”肽酶(“S-Glu”):来自枯草杆菌的所述酶(“S-MPR”或“Endo-GluC”)在枯草杆菌中表达,并从2-14L发酵物中纯化、收集和浓缩。经纯化的酶(纯度>85%)的浓度为3.5mg/mL。该23.9kDa丝氨 酸蛋白酶的蛋白序列与地衣芽孢杆菌Endo-Glu肽酶“L-Glu”的序列相似。所述S-Glu蛋白酶在较宽的pH范围内相对稳定。其特异性不如地衣芽孢杆菌的L-Glu酶。所述酶的序列是已知的并可见于公共数据库。例如,登陆互联网,可在欧洲分子生物学实验室数据库中的UniProtKB/Swiss-Prot原始登录号P39790获得所述酶的序列。参见,″Gene encoding a glu-specificextracellular endopeptidase in Bacillus subtilis.″;J.Bacteriol.172:1024-1029(1990),以及“Purification and characterization of a glutamic acid-specificendopeptidase from Bacillus subtilis ATCC 6051:application to the recovery ofbioactive peptides from fusion proteins by sequence-specific digestion.”Appl.Microbiol.Biotech.48:27-33(1997)。
方法:
为了评定蛋白水解消化的时间进程,将12%乳清蛋白(含13.3g乳清粉(Lacprodan DI-9224(Arla Foods))的100ml水)溶解在试剂级水中。将每份15g的该溶液置于4个50ml试管中并在振荡培养箱中温育至40℃(例如温育15分钟)。向3个上述50ml试管分别加入上述经纯化的酶。使用500μl浓度为1.5mg/ml的S-MPR或者浓度为4.2mg/ml的L-MPR内肽酶。以Succ-AAPEpNA为底物进行活性测定。通过SDS-PAGE,所述酶的均质性大于约98%。不添加酶的第4个试管作为对照试管。将上述4个试管在振荡摇床中于40℃、175rpm温育指定时间。在其温育时间终点(分别为2hr、4hr和20hr)移出试管并以3600rpm(约2800xg)离心10分钟以分离沉淀和上清液。
检测上清液以测定在上清中剩余的总可溶蛋白(TP)(g/l),干固体%和粘度测量值。还利用SDS-PAGE通过电泳对上清进行分析,以对水解进行监测。进行质谱(MS)分析,以确定各蛋白水解切割产物的存在。
质谱分析:
样本制备:按照上文的描述制备经水解的蛋白样本。通过高效液相色谱与LCQ离子阱质谱联用***(LC/MS)对经消化的蛋白样本(每个约20μl)进行分析。
LC/MS/MS分析:利用与LCQ高等离子阱MS(LGQ Advantage Ion TrapMS,ThermoFinnigan,San Jose,CA)偶联的Surveyor HPLC***获得所有MS和MS/MS数据。对所有经蛋白水解消化的样本均使用Vydac反相C18柱(2.1X 150mm),并使用从0%至70%的溶剂B、流速200μl/分钟进行HPLC梯度洗脱65分钟。溶剂A:含0.1%TFA的水溶液,溶剂B:含0.08%TFA的乙腈溶液。利用TurboSEQUEST和Xcalibur程序(ThermoFinnigan)对进行数据处理。
然后将MS分析的结果用于Mascot程序,该程序可以将肽消化片段用作唯一数据,通过利用公共数据库(例如国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)维护的公共数据库)鉴定源蛋白及其原始序列。关于Mascot及其前身Mowse的更多信息可见于互联网,例如由MatrixScience Inc.(Boston,MA)维护的网址(www.matrixscience.com)。
结果:
利用终酶蛋白浓度为0.188%的内肽酶S-Glu处理浓度为12%的乳清蛋白蛋白,其结果是2小时内总蛋白(TP)减少5.5%。在接下来的4-20小时内,TP进一步减少,最大减少量约为20%。
所沉淀凝乳的滞留水体积(即,凝乳保留水量的测量值)约等于进入凝乳内的水重。
在用S-Glu酶温育20小时后,上清的粘度从3.05cP提高到5.99cP。
利用终浓度相同的L-Glu酶可以观察到相似的结果。在2小时内,观察到TP减少6.9%,在4小时时间点时提高到10%。在20小时温育结束时所述减少达到14%。
所沉淀凝乳的滞留水体积约为蛋白重量的70重量%。
在用L-Glu内肽酶温育的20小时过程中,上清的粘度保持基本相同。
通过SDS-PAGE显示的S-Glu和L-Glu两种酶处理的时间进程结果示于图1。对于所述乳清样本的20hr消化产物的质谱分析结果,L-Glu的结果示于图2,S-Glu的结果示于图3。
乳清蛋白内肽酶水解产物样本中富含特定肽,利用上文详述的LC/MS/MS对所述特定肽的种类和含量进行确定。以下表1(a)和(b)以及表2(a) 和(b)显示由分别用L-Glu和S-Glu消化乳清样本20hr时,由肽数据的Mascot分析得到的数据。
表1(a)、(b):用L-Glu消化20hr时乳清蛋白样本的MS数据的Mascot分析结果。 (a):β-乳球蛋白 (b):κ-酪蛋白
方法:将10g脱脂乳(两个来源:Berkeley Farms和Sunnyside)分别放置到8个15ml的试管中。在振荡培养箱中将试管加热到40℃,持续15分钟。向试管(每种酶3支试管)中加入酶(S-Glu或L-Glu,500μl 3.8mg/ml的储 备溶液)。对每种脱脂乳各取一个试管作为对照试管,不加入任何酶。在上述条件下持续温育指定长的时间。对于每种酶,分别在2hr、4hr、20hr移走一支处理试管。然后将试管进行离心以分离沉淀物和上清。检测上清液以测定TP(总蛋白)(g/l)、干固体%和粘度测量值。利用SDS-PAGE分析监测内肽酶的切割。根据上述详述进行质谱分析,以确定所产生的切割产物的量和种类。还还使用所收集的质谱数据对生成的肽进行Mascot分析。
结果:经终浓度为0.19mg/g的S-Glu处理的两个脱脂乳样本在处理的2hr内产生重粗凝乳。在酶处理2hr内约有43%-57%的脱脂乳总蛋白发生沉淀。两个来源的脱脂乳在4hr或20hr后均没有观察到上清总蛋白的进一步明显下降,因此沉淀基本完成。
与S-Glu不同,用L-Glu处理的样本显示脱脂乳蛋白的沉淀随时间而提高。对于脱脂乳样本I,L-Glu内肽酶处理引起蛋白浓度在t=2hr降低32%,4hr降低42%,20hr降低62%。在用L-Glu处理的脱脂乳样本II中,TP浓度在t=2hr降低11.5%,4hr降低41%,20hr降低51.7%。
从SDS-PAGE结果(图3和4分别为脱脂乳I和脱脂乳II的结果)可以看出,内肽酶L-Glu和S-Glu都能在2hr内引起脱脂乳酪蛋白沉淀,并是酪蛋白水解以及乳球蛋白和乳白蛋白发生明显的水解。
所述经内肽酶水解的脱脂乳样本富含特异的肽,利用上文详述的LC/MS/MS对肽种类和量进行确定。以下表3(a)、(b)和(c)显示由用L-Glu消化脱脂乳样本I 20hr后,由肽数据的Mascot分析得到的数据。
类似地,以下表4分别显示用S-Glu(表4(a))、L-Glu(表4(b)和4(c))消化脱脂乳样本II 20hr后的肽数据的Mascot分析数据。
表4(a)、(b)和(c):用内肽酶消化脱脂乳样本II 20hr后的MS数据的Mascot分析。 (a):S-Glu消化α-酪蛋白 表4(b):L-Glu消化β-酪蛋白 表4(c):L-Glu消化: 实施例3利用内肽酶活性消化酪蛋白
方法:将10g酪蛋白粉(Sigma,Catalog # C-5890)混合到50ml 1M磷酸缓冲液(pH 6.5)和200ml温水中。将内容物加热至酪蛋白溶解至缓冲液中。将所述酪蛋白溶液在该温度下保持5分钟。然后将酪蛋白溶液冷却至室温,并调整至500ml的终体积。将该酪蛋白溶液分别放置到8个15ml试管中(每个试管10ml溶液),并在振荡培养箱中温热至40℃,保持15分钟。每3个试管为一组,分别加入内肽酶S-Glu或L-Glu(500μl 3.8mg/ml储备液)。每组分别有一个不加酶的试管作为对照。在t=2hr、4hr和20hr取出样本管,冷却并离心,以分离沉淀物和上清。检测上清以测定TP(总蛋白,g/l),干固体%和粘度测量值。还利用SDS-PAGE通过电泳分析上清,从而监测水解。进行质谱(MS)分析,以确定各蛋白水解切割产物的存在。然后,将MS分析结果用于Mascot程序,该程序可以将肽消化片段用作唯一数据,通过利用公共数据库(例如国家生物技术信息中心维护的公共数据库)来鉴定源蛋白及其原始序列。关于Mascot及其前身Mowse的更多信息见于互联网,例如由Matrix Science Inc.(Boston,MA)维护的网址(www.matrixscience.com)。 结果:
用浓度为0.19mg酶/g酪蛋白溶液的内肽酶处理被缓冲的酪蛋白溶液(16.85g/l),用S-Glu在2hr内沉淀58%的酪蛋白。然而,由于随时间而发生进一步的水解,有些沉淀的酪蛋白复溶。因此,4hr和20hr后沉淀蛋白的浓度分别为53%和49%。用L-Glu处理产生的沉淀酪蛋白随检测时间而增加。在2hr,32.5%的总蛋白(TP)从酪蛋白溶液中分离。该数值在4hr增加至34%,在20hr,分离出的总蛋白为54.2%。图6显示酪蛋白消化的SDS-PAGE分析结果。
分别使用L-Glu和S-Glu消化20hr后,酪蛋白消化物的Mascot分析结果分别示于下表5和6中。 表5:用L-Glu内肽酶消化α-酪蛋白20hr 表6:用S-Glu内肽酶消化α-酪蛋白20hr>
本说明书通篇引用了多种出版物,包括专利、公开的专利申请、技术文章和学术文章。出于各种目的,这些引用的出版物均通过引用方式全文并入本文。
Claims (24)
2.如权利要求1所述的水解产物,其中所述内肽酶优选在谷氨酸残基或天门冬氨酸残基的羧基端进行切割。
3.水解产物,其包含由至少一种蛋白水解酶水解的至少一种乳蛋白,所述蛋白水解酶优选在谷氨酸或天门冬氨酸残基位置进行切割,其中所述蛋白水解酶为UniProtKB/Swiss-Prot原始登录号P39790的内肽酶,所述水解产物在易于对所述乳蛋白产生免疫反应的受试者体内具有降低的免疫原性,并且所述水解产物至少富含肽AQSAPLRVYVE(SEQ ID NO:1)。
4.如权利要求3所述的水解产物,其中所述内肽酶受苯甲基磺酰氟或二异丙基氟磷酸酯抑制。
5.如权利要求1所述的水解产物,其中所述乳蛋白为可溶的非胶束乳蛋白。
6.如权利要求5所述的水解产物,其中所述乳蛋白为乳清蛋白。
7.如权利要求6所述的水解产物,其中所述内肽酶的活性不需要金属离子。
8.如权利要求6所述的水解产物,其中所述乳蛋白包含至少一种乳白蛋白。
9.如权利要求8所述的水解产物,其中所述乳白蛋白为α-乳白蛋白。
10.如权利要求9所述的水解产物,其中所述水解产物富含以下肽中的一种或多种:ILLQKWE(SEQ ID NO:2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO:3)或KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:4)。
11.如权利要求1所述的水解产物,与不经水解的乳蛋白相比,所述水解产物富含以谷氨酸残基或天门冬氨酸残基为末端的肽。
12.如权利要求11所述的水解产物,其富含以下肽中的一种或多种:ELEE(SEQ ID NO:5)、VATEE(SEQ ID NO:6)、PFTE(SEQ ID NO:7)、NSAEPE(SEQ ID NO:8)、VFGKE(SEQ ID NO:9)、ILLQKWE(SEQ ID NO:2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO:3)、KTKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:4)、IQPTPE(SEQ ID NO:10)、LKPTPE(SEQ ID NO:11)、LKPTPEGD(SEQ ID NO:12)、LKPTPEGDLE(SEQ ID NO:13)、TKIPAVFKID(SEQ IDNO:14)或TKIPAVFKIDALNE(SEQ ID NO:15)。
13.如权利要求11所述的水解产物,其富含以下肽中的一种或多种:DQAME(SEQ ID NO:16)、GIHAQQKE(SEQ ID NO:17)、VLNE(SEQ IDNO:18)、VFGKE(SEQ ID NO:19)、RLHSMKE(SEQ ID NO:20)、DIKQME(SEQ ID NO:21)、KHPIKHQGLPQE(SEQ ID NO:22)、RPKHPIKHQGLPQE(SEQ ID NO:23)、PMIGVNQE(SEQ ID NO:24)、GIHAQQKEPMEGVNQE(SEQ ID NO:25)、RYLGYLE(SEQ ID NO:26)、LAYFYPE(SEQ ID NO:27)、FVAPFPE(SEQ ID NO:28)、KTTMPLW(SEQID NO:29)、LFRQFYQLD(SEQ ID NO:30)、FFVAPFPE(SEQ ID NO:31)、NLLRFFVAPFPE(SEQ ID NO:32)或ENLLRFFVAPFPE(SEQ ID NO:33)。
14.如权利要求1-13中任一项所述的水解产物,其中,所述水解产物为含乳清蛋白的水解产物。
15.包含权利要求14所述的水解产物的食品成分,其中所述食品成分在易于对一种或多种乳清蛋白产生免疫反应的受试者体内具有降低的免疫原性。
16.包含权利要求14所述的水解产物的加工食品,其中,所述加工食品在易于对一种或多种乳清蛋白产生免疫反应的受试者体内具有降低的免疫原性。
17.如权利要求16的加工食品,其是婴儿配方食品、运动饮品、含干酪的产品、营养补充剂或膳食替代品。
18.如权利要求16的加工食品,其是蛋白补充剂。
19.包含权利要求1或3所述的水解产物的非食物产品,其中所述非食物产品为人类皮肤用的化妆品、洗剂或清洁剂。
21.如权利要求19或20所述的非食物产品,其包含乳清蛋白水解产物,其中,所述乳清蛋白水解产物富含以下肽中的一种或多种:ILLQKWE(SEQID NO:2)、KTKIPAVFKID(SEQ ID NO:3)或KTKIPAVFKIDALNE(SEQ IDNO:4);所述非食物产品在易于对一种或多种乳清蛋白产生免疫反应的受试者体内具有降低的免疫原性。
22.包含至少两种权利要求1或3所述的水解产物的组合物,其中所述水解产物中的每一种均由特异性不同的至少一种不同的蛋白水解酶产生。
23.如权利要求22所述的组合物,其中所述至少一种蛋白水解酶包含进一步的内肽酶。
24.如权利要求23所述的组合物,其中所述进一步的内肽酶为UniProtKB/Swiss-Prot原始登录号P80057。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US87596706P | 2006-12-20 | 2006-12-20 | |
US60/875,967 | 2006-12-20 | ||
PCT/US2007/024723 WO2008088472A2 (en) | 2006-12-20 | 2007-12-03 | Milk protein hydrolyzates with reduced immunogenic potential |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101594785A CN101594785A (zh) | 2009-12-02 |
CN101594785B true CN101594785B (zh) | 2014-01-08 |
Family
ID=39427002
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200780047281.4A Expired - Fee Related CN101594785B (zh) | 2006-12-20 | 2007-12-03 | 潜在免疫原性降低的乳蛋白水解产物 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20100273718A1 (zh) |
EP (1) | EP2124603B1 (zh) |
CN (1) | CN101594785B (zh) |
AU (1) | AU2007343749B2 (zh) |
BR (1) | BRPI0721123A2 (zh) |
DK (1) | DK2124603T3 (zh) |
ES (1) | ES2529237T3 (zh) |
NZ (1) | NZ577510A (zh) |
WO (1) | WO2008088472A2 (zh) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102006036285A1 (de) * | 2006-08-03 | 2008-02-07 | "S.U.K." Beteiligungs Gmbh | Fraktionen aus Molkepermeat und deren Verwendung zur Prävention und Therapie des Typ-2 Diabetes und des Metabolischen Syndroms |
JP5274814B2 (ja) * | 2007-03-13 | 2013-08-28 | 雪印メグミルク株式会社 | 美白剤 |
WO2009082229A2 (en) * | 2007-12-21 | 2009-07-02 | Friesland Brands B.V. | Pre-fibril composition and fibrils from proteinaceous materials |
ES2385621T3 (es) | 2008-05-15 | 2012-07-27 | Friesland Brands B.V. | Composición prefibrilar y fibrillas de materiales proteicos |
US8498729B2 (en) * | 2008-08-29 | 2013-07-30 | Smp Logic Systems Llc | Manufacturing execution system for use in manufacturing baby formula |
EP2253324A1 (en) * | 2009-04-30 | 2010-11-24 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Use of a casein-derived peptide and compositions thereof as antihypertensive |
JP2012188384A (ja) | 2011-03-10 | 2012-10-04 | Snow Brand Milk Products Co Ltd | 美肌剤 |
EP2730170B1 (de) | 2012-11-13 | 2016-02-10 | DMK Deutsches Milchkontor GmbH | Allergenfreie Nahrungsmittelzusammensetzungen |
JP6262694B2 (ja) * | 2014-08-18 | 2018-01-17 | 森永乳業株式会社 | プロリルオリゴペプチダーゼ阻害剤 |
WO2017102258A1 (en) * | 2015-12-18 | 2017-06-22 | Nestec S.A. | Heat sterilized high protein compositions with hydrolyzed protein from a continuous process with at least one endopeptidase |
WO2017144730A1 (en) | 2016-02-26 | 2017-08-31 | Danmarks Tekniske Universitet | Milk allergy prevention and treatment |
EP3430390B1 (en) * | 2016-03-18 | 2022-08-03 | Genclis | Molecular origin of allergy |
CN107188949B (zh) * | 2017-07-06 | 2019-12-24 | 浙江辉肽生命健康科技有限公司 | 一种生物活性多肽eintvqvtst及其制备方法和应用 |
CN107176995B (zh) * | 2017-07-06 | 2019-12-24 | 浙江辉肽生命健康科技有限公司 | 一种生物活性多肽skvlpvpekavpypq及其制备方法和应用 |
AU2019409827A1 (en) * | 2018-12-19 | 2021-05-27 | Société des Produits Nestlé S.A. | Composition for preventing or reducing transepidermal water loss and improving skin barrier function |
CN110150384A (zh) * | 2019-05-29 | 2019-08-23 | 山东翌丰经贸有限公司 | 乳铁蛋白粉及其制备方法 |
JPWO2021059755A1 (zh) * | 2019-09-26 | 2021-04-01 | ||
BR102019024709A2 (pt) * | 2019-11-22 | 2021-06-08 | Jadyr Mendes De Oliveira | processo de produção de hidrolisado de proteínas lácteas hipoalergênico ou não alergênico, hidroli-sado de proteínas lácteas hipoalergênico ou não alergênico, produto alimentício e uso do hidrolisado de proteínas lácteas hipoalergênico ou não alergênico |
JPWO2021201263A1 (zh) * | 2020-04-03 | 2021-10-07 | ||
EP3916006A1 (en) * | 2020-05-26 | 2021-12-01 | Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) | Peptides capable of inducing anorexic hormones, compositions and uses thereof |
FR3116274B1 (fr) * | 2020-11-17 | 2023-12-08 | Sederma Sa | Tétrapeptides, compositions les comprenant et leur utilisation cosmétique |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1105818A (zh) * | 1993-06-30 | 1995-08-02 | 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 | 乳蛋白部分水解产物及其制备方法 |
US5866357A (en) * | 1990-03-09 | 1999-02-02 | Novo Nordisk A/S | Method for hydrolyzing proteins with gluyasp specific protease |
CN1596676A (zh) * | 2004-08-30 | 2005-03-23 | 江南大学 | 一种酶法改性乳蛋白的方法及其应用 |
Family Cites Families (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2794305B2 (ja) * | 1988-07-20 | 1998-09-03 | 明治乳業株式会社 | 牛乳乳清蛋白質中のβ―ラクトログロブリンの選択的酵素分解方法 |
BE1003298A3 (nl) * | 1990-01-12 | 1992-02-18 | Tessenderlo Chem Nv | Werkwijze voor het bereiden van een enzymatisch hydrolysaat. |
US5863573A (en) * | 1990-03-09 | 1999-01-26 | Novo Nordisk A/S | Process for producing cheese |
EP0457565B1 (en) * | 1990-05-18 | 1997-07-30 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Milk-protein hydrolyzates and compositions for use as hair and skin treating agent |
JP3046344B2 (ja) * | 1990-10-24 | 2000-05-29 | 塩野義製薬株式会社 | 新規プロテアーゼ |
US5486461A (en) * | 1991-11-08 | 1996-01-23 | Novo Nordisk A/S | Casein hydrolyzate and method for production of such casein hydrolyzate |
FR2712350B1 (fr) * | 1993-11-10 | 1996-02-09 | Siemens Automotive Sa | Procédé et dispositif d'optimisation ou remplissage en air d'un cylindre de moteur à combustion interne. |
AU697604B2 (en) * | 1995-05-31 | 1998-10-15 | Gist-Brocades B.V. | Production of aminopeptidases from aspergillus niger |
US6416796B1 (en) * | 1999-04-27 | 2002-07-09 | Kraft Foods, Inc. | Whey protein digestion products in cheese |
US6093424A (en) * | 1999-04-27 | 2000-07-25 | Kraft Foods, Inc. | Process for making cheese using transglutaminase and a non-rennet protease |
DE60034885T2 (de) * | 1999-05-27 | 2008-01-17 | Amano Enzyme Inc., Nagoya | Enzymlauge und verfahren zu deren herstellung, enzymzubereitung, proteasezubereitungen und proteaseproduzierendes bakterium |
US6558939B1 (en) * | 1999-08-31 | 2003-05-06 | Novozymes, A/S | Proteases and variants thereof |
US20020192333A1 (en) * | 2001-04-27 | 2002-12-19 | Christensen Jorge Florin | Milk resistant to acid coagulation, method and milk-based product |
FR2827480B1 (fr) * | 2001-07-17 | 2003-09-19 | Cie Laitiere Europeenne | Lactoserum modifie, procede de preparation, utilisation et produit de panification comprenant le lactoserum modifie |
BR0314997A (pt) * | 2002-10-02 | 2005-08-09 | Novozymes As | Métodos para produzir leite resistente à coagulação acida, para aumentar a capacidade de absorção de cálcio no leite, para aumentar a viscosidade do leite e para produzir um leite acidulado sem coagulação, leite, e, produto alimentìcio |
WO2005078074A2 (en) * | 2004-02-13 | 2005-08-25 | Novozymes A/S | Protease variants |
US20060286208A1 (en) * | 2005-06-01 | 2006-12-21 | Nagendra Rangavajla | Methods for producing protein partial hydrolysates and infant formulas containing the same |
WO2006135089A1 (ja) * | 2005-06-17 | 2006-12-21 | Fuji Oil Company, Limited | クリームチーズ様食品及びその製造法 |
-
2007
- 2007-12-03 WO PCT/US2007/024723 patent/WO2008088472A2/en active Application Filing
- 2007-12-03 BR BRPI0721123-6A patent/BRPI0721123A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2007-12-03 DK DK07862429.3T patent/DK2124603T3/en active
- 2007-12-03 ES ES07862429.3T patent/ES2529237T3/es active Active
- 2007-12-03 EP EP07862429.3A patent/EP2124603B1/en not_active Revoked
- 2007-12-03 NZ NZ577510A patent/NZ577510A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-12-03 AU AU2007343749A patent/AU2007343749B2/en not_active Ceased
- 2007-12-03 US US12/519,317 patent/US20100273718A1/en not_active Abandoned
- 2007-12-03 CN CN200780047281.4A patent/CN101594785B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5866357A (en) * | 1990-03-09 | 1999-02-02 | Novo Nordisk A/S | Method for hydrolyzing proteins with gluyasp specific protease |
CN1105818A (zh) * | 1993-06-30 | 1995-08-02 | 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 | 乳蛋白部分水解产物及其制备方法 |
CN1596676A (zh) * | 2004-08-30 | 2005-03-23 | 江南大学 | 一种酶法改性乳蛋白的方法及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Enzymatic production of hypoallergenic peptides from casein;Nakamura T et al.;《Milchwissenschaft》;Volkswirtschaftlicher Verlag;19931231;第48卷(第1期);11-14 * |
Nakamura T et al..Enzymatic production of hypoallergenic peptides from casein.《Milchwissenschaft》.Volkswirtschaftlicher Verlag,1993,第48卷(第1期),11-14. |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NZ577510A (en) | 2012-06-29 |
ES2529237T3 (es) | 2015-02-18 |
BRPI0721123A2 (pt) | 2014-07-08 |
DK2124603T3 (en) | 2015-02-16 |
CN101594785A (zh) | 2009-12-02 |
AU2007343749B2 (en) | 2013-01-10 |
WO2008088472A3 (en) | 2008-10-02 |
US20100273718A1 (en) | 2010-10-28 |
WO2008088472A2 (en) | 2008-07-24 |
EP2124603B1 (en) | 2014-11-19 |
AU2007343749A1 (en) | 2008-07-24 |
EP2124603A2 (en) | 2009-12-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101594785B (zh) | 潜在免疫原性降低的乳蛋白水解产物 | |
Boland et al. | Milk proteins: from expression to food | |
Al Kanhal | Compositional, technological and nutritional aspects of dromedary camel milk | |
JP6693807B2 (ja) | 乳製品および調製方法 | |
Abd El-Salam et al. | Preparation, properties, and uses of enzymatic milk protein hydrolysates | |
Manso et al. | κ-Casein macropeptides from cheese whey: Physicochemical, biological, nutritional, and technological features for possible uses | |
KR0140248B1 (ko) | 신규한 카제인 포스포펩티드, 그것을 포함하는 카제인 및 그 제조방법 | |
US20170099852A1 (en) | Assembly of at least one plant protein and at least one milk protein, production thereof and uses of same | |
CN101098626A (zh) | 乳制品及其制备方法 | |
CA2150571C (en) | Low-phosphorus whey protein, manufacturing method thereof, low-phosphorus purified whey hydrolysate and manufacturing method thereof | |
Halavach et al. | Biologically active properties of hydrolysed and fermented milk proteins | |
Atanasova et al. | Formation of free amino acids and bioactive peptides during the ripening of Bulgarian white brined cheeses | |
Al-Otaibi et al. | Effect of chymosin reduction and salt substitution on the properties of white salted cheese | |
De Boer | From milk by-products to milk ingredients: upgrading the cycle | |
Ahmad | Buffalo milk | |
AU723396B2 (en) | Food product and process | |
Medeiros et al. | Bovine milk formula based on partial hydrolysis of caseins by bromelain enzyme: Better digestibility and angiotensin-converting enzyme-inhibitory properties | |
AU2015262094B2 (en) | Method for the preparation of an acid dairy drink and said acid dairy drink | |
JP2003250460A (ja) | 乳蛋白質の機能性改質方法 | |
Lajnaf et al. | Characteristics of cow milk proteins and the effect of processing on their allergenicity | |
SHAH et al. | Prospective utilization of valuable dairy by-product: whey. | |
Petit et al. | In vitro protein digestion of infant formula manufactured with β-casein-enriched whey | |
Ospanov et al. | MODERNIZATION OF THE FOOD INDUSTRY IN THE REPUBLIC OF KAZAKHSTAN, ON THE EXAMPLE OF COMBINED PRODUCTS FROM SHEEP MILK. | |
Smithers et al. | 1997 International Whey Conference | |
Antsyperova et al. | Development of Formulation and Technology of Low-lactose Dairy Beverage Made from Goat Milk |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: Copenhagen Applicant after: Danisco Address before: Copenhagen Applicant before: Danisco A/S |
|
COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: DYNISCO, INC. TO: DUPONT NUTRITION BIOSCIENCES APS |
|
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140108 Termination date: 20161203 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |