CN101514991A - 甲胎蛋白磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种AFP磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明的试剂盒包括：1)AFP校准品；2)抗异硫氰酸酯荧光素(FITC)单克隆抗体包被的磁微粒溶液；3)生物素标记的AFP单克隆抗体与FITC标记的AFP单克隆抗体的混合液；4)辣根过氧化物酶标记的链亲和素；5)化学发光底物液；以及6)反应管。进一步，根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：1)以AFP纯品配制校准品；2)制备FITC抗体包被的磁微粒溶液；3)制备生物素标记的AFP单克隆抗体与FITC标记的AFP单克隆抗体的混合液；4)用辣根过氧化物酶标记链亲和素；5)配制化学发光底物液；6)分装上述校准品、磁颗粒溶液、混合液、酶标记物、化学发光底物液和反应管；以及7)组装为成品。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。

Description

甲胎蛋白磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种宽范围、高灵敏测定甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)的磁微粒化学发光免疫分析试剂盒及其制备方法。本发明试剂盒结合了生物素-亲和素免疫放大技术、免疫磁微粒分离技术和化学发光免疫分析技术。

背景技术

癌症自从诞生之日起就对人类的生存健康构成了严重威胁。目前肿瘤治疗的关键在于早期发现、早期治疗。但是目前医院诊断早期肿瘤，主要是靠影像学和细胞病理学诊断技术，一般都是在具有明显的占位性病变和临床症状后才得以确诊，但这已不是癌变的最早期。随着肿瘤早期诊断进入蛋白质时代，以血液为代表的体液蛋白质成为肿瘤标志研究领域中的热点。越来越多肿瘤标志物的发现对建立发展快速、高灵敏、高特异肿瘤标志物新型检测技术提出了更高的要求。

原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC，又称为Primary liver cellcarcinoma)，是世界范围内第五大常见癌症，致命率居于第三位。在中国，肝癌发病率是世界其它地区的三到四倍，占世界肝癌发病总数的40％多。目前报道的关于HCC的肿瘤标志物有多种，其中以甲胎蛋白(AFP)最受关注。AFP是由一个天冬酰胺连接到糖链上的一种糖蛋白，分子量大约为70000Dalton，在胚胎发育阶段由婴儿的卵黄囊和肝脏大量分泌，婴儿出生后12～18个月内迅速减少，血清含量低于10μg/L。血清学检测AFP作为HCC参照物已经被世界多家权威机构认可，包括：欧洲肝脏研究协会(EASL)、英国胃肠病学研究协会(Br Soc GE)、欧洲肿瘤标志物组织(EGTM)和美国国立综合癌症网(NCCN)。并且AFP做为HCC诊断参考标准也受到美国NACB(National Academy of Clinical Biochemistry)的支持，该机构强调甲胎蛋白检测并连续观察AFP在体内的变化情况对于早期诊断HCC具有重要的临床价值。由于AFP在非肿瘤人群(如肝炎)或孕妇体内均有可能大幅升高，所以宽范围的检测是必需的。例如AFP在100～300μg/L之间者必须进行随访，密切观察AFP的动态变化，注意可能的小肝癌；AFP在350～500μg/L，或含量明显增高者，必须参考其他检查，高度警惕原发性肝癌的可能；AFP为500～1000μg/L，且含量在短期内不断升高，原发性肝癌可能性很大，但必须建议做活检；AFP大于1000μg/L者，甚至在近期内AFP含量迅速升高，则原发性肝癌诊断基本可确定。所以高灵敏的检测是疾病早期预警的要求，而宽范围又是动态监测所必需的。

免疫学测定是以抗体-抗原的特异性识别、抗体标记技术和示踪技术为基础的定量技术，在肿瘤标志物的体液检测中具有广泛应用。目前检测AFP的免疫学方法主要有石英晶体微天平法、元素示踪ICP-MS法、空间分辨荧光法、乳液光度免疫分析法、电化学免疫分析、毛细管电泳-化学发光检测。这些方法均具有不可避免的不足之处：如石英晶体微天平、ICP-MS价格昂贵，空间分辨荧光法易受到环境的干扰，光度分析法检测灵敏度较低、毛细管电泳的重现性较差，而电化学免疫分析又需要特殊的装置。同时这些方法的工作范围大多在0～600μg/L之间，对高浓度样品必须进行稀释方可测定，根本无法满足含量大于600μg/L后的连续监测。化学发光免疫分析法结合了免疫反应的高特异性和化学发光反应的高灵敏性，仪器简单，成本低廉，可达到10^-18摩尔检测水平，且检测范围可达6个数量级，因而得到了越来越多的关注。

在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的样品基质中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。免疫磁微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲合力的各种免疫活性物质(抗原或抗体)，使其致敏为免疫磁微粒，具有分离速度快、效率高、可重复性好；操作简单；不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。

免疫磁微粒技术与化学发光免疫分析技术结合检测待测物，可大大提高检测的灵敏度和准确性，它以微米级磁微粒为载体，利用表面有机物提供的羧基活性基团与蛋白质氨基共价结合，采用抗体进行“搭桥”成免疫磁微粒，可进行抗原、抗体反应。该技术的新颖之处有：(1)采用微小的磁微粒作为固相可增加包被表面积，从而增加了抗体的有效包被量，不仅节省了抗体，而且有助于建立宽范围的免疫检测方法，尤其适合于高浓度临床样本的测定，避免弯钩效应的发生；(2)利用顺磁铁微粒为固相载体，外包被单克隆抗体，增加抗原、抗体的接触面积及底物发光面积，提高反应的灵敏度，并采用旋转磁场使磁微粒起搅拌作用及分离结合抗原-抗体与游离抗体的作用；(3)在液相反应中，使用发光增强剂，将水分子从发光底物的发光位点排开，同时还可缩短发光的达峰时间；(4)使用单克隆抗体，提高了反应的特异性。

生物素-亲和素***(biotin-avidin system，BAS)具有多级的信号放大作用，并且不增加非特异性干扰，且具有灵敏度高、特异性好、稳定性高、适用性强和实验成本低等特点。生物素-亲和素免疫放大技术可以直接用标记亲和素连接生物素化大分子反应体系进行检测，这种方法称为标记亲和素-生物素法。待测反应体系可以利用生物素化抗体，使得亲和素-生物素***与免疫分析检测体系偶联，放大终反应：先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与抗原(标准抗原和待测抗原)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物，再加入亲和素与复合物中的生物素结合，最终使反应信号放大，从而提高了免疫分析的灵敏度。

化学发光免疫分析结合生物素-亲和素***和免疫磁微粒固相分离体系是一种检测AFP的先进而有效的方法，有助于促进化学发光免疫分析技术在临床检验、检测中的应用与发展。曾经有文献报道利用生物素-亲和素***的信号放大原理实现对AFP的荧光免疫检测，但与化学发光检测及磁微粒***结合建立高灵敏、宽范围的方法则未见报道。并且现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒为封闭式全自动化学发光测量***，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。本发明是在酶免疫分析的基础上应用酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶免疫分析中的显色底物，因而其灵敏度大大提高，并且操作简便适用性广，既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量***，可实现大批量、快检测，使用成本低，更易推广应用。

发明内容

本发明同时解决了上述问题，即将生物素-亲和素免疫放大技术和免疫磁微粒技术结合化学发光免疫分析技术，检测AFP，提供了一种高灵敏、宽范围、简便快速、稳定地定量检测AFP的测定试剂盒，该试剂盒适于产业化，具有良好的市场应用前景。

本发明的目的是提供一种生物素-亲和素免疫放大技术和免疫磁微粒技术结合化学发光免疫分析定量测定AFP的磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒。

本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。

根据本发明的试剂盒包括：1)AFP校准品；2)抗异硫氰酸酯荧光素(FITC)单克隆抗体包被的磁微粒溶液；3)生物素标记的AFP单克隆抗体与FITC标记的AFP单克隆抗体的混合液；4)辣根过氧化物酶标记的链亲和素液；5)上述酶所作用的化学发光底物液；以及6)反应管。

进一步，根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：

1)以AFP纯品配制校准品；

2)制备抗FITC单克隆抗体包被的磁微粒溶液；

3)制备生物素标记的AFP单克隆抗体与FITC标记的AFP单克隆抗体的混合液；

4)以辣根过氧化物酶标记链亲和素；

5)配制辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物液；

6)分装上述校准品、抗体包被的磁微粒、生物素标记物与FITC标记物的混合液、酶标记物和化学发光底物液和反应管；以及

7)组装为成品。

根据本发明的方法，在所述制备抗FITC单克隆抗体包被的磁微粒步骤2)中：

所述磁微粒为2～3μm粒径、四氧化三铁内核、表面包裹带有活性基团的聚合物，其使用浓度为3～8mg/mL；

所述抗体包被磁微粒是通过戊二醛两步法以抗FITC单克隆抗体包被磁微粒；

以封闭液封闭包被的磁微粒，所述封闭液为含有0.2％～1.0％牛血清白蛋白、0.5％～1.0％酪蛋白、pH值为7.2的0.02mol/L磷酸缓冲液。

所述制备生物素标记的AFP单克隆抗体与FITC标记的AFP单克隆抗体的混合液步骤3)中：

所述生物素标记物和FITC标记物的混合液是将抗生物素标记的AFP单克隆抗体和FITC标记的AFP单克隆抗体以体积比为1∶2混合，以20～40％小牛血清配制而成；

所述生物素标记的AFP单克隆抗体是通过生物素琥珀酰亚胺酯在微碱性条件下与抗体游离赖氨酸发生偶联反应而实现的。

根据本发明的方法，在所述以辣根过氧化物酶标记链亲和素的步骤4)中，采用改良过碘酸钠法以辣根过氧化物酶标记链亲和素。

根据本发明的方法，所述化学发光底物液包含A液和B液，其中，

A液是在双蒸水中加入Tris和浓HCl配成0.1M pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，包含4.0mg/mL的鲁米诺或异鲁米诺和0.3mg/mL的对碘苯酚；

B液是在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成0.1M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液，包含200mg/mL的过氧化氢溶液。

在根据本发明制备上述试剂盒的方法中，使用透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃作为反应管材料。

具体的上述试剂盒可以包括校准品、磁微粒溶液、生物素标记物和FITC标记物的混合液、酶标记物、化学发光底物液与洗涤缓冲液等。其中，所述校准品的原料为标准级，纯度不低于90％；抗FITC抗体包被于磁微粒上；FITC标记抗体与生物素标记的抗体形成混合液；标记链亲和素的酶为辣根过氧化物酶；化学发光底物液为鲁米诺或异鲁米诺；洗涤缓冲液为磷酸盐缓冲液。

本发明“甲胎蛋白磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒”可以“宽范围、高灵敏”检测出原发性肝癌患者体内的AFP含量，可以根据AFP含量的多少判断病情的变化及治疗效果。本发明的试剂盒(化学发光法、生物素-亲和素免疫放大技术与免疫磁微粒结合)具有简便快速、高灵敏、宽范围、稳定等优点，且各项指标均达到同类进口试剂盒的分析法水平。并且，根据本发明的检测***为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。

根据本发明的试剂盒，抗FITC单克隆抗体包被的磁微粒、FITC标记的单克隆抗体、生物素标记的单克隆抗体和待测样品中的AFP，形成“双夹心免疫复合物”，之后酶标记的链亲和素再与该复合结构结合，形成“磁微粒-抗体-待测抗原-抗体-生物素-亲和素-酶”复合物，最后与化学发光底物作用而产生并放大光信号，在管式发光仪中对AFP进行高灵敏、宽范围、高特异检测。

本发明采用“双抗体直接夹心两步法”反应模式，有效地利用了化学发光技术结合磁微粒和生物素-亲和素免疫放大技术原理，定量检测人体血清、血浆样品中AFP含量，确保了检测的灵敏度。使用的磁微粒具有超顺磁、高分散、表面积大的特点。对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单可靠，可快速、高通量检测大批样品，便于操作和生产。本发明的试剂盒结构简单，使用方便，价格便宜，携带便利，与市场上的酶免疫试剂盒、板式化学发光试剂盒相比，线性范围宽，有效避免弯钩效应，不需样品稀释，适用于大批量检测样品。

附图说明

图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图(双对数标准曲线)。

图2为本发明的试剂盒同国外试剂盒(Monobind公司微板式化学发光试剂盒)临床血样测值比对的相关曲线。

具体实施方式

实施例1制备本发明的AFP磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒

一、AFP校准品的制备

用马血清将AFP纯品稀释成校准品，分装0μg/L、15μg/L、50μg/L、150μg/L、500μg/L、1000μg/L共6瓶。

二、抗FITC单克隆抗体包被磁微粒溶液的制备

将粒径为2～3μm的磁微粒用戊二醛进行活化，室温搅拌，混匀2小时后，加磁场，静置20～25min，倒出上清，用pH值为7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液清洗三次，并用该溶液进行悬浮，浓度为50～100mg/mL；每毫升悬浮液中加入抗FITC单克隆抗体60～100μg，在4℃下搅拌过夜后，加磁场，静置10～15min，倒出上清，用含有0.2％～1.0％牛血清白蛋白、0.5％～1.0％酪蛋白、0.02mol/L的磷酸缓冲液(pH为7.2)于室温封闭3～4小时；最后用pH值为7.4、含吐温-20和叠氮化钠防腐剂的磷酸盐洗涤缓冲液清洗3～5次，并用该溶液配制成5～10mg/mL的工作液。磁微粒溶液在4℃保存，不应冻存，用时轻轻摇匀。

三、生物素标记物和FITC标记物的混合液的制备

1、生物素标记的AFP单克隆抗体的制备

生物素标记AFP单克隆抗体以生物素琥珀酰亚胺酯在微碱性条件下与单抗发生偶联反应，对PBS充分透析，生物素标记物以小牛血清稀释，加入proclin 300，-20℃以下保存。

2、FITC标记的AFP单克隆抗体的制备

FITC可以与抗体的伯氨基直接反应。将适量抗AFP单克隆抗体置于透析袋在50mmol·L^-1NaHCO3缓冲液(pH 9.3)中过夜透析后，置入溶有适量FITC的50mmol·L^-1碳酸盐缓冲液(pH 9.5)中，在4℃下搅拌反应16～20小时。更换透析液，以0.01mol·L^-1PBS液(pH 7.4)为透析液，每隔4～6小时更换一次，共更换4～5次。之后提取反应液于离心管中，3000rpm离心30min，弃去沉淀。标记物中加入等体积甘油后，置-20℃下保存待用。

3、混合液的制备

将生物素标记的AFP单克隆抗体与FTIC标记的AFP单克隆抗体以体积比为1∶2混合，以20～40％小牛血清配制而成。

四、辣根过氧化物酶标记的链亲和素的制备

以辣根过氧化物酶标记链亲和素采用改良过碘酸钠法，具体标记过程如下：

称取3～6mg辣根过氧化物酶溶解于1.5mL双蒸水，加入新鲜配制的0.05mol/LNaIO₄0.3～0.5mL，室温搅拌10min；经1mmol/L、pH 4.5～5.0的醋酸盐缓冲液于4℃透析4～10h后，加入链亲和素(4～8mg/mL)1.5mL，搅拌2～5h；用4～8mg/mL的NaBH₄0.15mL进行还原；经0.01mol/L、pH 7.2PBS缓冲液透析过夜后，离心去除沉淀；加等体积甘油，分装后，-20℃以下保存。

四、酶标记物的浓度选定

采用方阵法选择酶标记物的工作浓度范围为1∶3000～5000。

五、酶标记物稀释液

Tris    12.12g

BSA     5g

Proclin    1mL

双蒸水     1000mL

六、化学发光底物液

本发明所使用的辣根过氧化物酶(HRP)的化学发光底物液的配制方法：

A液：在双蒸水中加入Tris和浓HCl配成0.1M pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液。在此缓冲液中加入4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的对碘苯酚等发光增强剂。

B液：在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸，配制成0.1M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液，在此溶液中加入200mg/mL的过氧化氢溶液。

使用方法：A、B液双组分试剂，在使用前根据使用量等体积混合。

七、洗涤缓冲液

洗涤缓冲液是含有0.1～0.5％吐温-20、0.1％叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液，pH值为7.4。使用时用蒸馏水稀释20倍。

八、半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成AFP磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒，组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。

实施例2本发明的试剂盒的使用方法

一、样品前处理

取人的空腹晨血清样品，3000rpm离心5min，取上层血清进行分析。

二、检测方法

使用本试剂盒进行实验前，需先取出磁微粒溶液、生物素标记物与FITC标记物混合液、校准品/待测样品、酶标记亲和素在室温放置15～30分钟，使它们平衡到室温；之后，将恒温温箱或者水浴锅调至37℃；再后，准备好合适的微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪是否正常工作。

使用本试剂盒按照实施例2的方法进行实验的具体操作步骤如下：

将圆底聚苯乙烯试管编号后，向试管中加入25μL血清样品或系列校准品溶液，校准品每管加0μg/L、15μg/L、50μg/L、150μg/L、500μg/L、1000μg/L各25μL，再先后加入标记物混合液和磁微粒溶液各50、100μL，37℃振荡反应15min。再加入辣根过氧化物酶标记的亲和素50μL，37℃振荡反应15min。之后，将试管架置于磁分离器上分离1min，然后倒转分离器倒出上清液，将倒转的试管放在滤纸上吸干，拍击分离器以除去挂壁液体。每管加入洗涤液500μL，充分混匀，置于磁分离器上分离1min，倒出上清液，将倒转的试管放在滤纸上吸干，拍击分离器以除去挂壁液体，重复4次。各管加入化学发光底物液200～400μL，充分混匀，置于磁分离器内，待磁微粒富集于底部后，暗处放置5min，而后在管式化学发光测量仪上依序测量各管的发光强度(RLU)。以校准品浓度的Log值为横坐标，RLU的Log值为纵坐标绘出标准曲线(双对数曲线)，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清AFP的浓度，见附图1，其中，I为发光强度，C为AFP浓度(单位为μg/L)，相关系数r＝0.9963，Y＝0.9913+0.0491X。

实施例3本发明的试剂盒的方法学检定

按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，结果如下：

1、试剂盒精密度测定

(1)标准品精密度实验

将实施例1中制备的试剂盒分别取三批进行精密度实验，每批抽取10个试剂盒。以实施例1中所抽取的试剂盒测定50μg/L的AFP标准品5次。计算测定浓度的变异系数。实施例1中的三批试剂盒的测定结果如表1所示，结果表明变异系数在之3.8％～7.3％之间。

表1AFP标准可重复性实验

(2)样本精密度实验

将实施例1中制备的试剂盒分别取三批进行精密度实验，每批抽取10个试剂盒。以实施例1中所抽取的试剂盒测定110μg/L和220μg/L的AFP样品5次。计算测定浓度的变异系数。实施例1中的三批试剂盒的测定结果如表2、表3所示，结果表明变异系数小于8.4％。

表2 110μg/L血清样品精密度测定

表3 220μg/L血清样品精密度测定

2、试剂盒准确度测定

取两个AFP临床定值血清，浓度分别为75.8μg/L和105.6μg/L，分别向其中加入等体积的AFP标准品溶液15μg/L和50μg/L，按照实施例1的方法对每个浓度做3个平行，计算回收率。结果如表4所示，表明AFP的添加回收率在93.0％～102.0％之间之间。

表4准确度测定

3、试剂盒稳定性实验

对实施例1的试剂盒进行37℃7天加速实验后，测定试剂盒的最大、最低发光强度、待测物的加标回收率等结果表明实施例1的试剂盒指标均在正常范围之内。对实施例1的试剂盒主要组分进行2～8℃8个月跟踪实验，结果表明各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况的发生，将实施例1的试剂盒放入-20℃冷冻7天，测定结果也表明试剂盒的各项指标完全正常。从以上结果可以看出试剂盒可以在2～8℃至少可以保存6个月以上。

经过大量的实验证明，本发明的试剂盒方法学指标如下：

检测范围：0～1000μg/L；

灵敏度：最小检出限为1.0μg/L；

精密度：小于9％(n＝5)；

准确性：平均回收率在93.0％～102.0％之间；

特异性：与CA19-9、CEA、CA125、CA50、CA15-3等常见的肿瘤标志物的交叉反应率小于0.1％；

稳定性：各试剂组分置37℃，考察7天后，各组分仍稳定。

说明“甲胎蛋白磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒”的临床检测范围、灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性是完全合格的。

综上，在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量检定，包括包被抗体的活性、磁微粒的吸附性能和变异大小、HRP的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。然后对包被方法进行了研究，用不同的包被缓冲液和封闭液进行实验，选择出最适合的包被液和封闭液，通过抗体不同包被浓度实验找到最佳的浓度条件。对于HRP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对不同的酶稀释液进行了长期的考察实验，配制出了能够使酶标记物长期保持活性稳定的稀释液。

本发明的发明人还对试剂盒的反应模式和反应条件进行了实验研究，最终确定了双抗体夹心两步法反应模式，并就不同的反应时间对实验结果的影响进行了实验，确定最适合的反应时间。

利用本发明方法进行检测，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强，更适用于我国临床检测筛查实验室。因此本发明为临床检测AFP，诊断原发性肝癌，以及对肝癌的早期预警和动态监测，提供了一种灵敏、准确、快捷、特异的方法。

实施例4本发明的试剂盒同国外试剂盒临床血样测值比对

用本发明的试剂盒和Monobind公司的AFP微板式化学发光试剂盒对80份肿瘤病人的临床血清样品同时进行检测，所采用的92份临床血样来自首都医科大学附属天坛医院和首都医科大学附属友谊医院。其检测结果见附图2，以本发明方法测定的血样AFP结果为横坐标，以Monobind测定的结果为纵坐标作回归分析，相关方程为：Y＝1.0330X-1.9684，相关系数r＝0.9895。经统计学处理结果表明，本发明方法同国外试剂盒临床血样测值相关性良好。

Claims (11)

1、一种甲胎蛋白磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)AFP校准品；

2)抗异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)单克隆抗体包被的磁微粒溶液；

3)生物素标记的AFP单克隆抗体与FITC标记的AFP单克隆抗体的混合液；

4)辣根过氧化物酶标记的链亲和素；

5)上述辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物液；以及

6)反应管。

2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的AFP单克隆抗体与FITC标记的AFP单克隆抗体的混合比例为1∶2。

3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液包含A液和B液，其中，

A液是0.1M pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，包含4.0mg/mL的鲁米诺或异鲁米诺和0.3mg/mL的对碘苯酚；

B液是0.1M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液，包含200mg/mL的过氧化氢溶液。

4、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒使用的反应管材料为透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃。

5、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以AFP纯品配制校准品；

2)制备抗FITC单克隆抗体包被的磁微粒；

3)制备生物素标记的AFP单克隆抗体与FITC标记的AFP单克隆抗体的混合液；

4)以辣根过氧化物酶标记链亲和素；

5)配制辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物鲁米诺或异鲁米诺；

6)分装上述校准品、磁颗粒溶液、混合液、酶标记物、化学发光底物液和反应管；以及

7)组装为成品。

6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述制备抗FITC单克隆抗体包被的磁微粒步骤2)中：

所述磁微粒为2～3μm粒径、四氧化三铁内核、表面包裹带有活性基团的聚合物，其使用浓度为3～8mg/mL；

所述抗体包被磁微粒是通过戊二醛两步法以抗FITC单克隆抗体包被磁微粒；

以封闭液封闭包被的磁微粒，所述封闭液为含有0.2％～1.0％牛血清白蛋白、0.5％～1.0％酪蛋白、pH值为7.2的0.02mol/L磷酸缓冲液。

7、如权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述制备生物素标记的AFP单克隆抗体与FITC标记的AFP单克隆抗体的混合液步骤3)中：

所述生物素标记物和FITC标记物的混合液是将抗生物素标记的AFP单克隆抗体和FITC标记的AFP单克隆抗体以体积比为1∶2混合，以20～40％小牛血清配制而成；

所述生物素标记的AFP单克隆抗体是通过生物素琥珀酰亚胺酯在微碱性条件下与抗体游离赖氨酸发生偶联反应而实现的。

8、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述活性基团为氨基或羧基。

9、如权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述以辣根过氧化物酶标记链亲和素的步骤4)中，采用改良过碘酸钠法以辣根过氧化物酶标记链亲和素。

10、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物液包含A液和B液，其中，

A液是0.1M pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液，包含4.0mg/mL的鲁米诺或异鲁米诺和0.3mg/mL的对碘苯酚；

B液是0.1M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液，包含200mg/mL的过氧化氢溶液。

11、如权利要求5所述的方法，其特征在于，使用透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃作为反应管材料。

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