JP7159304B2 - 腫瘍および/または癌の処置のための医薬のための単離された組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス、医薬組成物、およびそれらの使用 - Google Patents
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Description
(1) 単離された組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスであって、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは選択的に複製する腫瘍溶解性アデノウイルスであり、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムは、腫瘍細胞によるPDL1の発現を阻害することができる外来性のshRNAのコード配列をインテグレーションされる。
(2) (1)に従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスであって、外来性のshRNAのコード配列は配列番号16、19、および22のいずれか1つに示されている通りである。
(3) (1)に従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスであって、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムはE1B19K遺伝子、E1B55K遺伝子、およびE3領域の全ての遺伝子を欠失する。
(4) (1)または(3)に従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスであって、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムはE1A遺伝子のコード配列を含み、好ましくは、E1A遺伝子のコード配列はCMVプロモーターのコントロール下にある。
(5) (1)に従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスであって、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスはアデノウイルス5型を遺伝子改変することによって得られる。
(6) 医薬組成物であって、医薬組成物は、活性成分としての(1)から(5)のいずれか1つに従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスと薬学的に許容される添加剤とを含む。
(7) (6)に従う医薬組成物であって、医薬組成物は組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを5×107から5×1012vp/日の範囲である用量で含む。
(8) (6)に従う医薬組成物であって、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは腫瘍内注射によって投与または静脈内投与されるように製剤される。
(9) (1)から(5)のいずれか1つに従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを調製するためのベクターであって、ベクターはプロモーターのコントロール下の外来性のshRNAのコード配列を含有し、shRNAのコード配列は配列番号16、19、および22のいずれか1つに示されている通りである。
(10) (9)に従うベクターであって、ベクターはpShuttleを基本バックボーンとして用い、基本バックボーンは、作動可能に連結された外来性のshRNAのコード配列の発現をコントロールするプロモーター、外来性のshRNAのコード配列、E1A遺伝子のコード配列の発現をコントロールするプロモーター、およびE1A遺伝子のコード配列を順に含む。
(11) (9)または(10)に従うベクターを含む宿主細胞。
(12) (11)に従う宿主細胞であって、宿主細胞はベクターを安定発現する。
(13) 単離されたshRNAであって、shRNAのコード配列は配列番号16、19、および22のいずれか1つに示されている通りであり、shRNAは腫瘍細胞によるPDL1の発現を阻害することができる。
(14) 腫瘍および/または癌の処置のための医薬の調製のための、(1)から(5)のいずれか1つに従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの使用。
(15) (14)に従う使用であって、腫瘍および/または癌は肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、および精巣癌を包含する。
(16) 腫瘍および/または癌を処置するための方法であって、(1)から(5)のいずれか1つに従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを腫瘍および/または癌患者に投与することを含む。
(17) (16)に従う方法であって、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは、5×107から5×1012vp/日の範囲である用量で、1日1回または2回、連続1から7日に渡って与えられる。
(18) (16)に従う方法であって、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは腫瘍内注射によって投与または静脈内投与される。
(19) (16)に従う方法であって、腫瘍および/または癌は肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、および精巣癌を包含する。
(20) 単離された組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスであって、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスは選択的に複製する腫瘍溶解性アデノウイルスであり、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムはE1B19K遺伝子、E1B55K遺伝子、およびE3遺伝子領域の全ての遺伝子を欠失し、好ましくは、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムはE1A遺伝子のコード配列を含み、より好ましくは、E1A遺伝子のコード配列はCMVプロモーターのコントロール下にある。
本願において用いられる用語「腫瘍」、「癌」、「腫瘍細胞」、および「癌細胞」は、当分野において通常認識される意味を包摂する。
本願において用いられる用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、腫瘍細胞内で選択的に複製し、腫瘍細胞を溶解し得るウイルスを言う。
本願において用いられる用語「治療有効量」は、検出測定可能な治療もしくは阻害効果を見せるかまたは抗腫瘍応答を誘起するために有用な機能性薬剤または医薬組成物の量を言う。効果は当分野において公知のいずれかのアッセイ方法によって検出測定され得る。
本願において用いられる用語「投与する」または「投与」は、化合物、複合物、または組成物(ウイルスおよび細胞を包含する)を対象に提供することを言う。
本願において用いられる用語「患者」はヒトまたは非ヒト生物を言う。それゆえに、本願に記載される方法および組成物はヒトおよび獣類の疾患両方に適用可能である。ある種の実施形態では、患者は腫瘍を有する。いくつかのケースでは、患者は同時に1つ以上の型の癌に罹患し得る。
本願において用いられる用語「相乗効果」は、それらの個々の効果の合計よりも多大な効果を生ずる2つ以上の薬剤から生起する効果を言う。
本願において用いられる用語「pfu」または「プラーク形成単位」はプラークを形成するウイルス数を言う。
本願において用いられる用語「VP」はウイルス粒子数を言う。
本願において用いられる用語「VP/kg」は患者の体重のキログラムあたりのウイルス粒子数を言う。
本願において用いられる用語「TCID50」は50%培養組織感染量を表し、培養細胞の50%において感染に至り、細胞変性効果を引き起こすウイルス用量を言う。
本願において用いられる用語「MOI」または「多重感染度」は、ウイルス数および細胞数の間の比、すなわち細胞あたりのウイルス感染を開始するために用いられるウイルス粒子数を言う。MOI=pfu/細胞数、すなわち細胞数×MOI=トータルのPFU。
(a) 第1の薬学的に許容される担体中に本開示の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを含む第1の医薬組成物と、
(b) 第2の薬学的に許容される担体中にNK細胞を含む第2の医薬組成物と、
を含む治療薬を提供する。
1) 本開示に従う組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを腫瘍および/または癌患者に投与すること、
2) 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの投与の18~72時間(例えば、20~70時間、22~48時間、24~48時間、30~48時間など)後に、本開示に従うNK細胞を腫瘍および/または癌患者に投与すること。
実験に用いたNK細胞の起源は次の通りである。
各例に用いたNK細胞は杭州康万達医薬科技有限公司によって培養および凍結保存されたヒトNK細胞であった。ヒトNK細胞は次のプロセスによって調製した。当分野の通常用いられる技術として、採血針を尺骨静脈に挿入して、免疫細胞PBMCの抽出のために健康人の末梢静脈血を採集した。放射線照射済みK562フィーダー細胞(杭州鼎云生物技術有限公司から購入)を用いて、自家血漿培養によってNK細胞を拡大し、NK細胞は最高で90%の最終純度、最高で90%の生存可能性、および最高で85%のインビトロ腫瘍細胞殺傷率を有した。
CCK8アッセイ:10μlのCCK8溶液を各ウェルの細胞に追加し、それから細胞をインキュベータ内で、37℃で1~4時間に渡ってインキュベーションし、それからシェーカー上で低速で5分に渡って振盪した。結晶物を充分に溶解および均一混合させ、マイクロプレートリーダーを用いて450nmの吸光度値(OD450)を測定した。阻害率の計算式は次の通りである。細胞増殖阻害率(IR%)=1-(OD450試験産物-OD450ブランク)/(OD450負のコントロール-OD450ブランク)×100%。
MTTアッセイ:10μlのMTT溶液(5mg/ml)を各ウェルの細胞に追加し、それから細胞をインキュベータ内で、37℃で4時間に渡ってインキュベーションし、培養培地を吸って捨て、150μlのDMSOを各ウェルに追加し、それからシェーカー上で低速で10分に渡って振盪した。結晶物を充分に溶解および均一混合させ、マイクロプレートリーダーを用いて490nmの吸光度値(OD490)を測定した。阻害率の計算式:細胞増殖阻害率(IR%)=1-(OD490試験産物-OD490ブランク)/(OD490負のコントロール-OD490ブランク)×100%。
トリパンブルー染色法を用いる細胞計数:細胞をPBSによって洗浄し、トリプシンを用いて消化し、それから細胞をPBSに懸濁した。懸濁液に、0.04%(w/v)の終濃度でトリパンブルー溶液を追加した。それから、細胞計数を顕微鏡下で行った。これの間に、死細胞は青く染色され、生細胞は未染色のままであった。生細胞数を最終的なデータとして用いた。
各例に用いた6ウェル細胞培養プレート(ウェルあたり2ml)、12ウェル細胞培養プレート(ウェルあたり1ml)、24ウェル細胞培養プレート(ウェルあたり500μl)、96ウェル細胞培養プレート(ウェルあたり100μl)は全てコーニング社から得た。
2つのPCRプライマー(P1:GGAAGATCTGGACTGAAAATGAG(配列番号1)およびP2:TGAGGTCAGATGTAACCAAGATTA(配列番号2)。注:プライマーP1の5’端にはBglII制限部位を追加し、これは下線で示す)を、ヒトアデノウイルス5型(AD5)ゲノムDNA配列(NCBI(すなわち、国立生物工学情報センター。https://www.ncbi.nlm.nih.gov)のGenbankのアクセッション:AC_000008)に基づいて設計した。上海三維生物技術有限公司によって産生された腫瘍溶解性ウイルス(H101)のゲノムDNAを抽出し、鋳型として用い、AD5ゲノムDNAの551~1714の1164bp配列を高フィデリティPCRによって鋳型から増幅した。実際のサイズは1173bpである(図1参照)。この配列はE1A遺伝子のコード領域(E1Aプロモーター配列を包含しない)および部分的な3’UTR領域を包含する。得られたPCR産物をBglIIによって消化し、ベクターpShuttle-CMV(Agilentから購入)のマルチクローニング部位領域(MCS)のBglIIおよびEcoRV部位の間にクローニングし、それによって中間体ベクターpShuttle-E1Aを得た。得られたpShuttle-E1A陽性クローンはP1およびP2によるPCRによって確認した。結果は図2に示し、構築プロセスは図3に示した。得られた陽性クローンをシーケンシングし、シーケンシング結果はAD5ゲノムDNA上の対応する配列と完全に一致した。
それぞれPDL1のコード領域のmRNAの168~190、430~452、および589~611の3つの領域を標的化する3つのshRNA配列(shPDL1-1(shPDL1-#1ともまた言う)、shPDL1-2(shPDL1-#2ともまた言う)、およびshPDL1-3(shPDL1-#3ともまた言う)。これらはそれぞれ配列番号16、配列番号19、および配列番号22である)を、NCBIウェブサイトのGenbankのヒトPDL1バリアント1配列(アクセッション:NM_014143)に基づいて設計した。加えて、ヒトPDL1のmRNAとは無関係である負のコントロール配列shPDL1-NCを設計した。配列は次の通りである。
合成センス配列(配列番号14):
合成センス配列(配列番号17):
合成センス配列(配列番号20):
合成NCセンス配列(配列番号23):
hPDL1のmRNA(ヒトPDL1のmRNA)に対するshPDL1の阻害効果をU251およびH460細胞において検出測定した。U251およびH460細胞をそれぞれ12時間前に12ウェルプレートにウェルあたり2×105細胞で播種した。各ウェルのU251およびH460細胞を1.6μgのshRNA発現ベクターDNA:4μlのlipofectamin2000の比でトランスフェクションした。2つの細胞サンプルをそれぞれ24時間および48時間に取った。トータルRNAを抽出し、逆転写を行った後に、GAPDH遺伝子のmRNAレベルをコントロールとしてリアルタイムPCRを行って、細胞のヒトPDL1のmRNAの発現レベルを検出測定した。結果は、コントロールと比較して、shPDL1-#1、2、3の全てが一定時間以内にhPDL1のmRNAに対する阻害効果を見せるということを示した。shPDL1-#1はhPDL1のmRNAに対する最も有意な阻害効果を有した(図8)。
1. shPDL1の阻害効果が確認された後に、U6プロモーターおよびshPDL1の配列全体を包含するコードカセットをpShuttle-MCS-E1Aベクターにクローニングした。pSGU6/GFP/Neo-shPDL1ベクターをSacIによって消化し、それによって形成された付着末端をT4DNAポリメラーゼによって消化して平滑末端を得た。それから、エタノール/酢酸アンモニウムを用いて沈殿および回収を行った。U6プロモーターおよびshPDL1配列を包含するコードカセット配列をKpnIによる消化によって回収した。同時に、pShuttle-MCS-E1AベクターをKpnIおよびEcoRVによって消化し、回収した。最後に、3つのshPDL1コードカセットをそれぞれpShuttle-MCS-E1Aベクターに繋げて、図10に示されている通り最終的なベクターpShuttle-U6-shPDL1-CMV-E1Aを得た。いくつかのコロニーをプラスミド抽出のために選択し、KpnI/HindIII消化によって鑑定した。正しいクローンは370bpのバンドを生ずるであろう(図11参照)。正しいpShuttle-U6-shPDL1-CMV-E1Aプラスミドをシーケンシングのために選択した。結果は、配列が完全に正しいことを示した。
我々の研究室において-80℃に保存したBJ5183株(pAdEasy-1プラスミドが移入された)をLB/Amp培地に接種し、37℃かつ200RPMにおいて一晩培養し活性化させた。BJ5183コンピテント細菌を生工生物工程株式会社のスーパーコンピテントセル調製キット(B529303-0040)を用いて調製し、チューブに100μlずつ小分けし、用時まで-80℃で保存した。
(2) pShuttle関連プラスミドとpAdEasy-1プラスミドとの間の相同組換え
各pShuttle-MCS-E1A、pShuttle-U6-shPDL1-1-CMV-E1A、pShuttle-U6-shPDL1-2-CMV-E1A、およびpShuttle-U6-shPDL1-3-CMV-E1Aの1μgのプラスミドDNAを取り、それぞれ1μlのPmeIによって消化した。37℃での1.5時間の反応後に、1μlのアルカリホスファターゼを追加して線状化DNA断片を脱リン酸化した。それから、消化産物を100μlのBJ5183コンピテント細菌に直接的に追加して、従来の形質転換を行った。最後に、形質転換された細菌溶液をKana耐性LBプレートに広げ、37℃で一晩培養した。次の日に、プレート上に現れたコロニーを拾い、LB/Kanaに接種し、一晩培養してプラスミドDNAを抽出し、従来のPacI消化を行った。消化産物を電気泳動によって分析した。相同組換えが起こる位置に依存して、相同組換えの3種類の異なるモードが起こり得る(図13)。PacIによる消化後に4.5Kbまたは3Kb断片を生じ得るプラスミドは、正しい相同組換えを起こしたプラスミドである。消化産物の電気泳動結果(図14)は、正しい相同組換えがpAdEasy-1プラスミドとそれぞれpShuttle-MCS-E1A、pShuttle-U6-shPDL1-1-CMV-E1A、pShuttle-U6-shPDL1-2-CMV-E1A、およびpShuttle-U6-shPDL1-3-CMV-E1Aとの間において起こり、腫瘍溶解性アデノウイルス(全てOAd-shPDL1と呼ぶ)およびそのコントロールウイルスをパッケージングするためのゲノムDNA(pAdEasy-U6-shPDL1#1-CMV-E1A、pAdEasy-U6-shPDL1#2-CMV-E1A、pAdEasy-U6-shPDL1#3-CMV-E1A、およびpAdEasy-CMV-E1A)が首尾よく得られたということを証明している。もたらされた陽性クローン内に挿入されたshPDL1コードカセットおよびE1A発現カセットをシーケンシングし、完全に正しいことを確認した。
(1) 腫瘍溶解性アデノウイルス(OAd-shPDL1)をパッケージングするためのゲノムDNAの調製
pAdEasy-CMV-E1A、pAdEasy-U6-shPDL1#1-CMV-E1A、pAdEasy-U6-shPDL1#2-CMV-E1A、およびpAdEasy-U6-shPDL1#3-CMV-E1Aのそれぞれの2μgのプラスミドDNAに、2μlのPacI酵素を追加し、37℃での2時間の反応後に、エタノール/酢酸アンモニウムによるDNAの沈殿を行い、70%エタノールによってリンスした。それから、DNA沈殿を10μlの純ddH2Oに溶解し、AD293にトランスフェクションしてウイルスパッケージングを行った。
良好な成長状態のAD293細胞を1日前に6ウェルプレートに接種し、接種細胞数は、次の日にトランスフェクションを行うときに細胞の60~70%コンフルエントを達成することが適当である。調製した線状化DNA(約2μg)およびQIAGENから購入したAttracteneトランスフェクション試薬(6μl)を均一混合し、AD293細胞に追加した。混合物を上下左右に均一混合し、細胞インキュベータ(37℃、5%CO2)内に置き、さらに約10~14日に渡って培養する。細胞変性を2~3日毎に観察する。細胞の小片が「数珠状」になり、大量の細胞が脱落するまで徐々に拡大したときに、細胞を穏やかに吹き叩いて細胞および培養上清を収穫し得る。これらは-80℃で保存するか、または直接的にさらなる増幅を行った。プロセスを図15に示す。
類似に、良好な成長状態のAD293細胞を1日前に6cmペトリ皿に接種し、接種細胞数は、次の日にトランスフェクションを行うときに細胞の70~80%コンフルエントを達成することが適当である。先に採集したウイルス上清の800~1000μlを各6cmペトリ皿に追加し、混合物を上下左右に均一混合した後に、細胞培養培地によってさらに培養した。通常は、大量の細胞が48時間後に丸くなり、剥離した。このときに細胞および培養上清を採集し得る。爾後に、ウイルスのさらなる増幅を10cmペトリ皿で行い、細胞密度はウイルスが接種されるときに好ましくは約70%である。先に採集したウイルス上清の1200~1500mlを各10cmペトリ皿に追加し、48時間後に大量の細胞が変性剥離したときに細胞および上清を採集した。最後に、ウイルスをさらに15cmペトリ皿で増幅し、細胞密度が約70%であるときに、10cmペトリ皿から採集したウイルス培養上清の2mlを追加した。均一混合後に、細胞をさらに48時間に渡って培養して細胞および培養上清を採集した。ウイルスはそれから15cmペトリ皿で所望のウイルス量まで反復的に増幅され得る。
アデノウイルスの力価を測定するための方法は、VP法、GTU/BFU法、プラーク法、TCID50法、およびHexon染色(キット)法を包含する。TCID50法およびHexon染色法はより正確であり、再現率が高い。この例では、得られたウイルス上清中の活性なウイルス粒子数(単位:PFU/ml)をHexon染色法によって測定した。結果を下に示す。本開示に記載される3種類のpShuttle-U6-shPDL1-CMV-E1Aプラスミドおよび1種類のコントロールプラスミドpShuttle-MCS-E1AをpAdEasy-1プラスミドと相同組換えさせて、6種類のpAdEasy-U6-shPDL1-CMV-E1Aプラスミドおよび2種類のpAdEasy-CMV-E1Aを生じた(図13参照。各種類のプラスミドは2つの正しい様式の相同組換えを行い得、そして2つの正しいプラスミドを得る。PacIによる消化後に、それぞれ4.5Kまたは3Kのバンドを生じ得る)。相同組換えによって得られた8種類のプラスミドを用いて、AD293によってウイルスをパッケージングして、8種類の腫瘍溶解性ウイルスOAd-C-4.5K、OAd-C-3K、OAd-shPDL1#1-4.5K、OAd-shPDL1#1-3K、OAd-shPDL2#1-4.5K、OAd-shPDL1#2-3K、OAd-shPDL1#3-4.5K、およびOAd-shPDL1#3-3Kを得た。これらはそれぞれ次の通り略称される。C-4.5K、C-3K、1-4.5K、1-3K、2-4.5K、2-3K、3-4.5K、および3-3K。それらのうち、C-4.5KおよびC-3Kは同じ配列を有する同一種類のウイルスであり、1-4.5Kおよび1-3Kは同じ配列を有する同一種類のウイルスであり、2-4.5Kおよび2-3Kは同じ配列を有する同一種類のウイルスであり、3-4.5Kおよび3-3Kは同じ配列を有する同一種類のウイルスである。
細胞(HUVEC、MRC-5、Hela、A549、およびU251)をウェルあたり1.5×105細胞の量で12ウェルプレートに播種した。培養培地の体積(HUVEC細胞はAllcells専用培地で培養した。細胞および培地両方はAussels Biotechnology(上海)有限公司から購入した。MRC-5細胞はMEM+10%FBS培地で培養した。Hela細胞はRPMI1640+10%FBS培地で培養した。A549細胞はDMEM/F12+10%FBS培地で培養した。U251細胞はMEM+10%FBSで培養した。全ての培地はGibco社から購入した)は1mlであった。12時間後に、培地を除去し、細胞をPBSによって1回リンスし、500μlのウイルス懸濁液(調製例4によって調製した)を図16に示されている通り10のウイルス多重感染度(MOI)で追加した。ウイルスを細胞と一緒に90分に渡ってインキュベーションした後で、ウイルス懸濁液を除去し、細胞をPBSによって2回リンスした。この時点を0時間と見なし、細胞サンプルの一部をトリプシン処理によって取った。細胞サンプルの別の一部を48時間後に取った。0時間および48時間に収穫した細胞サンプルのゲノムDNAをそれぞれ抽出し、アデノウイルス5型E1A遺伝子(P5:TCCGGTTTCTATGCCAAACCT(配列番号5)およびP6:TCCTCCGGTGATAATGACAAGA(配列番号6))、Hexon遺伝子(P7:CCATTACCTTTGACTCTTGTGT(配列番号7)およびP8:GGTAGTCCTTGTATTTAGTATC(配列番号8))、ならびにヒトGAPDH遺伝子(P9:CATGCCTTCTTGCCTCTTGTCTCTTAGAT(配列番号9)およびP10:CCATGGGTGGAATCATATTGGAACATGTAA(配列番号10))の特異的プライマーを用いてQ-PCRを行った。ウイルスが48時間に渡って細胞に感染した後の細胞内でのウイルスの複製能力をQ-PCR結果に基づいて分析した。異なる細胞内での腫瘍溶解性アデノウイルス(OAd-shPDL1)の複製能力の比較は図17に示されている通りであった。
この例では、本開示に従う腫瘍溶解性アデノウイルス(OAd-shPDL1)の殺傷能力をCCK8アッセイによって試験した。細胞(U251、Hela、およびA549)をウェルあたり1.5×103細胞で96ウェルプレートに播種した。培養培地の体積(U251細胞はMEM+10%FBSで培養した。Hela細胞は培地RPMI1640+10%FBSで培養した。A549細胞は培地DMEM/F12+10%FBSで培養した。全ての培地はGibco社から購入した)は各ウェルについて100μlである。12時間後に、50μlの培地を除去し、ウイルス(それぞれ調製例4で調製したコントロールウイルスC-4.5K、OAd-shPDL1ウイルス1-4.5K、2-4.5K、および3-4.5K)および純粋な培地の50μl混合物をそれぞれ1、3、10、30、100、および300の多重感染度(MOI)で追加した(この時点を0時間として記録した)。各MOIについて3つのデュプリケートを設けた。10μlのCCK8(同仁化学研究所から購入)を48時間および72時間の時点で追加した。450nmの培養物の吸光度値を1時間のインキュベーション後に測定した。得られた吸光度値に従って、細胞に対する異なるウイルスの殺傷能力を決定した。市販の腫瘍溶解性アデノウイルスH101をコントロールとして用いた。実験では、同じ細胞を同じMOIのウイルス量によって処置し、同じ時点で吸光度値を測定した。加えて、1μMのパクリタキセル溶液を系の正のコントロールとして用いた。3種類の腫瘍細胞に対する腫瘍溶解性アデノウイルス(OAd-shPDL1)の用量依存的殺傷効果および半数殺傷用量(IC50)を図18~21に示した。
本開示の腫瘍溶解性アデノウイルス(OAd-shPDL1)によって発現されたshPDL1の効力の検出測定を容易化するために、この例では、FLAGタグ付きhPDL1を安定発現し得る2つの細胞株A549/hPDL1-FLAGおよびHela/hPDL1-FLAGを構築した。構築プロセスは次の通り略述される。例2に従って得られたpcDNA3.3-hPDL1-FLAGベクター(pcDNA3.3-hPDL1-FLAG-IRES-hrGFPベクターともまた言う)をlipofectamin2000によってA549細胞およびHela細胞にトランスフェクションした。ベクターはネオマイシン遺伝子を保有するので、G418を追加して3回のスクリーニングを行い、FLAGタグ付きhPDL1およびGFP蛋白質を安定発現することができるA549/hPDL1-FLAGおよびHela/hPDL1-FLAG細胞株を最後に得た。
1) 超遠心前の腫瘍溶解性アデノウイルスの溶液の調製
293細胞を15CM皿上で、調製例4で得られたアデノウイルス培養上清によってウイルス上清対細胞培養培地の2:20の体積比(AD:DMEM=2:20)で感染させ、37℃の5%CO2インキュベータ内で約36時間に渡ってさらにインキュベーションした。細胞の約50%の細胞変性効果(CPE)が顕微鏡下で観察され、細胞が浮いたときに、吹き叩くことまたは掻き取ることなどによってペトリ皿の細胞および培養液を採集し、4℃で短時間保存、または-20℃もしくは-80℃で長期保存した。一般的に、1回の超遠心によって精製されるウイルス量は、60から80個の15cmペトリ皿(培地上清および感染した293細胞を包含する)によって産生されるウイルス量である。採集した腫瘍溶解性ウイルスを含有する293細胞および培養上清を3000RPMで30分に渡って4℃において遠心した。上清および沈殿をそれぞれ爾後の実験に付した。A) 遠心上清は新たなフラスコに移し、4℃で一時的に保存し、細胞に感染させることによってウイルス増幅に用いた。ウイルス増幅の終わりまでに、全ての上清をPEG8000溶液(20%PEG8000を含有する2.5MのNaClの水溶液)と2:1の比で混合し、氷上で1時間または一晩に渡って沈殿させた。それから、20分の12000RPMの遠心後に、上清を捨て、ウイルス沈殿を保持した。最後に、それが完全に分散されるまで、ウイルス沈殿を適当量の10mMのTris-Cl(pH8.0)溶液に再懸濁した。5分の7000RPMの遠心後に、ウイルス含有上清を保持し、ウイルス含有上清を超遠心のための勾配塩化セシウム遠心チューブに直接的にローディングした。B) 遠心後の細胞沈殿は、小量の10mMのTris-Cl(pH8.0)によって穏やかに(吹き叩くことなしに)洗浄して、細胞表面の培地を洗浄および除去した。10から12個の15cmペトリ皿からの細胞沈殿を3mlのTris-Clに再懸濁し、細胞懸濁液を小分けし、-20℃で保存した。精製前の保存時間は2ヶ月よりも多くはない。サンプルを採集した後に、細胞懸濁液を37℃の水浴によって融解し、30秒に渡って激しく振盪し、-80℃冷凍庫に戻すか、またはドライアイス/純粋なエタノール混合物中に置いて細胞懸濁液を急速凍結した。凍結融解プロセスを3~5回繰り返して、細胞膜を完全に破壊し、それによってウイルスを細胞から放出してウイルス溶液を得た。ウイルス溶液を直ちに精製しない場合には、それは-20℃で保存され得る。超遠心による精製前に、このステップで得られたウイルス溶液を37℃の水浴によって融解し、16000RPMの速度で室温において10分に渡って遠心した。ウイルス含有上清を採集し、これは一時的に氷上で低温保存され得る。
塩化セシウム密度勾配遠心は種々のウイルスの単離および精製のためになお最も常用される方法である。主に、これはCsCl溶液中における異なるウイルスの異なる浮遊密度に依拠しており、細胞ライセート中の他の成分からそれらを分離する。標的ウイルスの特異的なバンドを採集した後で、PD-10脱塩カラムを用いて塩化セシウムを除去し、精製されたウイルスが最後に得られた。非常に高純度のウイルスがこの方法を用いて得られ得る。具体的な精製手続きは次の通りである。
この例では、腫瘍溶解性アデノウイルス(OAd-shPDL1)の殺傷能力をMTTアッセイによって試験した。ヒト腫瘍細胞(HCT116、PANC1、HT29、およびH460)を96ウェルプレートに播種し、ウェルあたりの播種細胞数は3×103細胞であり、各ウェルの培養培地は100μlであった(HCT116細胞は培地マッコイ5A+10%FBSで培養した。PANC-1細胞は培地DMEM+10%FBSで培養した。HT29細胞は培地DMEM/F12+10%FBSで培養した。H460細胞はRPMI1640+10%FBSで培養した。全ての培地はGibco社から購入した)。12時間後に、50μlの培地を捨て、ウイルス(用いたウイルスはそれぞれコントロールウイルスC-4.5K、OAd-shPDL1ウイルス1-4.5K、2-4.5K、および3-4.5Kであった。これらは調製例5に記載されている方法に従って調製した)および血清不含培地の50μl混合物を追加し(この時点を0時間として記録した)、多重感染度(MOI)はそれぞれ1、3、10、30、100、および300であった。各MOIについて3つのデュプリケートを設けた。10μlのMTT溶液(索莱宝生物科技有限公司から購入)(5mg/ml、すなわち0.5%MTT)をそれぞれ48時間および72時間の時点で各ウェルに追加し、4時間に渡ってさらにインキュベーションを行った。それから、細胞に接触することおよび捨てることなしに、全ての培養培地を注意深く捨てた。150μlのDMSOを各ウェルに追加し、シェーカー上で低速で10分に渡って振盪して結晶物を十分に溶解し、490nmの吸光度値をマイクロプレートリーダーによって測定した。市販の腫瘍溶解性アデノウイルスH101をコントロールとしてこの実験に用い、同じ細胞を同じMOIのウイルス量によって処置し、吸光度値を同じ時点で同時に測定した。加えて、1μMパクリタキセル溶液を系の正のコントロールとして用いた。データはグラフパッドプリズム5.04を用いて分析し、用量反応曲線をプロットし、IC50を計算した。阻害率の計算式は次の通りである。細胞増殖の阻害率(IR%)=1-(OD試験サンプル-ODブランク)×100%。4種類の腫瘍細胞に対する腫瘍溶解性アデノウイルス(OAd-shPDL1)の用量依存的殺傷効果および半数殺傷用量(IC50)の結果を図25~29に示した。
この例は、細胞によるインビトロ機能アッセイおよび腫瘍を持つマウスモデルによるインビボ機能アッセイを包含する。実験に用いた腫瘍溶解性アデノウイルスはコントロールウイルスC-4.5KおよびOAd-shPDL1ウイルス1-4.5Kであった(用いたウイルスは調製例5に従って調製した)。
(1) ヒト乳癌細胞MDA-MB-231に対する細胞アッセイ
実験に用いた細胞株はヒトPDL1の発現レベルが高いヒト乳癌細胞株MDA-MB-231であった。MDA-MB-231細胞を6ウェルプレートの3つのウェルにウェルあたり1×106細胞の量で播種した。12時間後に、1×107PFU(MOI=10)の腫瘍溶解性アデノウイルスC-4.5Kまたは1-4.5Kを含有するウイルスおよび血清不含L15培地(L15培地はGibcoから購入した)の100μl混合物を、それぞれ、2つのウェルのそれぞれに追加した。100μlの血清不含培地を残りの1つのウェルに追加し、ブランクコントロールとした。6ウェルプレートを穏やかに上下左右に均一混合して、ウイルスが可能な限り培養ウェル内に均一に分布するようにさせた。37℃かつ5%CO2の24時間のインキュベーション後に、細胞をトリプシン消化した後に、細胞サンプルを収穫した。収穫した細胞サンプルをきれいなPBSによって2回リンスし、収穫した細胞ペレットを、プロテアーゼ阻害剤を加えたRIPA緩衝液(50mMのTris-Cl(pH7.4)、150mMのNaCl、1%NP-40、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS、および1/20のカクテルプロテアーゼ阻害剤)に懸濁し、氷上に置いて、30分に渡って溶解した。細胞サンプルを時々振盪しながら均一混合し、12000RPMで5分に渡って遠心し、それから上清および細胞ペレットを収穫し、それぞれ-20℃で保存した。MDA-MB-231細胞の3つの群の収穫した上清のhPDL1蛋白質レベルを従来のウエスタンブロッティングによって検出測定した。一次抗体はNovusbioからのウサギ由来PDL1抗体(Cat.No.NBP2-15791)であった。各群はトリプリケートであった。ウエスタンの結果およびグレースケールスキャン値分析を図30に示した。
ヒト結腸癌細胞HCT116を12ウェルプレートの3つのウェルにウェルあたり1×104細胞で播種した。12時間後に、1×105PFU(MOI=10)の腫瘍溶解性アデノウイルスC-4.5Kまたは1-4.5Kおよび血清不含培地の混合溶液をそれぞれ2つのウェルに追加した。等体積の血清不含培地マッコイ5Aを残りの1つのウェルに追加し、ブランクコントロールとした。12ウェルプレートを穏やかに上下左右に均一混合して、ウイルスが可能な限りウェル内に均一に分布するようにさせた。37℃の5%CO2インキュベータ内で24時間に渡って培養した後に、細胞サンプルをトリプシン消化によって収穫し、CD274のフローサイトメトリー抗体を用いてFACSを行って、細胞サンプル中のhPDL1を発現する細胞のパーセンテージを検出測定した。全ての群はトリプリケートであった。フローサイトメトリー結果を図32に示した。
この部では、ヒト結腸癌細胞HCT116を9匹のBALB/Cヌードマウスの背中に皮下接種した。各ヌードマウスに接種した細胞数は5×106であった。約9日後に、腫瘍が皮下に形成した後に、マウスをランダムに3群に分けた。第1の群はいずれかの処置なしのブランクコントロール群であった。第2の群では、腫瘍内注射によって皮下腫瘍にコントロール腫瘍溶解性アデノウイルスC-4.5Kを注射した。ヌードマウスあたりの注射したウイルス量は1×109PFUであり、注射体積は100μlであった。第3の群でもまた、腫瘍内注射を用いて、腫瘍溶解性アデノウイルス1-4.5Kを皮下腫瘍に注射した。ヌードマウスあたりの注射したウイルス量は1×109PFUであり、注射体積は100μlであった。注射はかかる用量および様式で3日に渡って1日1回行い、第4日には処置を行わなかった。ヌードマウスを第5日に屠殺して腫瘍組織を収穫した。プロテアーゼ阻害剤を含有するRIPA緩衝液(調合は上述と同じである)を組織サンプルの一部に追加し、これらをそれからホモジナイズして組織の蛋白質を抽出した。腫瘍組織のhPDL1の蛋白質発現レベルをウエスタンブロットによって検出測定した。結果は図33および図34に示した。
本開示の腫瘍溶解性アデノウイルスOAd-shPDL1は1つのshPDL1発現カセットを含み、これは感染した腫瘍細胞内でshPDL1を発現し得、それによって腫瘍細胞のhPDL1の発現レベルをノックダウンし、腫瘍細胞表面のhPDL1の存在を縮減する。最終的に、免疫細胞(T細胞またはNK細胞を包含する)のPD1への腫瘍細胞表面のhPDL1の結合によって引き起こされる免疫細胞活性化に対する免疫抑制効果が、減弱または抹消され得る。よって、この例は、主に細胞レベルで、腫瘍溶解性アデノウイルスOAd-shPDL1(1-4.5K)(調製例5に記載されている方法によって調製した)およびヒトNK細胞がヒト腫瘍細胞を殺傷する上で相乗効果を有するかどうかを検出測定した。実験では、トリパンブルー染色法を用いて、腫瘍溶解性アデノウイルスOAd-shPDL1(1-4.5K)およびヒトNK細胞がヒト結腸癌細胞HCT116およびヒト肺癌細胞A549に対する組み合わせ殺傷プロセスの相乗効果を見せるかどうかを検出測定した。
トリパンブルー染色試験によって、HCT116細胞に対する腫瘍溶解性アデノウイルスOAd-shPDL1(1-4.5K)の殺傷用量が約MOI=1~3であるときに、殺傷率は40%および60%の間であるということが決定された。HCT116細胞に対するヒトNK細胞の殺傷用量がNK:HCT116(E:T比)を約5:1とするときには、殺傷率は10%および20%の間である。殺傷用量はそれぞれ比較的好適であり、これらは組み合わせ殺傷実験に適していた。
トリパンブルー染色試験によって、A549細胞に対する腫瘍溶解性アデノウイルスOAd-shPDL1(1-4.5K)の殺傷用量が約MOI=30であるときには、殺傷率は40%および60%の間であるということが決定された。A549細胞に対するヒトNK細胞の殺傷用量が約5:1のE:T比であるときには、殺傷率は10%および20%の間である。殺傷用量はそれぞれ比較的好適であり、これらは組み合わせ殺傷実験に適していた。
この例では、NOD-SCID免疫不全マウスにヒト結腸癌細胞HCT116を皮下接種して(マウスあたりの皮下接種した細胞数は5×106細胞であった)、腫瘍を持つマウスモデルを調製した。これを用いて、HCT116に対する腫瘍溶解性アデノウイルスOAd-shPDL1(1-4.5K)の成長阻害効果を検出測定した。コントロール腫瘍溶解性ウイルスC-4.5Kを負のコントロールウイルスとして用いた。実験に用いたコントロールウイルスC-4.5KおよびOAd-shPDL1ウイルス1-4.5Kは調製例5に記載されている方法によって調製した。腫瘍を皮下接種された体積要件を満たす12匹の腫瘍を持つマウスを選択し(腫瘍体積は90~120mm3であった)、ランダムな群分けの様式で群あたり3匹のマウスで4つの群に分ける。第1群はコントロール群(ブランクコントロール)であり、各マウスには100μlのアデノウイルス保存溶液(すなわち、1mMのMgCl2および10%グリセロールを含有する10mMのTris溶液(pH7.4))を毎回注射した。第2群は中用量コントロール腫瘍溶解性ウイルス群(C-4.5K(中))であり、各マウスには1×108PFUの腫瘍溶解性ウイルスC-4.5Kを含有する100μlのウイルス懸濁液を毎回注射した。第3群は中用量腫瘍溶解性ウイルス群(1-4.5K(中))であり、各マウスには1×108PFUの腫瘍溶解性ウイルス1-4.5Kを含有する100μlのウイルス懸濁液を毎回注射した。第4群は高用量腫瘍溶解性ウイルス群(1-4.5K(高))であり、各マウスには1×109PFUの腫瘍溶解性ウイルス1-4.5Kを含有する100μlのウイルス懸濁液を毎回注射した。実験ではトータルで3回の投与を行い、医薬は隔日で投与した。最初の投与は群分けの日に始めた(第0日として記録した)。マウスの腫瘍直径および体重を週に2回測定した。第21日の後に、マウスを屠殺し、撮像のために腫瘍を取った。実験結果をそれぞれ図38、39、40、および41に示した。
BALB/Cヌードマウスに皮下接種されたHCT116細胞に対する成長阻害についてOAd-shPDL1(1-4.5K)の有効な用量をさらに確認するために、この例は動物モデルのサンプルサイズを拡大して、OAd-shPDL1(1-4.5K)の有効な用量をさらに検証した。ヒト結腸癌細胞HCT116をBALB/Cヌードマウスに皮下接種して、腫瘍を持つマウスモデルを調製した。各ヌードマウスの細胞接種量は5×106細胞であった。腫瘍を皮下接種された腫瘍体積要件を満たす35匹の腫瘍を持つマウスを選択し(腫瘍体積は80~130mm3であった)、ランダムな群分けの様式で群あたり7匹のマウスで5つの群に分ける。第1群はコントロール群(ブランクコントロール)であり、各マウスには100μlのアデノウイルス保存溶液(すなわち、1mMのMgCl2および10%グリセロールを含有する10mMのTris溶液(pH7.4))を毎回注射した。第2の群は中用量コントロール腫瘍溶解性ウイルス群(C-4.5K(1×108))であり、各マウスには1×108PFUの腫瘍溶解性ウイルスC-4.5Kを含有する100μlのウイルス懸濁液を毎回注射した。第3の群は高用量コントロール腫瘍溶解性ウイルス群(C-4.5K(1×109))であり、各マウスには1×109PFUの腫瘍溶解性ウイルスC-4.5Kを含有する100μlのウイルス懸濁液を毎回注射した。第4の群は中用量腫瘍溶解性ウイルス群(1-4.5K(1×108))であり、各マウスには1×108PFUの腫瘍溶解性ウイルス1-4.5Kを含有する100μlのウイルス懸濁液を毎回注射した。第5の群は高用量腫瘍溶解性ウイルス群(1-4.5K(1×109))であり、各マウスには1×109PFUの腫瘍溶解性ウイルス1-4.5Kを含有する100μlのウイルス懸濁液を毎回注射した。実験ではトータルで5回の投与を行い、医薬は隔日で投与した。最初の投与は群分けの日に始めた(第0日として記録した)。マウスの腫瘍直径および体重を週に2回測定した。コントロール群およびコントロール腫瘍溶解性ウイルス群の腫瘍を持つヌードマウスの腫瘍が潰瘍化したので、第25日に実験を止め、全ての35匹のマウスを屠殺した。腫瘍を秤量および撮像のために取り、同じマウスの血液および脾臓と一緒に、それぞれ細胞懸濁液を調製した。BALB/CヌードマウスのNK細胞およびT細胞を検出測定するために、フローサイトメトリー抗体(抗マウスCD49b抗体および抗マウスCD3抗体。これらの両方はEbioscience社から購入した)をそれらに追加し、染色後に、FACSを行って、腫瘍の腫瘍細胞、血液、および脾臓のNKおよびT細胞の割合の変化を分析した。実験結果をそれぞれ図46、図47、図48、図49、図50、および図51に示す。
Claims (30)
- 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスが選択的に複製する腫瘍溶解性アデノウイルスであり、
組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムが、腫瘍細胞によるPDL1の発現を阻害することができる外来性のshRNAのコード配列をインテグレーションされ、
組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムが、E1B19K遺伝子、E1B55K遺伝子、およびE3領域の全ての遺伝子を欠失しており、
組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムが、E1A遺伝子のコード配列を含み、
E1A遺伝子のコード配列が、プロモーターのコントロール下にある、
単離された組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス。 - 外来性のshRNAのコード配列が配列番号16、19、および22のいずれか1つに示されている通りである、請求項1に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス。
- E1A遺伝子のコード配列がCMVプロモーターのコントロール下にある、請求項1に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス。
- 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスがアデノウイルス5型を遺伝子改変することによって得られる、請求項1に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス。
- 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを調製するためのベクターがプロモーターのコントロール下の外来性のshRNAのコード配列を含み、shRNAのコード配列が配列番号16、19、および22のいずれか1つに示されている通りである、請求項1に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス。
- ベクターがpShuttleを基本バックボーンとして用い、基本バックボーンが、作動可能に連結された外来性のshRNAのコード配列の発現をコントロールするプロモーター、外来性のshRNAのコード配列、E1A遺伝子のコード配列の発現をコントロールするプロモーター、およびE1A遺伝子のコード配列を順に含む、請求項5に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス。
- 宿主細胞がベクターを安定発現する、請求項5または6に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルス。
- 医薬組成物が、活性成分としての請求項1~7のいずれか1項に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスと薬学的に許容される添加剤とを含む、医薬組成物。
- 医薬組成物が組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを5×107から5×1012vp/日の範囲である用量で含む、請求項8に記載の医薬組成物。
- 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスが、腫瘍内注射によって投与または静脈内投与されるように製剤される、請求項8に記載の医薬組成物。
- 腫瘍および/または癌の処置のための医薬の調製のための、請求項1~7のいずれか1項に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスの使用。
- 腫瘍および/または癌が、肺癌、黒色腫、頭頸部癌、肝臓癌、脳腫瘍、結腸直腸癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頚癌、リンパ腫、胃癌、食道癌、腎臓癌、前立腺癌、膵臓癌、白血病、骨癌、および精巣癌を包含する、請求項11に記載の使用。
- 医薬組成物の活性成分が、請求項1~7のいずれか1項に記載の組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスと、NK細胞とを含む、医薬組成物。
- 医薬組成物の活性成分が、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびNK細胞からなる、請求項13に記載の医薬組成物。
- 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびNK細胞が互いに混合されることなしに独立して医薬組成物中に存在する、請求項13に記載の医薬組成物。
- 医薬組成物が組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを5×10 7 から5×10 12 vp/日の範囲である用量で含み、NK細胞を1×10 9 から3×10 9 細胞/日の範囲の用量で含む、請求項13に記載の医薬組成物。
- NK細胞が、自家NK細胞および同種NK細胞から選択される、請求項13に記載の医薬組成物。
- NK細胞がインビトロ拡大から得られる自家NK細胞またはインビトロ拡大から得られる同種NK細胞である、請求項17に記載の医薬組成物。
- 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスが腫瘍内注射によって投与または静脈内投与されるように製剤され、NK細胞が静脈内投与されるように製剤される、請求項13に記載の医薬組成物。
- 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスおよびNK細胞をそれぞれ独立に含む別々の容器と、投与のタイミングおよび経路を定める説明書を含む、腫瘍および/または癌の処置のための相乗効果を有する組み合わせ医薬のキットであって、
組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスが選択的に複製する腫瘍溶解性アデノウイルスであり、
組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムが、腫瘍細胞によるPDL1の発現を阻害することができる外来性のshRNAのコード配列をインテグレーションされ、
組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムが、E1B19K遺伝子、E1B55K遺伝子、およびE3領域の全ての遺伝子を欠失しており、
組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスのゲノムが、E1A遺伝子のコード配列を含み、
E1A遺伝子のコード配列が、プロモーターのコントロール下にある、
キット。 - 外来性のshRNAのコード配列が配列番号16、19、および22のいずれか1つに示されている通りである、請求項20に記載のキット。
- E1A遺伝子のコード配列がCMVプロモーターのコントロール下にある、請求項20に記載のキット。
- 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスがアデノウイルス5型を遺伝子改変することによって得られる、請求項20に記載のキット。
- 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを調製するためのベクターがプロモーターのコントロール下の外来性のshRNAのコード配列を含み、shRNAのコード配列が配列番号16、19、および22のいずれか1つに示されている通りである、請求項20に記載のキット。
- ベクターがpShuttleを基本バックボーンとして用い、基本バックボーンが、作動可能に連結された外来性のshRNAのコード配列の発現をコントロールするプロモーター、外来性のshRNAのコード配列、E1A遺伝子のコード配列の発現をコントロールするプロモーター、およびE1A遺伝子のコード配列を順に含む、請求項24に記載のキット。
- 宿主細胞がベクターを安定発現する、請求項24または25に記載のキット。
- 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを含む容器は、組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスを5×10 7 から5×10 12 vp/日の範囲である用量で含み、NK細胞を含む容器は、NK細胞を1×10 9 から3×10 9 細胞/日の範囲の用量で含む、請求項20に記載のキット。
- NK細胞が、自家NK細胞および同種NK細胞から選択される、請求項20に記載のキット。
- NK細胞がインビトロ拡大から得られる自家NK細胞またはインビトロ拡大から得られる同種NK細胞である、請求項28に記載のキット。
- 組換え体腫瘍溶解性アデノウイルスが腫瘍内注射によって投与または静脈内投与されるように製剤され、NK細胞が静脈内投与されるように製剤される、請求項20に記載のキット。
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