CN101591262B - 提取农林副产品中的神经酰胺两性脂质的方法 - Google Patents

Abstract

一种提取农林副产品中的神经酰胺两性脂质的方法，是以农林副产品米糠、麦麸、玉米加工的废弃物为原料，加入农林副产品重量的0.1～1.0％的蛋白酶以及农林副产品重量的0.01～0.1％的氨基酸化学渗透剂，利用氯仿与甲醇的混合溶剂提取3次，柱色谱分离，用溶剂洗脱出富含神经酰胺脂类，碱处理后，经过高效液相色谱分离出神经酰胺。本发明提取率高，简化了其他成分的分离步骤，同时获得不同含量的神经酰胺脂质。

Description

提取农林副产品中的神经酰胺两性脂质的方法

技术领域

本发明是关于提取农林副产品中的神经酰胺活性两性脂质的方法，涉及对农林副产品通过生物与化学方法进行活性化合物的有效制备的领域。

背景技术

农林副产品等生物资源属再生资源，取之不尽，用之不竭，有广阔的发展前途。中国是世界第一产稻大国，年产稻谷约2亿吨，米糠是稻谷加工的副产品，约占稻谷质量的5％-5.5％，年产米糠在1000万吨以上，约占世界总产量的1/3。小麦麸皮是小麦面粉加工中的主要副产品，一般情况下，面粉厂生产出的麸皮约占小麦籽粒质量的20％左右。小麦加工后的麸皮基本上直接应用于饲料工业，很少用于深加工和再利用，经济价值不高。所以农林副产品活性成分的提取工艺研究成了研究的热点。若能将这些经济价值极高的农林副产品活性成分变废为宝，这将为大家的生活添加新鲜健康的动力。

日本朝日大学科研人员发现米糠中的神经酰胺糖苷有抑制黑色素生成的功效。日本一油化公司最近向市场销售的米糠、米胚芽等为原料萃取精制而成的功能性成分神经酰胺。神经酰胺以前主要作化妆品原料使用，近年来已拓展为保健食品的主要原料和潜在的药物等。采用廉价的农林副产品为原料来制取富含神经酰胺脂质，具有极大的市场潜力和科研价值。

但现有提取方法，提取率较低，步骤繁琐，神经酰胺的脂质中含杂质高。

发明内容

本发明目的是提供一种提取农林副产品中的神经酰胺活性物的方法，有效制备神经酰胺两性脂质。

本发明提供一种提取农林副产品中的神经酰胺活性物的方法，是以农林副产品为原料，通过蛋白酶辅助提取富含神经酰胺活性两性脂质，制备步骤如下：

第1步：将农林副产品米糠、麦麸、玉米加工的废弃物干燥，粉碎目数是小于1mm，取处理的农林副产品置于反应釜中，按农林副产品∶水重量比为1∶5～20与水混合，用碳酸钠调节提取液的pH值至7.5～8.5；加入相当于农林副产品重量的0.01％～0.1％的氨基酸化学渗透剂。

第2步：取相当于农林副产品重量的0.1％～1.0％的蛋白酶，缓慢加入反应釜中的提取液中，继续搅拌10h～24h。

第3步：然后将提取液旋转蒸干，向反应釜中加入氯仿∶甲醇体积比为9～2∶1的混合溶剂，按提取液与混合溶剂体积比为4～1∶1加入，提取3次，分层后，旋转蒸发干有机层，得浓缩液神经酰胺脂质粗品1。

第4步：将提取所得的富含神经酰胺的脂质粗品1，用二氯甲烷溶解，利用柱色谱分离，洗脱，获得洗脱后富含神经酰胺的脂质2。

第5步：将富含神经酰胺的脂质2加入到0.5～0.1mol/L甲醇钠溶液，富含神经酰胺的脂质2∶甲醇钠溶液重量比为1∶150～80，在常温下搅拌5～24h。碱处理完成后，将反应液旋转蒸干，获得碱处理后富含神经酰胺的脂质3。

第6步：取上述碱处理后的富含神经酰胺的脂质3，经过高效液相色谱分离获得神经酰胺的脂质4，做NMR、ESI-MS，分析其结构。

本发明农副产品包括米糠、麦麸、玉米、果蔬等农林加工废弃物，干燥，粉碎目数是小于1mm。

本发明涉及酶包括一种及两种以上蛋白酶或纤维素酶，最佳为纤维素酶、木瓜蛋白酶。

本发明涉及氨基酸化学渗透剂，包括甘氨酸、丙氨酸等已知氨基酸。

本发明所指活性两性脂质包含神经酰胺、糖缀神经酰胺、糖缀甾族、糖缀磷脂、糖缀甘油脂的一种或多种。

本发明柱色谱可以利用氧化铝柱色谱、硅胶柱色谱、大分子树脂柱色谱。

蛋白酶等能有效地破坏细胞壁，氨基酸可作为温和化学渗透剂，从而提高神经酰胺的提取率。本发明采用蛋白酶等和化学渗透剂氨基酸辅助下提取农林副产品中的富含神经酰胺脂质，与用混合溶剂直接提取相比，减少了粗提脂质中高极性脂质的含量。

本发明优点：(1)提取率提高，简化了其他成分的分离步骤。(2)同时获得不同含量的神经酰胺脂质。(3)在提取过程中不影响其他农林副产品活性成分的利用(4)整个过程溶剂可回收，无严重的“三废”，属环境友好技术。

具体实施方式

实施例1

第1步：将玉米加工废弃物，干燥，粉碎目数是小于1mm。取处理过的农林副产品置于反应釜中，按玉米加工废弃物∶水重量比为1∶5～20与水混合，用碳酸钠调节提取液的pH值至7.5～8.5。加入相当于农林副产品重量的0.01％～0.1％的氨基酸化学渗透剂。

第2步：称取相当于玉米加工废弃物的0.1％～1.0％的蛋白酶，缓慢加入上述的提取液中，继续搅拌10h～24h。

第3步：然后将提取液旋转蒸干，并向其中加入氯仿∶甲醇体积比为9～2∶1的混合溶剂提取3次，提取液与混合溶剂体积比为4～1∶1。分层后，旋转蒸发有机层得浓缩液脂质1。

第4步：将提取所得的富含神经酰胺的脂质1粗品，用少量二氯甲烷溶解。利用柱色谱分离，用溶剂洗脱出富含神经酰胺脂类。柱色谱可以利用氧化铝、硅胶、大孔树脂。获得富含神经酰胺的脂质2。

第5步：将富含神经酰胺的脂质2加入到0.5～0.1mol/L甲醇钠溶液，富含神经酰胺的脂质2∶甲醇钠溶液重量比为1∶150～80，在常温下搅拌5～24h。碱处理完成后，将反应液旋转蒸干，获得富含神经酰胺的脂质3。

第6步：取上述碱处理后的富含神经酰胺的脂质3，经过高效液相色谱分离的神经酰胺的脂质4，做NMR、ESI-MS，分析其结构。

实施例2

按照实施例1的制备步骤和方法。

100克处理过的麦麸，粉碎粒径小于1mm，置于2000ml水中，用碳酸钠调节提取液的pH值至8。按麦麸重量的0.06％加入甘氨酸化学渗透剂。称取相当于米糠重量的0.1％的纤维素酶，缓慢加入的提取液中，继续搅拌24h。然后将提取液旋转蒸干，并向其中加入2000ml的氯仿∶甲醇(体积比为4∶1)的混合溶剂提取3次。分层后，旋转蒸发有机层，获得浓缩液脂质1。将富含神经酰胺的脂质1用二氯甲烷溶解，利用大孔树脂柱色谱分离，用溶剂洗脱获得富含神经酰胺的脂质2。将富含神经酰胺的脂质2加入到0.35mol/L甲醇钠溶液100mL，在常温下搅拌10h。碱处理完成后，将反应液旋转蒸干，获得富含神经酰胺的脂质3。富含神经酰胺的脂质3经过高效液相色谱分离的神经酰胺的脂质4。做NMR、ESI-MS，分析其结构。神经酰胺提取率95％。

实施例3

按照实施例1的制备步骤和方法。

100克处理过的米糠，粉碎粒径小于1mm，置于1000ml水中，用碳酸钠调节提取液的pH值至7.5。按米糠重量的0.1％加入丙氨酸化学渗透剂。称取相当于米糠重量的0.8％的木瓜蛋白酶，缓慢加入的提取液中，继续搅拌14h。然后将提取液旋转蒸干，并向其中加入1500ml的氯仿∶甲醇(体积比为2∶1)的混合溶剂提取3次。分层后，旋转蒸发有机层获得浓缩液脂质1。将富含神经酰胺的脂质1用少量二氯甲烷溶解，利用硅胶柱色谱分离，用溶剂洗脱获得富含神经酰胺的脂质2。将富含神经酰胺的脂质2加入到0.15mol/L甲醇钠溶液150mL，在常温下搅拌20h。碱处理完成后，将反应液旋转蒸干，获得富含神经酰胺的脂质3。富含神经酰胺的脂质3经过高效液相色谱分离的神经酰胺的脂质4。做NMR、ESI-MS，分析其结构。神经酰胺提取率90％。

Claims (5)

1.一种提取农林副产品中的神经酰胺的方法，其特征是：是以农林副产品为原料，通过酶和化学渗透剂辅助下提取农林副产品中的富含神经酰胺两性脂质，所述的神经酰胺两性脂质选自：神经酰胺、糖缀神经酰胺、糖缀甾族、糖缀磷脂、糖缀甘油脂的一种或多种，制备步骤如下：

1)、将农林副产品米糠、麦麸、玉米加工的废弃物干燥，粉碎目数是小于1mm，取处理过的农林副产品置于反应釜中，按农林副产品∶水重量比为1∶5～20与水混合，用碳酸钠调节提取液的pH值至7.5～8.5，再加入相当于农林副产品重量的0.01～0.1％的氨基酸化学渗透剂；

2)、取相当于农林副产品重量的0.1～1.0％的蛋白酶或纤维素酶，缓慢加入上述反应釜的提取液中，继续搅拌10h～24h；

3)、然后将提取液旋转蒸干，并向其中加入氯仿∶甲醇体积比为9～2∶1的混合溶剂，按提取液与混合溶剂的体积比为4～1∶1的比例加入，提取3次，分层后，旋转蒸发有机层，浓缩，得神经酰胺两性脂质粗品；

4)、将第3步所得的神经酰胺的脂质粗品，用二氯甲烷溶解，利用柱色谱分离，洗脱，得洗脱后的富含神经酰胺两性脂质；

5)、将第4步得富含神经酰胺两性脂质，按富含神经酰胺两性脂质∶甲醇钠溶液重量比为1∶150～80，加入到浓度为0.5～0.1mol/L甲醇钠溶液中碱处理，在常温下搅拌5～24h，碱处理完成后，将反应液旋转蒸干，获得碱处理后的富含神经酰胺两性脂质；

6)、将第5步碱处理后的富含神经酰胺两性脂质，经过高效液相色谱分离获得神经酰胺，做NMR、ESI-MS，分析其结构。

2.根据权利要求1所述的农林副产品中的神经酰胺的方法，其特征是：蛋白酶为木瓜蛋白酶。

3.根据权利要求1所述的农林副产品中的神经酰胺的方法，其特征是：混合溶剂中氯仿∶甲醇体积比为4～2∶1。

4.根据权利要求1所述的农林副产品中的神经酰胺的方法，其特征是：氨基酸化学渗透剂为甘氨酸或丙氨酸。

5.根据权利要求1所述的农林副产品中的神经酰胺的方法，其特征是：柱色谱用氧化铝柱色谱、硅胶柱色谱或大分子树脂柱色谱。