CN101588816A - 白介素-13受体α1的高亲和性抗体拮抗物 - Google Patents

白介素-13受体α1的高亲和性抗体拮抗物 Download PDF

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Abstract

本申请公开了人类白介素－13受体α1的高亲和性抗体拮抗物。抗体分子有效地抑制了IL－13Rα1介导的活性，因此提供可用于治疗与IL－13Rα1活性有关的病症所需的拮抗物。本发明还公开了编码所述抗体分子的核酸、载体、宿主细胞和包含该抗体分子的组合物。还公开了使用该抗体分子抑制或拮抗IL－13Rα1介导的活性的方法。

Description

白介素-13受体α1的高亲和性抗体拮抗物
简介
本申请要求2006年10月19日提交的美国临时专利申请60/852,884的优先权，该临时专利申请的内容在此以其全文引为参考。
发明背景
来自人类研究和实验动物模型的数据强烈建议Th2来源的细胞因子促进了变应性哮喘，其中白介素-4(IL-4)和白介素-13(IL-13；参见例如Minty等，1993Nature 362：248-250；McKenzie等，1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3735-3739；登记号为U31120和L13029(人类)以及NM_001032929(恒河猴(Macaca mulatta)))扮演了最重要的角色。这两种细胞因子具有显著的结构相似性，共有某些受体成分。IL-4和IL-13的受体是双重IL-4R/IL-13受体(或II型受体)，它与IL-4和IL-13都结合。该受体包括IL-4Rα链(参见例如Idzerda等，1990J.Exp.Med.171：861-873)和IL-13Rα1链(参见例如Hilton等，1996Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：497-501；Aman等，1996 J.Biol.Chem.271：29265-29270；Miloux等，1997FEBS Lett.401：163-166；登记号为U62858和CAA70508(人类)以及AAP78901(食蟹猴(Macacafascicularis)))组成。双重IL-4R/IL-13R受体表达在造血和非造血细胞上，包括肺上皮和平滑肌细胞。此外，IL-4和IL-13每个都各具有一个识别它们但排除另一个的受体。例如，I型IL-4受体(IL-4R)，包含IL-4Rα链和常见的γ链(γc)，与IL-4特异性结合。I型IL-4R专门表达在造血来源的细胞上。特异性针对IL-13的受体IL-13Rα2，以高亲和性与IL-13结合，但是明显不转导信号。相反，该受体作为假目标(decoy)衰减对IL-13的应答。
IL-13和IL-4执行许多功能，并且都调节许多与过敏性表现型有关的功能，例如B细胞中向IgE的同种型类别转换、肥大细胞和嗜曙红细胞的活化、内皮细胞上血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的上调，以及趋化因子例如噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、胸腺和活化调节的趋化因子(TARC)以及巨噬细胞来源的趋化因子(MDC)的产生。
但是，由于它们的受体复合物的差别，IL-4和IL-13在体外和体内具有许多不同的功能。例如，IL-13而不是IL-4的多价螯合，已经显示出在小鼠哮喘模型中阻止了气管超反应性并减少了粘液的产生。IL-13与哮喘反应之间的这种相关性已经得到了其它研究的进一步支持；参见例如Hershey等，2003 J.Allergy Clin.Immunol.111(4)：677-690；Grunig等，1998Science 282(5397)：2261-2263；Mattes等，2001 J.Immunol.167(3)：1683-1692；以及Fulkerson等，2006Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.35(3)337-346。例如，已经发现，IL-13向肺部递送，足以在小鼠中诱导全部类似哮喘的表现型。被处理的动物发展出气管超反应性、富含嗜曙红细胞的细胞炎症、杯状细胞增生伴有相关的粘液过量产生、以及上皮下纤维变性；参见例如Wills-Karp等，1998Science 282(5397)：2258-2261；Reiman等，2006 Infect.Immun.74(3)：1471-1479；以及Kaviratne等，2004 J.Immunol.173(6)：4020-4029。此外，已经报道在人类哮喘的肺中IL-13的表达升高了。另外，几个研究组已经报道了IL-13基因中的多态性与过敏性状和哮喘症状的增加的风险之间的关联。这些多态性中的某些已经显示出与IL-13的增加的表达相关；参见例如Huang等，1995 J.Immunol.155(5)2688-2694；Naseer等，1997Am.J.Respir.Crit.Care Med.155(3)：845-851；Vladich等，2005 J.Clin.Invest.115(3)：747-754；Chen等，2004 J.Allergy Clin.Immunol.114(3)：553-560；以及Vercelli等，2002Curr.Opin.AllergyClin.Immunol.2(5)：389-393。
IL-13也已经与各种其它的病症相关联，包括但不限于各种呼吸***和过敏介导的病症、纤维变性、硬皮病、炎症性肠病和某些癌症；参见例如Wynn，T.A.，2003Annu.Rev.Immunol.21：425-456；Terabe等，2000Nat.Immunol.1(6)：515-520；Fuss等，2004 J.Clin.Invest.113(10)：1490-1497；Simms等，2002Curr.Opin.Rheumatol.14(6)：717-722；以及Hasegawa等，1997J.Rheumatol.24(2)：328-332。
因此，IL-13的拮抗物将是具有高度吸引力的分子，可用于发展对IL-13相关疾病的治疗。有效的抗体拮抗物将干扰IL-13与IL-13R的结合。针对IL-13Rα1的有效抗体拮抗物也可以干扰IL-13的结合，并阻止IL-4Rα和IL-13Rα1的异源二聚体聚合。这样的抗体能够通过II型受体抑制IL-13和IL-4的信号传导，同时通过I型受体节制IL-4信号传导。通过I型受体的信号传导在期间Th2细胞发生分化的免疫应答的诱导阶段中是必需的。T细胞不表达IL-13Rα1，所以II型受体在Th2分化中不发挥作用。因此，IL-13Rα1抗体将不会影响总的Th1/Th2平衡。通过II型IL-4/IL-13受体的信号传导在建立过敏炎症的过程中，在免疫应答的效应子阶段中是关键的。因此，II型受体的阻断将对许多哮喘的症状和其它IL-13R介导的病症有有益的作用，因此将是有效的疾病调节剂。
在本技术领域中已经描述了针对IL-13Rα1的抗体(单克隆的和多克隆的)；参见例如WO 97/15663、WO 03/80675、WO 03/46009、WO06/072564；Gauchat等，1998Eur.J.Immunol.28：4286-4298；Gauchat等，2000Eur.J.Immunol.30：3157-3164；Clement等，1997Cytokine9(11)：959(会议摘要)；Ogata等，1998 J.Biol.Chem.273：9864-9871；Graber等，1998Eur.J.Immunol.28：4286-4298；C.Vermot-Desroches等，2000Tissue Antigens 5(Supp.1)：52-53(会议摘要)；Poudrier等，2000Eur.J.Immunol.30：3157-3164；Akaiwa等，2001Cytokine 13：75-84；Cancino-Diaz等，2002 J.Invest.Dermatol.119：1114-1120；以及Krause等，2006Mol.Immunol.43：1799-1807。
对于具有增强的生物学活性、能够影响与过敏和哮喘反应以及已经至少部分归因于IL-13Rα1的增加的表达/功能的其它各种病症有关的活性的抗体，存在着需求。对于对IL-13Rα1具有高亲和性并在人类中具有低免疫原性的抗体分子，也存在着需求。因此，生产抑制或拮抗IL-13Rα1的活性和IL-13Rα1在各种不同治疗病症中发挥的相应作用的基于治疗的人类抗体拮抗物，将是极其重要的。
发明简述
本发明涉及IL-13Rα1、特别是人类IL-13Rα1的高亲和性抗体拮抗物。所公开的抗体分子选择性识别与人类IL-13Rα1的结合表现出KD为5×10-9或以下，更优选为2×10-9或以下，更优选为1×10-9或以下的IL-13Rα1、特别是人类IL-13Rα1。此外，符合本发明的具体的抗体分子以高亲和性与灵长类动物的IL-13Rα1结合，这是一种需要的性质，即可以使用非人类灵长动物模型来预测在人类中的效能和安全性情况。本发明的抗体分子能够有效抑制IL-13Rα1介导的活性，因此，在与其有关的病症的治疗中是重要的，这些病症包括但不限于哮喘、过敏、过敏性鼻炎、慢性鼻窦炎、花粉热、特异反应性皮炎、慢性阻塞性肺病(“COPD”)、肺纤维变性、食管嗜曙红细胞增多症、硬皮病、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、纤维变性、炎症性肠病(特别是溃疡性结肠炎)、过敏性反应和癌症(特别是霍奇金氏(Hodgkin′s)淋巴瘤、神经胶质瘤和肾癌)，以及普遍的Th2介导的紊乱/病症。IL-13Rα1特异性抗体也可用于检测和定量IL-13Rα1的各种诊断目的。
在一个具体的方面，本发明提供了分离的抗体10G5，它能够通过IL-13Rα1非常有效地拮抗IL-13的功能。10G5在NHDF细胞中表现出对IL-13和IL-4诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)释放的抑制，在NHDF细胞中表现出对IL-13和IL-4诱导的STAT6磷酸化的抑制，在血液或外周血单核细胞(PBMCs)中表现出对IL-13刺激的TARC释放的抑制。因此，本发明涵盖了由保藏为ATCC保藏编号No.PTA-6933的杂交瘤细胞系产生的抗体。本发明还包含了与PTA-6933的抗体竞争与hIL-13Rα1的结合的抗体。本发明的具体实施方案包括了包含10G5的重链和/或轻链可变区序列及其等价物(特征为具有一个或多个保守的氨基酸取代)或其同源物的抗体分子。具体的实施方案包含了分离的抗体分子，它具有本文公开的CDR结构域或本文公开的成组重链和/或轻链CDR结构域，或其等价物，特征为具有一个或多个保守的氨基酸取代。具体来说，本发明的抗体分子具有SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：121分别显示的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的重链可变区，以及具有有SEQ ID NO：84、SEQ IDNO：85和SEQ ID NO：122显示的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列的轻链可变区。更具体来说，本发明的抗体分子具有SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：67显示的氨基酸序列的重链可变区；具有SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：79显示的氨基酸序列的轻链可变区；或上面引用的重链和轻链可变区的组合。
本技术领域的专业人员将会认识到，保留了与hIL-13Rα1结合的能力的抗体的片段可以被***到各种不同框架中，参见例如美国专利No.6,818,418以及其中包含的参考文献，其中讨论了各种不同的支架，可用于显示以前在抗原结合的基础上选择的抗体环。此外，编码VL和VH的基因可以使用重组方法连接起来，例如使用合成的连接物使它们被制备成单一的蛋白链，其中VL和VH区域对形成了单价分子，或称为单链Fvs(ScFVs)；参见例如Bird等，1988Science 242：423-426，以及Huston等，1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883。
另一方面，本发明提供了编码公开的抗体分子的核酸。本发明还提供了可变重链和轻链及其选择的组分、特别是公开的相应CDR3区域的编码核酸。另一方面，本发明提供了包含所述核酸的载体。另一方面，本发明提供了包含编码公开的抗体分子及其所述组分的核酸的分离的细胞。另一方面，本发明提供了包含本发明的多肽或载体的分离的细胞。
另一方面，本发明提供了制造本发明的与IL-13Rα1选择性结合的抗体分子(包括抗体、抗原结合片段、衍生物、嵌合分子、任何上述分子与另一种多肽的融合物、或整合有任何上述分子的可选的结构/组合物)的方法，包括将包含编码重链和/或轻链的核酸(依赖于所生产的抗体分子)的细胞，在允许该重链和/或轻链表达和/或组装到抗体分子中的条件下进行温育，以及从细胞中分离该抗体分子。本技术领域的专业人员可以使用标准的重组DNA技术获得本文公开的抗体分子。
另一方面，本发明提供了拮抗IL-13Rα1的活性或功能的方法，这可能是信号传导或其它活性或功能，该方法包括将表达IL-13Rα1的细胞与本文公开的抗体分子在允许该抗体分子与IL-13Rα1结合的条件下相接触。本发明的具体实施方案包括了这样的方法，其中细胞是人类细胞。这里描述的抗体分子能够有效抑制IL-13Rα1介导的活性。本发明的抗体分子被发现能够有效抑制噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)从正常人类真皮成纤维细胞(在后文中称为“NHDF”细胞)的释放。本发明的抗体分子被发现在NHDF细胞中有效抑制IL-13和IL-4刺激的STAT6的磷酸化，并被发现在全血(人类/恒河猴)中有效地抑制IL-13刺激的TARC(CCL17)的释放。
另一方面，本发明提供了在表现出与IL-13Rα1活性相关的病症(或其中IL-13Rα1的功能被认为对具体的对象不利的病症)的对象中拮抗IL-13Rα1活性的方法，该方法包括给对象施用治疗有效量的本发明的抗体分子。在选择的实施方案中，病症可以是哮喘、过敏、过敏性鼻炎、慢性鼻窦炎、花粉热、特异反应性皮炎、慢性阻塞性肺病(“COPD”)、肺纤维变性、食管嗜曙红细胞增多症、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、纤维变性、硬皮病、炎症性肠病(特别是溃疡性结肠炎)、过敏性反应和癌症(特别是霍奇金氏淋巴瘤、神经胶质瘤和肾癌)，以及普遍的Th2介导的紊乱/病症。另一方面，本发明提供了药物组合物或其它组合物，其中包含本发明的抗体分子(或包含本文公开的IL-13Rα1-特异性抗原结合部分的可选的抗原结合结构或蛋白)以及可药用的载体、赋形剂、稀释剂、稳定剂、缓冲液，或被设计用于促进抗体分子以所需量施用于被治疗的个体的可选物质。
本发明的另一方面涉及本文公开的抗体与hIL-13Rα1之间的关键接触点的鉴定。该关键接触点是通过产生影响了受体被抗体结合的特异突变体来鉴定的。更具体来说，发现了将SEQ ID NO：101的233位的苯丙氨酸残基用丙氨酸残基取代，导致了抗体与受体之间结合的丧失。这是在对10G5及其衍生物的表征中作出的非常有用的发现。利用233位氨基酸周围的狭窄区域的肽，将可用于产生其它具有类似特异性的单克隆抗体。因此，本发明包含了包含具有Phe233Ala突变的hIL-13R序列的分离的肽，不论它们是全长的还是其包含突变的片段。此外，本发明还包括了在分析方法中使用该多肽，以评估10G5或10G5衍生物，鉴定对相似的表位具有特异性的抗体，或产生具有相似特异性的抗体。
附图说明
图1显示了抗体10G5的重链可变区的核苷酸及衍生的氨基酸序列。CDRs和编码CDRs的核酸被加下划线。
图2显示了抗体10G5的轻链可变区的核苷酸及衍生的氨基酸序列。CDRs和编码CDRs的核酸被加下划线。
图3显示了pFab3d的遗传图谱。
图4A和4B分别显示了在pFab3d中10G5Fab的重链和轻链构建物SEQ ID NOs：86和87。
图5显示了周质制备物中突变的Fabs与恒河猴IL-13Rα1的结合。
图6显示了10G5突变体的周质制备物与人类IL-13Rα1结合的ELISA分析。
图7显示了10G5突变体的周质制备物与人类IL-13Rα1结合的ELISA分析。
图8显示了轻链变异体克隆的Myc捕获的ELISA数据。
图9显示了10G5、10G5H6和10G5-6在NHDF噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)释放分析中的功能。
图10显示了10G5-6在NHDF细胞中阻断IL-13和IL-4刺激的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放中的功能。
图11显示了10G5和10G5H6在IL-13-诱导的STAT6分析中的功能。
图12显示了10G5和10G5H6在IL-4诱导的STAT6分析中的功能。
图13显示了10G5-6在人类全血中阻断IL-13刺激的TARC(CCL17)的释放中的功能。
图14显示了10G5和10G5H6在人类全血中在IL-13刺激的TARC释放分析中的功能。
图15显示了10G5H6和10G5-6在恒河猴全血中阻断恒河猴IL-13刺激的TARC的释放中的功能。
图16显示了IgG1(SEQ ID NO：97)、IgG2(SEQ ID NO：98)、IgG4(SEQ ID NO：99)和IgG2m4(SEQ ID NO：100)同种型的Fc结构域的序列比较。
图17显示了10G5、10G5H6和10G5-6对霍奇金氏病细胞系L1236的细胞增殖的抑制。
发明详述
本发明涉及IL-13Rα1、特别是人类IL-13Rα1的高亲和性抗体拮抗物。所公开的抗体分子选择性识别并特异性结合IL-13Rα1。在具体的实施方案中，抗体以高亲和性结合灵长类IL-13Rα1(例如食蟹猴IL-13Rα1)，这是一种需要的性质，可以使用非人类灵长动物模型来预测在人类中的效能和安全性情况。本文中使用的术语“选择性”或“特异性”是指所公开的抗体分子不显示出与IL-13Rα1之外的分子显著结合的事实。所公开的抗体分子与人类IL-13Rα1结合的KD为5×10-9或以下，更优选为2×10-9或以下，更优选甚至为1×10-9或以下。KD是指解离常数，从Kd(具体的抗体-抗原相互作用的解离率)与Ka(具体的抗体-抗原相互作用的结合率)的比率、或以摩尔浓度(M)表示的Kd/Ka获得。KD值可以使用在本技术领域中已经建立的方法来确定。优选的确定抗体的KD的方法是通过使用表面等离子共振，例如生物传感器***，例如BIACORETM(Pharmacia AB Corporation)***。
正如本文所述，抗体能够特别有效地拮抗IL-13Rα1的功能，或在本文中所称的IL-13Rα1介导的活性。本文中使用的词组“IL-13Rα1介导的”活性/功能是指任何需要IL-13Rα1的功能或被IL-13Rα1的功能加强或增加的活性/功能。所公开的抗体分子已经被显示出表现了至少一种下述功能特性：(i)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(ii)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(iii)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的STAT6的磷酸化；(iv)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的STAT6的磷酸化；或(v)在血液或PBMCs中抑制IL-13刺激的TARC的释放。本发明的具体实施方案提供了拮抗IL-13Rα1介导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)从NHDF细胞的释放的抗体分子，其IC50为1.0μg/ml或以下，更优选为0.5μg/ml或以下，更优选为0.1μg/ml或以下。本发明的具体实施方案提供了在NHDF细胞中拮抗IL-13Rα1介导的STAT6的磷酸化的抗体分子。本发明的具体实施方案提供了拮抗在全血或PBMCs中IL-13Rα1介导的TARC(CCL17)的释放的抗体分子，其IC50为1000ng/ml或以下，更优选为500ng/ml或以下，更优选为250ng/ml或以下。任何具体的抗体的拮抗程度可以被定量测定为与对照相比的统计学IC50值，或通过本技术领域中可用的、评估对IL-13Rα1功能的负面影响或抑制的可选方法(即任何能够评估对IL-13Rα1功能的拮抗的方法)。
本文描述的“抗体分子”或“抗体”是指与hIL-13Rα1选择性结合的免疫球蛋白衍生的结构，包括但不限于全长的或完整的抗体、抗原结合片段(在物理上或概念上从抗体结构衍生的片段)、任何上述分子的衍生物、嵌合分子、任何上述分子与另一种多肽的融合物，或任何包含任何上述分子的用于选择性结合/抑制IL-13Rα1的功能的可选结构/组合物。“完整”抗体或“全长”抗体是指具有通过二硫键相互连接的两条重链(H)和两条轻链(L)的蛋白，包括：(1)对于重链来说，可变区(在本文中缩写为“VH”)和具有三个结构域CH1、CH2和CH3的重链恒定区；以及(2)对于轻链来说，轻链可变区(在本文中缩写为“VL”)和包含一个结构域CL的轻链恒定区。本文中使用的“分离的”当指称所公开的抗体分子、核酸或其它分子时，描述了使它们与在自然界中发现的有所不同的性质。这种不同可以是，例如，它们与在自然界中发现的具有不同的纯度，或它们与在自然界中发现的具有不同的结构或形式。在自然界中没有被发现的结构例如包括重组人类免疫球蛋白结构，包括但不限于具有最优化的互补性决定区(CDRs)的重组人类免疫球蛋白结构。其它没有在自然界中发现的结构的例子是基本上不含其它细胞物质的抗体分子或核酸。分离的抗体一般不含其它具有不同抗原特异性(IL-13Rα1之外)的抗体。
抗体片段、更具体来说抗原结合片段，是具有抗体可变区或其片段的分子(包含重链和/或轻链的一个或多个所公开的CDR3结构域)，这使它们与IL-13Rα1、特别是人类IL-13Rα1(hIL-13Rα1)选择性结合。包含这样的抗体可变区的抗体片段包括但不限于下列的抗体分子：Fab、F(ab′)2、Fd、Fv、scFv、双特异性抗体分子(即抗体分子包含与具有与本文公开的抗体不同的结合特异性的第二个功能性基团连接的本文公开的IL-13Rα1特异性抗体或抗原结合片段，第二个功能性基团包括但不限于另一种肽或蛋白，例如抗体或受体配体)、双特异性单链Fv二体、分离的CDR3、微型抗体、“scAb”、dAb片段、双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)、四链抗体(tetrabody)，以及基于蛋白构架的人工抗体，包括但不限于III型纤维粘连蛋白多肽抗体(参见例如美国专利No.6,703,199、WO 02/32925和WO 00/34784)或细胞色素B(参见例如Nygren等，1997Curr.Opinion Struct.Biol.7：463-469)。抗体的部分或结合片段可以是天然的，也可以是部分或全部合成生产的。这样的抗体部分可以通过本技术领域的专业人员已知的各种方法来制备，包括但不限于常规的技术，例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化)。
在一个具体的方面，本发明提供了分离的抗体10G5，它能够通过IL-13Rα1非常有效地拮抗IL-13的功能。10G5在NHDF细胞中表现出对IL-13和IL-4诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)释放的抑制，在NHDF细胞中表现出对IL-13和IL-4诱导的STAT6磷酸化的抑制，在血液或外周血单核细胞(PBMCs)中表现出对IL-13刺激的TARC释放的抑制。因此，本发明涵盖了由保藏为ATCC保藏编号No.PTA-6933的杂交瘤细胞系产生的抗体。本发明还包含了与PTA-6933的抗体竞争与hIL-13Rα1的结合的抗体分子。本发明的其它实施方案是与本文公开的抗体竞争与hIL-13Rα1的结合的抗体分子。本发明的具体实施方案提供了抑制IL-13与hIL-13Rα1结合的分离的抗体分子。
本发明的具体实施方案包括了具有10G5的重链和/或轻链可变区序列的抗体分子，及其等价物(特征为具有一个或多个保守的氨基酸取代)或同源物。具体的实施方案为分离的抗体分子，它包含本文公开的CDR结构域或本文公开的成组重链和/或轻链CDR结构域，或其等价物，特征为具有一个或多个保守的氨基酸取代。这里使用的术语“结构域”或“区域”仅仅是指抗体分子的相应部分，其中所讨论的序列或片段将位于、或目前位于其中。
表1提供了本发明包含的序列的概况。
表1
  SEQ ID NO：   描述
  SEQ ID NO：1   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：2   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：3   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：4   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：5   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：6   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：7   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：8   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：9   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：10   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：11   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：12   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：13   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：14   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：15   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：16   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：17   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：18   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：19   变异体序列W/最优化的CDR3
  SEQ ID NO：20   变异体序列W/最优化的CDR3
  SEQ ID NO：21   变异体序列W/最优化的CDR3
  SEQ ID NO：22   变异体序列W/最优化的CDR3
  SEQ ID NO：23   变异体序列W/最优化的CDR3
  SEQ ID NO：24   变异体序列W/最优化的CDR3
  SEQ ID NO：25   变异体序列W/最优化的CDR3
  SEQ ID NO：26   重链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：27   轻链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：28   轻链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：29   轻链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：30   轻链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：31   轻链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：32   轻链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：33   轻链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：34   轻链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：35   轻链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：36   轻链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：37   轻链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：38   轻链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：39   轻链CDR3最优化的变异体
  SEQ ID NO：40   10G5重链CDR3
  SEQ ID NO：41   10G5重链CDR3
  SEQ ID NO：42   10G5VH SEQ W/前导序列，以及附加的恒定区——核酸
  SEQ ID NO：43   只有10G5VH序列——核酸
  SEQ ID NO：44   10G5VH SEQ W/前导序列，以及附加的恒定区——蛋白
  SEQ ID NO：45   只有10G5VH序列——蛋白
  SEQ ID NO：46   10G5VL SEQ W/前导序列，以及附加的恒定区——核酸
  SEQ ID NO：47   只有10G5VL序列——核酸
  SEQ ID NO：48   10G5VL SEQ W/前导序列，以及附加的恒定区——蛋白
  SEQ ID NO：49   只有10G5VL序列——蛋白
  SEQ ID NO：50   10G5-1，3重链*
  SEQ ID NO：51   10G5-1，3VH*
  SEQ ID NO：52   10G5-1，3重链核酸*
  SEQ ID NO：53   10G5-1，3VH核酸*
  SEQ ID NO：54   10G5-2重链
  SEQ ID NO：55   10G5-2VH
  SEQ ID NO：56   10G5-2重链核酸
  SEQ ID NO：57   10G5-2VH核酸
  SEQ ID NO：58   10G5-4，5重链*
  SEQ ID NO：59   10G5-4，5VH*
  SEQ ID NO：60   10G5-4，5重链核酸*
  SEQ ID NO：61   10G5-4，5VH核酸*
  SEQ ID NO：62   10G5-6重链*
  SEQ ID NO：63   10G5-6VH*
  SEQ ID NO：64   10G5-6重链核酸*
  SEQ ID NO：65   10G5-6VH核酸*
  SEQ ID NO：66   10G5-7，8重链
  SEQ ID NO：67   10G5-7，8VH
  SEQ ID NO：68   10G5-7，8重链核酸
  SEQ ID NO：69   10G5-7，8VH核酸
  SEQ ID NO：70   10G5-1，2，4，6，7轻链*
  SEQ ID NO：71   10G5-1，2，4，6，7VL*
  SEQ ID NO：72   10G5-1，2，4，6，7轻链核酸*
  SEQ ID NO：73   10G5-1，2，4，6，7VL核酸*
  SEQ ID NO：74   10G5-3轻链
  SEQ ID NO：75   10G5-3VL
  SEQ ID NO：76   10G5-3轻链核酸
  SEQ ID NO：77   10G5-3VL核酸*
  SEQ ID NO：78   10G5-5，8轻链*
  SEQ ID NO：79   10G5-5，8VL*
  SEQ ID NO：80   10G5-5，8轻链核酸*
  SEQ ID NO：81   10G5-5，8VL核酸*
  SEQ ID NO：82   10G5VH CDR1
  SEQ ID NO：83   10G5VH CDR2
  SEQ ID NO：84   10G5VL CDR1
  SEQ ID NO：85   10G5VL CDR2
  SEQ ID NO：86   PFAB3D-10G5H
  SEQ ID NO：87   PFAB3D-10G5L
  SEQ ID NO：92   IGG2M4的恒定区
  SEQ ID NO：93   IGG2M4的恒定区核酸
  SEQ ID NO：94   10G5-6重链IGG2M4
  SEQ ID NO：95   10G5-6重链IGG2M4核酸
  SEQ ID NO：96   10G5H6重链IGG2M4
  SEQ ID NO：97   IGG1FC
  SEQ ID NO：98   IGG2FC
  SEQ ID NO：99   IGG4FC
  SEQ ID NO：100   IGG2M4FC
  SEQ ID NO：101   成熟的人类IL-13受体α1
  SEQ ID NO：103   hIL-13Rα1.ECR
  SEQ ID NO：104   成熟的食蟹猴IL-13Rα1序列
  SEQ ID NO：105   成熟的鼠类IL-13Rα1序列
  SEQ ID NO：106   VH CDR1核酸
  SEQ ID NO：107   VH CDR2核酸
  SEQ ID NO：108   VH CDR3核酸
  SEQ ID NO：109   VL CDR1核酸
  SEQ ID NO：110   VL CDR2核酸
  SEQ ID NO：111   VL CDR3核酸
  SEQ ID NO：112   VH CDR310G5-6核酸
  SEQ ID NO：113   VL CDR310G5-6核酸
  SEQ ID NO：120   突变的人类IL-13受体α1
  SEQ ID NO：121   VH CDR3
  SEQ ID NO：122   VL CDR3
  SEQ ID NO：123   VL CDR1核酸
*注解：当具体的SEQ ID NO：与一种以上被命名的抗体相关时，可以使用下面的格式作为不同抗体的缩写：抗体基本名称-一个指派编号，另一个指派编号，等等。一个例子如下：10G5-1，3表示10G5-1和10G5-3两者。
在具体的实施方案中，本发明提供了包括SEQ ID NO：45的重链可变区、其具有一个或多个保守氨基酸取代的等价物、及其同源物的分离的抗体分子。所公开的抗体表现出至少一种下列功能特性：(i)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(ii)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(iii)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的STAT6的磷酸化；(iv)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的STAT6的磷酸化；或(v)在血液或PMBCs中抑制IL-13刺激的TARC的释放。在具体的实施方案中，本发明提供了所公开的抗体分子的同源物，其特征为与其至少90％同源，并表现出至少一种上述功能特性。所提供的具体抗体将与保藏作ATCC保藏号No.PTA-6933的杂交瘤细胞系产生的抗体竞争与hIL-13Rα1的结合。
在具体的实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：49的轻链可变区、其具有一个或多个保守氨基酸取代的等价物、及其同源物的分离的抗体分子。所公开的抗体表现出至少一种下列功能特性：(i)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(ii)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(iii)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的STAT6的磷酸化；(iv)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的STAT6的磷酸化；和(v)在血液或PMBCs中抑制IL-13刺激的TARC的释放。在具体的实施方案中，本发明提供了所公开的抗体分子的同源物，其特征为与其至少90％同源，并表现出至少一种上述功能特性。所提供的具体抗体将与保藏作ATCC保藏号No.PTA-6933的杂交瘤细胞系产生的抗体竞争与hIL-13Rα1的结合。
在具体的实施方案中，本发明提供了包含包括SEQ ID NO：45的重链可变区和包括SEQ ID NO：49的轻链可变区、或其具有一个或多个保守氨基酸取代的等价物的分离的抗体分子。在具体的实施方案中，该抗体表现出至少一种下列功能特性：(i)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(ii)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(iii)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的STAT6的磷酸化；(iv)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的STAT6的磷酸化；和(v)在血液或PMBCs中抑制IL-13刺激的TARC的释放。
在具体的实施方案中，本发明提供了包括可变重链CDR3序列SEQ ID NO：40及其保守修饰物的分离的IL-13Rα1抗体分子，该抗体表现出至少一种下列功能特性：(i)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(ii)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(iii)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的STAT6的磷酸化；(iv)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的STAT6的磷酸化；和(v)在血液或PMBCs中抑制IL-13刺激的TARC的释放。本发明具体包含的重链可变区CDR3序列列于下表2中。
表2
  SEQ ID NO：   VH CDR3序列
  SEQ ID NO：1   FPNWGALDQ
  SEQ ID NO：2   VPNWGSLDT
  SEQ ID NO：3   FPNWGSMDA
  SEQ ID NO：4   FPNWGSLDH
  SEQ ID NO：5   MPNWGSFDY
  SEQ ID NO：6   MPNWGSFDT
  SEQ ID NO：7   MPNWGSLDH
  SEQ ID NO：8   MPNWGSFDS
  SEQ ID NO：9   MPNWGSLDT
  SEQ ID NO：10   MPNWGSLDA
  SEQ ID NO：11   MPNWGSLDN
  SEQ ID NO：12   MPNWGALDS
  SEQ ID NO：13   MPNWGSFDN
  SEQ ID NO：14   MPNWGSLDY
  SEQ ID NO：15   MPNWGSFDH
  SEQ ID NO：16   MPNWGSLDS
  SEQ ID NO：17   MPNWGSLDG
  SEQ ID NO：18   VPNWGSLDN
  SEQ ID NO：19   CARFPNWGSLDHWGQGTLVTVSSASIKG
  SEQ ID NO：20   CARMPNWGSLDHWGQGTLVTVSSASTKG
  SEQ ID NO：21   CARMPNWGSFDYWGQGTLVTVSSASIKG
  SEQ ID NO：22   VRMPNWGSLDHW
  SEQ ID NO：23   VRMPNWGSLDHWGQGTLVTVSSASIKG
  SEQ ID NO：24   ARMPNWGSLDHWGQGTLVTVSSASIKG
  SEQ ID NO：25   FPNWGSFDYWGQGTLVTVSSASIKG
  SEQ ID NO：26   VPNWGSLDA
具体的实施方案提供了分离的抗体分子，其包含的重链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3序列分别为SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83和/或SEQ ID NO：40，或其在任何一个或多个CDR序列中具有一个或多个保守氨基酸取代的等价物。其它选择性实施方案提供了分离的抗体分子，其包含的重链可变区的CDR1、CDR2和/或CDR3序列分别为SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：102和/或SEQ ID NO：40，或其在任何一个或多个CDR序列中具有一个或多个保守氨基酸取代的等价物。
在具体的实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO：41的可变区轻链CDR3序列及其保守修饰物的分离的IL-13Rα1抗体分子，该抗体表现出至少一种下列功能特性：(i)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(ii)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(iii)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的STAT6的磷酸化；(iv)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的STAT6的磷酸化；和(v)在血液或PMBCs中抑制IL-13刺激的TARC的释放。本发明具体包含的轻链可变区CDR3序列列于表3中。
表3
  SEQ ID NO：  VL CDR3序列
  SEQ ID NO：27   QRYAT
  SEQ ID NO：28   QRYST
  SEQ ID NO：29   QMYST
  SEQ ID NO：30   QQVGT
  SEQ ID NO：31   QVYST
  SEQ ID NO：32   QQYST
  SEQ ID NO：33   QSYST
  SEQ ID NO：34   QQYAT
  SEQ ID NO：35   QQYSS
  SEQ ID NO：36   QTYST
  SEQ ID NO：37   QQYGS
  SEQ ID NO：38   QQYAS
  SEQ ID NO：39   QQYEA
具体的实施方案提供了分离的抗体分子，其包含的轻链可变区包含的CDR1、CDR2和/或CDR3序列分别显示在SEQ ID NO：84、SEQ IDNO：85和/或SEQ ID NO：41中，或其在任何一个或多个CDR序列中具有一个或多个保守氨基酸取代的等价物。
在具体的实施方案中，本发明提供了分离的IL-13Rα1抗体分子，它包含了分别由SEQ ID NO：40和41显示的重链可变区CDR3序列和轻链可变区CDR3序列，或其在任何一个或多个CDR3序列中的保守修饰物，该抗体表现出至少一种下列功能特性：(i)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(ii)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(iii)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的STAT6的磷酸化；(iv)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的STAT6的磷酸化；和(v)在血液或PMBCs中抑制IL-13刺激的TARC的释放。
具体的实施方案提供了分离的IL-13Rα1抗体分子，它包含了分别由SEQ ID NO：82、83、40、84、85和41显示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列和轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3序列；及其在任何一个或多个CDR序列中具有一个或多个保守氨基酸取代的等价物。
正如本技术领域的普通专业人员将会认识到的，保守氨基酸取代是将一个氨基酸残基用另一个赋予相似的或更好的(对于所打算的目的来说)功能和/或化学性质的残基取代。例如，保守的氨基酸取代通常是将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸取代。在本技术领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。这样的修饰不会显著降低或改变包含氨基酸序列的抗体的结合或功能抑制特性，但是可能增进这样的性质。进行取代的目的并不重要，可以包括但不限于将一个残基用另一个能够更好地维持或增强分子的结构、分子的电荷或疏水性、或分子的大小的残基取代。例如，人们可能希望将一个不太想要的残基简单地用另一个具有同样的极性或电荷的残基取代。这种修饰可以通过本技术领域已知的标准技术导入，例如定点突变和PCR介导的突变。本技术领域的专业人员完成保守氨基酸取代的一种具体的方法是丙氨酸扫描突变技术，该技术被讨论在例如MacLennan等，1998Acta Physiol.Scand.Suppl.643：55-67和Sasaki等，1998Adv.Biophys.35：1-24中。然后使用本技术领域可用的或本文描述的功能性分析方法测试被改变的抗体分子的保留的或更好的功能。具有一个或多个这样的保守氨基酸取代，并且与不具有这些氨基酸改变的分子相比，具有同样或更好水平的与hIL-13Rα1选择性结合和拮抗IL-13Rα1功能的能力的抗体分子，在本文中被称为所公开的抗体的“功能等价物”，并形成了本发明的特定实施方案。
另一方面，本发明提供了抗体分子，其包含的重链和/或轻链可变区包含与所公开的抗体的相应氨基酸序列同源的氨基酸序列，其中抗体分子表现出低于5nM的与人类白介素13受体α1(hIL-13Rα1)的平衡竭力常数(KD)，并拮抗hIL-13Rα1介导的活性。具体的实施方案是包含的重链和/或轻链可变区与公开的重链和/或轻链可变区分别具有至少90％的同源性、并表现出至少一种下列功能特性的抗体分子：(i)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(ii)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(iii)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的STAT6的磷酸化；(iv)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的STAT6的磷酸化；或(v)在血液或PMBCs中抑制IL-13刺激的TARC的释放。本发明的另一实施方案是包含的的重链和/或轻链可变区与公开的重链和/或轻链可变区分别具有至少90％的同源性、并与保藏作ATCC保藏号No.PTA-6933的杂交瘤细胞系产生的抗体竞争与hIL-13Rα1的结合的抗体分子。指称在可变区中“至少90％同源”包含了至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％同源的序列。
典型情况下，生产具有与本文描述的特定抗体分子的氨基酸序列同源的氨基酸序列的抗体，以改进抗体的一种或多种性质，而不改变它对IL-13Rα1的特异性。获得这样的序列的一种方法、但不是本领域技术人员可用的唯一方法，是通过定点或随机突变技术对编码本文描述的重链和/或轻链可变区的序列进行突变，表达包含突变的可变区的抗体分子，以及使用本文描述的功能分析方法测试被编码抗体分子的保留的功能。
本文中使用的两个氨基酸序列之间的百分同源性等价于两个序列之间的百分同一性。两个序列之间的百分同一性是序列所共有的相同位置的数量的函数(即同源性％＝相同的位置的数量/位置的总数X100)，其中考虑到了对两个序列进行最适比对所需要引入到空隙的数量和每个空隙的长度。序列的比较和序列间百分同一性的确定可以使用本技术领域的专业人员普遍了解的方法来确定，可以使用数学算法来完成。例如，氨基酸序列和/或核苷酸序列之间的百分同一性可以使用Meyers和Miller，1988Comput.Appl.Biosci.4：11-17中的算法来确定，该算法已经被整合到ALIGN程序(2.0版)中。此外，氨基酸序列或核苷酸序列之间的百分同一性可以使用GCG软件包中的GAP程序使用缺省的参数来确定，该程序可以从Accelrys在线使用。
本发明的具体抗体抑制了IL-13与hIL-13Rα1的结合。本发明的具体抗体与本文公开的任何抗体、特别是10G5、竞争与hIL-13Rα1的结合。这样的竞争性抗体可以在标准的IL-13Rα1结合分析中，根据它们与本文公开的10G5或其衍生物交叉竞争(例如以统计学显著的方式竞争性抑制其结合)的能力来鉴定。测试抗体抑制10G5或其衍生物与人类IL-13Rα1结合的能力，证明了测试抗体可以与该抗体竞争与人类IL-13Rα1的结合。按照非限制性的理论，这样的抗体可以象它所竞争的抗体那样，与人类IL-13Rα1上相同的或相关的(例如结构相似的或空间上接近的)表位结合。然后评估与10G5或其公开的衍生物竞争结合的抗体是否具有至少一种下列功能特性：(i)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(ii)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(iii)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的STAT6的磷酸化；(iv)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的STAT6的磷酸化；和(v)在血液或PMBCs中抑制IL-13刺激的TARC的释放。然后也可以评估抗体在本文描述的人类IL-13Rα1的Phe233Ala残基处的结合敏感性。
在具体的实施方案中，本发明提供了分离的抗体分子，它拮抗IL-13Rα1功能(IL-13Rα1介导的活性)，并表现出少于200pM、优选情况下少于100pM的与hIL-13Rα1的平衡解离常数(KD)，该平衡解离常数通过本技术领域的专业人员容易获得和理解的表面等离子共振技术来测定，包括但不限于BIACORETM(Upsala，Sweden)和
Figure A20078003895400281
(Sapidyne Instruments，Boise，ID)或其适合的等价物。在具体的实施方案中，分离的抗体分子表现出上述的KD以及一种下列功能特性：(i)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(ii)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的释放；(iii)在NHDF细胞中抑制IL-13诱导的STAT6的磷酸化；(iv)在NHDF细胞中抑制IL-4诱导的STAT6的磷酸化；和(v)在血液或PMBCs中抑制IL-13刺激的TARC的释放。
在具体的实施方案中，本发明提供了分离的抗体分子，它表现出上述的KD、拮抗IL-13Rα1介导的活性，并且它包含的重链可变区具有SEQ ID NO：5中所示的互补性决定区3(CDR3)结构域、或其在1、7和/或9位氨基酸位置处具有保守氨基酸取代的等价物。在具体的实施方案中，本发明提供了分离的抗体分子，它表现出上述的KD和重链可变区，并且它包含的轻链可变区具有SEQ ID NO：38中所示的CDR3结构域、或其在2、4和/或5位氨基酸位置处具有保守氨基酸取代的等价物。在具体的实施方案中，这样的保守氨基酸取代包括下列取代：
在SEQ ID NO：5中，1位用选自F、M、Q、L和V的残基取代；
在SEQ ID NO：5中，7位用选自F、L、A和M的残基取代；
在SEQ ID NO：5中，9位用选自Y、Q、K、R、W和H的残基取代；
在SEQ ID NO：38中，2位用选自Q、R、M、S和T的残基取代；
在SEQ ID NO：38中，4位用选自E、A、G和S的残基取代；和/或
在SEQ ID NO：38中，5位用选自T、A和S的残基取代。
因此，本发明的一个实施方案包含的抗体分子的重链可变区CDR3具有序列Xaa1-Pro-Asn-Trp-Gly-Xaa2-Xaa3-Asp-Xaa4(SEQ ID NO：121)，其中Xaa1是Phe、Met、Gln、Leu或Val；Xaa2是Ser或Ala；Xaa3是Phe、Leu、Ala或Met；Xaa4是Tyr、Gln、Lys、Arg、Trp、His、Ala、Thr、Ser、Asn或Gly。另一个实施方案包含的抗体分子的轻链可变区CDR3具有序列Gln-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4(SEQ ID NO：122)，其中Xaa1是Gln、Arg、Met、Ser、Thr或Val；Xaa2是Tyr或Val；Xaa3是Glu、Ala、Gly或Ser；Xaa4是Thr、Ala或Ser。
本发明的一个方面是分离的抗体或抗原结合片段，包含：
重链可变区，其CDR3结构域具有选自下列的序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：26；或具有包含了CDR3结构域的序列的重链可变区，该序列选自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25；和/或
轻链可变区，其CDR3结构域具有选自下列的序列：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39；
其中其具体的实施方案显示出小于200pM的与IL-13Rα1的KD。
具体的实施方案具有的重链包含了选自SEQ ID NO：50、SEQ IDNO：54、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：66的序列。具体的实施方案具有的重链可变结构域包含了选自SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：67的序列。具体的实施方案具有的轻链具有选自SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：78的序列。具体的实施方案具有的轻链可变结构域具有选自SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：79的序列。
本发明的另一方面是符合本公开的分离的抗体或抗原结合片段，具有：
包含了具有SEQ ID NO：85中所示的序列的CDR2结构域的轻链可变区；
包含了具有SEQ ID NO：83中所示的序列的CDR2结构域的重链可变区；
包含了具有SEQ ID NO：84中所示的序列的CDR1结构域的轻链可变区；和/或
包含了具有SEQ ID NO：82中所示的序列的CDR1结构域的重链可变区。因此，本发明的具体实施方案提供了特异性针对人类IL-13受体的抗体分子，其包含的抗原结合区具有本文描述的重链和轻链可变区以及一组CDRs(CDR1、CDR2和CDR3)。本发明还提供了包含一种和/或两种下列组分的组合物：(1)具有一组CDRs的重链可变区，和(2)具有一组CDRs的轻链可变区。
一种情况下，本发明提供了针对人类IL-13Rα1的分离的抗体分子，其中具有至少一个轻链可变结构域和至少一个重链可变结构域(分别为VL和VH)。
在具体的实施方案中，具有符合本文描述的重链可变链区的抗体分子与具有SEQ ID NO：41中所示的CDR3序列的轻链可变区一起表达。在另一个实施方案中，具有符合本文描述的轻链可变区的抗体分子与具有SEQ ID NO：40中所示的CDR3序列的重链可变区一起表达。在具体的实施方案中，上面描述的分子式的轻链和重链被组合使用。本发明的具体实施方案提供了抗体分子，它进一步包含：
具有SEQ ID NO：85中所示的CDR2结构域的轻链可变区；
具有SEQ ID NO：83中所示的CDR2结构域的重链可变区；
具有SEQ ID NO：84中所示的CDR1结构域的轻链可变区；和/或
具有SEQ ID NO：82中所示的CDR1结构域的重链可变区，或其适合的等价物或衍生物，包括包含上面描述的保守氨基酸取代的该结构域。
本发明涵盖了任何包含所公开的重链和/或轻链CDRs、可变区、轻链或重链、或其任何组合的抗体分子，包括但不限于下列的抗体分子：(1)具有包含SEQ ID NO：5中所示的CDR3序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：38中所示的CDR3序列的轻链可变区的分离的抗体分子；(2)具有SEQ ID NO：5中所示的CDR3序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：39中所示的CDR3序列的轻链可变区的分离的抗体分子；(3)具有SEQ ID NO：5中所示的CDR3序列的重链可变区和具有SEQID NO：41中所示的CDR3序列的轻链可变区的分离的抗体分子；(4)具有SEQ ID NO：22中所示的CDR3序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：38中所示的CDR3序列的轻链可变区的分离的抗体分子；(5)具有SEQID NO：23中所示的CDR3序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：38中所示的CDR3序列的轻链可变区的分离的抗体分子；和(6)具有SEQ IDNO：7中所示的CDR3序列的重链可变区和具有SEQ ID NO：38中所示的CDR3序列的轻链可变区的分离的抗体分子。
在某些实施方案中，本发明的分离的抗体具有的轻链可变区包含具有SEQ ID NO：85中所示的序列的CDR2结构域；重链可变区包含具有SEQ ID NO：83中所示的序列的CDR2结构域；轻链可变区包含具有SEQ ID NO：84中所示的序列的CDR1结构域；重链可变区包含具有SEQ ID NO：82中所示的序列的CDR1结构域。
在另一个实施方案中，本发明的分离的抗体分子具有的重链可变区具有分别在SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：7中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列；轻链可变区包含分别在SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85和SEQ ID NO：38中所示的CDR1、CDR2和CDR3序列。
本文还包含了抗体分子，包含(i)SEQ ID NO：63中所示的重链可变区和/或SEQ ID NO：71中所示的轻链可变区；(ii)SEQ ID NO：62中所示的重链和SEQ ID NO：71中所示的轻链可变区；以及(iii)SEQ IDNO：94中所示的重链和SEQ ID NO：71中所示的轻链可变区。
操作单克隆抗体和其它抗体以生产其它保留了原始抗体的特异性的抗体或嵌合分子，完全属于本技术领域的专业人员的知识范畴。这可以使用例如重组DNA技术来完成。这样的技术可以包括将编码免疫球蛋白可变区或抗体的一个或多个CDRs的DNA，在适合的情况下导入到不同的免疫球蛋白的可变区、恒定区或恒定区加框架区中。这种分子形成了本发明的重要的方面。本公开的序列可以***到其中或形成其基本部分的具体的免疫球蛋白，包括但不限于下列形成了本发明的具体实施方案的抗体分子：Fab(具有轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)、轻链恒定区(CL)和重链恒定区1(CH1)结构域的单价片段)；F(ab′)2(包含通过铰链区的二硫键或其它键连接的两个Fab片段的双价片段)；Fd(VH和CH1结构域)；Fv(VL和VH结构域)；scFv(单链Fv，其中VL和VH通过连接物例如肽连接物连接在一起，参见例如Bird等，1988Science 242：423-426，Huston等，1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)；双特异性抗体分子(抗体分子包含与第二个功能性基团结合的本文公开的IL-13Rα1特异性抗体或抗原结合片段，该第二个功能性基团具有与抗体不同的结合特异性，包括但不限于另一个肽或蛋白，例如抗体或受体配体)；双特异性单链Fv二体(参见例如PCT/US92/09965)；分离的CDR3；微型抗体(单链CH3融合物，自身组装成大约80kDa的双价二体)；“scAb”(包含VH和VL以及CL或CH1的抗体片段)；dAb片段(VH结构域，参见例如Ward等，1989Nature 341：544-546和McCafferty等，1990Nature348：552-554；或VL结构域；参见Holt等，2003，Trends in Biotechnology21：484-489)；双链抗体(参见例如Holliger等，1993Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448和WO 94/13804)；三链抗体；四链抗体；微型抗体(scFv与CH3连接，参见例如Hu等，1996Cancer Res.56：3055-3061)；IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgA、IgE或其任何衍生物，以及基于蛋白支架的人造抗体，包括但不限于III型纤维粘连蛋白多肽抗体(参见例如美国专利No.6,703,199和WO02/32925)或细胞色素B；参见例如Koide等，1998J.Mol.Biol.284：1141-1151和Nygren等，1997Current Opinion in Structural Biology7：463-469。某些抗体分子、包括但不限于Fv、scFv和双链抗体分子，可以通过引入二硫键连接VH和VL结构域来稳定化，参见例如Reiter等，1996Nature Biotech.14：1239-1245。双特异性抗体可以使用常规的技术(参见例如Holliger & Winter，1993Current Opinion Biotechnol.4：446-449，其具体的方法包括化学生产或从杂交的杂交瘤生产)和其它技术来生产，其它技术包括但不限于BITETM技术(具有不同特异性的抗原结合区的分子用肽连接物相连)和knobs-into-holes工程化(参见例如Ridgeway等，1996Protein Eng.9：616-621)。双特异性双链抗体可以在大肠杆菌中生产，正如本技术领域的专业人员认识到的，这些分子以及其它的抗体分子可以使用噬菌体展示技术在适合的文库中选择(参见例如WO 94/13804)。
目的CDRs被***到其中的可变区结构域可以从任何种系或重排的人类可变结构域获得。可变结构域也可以合成生产。可以使用重组DNA技术将CDR区导入到相应的可变结构域中。一种可以实现这种情况的方法被描述在Marks等，1992Bio/Technology 10：779-783。表达和选择可以使用适合的技术来完成，包括但不限于噬菌体展示(参见例如WO 92/01047；Kay等，1996，《肽和蛋白的噬菌体展示实验指南》(Phage Display of Peptides and Proteins：A Laboratory Manual)，SanDiego：Academic Press)、酵母展示、细菌展示、T7展示和核糖体展示(参见例如Lowe & Jermutus，2004Curr.Pharm.Biotech.517-527)。重链可变结构域可以与轻链可变结构域配对以提供抗原结合位点。此外，独立的区域(例如单独的重链可变结构域)可以被用于结合抗原。技术人员也会清楚地认识到，Fv片段的两个结构域VL和VH，尽管可能由分离的基因编码，但可以使用重组方法通过合成的连接物连接在一起，使它们被制造成单一的蛋白链，其中VL和VH区域配对形成了单价分子(scFvs)。
具体的实施方案在种系框架区中提供了CDR(s)。本文的具体实施方案提供了将目的重链CDR(s)***在VH5-51(JH4)中代替相关的CDR(s)；象例如SEQ ID NOs：50、54、58、62和66中那样。本文的具体实施方案提供了将轻链CDR(s)***到Vκ3A27(JK1)中代替相关的CDR(s)；象例如SEQ ID NOs：70、74和78中那样。
本发明包含了人类、人源化、去免疫化、嵌合的和灵长动物化的抗体分子。本发明还包含了通过镶饰方法生产的抗体；参见例如Mark等，1994，《实验药物学手册》第113卷：“单克隆抗体的药物学”(Handbook of Experimental Pharmacology，vol.113：The pharmacologyof monoclonal Antibodies)，Springer-Verlag，pp.105-134和美国专利No.6,797,492。在指称所公开的抗体分子时，“人类的”具体是指具有人类种系免疫球蛋白序列衍生的可变区和/或恒定区的抗体分子，其中该序列可以、但不是必须被修饰/改变，以具有不是被人类种系免疫球蛋白序列编码的某些氨基酸取代或残基。这样的突变可以通过多种方法导入，所述方法包括但不限于体外随机或定点突变、或通过体内体细胞突变。在文献中讨论的突变技术的具体例子是在Gram等，1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3576-3580；Barbas等，1994Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3809-3813和Schier等，1996J.Mol.Biol.263：551-567中公开的技术。它们仅仅是具体的例子，并不代表是唯一可用的技术。在科学文献中有大量突变技术可以使用，并且被本领域技术人员广泛认识到。在指称所公开的抗体分子时，“人源化”具体来说是指抗体分子，其中来自于另一个哺乳动物物种例如小鼠的CDR序列被嫁接到人类框架序列中。在指称所公开的抗体分子时，“灵长动物化”是指抗体分子，其中非灵长动物的CDR序列被***到灵长动物框架序列中，参见例如WO 93/02108和WO 99/55369。
本发明的具体的抗体是单克隆抗体，在具体的实施方案中，是下列抗体形式中的一种：IgD、IgA、IgE、IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或任何上述形式的任何衍生物。词语“其衍生物”或“衍生物”尤其包括(i)在框架区或一个或两个可变区(即VH和/或VL)的CDR区中带有修饰的抗体和抗体分子，(ii)在重链和/或轻链的恒定区中进行了操作的抗体和抗体分子，以及(iii)包含其它正常情况下不是免疫球蛋白分子的一部分的其它化学基团(例如PEG化)的抗体和抗体分子。
可变区的操作可以在一个或多个VH和/或VL CDR区中。可以进行定点突变或随机突变来导入突变，对所需的抗体功能特性的影响可以使用可用的体外或体内分析方法、包括在本文中描述的分析方法、进行评估。
本发明的抗体还包括其中在VH和/或VL中的框架残基上进行了修饰、以改进目标抗体的一种或多种特性的抗体。典型情况下，进行这样的框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“突变回”相应的种系序列。更具体来说，经历了体细胞突变的抗体可能包含与抗体所源自的种系序列不同的框架序列。这样的残基可以通过将抗体框架序列与抗体所源自的种系序列相比较来鉴定。这样的“突变回来的”抗体也打算包含在本发明中。另一种类型的框架修饰包括对框架区中或甚至一个或多个CDR区中的一个或多个残基进行突变，以除去T细胞表位，从而降低抗体的可能的免疫原性。这种方法也被称为“去免疫作用”，被进一步详细描述在Carr等的美国专利公开No.20030153043中。
除了或可选的在框架区或CDR区中进行的修饰之外，本发明的抗体可以被工程化，以便在Fc区中包含修饰，这种修饰在存在时，一般改变抗体的一种或多种功能特性，例如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗原依赖性细胞性细胞毒性。
在一个实施方案中，CH1铰链区被修饰，使得铰链区中半胱氨酸残基的数量被改变，例如增加或减少，以便例如促进轻链和重链的组装，或增加或降低抗体的稳定性。这种方法进一步描述在Bodmer等的美国专利No.5,677,425中。
在另一个实施方案中，抗体的Fc铰链区被突变，以降低抗体的生物学半衰期。该方法被进一步详细描述在Ward等的美国专利No.6,165,745中。
在另一个实施方案中，抗体被修饰以增加其生物学半衰期。各种不同的方法都是可能的。例如，可以引入一种或多种下面的突变：Thr252Leu，Thr254Ser，Thr256Phe，正如在Ward的美国专利No.6,277,375中描述的那样。或者，为了增加生物学半衰期，抗体可以在CH1或CL区中进行改变，以包含从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环获得的补救受体结合表位，正如在Presta等的美国专利Nos.5,869,046和6,121,022中描述的那样。
在另一个实施方案中，通过用不同的氨基酸残基代替至少一个氨基酸残基而对Fc区进行了改变，以改变抗体的效应子功能。例如参见Winter等的美国专利Nos.5,624,821和5,648,260。
在另一个例子中，选自329、331和322位氨基酸残基的一个或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基取代，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低的或废止的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这种方法被进一步详细描述在Idusogie等的美国专利No.6,194,551中。
在另一个例子中，氨基酸位置231和239中的一个或多个氨基酸残基被修饰，从而改变了抗体结合补体的能力。该方法被进一步描述在Bodmer等的WO 94/29351中。
在另一个例子中，Fc区域被修饰，以增加抗体介导抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)的能力，和/或通过修饰一个或多个氨基酸增加抗体对Fcγ受体的亲和性；参见例如Presta的WO 00/42072。此外，人类IgG1上FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已经被作图，具有改进的结合的变异体已经被描述(参见Shields等，J.Biol.Chem.276：6591-6604，2001)。
产生包含各种不同抗体同种型的“杂交体”或“组合的”IgG形式、以筛选所需的效应子功能的概念，已经被广泛描述了；参见例如Tao等，1991 J.Exp.Med.173：1025-1028。本发明的具体实施方案包含了在Fc区中具有特定操作的抗体分子，这些操作已经被发现导致了抗体部分上与FcγR受体或C1q结合的降低。因此，本发明包含了符合被发明描述的抗体，它们不引起(或仅在较低程度上引起)抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)、补体介导的细胞毒性(CMC)或形成免疫复合物，而同时保留了正常的药物动力学(PK)性质。本发明的具体的实施方案提供了按照本发明定义的抗体分子，该抗体分子作为其免疫球蛋白结构的一部分，包含SEQ ID NO：92中所示的序列。图16显示了包括SEQ ID NO：92的IgG2m4的序列(正如在美国专利公开No.US20070148167(A1)中描述的)与IgG1、IgG2和IgG4的氨基酸序列的比较。上述的实施方案的一个具体的例子是包含SEQ ID NO：94的抗体分子，它具有基于10G5-6抗体的序列。上述实施方案的另一个具体的例子是包含SEQ ID NO：96的抗体分子，它具有基于10G5H6抗体的序列。
在另一个实施方案中，抗体的糖基化被修饰。例如，可以制备无糖基化的抗体(即抗体缺少糖基化)。糖基化可以被改变，以例如增加抗体对抗原的亲和性。这样的碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列中的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这样的方法进一步详细描述在Co等的美国专利Nos.5,714,350和6,350,861中。
此外或可选地，可以制备具有改变的糖基化的抗体，例如具有减少的藻糖残基量的低岩藻糖基(fucosyl)的抗体，或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。这样的改变的糖基化形式已经被证明增加了抗体的ADCC活性。这样的碳水化合物修饰可以通过例如将抗体在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达来完成。具有改变的糖基化机制的细胞在本技术领域中已经被描述，可以用作宿主细胞，在其中表达本发明的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。
具体的抗体分子可以带有可检测的标记物，或者可以与毒素(例如细胞毒素)、放射性同位素、放射性核素、脂质体、靶向基团、生物传感器、阳离子尾或酶(例如通过肽键或连接物)连接。这样的抗体分子成分形成了本发明的另一个方面。
另一方面，本发明提供了编码所公开的抗体分子的分离的核酸。核酸可以存在于全细胞中、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当例如使用标准技术、包括但不限于碱/SDS处理、CsCl分层、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和其它本技术领域已知的适合方法，将核酸从其它细胞组分或其它污染物、例如其它细胞核酸或蛋白中纯化出来时，核酸是“分离的”或“基本上被提纯”。核酸可以包括DNA(包括cDNA)和/或RNA。本发明的核酸可以使用标准的分子生物学技术获得。对于杂交瘤(例如从带有人类免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体来说，编码通过杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNAs可以通过标准的PCR扩增或cDNA克隆技术来获得。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)来说，编码抗体的核酸可以从文库中回收。
本发明包含了编码所公开的可变重链和/或轻链及其选定的组分、特别是公开的相应CDR3区的分离的核酸。在其具体的实施方案中，CDR(s)被提供在抗体框架区中。具体的实施方案提供了编码***到种系框架区中的CDR(s)的分离的核酸。本文的具体实施方案提供了***到VH5-51(JH4)种系中、代替了编码相应的CDR(s)的核酸的编码重链CDR(s)的分离的核酸；如同例如SEQ ID NOs：52、56、60、64和68中所示。本文的具体实施方案提供了***到Vκ3A27(JK1)种系中、代替了编码相应CDR(s)的核酸的编码轻链CDR(s)的分离的核酸；如同例如SEQ ID NOs：72、76和80中所示。编码可变区的分离的核酸可以提供在任何所需抗体分子形式中，包括但不限于下述：F(ab′)2、Fab、Fv、scFv、双特异性抗体分子(抗体分子包含本文公开的IL-13Rα1特异性抗体或抗原结合片段，它们与具有与所述抗体不同的结合特异性的第二个功能性基团连接，第二个功能性基团包括但不限于另一种肽或蛋白，例如抗体或受体配体)、双特异性单链Fv二体、微型抗体、dAb片段、双链抗体、三链抗体或四链抗体、IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgA、IgE或其任何衍生物。
具体的实施方案提供了分离的核酸，其编码的抗体分子包含的重链具有选自SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：64和SEQ ID NO：68的序列。具体的实施方案提供了分离的核酸，其编码的抗体分子包含的重链可变结构域具有选自SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：69的序列。本发明的具体的实施方案提供了分离的核酸，其编码的抗体分子包含(i)重链CDR1核苷酸序列SEQ ID NO：106，(ii)重链CDR2核苷酸序列SEQ ID NO：107，和/或(iii)重链CDR3核苷酸序列SEQ ID NO：108或SEQ ID NO：112。具体的实施方案提供了分离的核酸，其编码的抗体分子包含的轻链具有选自SEQ ID NO：72、SEQID NO：76和SEQ ID NO：80的序列。具体的实施方案提供了分离的核酸，其编码的抗体分子包含的轻链可变结构域具有选自SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：81的序列。本发明的具体的实施方案提供了分离的核酸，其编码的抗体分子包含(i)轻链CDR1核苷酸序列SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：123，(ii)轻链CDR2核苷酸序列SEQ ID NO：110，和/或(iii)轻链CDR3核苷酸序列SEQ IDNO：111或SEQ ID NO：113。本发明的具体实施方案包含了核酸分子，其编码的抗体分子在Fc区中具有操作，导致了抗体部分上与FcγR受体或C1q结合的降低。本发明的一个具体实施方案是包含了SEQ ID NO：93的分离的核酸。这样的实施方案的一个具体的例子是包含了SEQ IDNO：95的序列的抗体分子，或编码了SEQ ID NO：94的抗原结合片段的核酸。在具体的实施方案中，可以通过将合成的寡核苷酸产生的并组装在适合的表达载体中的核酸进行表达，来产生合成的抗体分子；参见例如Knappick等，2000J.Mol.Biol.296：57-86，和Krebs等，2001J.Immunol.Methods 254：67-84。
本发明还包括了包含与本文描述的核苷酸序列具有至少大约90％同一性、更优选至少大约95％同一性的核苷酸序列的核酸，并且该核苷酸序列编码本发明的抗体。用于确定同一性的序列比较方法对于本技术领域的专业人员来说是已知的，包括了早些时候讨论的那些。指称“至少大约90％同一性”包括至少大约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性。
本发明还提供了在特定杂交条件下与本文公开的核酸的互补链(例如，核酸的互补链包括：(i)重链核苷酸序列SEQ ID NO：52、SEQID NO：56、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：68或SEQ IDNO：95；(ii)VH核苷酸序列SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：53、SEQ IDNO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：69；(iii)重链CDR1核苷酸序列SEQ ID NO：106；(iv)重链CDR2核苷酸序列SEQ IDNO：107；(v)重链CDR3核苷酸序列SEQ ID NO：108或SEQ ID NO：112；(vi)轻链核苷酸序列SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：0；(vii)VL核苷酸序列SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：77或SEQ ID NO：81；(viii)轻链CDR1核苷酸序列SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：123；(ix)轻链CDR2核苷酸序列SEQ ID NO：110；或(x)轻链CDR3核苷酸序列，包括SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：113)杂交的核酸，该核酸编码与hIL-13Rα1特异性结合并拮抗IL-13Rα1介导的活性的抗体分子。杂交核酸的方法在本技术领域中是众所周知的，参见例如Ausubel，《现代分子生物学方法》，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.，6.3.1-6.3.6，1989。正如本文定义的，中度严紧的杂交条件可以使用包含5X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5％w/v SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的预清洗溶液，大约50％v/v甲酰胺、6X SSC的杂交缓冲液，以及杂交温度55℃(或其它类似的杂交溶液，例如包含大约50％v/v甲酰胺的杂交溶液，杂交温度为42℃)，清洗条件为60℃，在0.5X SSC、0.1％w/v SDS中。严紧的杂交条件可以是在45℃使用6X SSC，然后在68℃下在0.1X SSC、0.2％SDS中进行一次或多次清洗。此外，本技术领域的专业人员可以操作杂交和/或清洗条件来增加或降低杂交的严紧性，以便包含彼此之间具有至少65、70、75、80、85、90、95、98或99％同一性的核苷酸序列的核酸典型情况下仍然彼此杂交。影响杂交条件的选择的基本参数和用于设计适合条件的准则，描述在Sambrook等，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第9和第11章，1989；以及Ausubel等主编的《现代分子生物学方法》(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley & Sons，Inc.，2.10和6.3-6.4章节，1995，中，可以由本技术领域的普通专业人员根据例如DNA的长度和/或碱基组成容易地加以确定。
本发明提供了分离的抗体，它包含轻链和/或重链可变结构域，编码其至少一部分的核苷酸序列，其在中度严紧条件下与编码本文公开的轻链和/或重链可变结构域的核酸序列的互补链(例如，选自SEQ IDNO：43、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：81)杂交。在另一个实施方案中，本发明包含了分离的抗体，它包含轻链和/或重链可变结构域，编码其至少一部分的核苷酸序列，其在严紧条件下与包括本文公开的轻链和/或重链可变结构域的核酸序列的互补链杂交。
另一方面，本发明提供了包含该核酸的载体。本发明的载体包括但不限于适合于以适合于所需目的的水平表达所需抗体分子的质粒和其它表达构建物(例如噬菌体或噬粒，如果适合的话)；参见例如Sambrook & Russell，《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press。对于大多数克隆目的来说，可以使用DNA载体。典型的载体包括质粒、修饰的病毒、细菌噬菌体、粘粒、酵母人工染色体、以及其它形式的游离或整合的DNA。用于具体的基因转移、产生重组人类抗体或其它应用的适合的载体的确定，恰恰在本领域技术人员的范畴内。在具体的实施方案中，除了重组基因之外，载体还可以包含用于在宿主细胞中自主复制的复制起点，适合的调控序列、例如启动子、终止序列、多聚腺苷化序列、增强子序列、选择性标记物、有限数量的有用的限制性酶位点、其它适合的序列以及具有高拷贝数的能力。用于抗体和抗体片段生产的的表达载体的例子在本技术领域中是众所周知的；参见例如Persic等，1997Gene 187：9-18；Boel等，2000J.Immunol.Methods239：153-166，以及Liang等，2001J.Immunol.Methods 247：119-130。如果需要，可以使用本技术领域众所周知的技术将编码抗体的核酸整合到宿主染色体；参见例如Ausubel，《现代分子生物学方法》，(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，1999，以及Marks等，WO 95/17516。核酸也可以表达在维持在染色体外的质粒上或整合到人工染色体中，参见例如Csonka等，2000J.Cell Science113：3207-3216；Vanderbyl等，2002Molecular Therapy 5：10。抗体轻链基因和抗体重链基因可以***到分别的载体中，或更典型情况下，两个基因被***到同一表达载体中。可以通过标准方法(例如将抗体基因片段和载体上的互补的限制性位点连接，或者如果不存在限制性位点的话进行平末端连接)将抗体基因***到表达载体中。本文描述的抗体的轻链和重链可变区，可通过将它们***到已经编码了所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH片段与载体中的CH片段可操作地连接，VL片段与载体中的CL片段可操作地连接，来用于产生任何抗体同种型的全长抗体基因。此外或可选地，重组表达载体可以编码便于抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。抗体链基因可以被克隆到载体中，以便信号肽按阅读框架与抗体链基因的氨基末端连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源的信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白的信号肽)。本领域技术人员可以获得的任何技术都可用于将核酸导入宿主细胞中；参见例如Morrison，1985Science，229：1202。将目标核酸分子亚克隆到表达载体中的方法，转化或转染包含载体的宿主细胞的方法，以及制备基本上纯的蛋白的方法，包括将相应表达载体导入宿主细胞、以及在适合的条件下培养宿主细胞的步骤，都是众所周知的。这样产生的抗体可以常规的方式从宿主细胞收获。适合于将核酸导入目标细胞的技术依赖于被使用的细胞的类型。通用的技术包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染、以及使用适合于目标细胞系的病毒(例如反转录病毒、痘苗病毒、杆状病毒或细菌噬菌体)进行转导。
另一方面，本发明提供了分离的细胞，它包含编码被公开的抗体分子及其所述组分的核酸。各种不同的细胞系可用于抗体分子的重组生产，包括但不限于来自原核生物体(例如大肠杆菌、芽孢杆菌(Bacillus)和链霉菌(Streptomyces))和来自真核生物(例如酵母、杆状病毒和哺乳动物)的细胞系；参见例如Breitling等，《重组抗体》(Recombinant antibodies)，John Wiley & Sons，Inc.和SpektrumAkademischer Verlag，1999。包含本文公开的核酸或抗体分子的植物细胞、包括转基因植物，以及动物细胞、包括转基因动物(人类之外)，也被考虑到作为本发明的一部分。适合的哺乳动物细胞系包括但不限于源自中华仓鼠卵巢(CHO)细胞的细胞系，包括但不限于DHFR-CHO细胞(描述在Urlaub和Chasin，1980Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216-4220中)，它与例如DHFR选择性标记物一起使用(例如在Kaufman和Sharp，1982Mol.Biol.159：601-621中描述的那样)，NS0骨髓瘤细胞(其中可以使用如在WO 87/04462、WO 89/01036和EP338,841中描述的GS表达***)，COS细胞，SP2细胞，HeLa细胞，幼仓鼠肾细胞，YB2/0大鼠骨髓瘤细胞，人类胚胎肾细胞，人类胚胎视网膜细胞，以及其它包含本文公开的核酸或抗体分子的细胞，形成了本发明的其它实施方案。本发明的具体实施方案可以使用大肠杆菌；参见例如Pluckthun，1991Bio/Technology 9：545-551，或酵母，例如毕赤酵母(Pichia)及其重组衍生物(参见例如Li等，2006Nat.Biotechnol.24：210-215)。本发明的其它具体实施方案可以使用真核细胞来生产抗体分子，参见Chadd & Chamow，2001Current Opinion in Biotechnology12：188-194，Andersen & Krummen，2002Current Opinion inBiotechnology 13：117，Larrick & Thomas，2001Current Opinion inBiotechnology 12：411-418。本发明的具体实施方案可以使用能够产生具有适合的翻译后修饰的抗体分子的哺乳动物细胞。翻译后修饰包括但不限于二硫键形成和糖基化。另一种类型的翻译后修饰是信号肽水解。本文的具体实施方案具有适合的糖基化；参见例如Yoo等，2002J.Immunol.Methods 261：1-20。天然存在的抗体包含至少一个N-连接的碳水化合物结合到重链上。同上。不同类型的哺乳动物宿主细胞可用于提供有效的翻译后修饰。这样的宿主细胞的例子包括中华仓鼠卵巢(CHO)、HeLa、C6、PC12和骨髓瘤细胞；参见Yoo等，2002J.Immunol.Methods 261：1-20，以及Persic等，1997Gene 187：9-18。
另一方面，本发明提供了包含本发明的多肽的分离的细胞。
另一方面，本发明提供了制造本发明的抗体分子的方法，包括将包含编码对人类IL-13α1具有特异性的重链和/或轻链的核酸(按照所需抗体分子的要求)的细胞，在允许该重链和/或轻链表达和/或组装到抗体分子中的条件下进行温育，以及从细胞中分离该抗体分子。产生所需重链和/或轻链序列的方法的一个例子是，首先使用PCR扩增(并修饰)种系的重链和/或轻链可变区序列。本领域技术人员可以容易地获得人类重链和/或轻链可变区的种系序列，参见例如“Vbase”人类种系序列数据库，以及Kabat，E.A.等，1991《免疫学重要的蛋白的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第五版，美国卫生与人类服务部，NIH出版号No.91-3242；Tomlinson，I.M.等，1992″TheRepertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groupsof VH Segments with Different Hypervariable Loops″(人类种系VH序列的全部成分清单揭示出大约50类具有不同超变环的VH片段)，J.Mol.Biol.227：776-798；以及Cox，J.P.L.等，1994″A Directory of HumanGerm-line VκSegments Reveals a Strong Bias in their Usage″(人类种系Vκ片段的目录揭示出它们的使用的强烈偏好)，Eur.J.Immunol.24：827-836。种系序列的突变可以使用标准方法来进行，例如PCR介导的突变技术，其中突变被引入到PCR引物中，或定点突变技术。如果需要全长的抗体，人类重链恒定区基因的序列是可以获得的；参见例如Kabat.E.A.等，1991《免疫学重要的蛋白的序列》(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，第五版，美国卫生与人类服务部，NIH出版号No.91-3242。包含这些区域的片段可以通过例如标准的PCR扩增来获得。或者，本领域技术人员可以利用已经编码重链和/或轻链恒定区的载体。
已有可用的技术来重组生产其它仍保留原始抗体的特异性的抗体分子。其具体的例子是将编码免疫球蛋白可变区或CDRs的DNA导入到另一个抗体分子的恒定区、或恒定区和框架区中；参见例如EP-184,187、GB 2188638和EP-239400，以及该领域的科学文献。抗体分子、包括嵌合抗体的克隆和表达，被描述在文献中；参见例如EP0120694和EP 0125023，以及该领域的其它科学文献。
此外，符合本发明的抗体可以使用已知的技术来产生，然后针对本文鉴定的特征进行筛选。制备单克隆抗体的基本技术被描述在文献中，参见例如Kohler和Milstein(1975，Nature 256：495-497)。全人类单克隆抗体通过可用的方法来产生。这些方法包括但不限于使用遗传工程化的具有免疫***的小鼠株系，由此小鼠的抗体基因已经被失活，代替它们的是有功能的人类抗体基因的全部成分，同时留下小鼠免疫***的其它成分不变。这种遗传工程化的小鼠允许发生天然的体内免疫应答和亲和成熟过程，产生高亲和性的、全人类的单克隆抗体。该技术在本技术领域中是众所周知的，在各种不同的出版物中被完全详细描述了，这些出版物包括但不限于美国专利Nos.5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299、5,770,249(授权给GenPharm International公司，可以通过Medarex在“UltraMab人类抗体开发***”的情报信息(umbrella)下获得)，以及美国专利Nos.5,939,598、6,075,181、6,114,598、6,150,584和相关家族成员(从授权给Abgenix公司，公开了他们的
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技术)。有关综述也参见Kellerman和Green，2002Curr.Opinion in Biotechnology 13：593-597，以及Kontermann &Stefan，2001《Springer抗体工程实验手册》(Antibody Engineering，Springer Laboratory Manuals)。
或者，可以将本发明的抗原结合片段的文库与IL-13Rα1相接触，并选择能够证明以规定水平结合、例如表现出与抗原的KD小于200pM、并且能够拮抗IL-13Rα1介导的活性的抗原结合片段。本领域技术人员可以获得从文库使用富集技术筛选抗体片段的技术，这些技术包括但不限于噬菌体展示(例如参见剑桥抗体技术公司(CambridgeAntibody Technology(CAT))的技术，公开在美国专利Nos.5,565,332、5,733,743、5,871,907、5,872,215、5,885,793、5,962,255、6,140,471、6,225,447、6,291,650、6,492,160、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、6,593,081，以及依赖于1992年5月24日提交的优先权存档GB 9206318的其它美国专利家族成员和/或申请中；也参见Vaughn等，1996，Nature Biotechnology 14：309-314)、核糖体展示(参见例如Hanes和Pluckthun，1997Proc.Natl.Acad.Sci.94：4937-4942)、细菌展示(参见例如Georgiou等，1997Nature Biotechnology 15：29-34)和/或酵母展示(参见例如Kieke等，1997Protein Engineering10：1303-1310)。文库可以展示在例如噬菌体颗粒的表面上，编码抗原结合片段的核酸表达和展示在其表面上。然后可以从表现出所需活性水平的噬菌体颗粒中分离核酸，并使用核酸开发抗体分子。本发明的单独的重链或轻链克隆也可以分别用于筛选能够与其相互作用形成组合的重链和轻链分子的互补的重链或轻链；参见例如WO 92/01047。噬菌体展示已经被描述在文献中；参见例如Kontermann & Stefan，同上，以及WO 92/01047。
单克隆抗体(Mabs)可以通过本技术领域的专业人员可以获得的技术来纯化。相关的腹水、杂交瘤培养液或目标测试样品的抗体滴度，可以通过各种不同的血清学或免疫学分析方法来测定，这些方法包括但不限于沉淀、被动凝集反应、酶联免疫吸附抗体(ELISA)技术和放射免疫分析(RIA)技术。
另一方面，本发明提供了用于拮抗IL-13Rα1活性的方法，包括将表达IL-13Rα1的细胞与本文公开的抗体分子，在允许该抗体分子与IL-13Rα1结合的条件下相接触。本发明的具体实施方案包含了这样的方法，其中细胞是人类细胞。
另一方面，本发明提供了用于在表现出与IL-13Rα1活性有关的病症的对象中拮抗IL-13Rα1的活性的方法，包括给对象使用治疗有效量的本发明的抗体分子。本文的“拮抗”是指对抗、抵抗或削减靶的一种或多种功能的作用，其中靶的功能是结合、信号传导等。按照本技术领域已知的以及本文描述的方法，可以容易地测定对一种或多种IL-13Rα1功能特性的抑制或拮抗。此外，应该理解，这种抑制或拮抗将导致特定活性与不存在抗体时观察到的、或例如在存在具有不相关的特异性的对照抗体时观察到的活性相比降低了。优选情况下，本发明的抗体分子将LI-13和/或IL-4介导的IL-13Rα1功能拮抗到测量到的参数减少了至少10％，更优选情况下，测量到的参数减少了至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和95％。在受体功能对于特定的表现型、疾病、紊乱或对对象有负面影响的病症有至少一部分贡献的情况下，这种对IL-13Rα1功能的抑制/拮抗是特别有效的。
还考虑到了使用公开的抗体分子生产治疗IL-13Rα1介导的疾病、紊乱或病症的药物的方法。因此，另一方面，本发明提供了可药用组合物，其中包含本发明的抗体分子和可药用载体、赋形剂、稀释剂、稳定剂、缓冲剂，或被设计以促进将抗体分子以所需的形式和量施用被治疗的个体的可选物质。本文公开的抗体分子可用于特定个体(人类或灵长动物)的治疗或诊断方法中。治疗方法在本质上可以是预防性的或治疗性的。本发明的治疗方法包括给个体施用治疗(或预防)有效量的本发明的抗体分子。“治疗有效的”或“预防有效的”量是指在所需的时期内以所打算的药剂形式获得所需的治疗/预防效果所必需的量。所需的效果可以是例如至少一种与被治疗的病症有关的症状的缓解。正如本领域技术人员将会认识到的那样，这些量可以随着各种不同的因素而变化，包括但不限于个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗体分子在个体中引发所需效果的能力。反应可以通过体外分析方法、体内非人类动物研究来证实，和/或从临床试验获得进一步支持。本发明的基于抗体的药物组合物可以通过本技术领域已知的任何数量的策略来配制，参见例如McGoff和Scher，2000“蛋白/肽溶液制剂”(Solution Formulation of Proteins/Peptides)，在McNally，E.J.主编的《蛋白制剂和递送》，(Protein Formulation and Delivery，NewYork，NY：Marcel Dekker)中的139-158页；Akers & Defilippis，2000，“肽和蛋白的肠胃外溶液“(Peptides and Proteins as ParenteralSolutions)，在《肽和蛋白的药物制剂发展》(Pharmaceutical FormulationDevelopment of Peptides and Proteins，Philadelphia，PA：Taylor andFrancis)中的145-177页；Akers等，2002，Pharm.Biotechnol.14：47-127。适合于病人施用的可药用组合物，将在制剂中包含有效量的抗体分子，该制剂既保留了生物学活性，同时又在可接受的温度范围内进行储存的过程中促进了最大的稳定性。
基于抗体的可药用组合物可以采用液体或固体形式。可以使用任何生产液体或固体制剂的技术。这样的技术在本领域技术人员的能力范畴内。固体制剂可以通过任何可用的方法来生产，包括但不限于冷冻干燥、喷雾干燥、或通过超临界流体技术进行干燥。用于口服的固体制剂可以采取使抗体分子以规定量在规定的时期内进入到患者中的任何形式。口服剂型可以采取多种固体制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊或粉末。可选地，固体制剂可以是冷冻干燥的，然后在单剂或多剂施用之前配制成溶液。一般情况下，抗体组合物应该被配制在生物相关的pH范围内，可以被缓冲以便在储存过程中维持适当的pH范围。液体和固体制剂一般都需要储存在较低温度下(例如2-8℃)，以便维持较长期的稳定性。配制好的抗体组合物、特别是液体制剂，可以包含抑菌剂以防止或最小化储存过程中的蛋白水解，抑菌剂包括但不限于有效浓度(例如≤1％w/v)的苯甲醇、苯酚、间甲酚、氯代丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。抑菌剂对某些患者来说可能是有禁忌的。因此，可以将冷冻干燥的制剂复溶在包含或不包含这样的成分的溶液中。其它成分可以加入到缓冲的液体或固体抗体制剂中，包括但不限于作为防冻剂的糖类(包括但不限于多羟基碳氢化合物例如山梨糖醇、甘露糖醇、甘油和卫矛醇，和/或二糖例如蔗糖、乳糖、麦芽糖或海藻糖)，以及在某些情况下的相关的盐(包括但不限于NaCl、KCl或LiCl)。这些打算要长期保存的抗体制剂、特别是液体制剂，将依赖于可用的总渗透压的范围，要求既能够促进在例如2-8℃或以上的温度下的长期稳定性，同时又使制剂可用于肠胃外注射。如果合适，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。制剂可以包含二价阳离子(包括但不限于MgCl2、CaCl2和MnCl2)，和/或非离子型表面活性剂(包括但不限于聚山梨酸酯-80(TWEEN 80TM)、聚山梨酸酯-60(TWEEN 60TM)、聚山梨酸酯-40(TWEEN 40TM)和聚山梨酸酯-20(TWEEN 20TM)，聚氧乙烯烷基醚，包括但不限于BRIJ58TM、BRIJ 35TM，以及其它物质例如TRITON X-100TM、TRITONX-114TM、NP40TM、Span 85和
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系列的非离子型表面活性剂(例如
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121)。这些组分的任何组合形成了本发明的具体实施方案。
液体形式的药物组合物可以包含液体载体，例如水、石油、动物油、植物油、矿物油或合成的油。液体形式也可以包含生理盐水溶液、葡萄糖溶液或其它糖类溶液或二醇，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
药物组合物可以采取无热原的、具有适合的pH、张性和稳定性的可肠胃外使用的水性溶液的形式。药物组合物可以配制成在等渗介质中用于稀释后施用，等渗介质例如氯化钠注射液、Ringer′s注射液或添加乳酸的Ringer′s注射液。
抗体治疗剂的剂量在本领域技术人员的知识范畴内，参见例如Lederman等，1991 Int.J.Cancer 47：659-664；Bagshawe等，1991Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4：915-922，并且将根据多种因素而变化，包括但不限于使用的抗体分子、被治疗的患者、患者的病症、被治疗的区域、施用路线、和所需的治疗。普通的专业医师或兽医可以容易地确定并规定抗体的有效治疗量。剂量范围可以从大约0.01到100mg/kg宿主体重，更通常为0.05到25mg/kg宿主体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg的范围内。出于说明的目的而不是限制，在具体的实施方案中，可以使用5mg到2.0g的剂量来全身性递送抗体分子。为了获得在产生效能而没有毒性的范围内的抗体浓度的最适精确性，需要基于靶位点的药物可用性的动力学的治疗方案。这包括考虑到抗体分子的分布、平衡和消除。本文描述的抗体可以适合的剂量单独使用。或者，可能希望同时施用或顺序施用其它药剂。提出与可选的治疗方案结合的本发明的抗体分子的治疗剂量方案是可能的。能够治疗的个体(对象)包括灵长动物、人类和非人类，包括任何具有商业或家庭畜牧重要性的非人类哺乳动物或脊椎动物。
抗体分子可以通过本技术领域已知的任何施用途径施用于个体，包括但不限于口服施用、注射施用(具体的实施方案包括静脉内、皮下、腹膜内或肌内注射)、吸入施用、鼻内或局部施用，可以单独使用或与被设计用于辅助个体治疗的其它药剂组合施用。施用途径将根据本领域技术人员认识到的多种考虑因素来确定，包括但不限于治疗的所需生理化学特征。治疗可以在每日、每周、每两周或每月基础上提供，或采取任何其它能够将适合量的抗体分子在规定的时间递送到个体，以便所需的治疗实现并维持的治疗方式。制剂可以单剂或在分开的时间以多于一剂的方式施用。
在具体的实施方案中，被治疗的病症选自哮喘、过敏、过敏性鼻炎、慢性鼻窦炎、花粉热、特异反应性皮炎、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺纤维变性、食管嗜曙红细胞增多症、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、纤维变性、硬皮病、炎症性肠病(特别是溃疡性结肠炎)、过敏性反应和癌症(特别是霍奇金氏淋巴瘤、神经胶质瘤和肾癌)，以及普遍的Th2介导的紊乱/病症。
本发明还提供了施用所公开的抗hIL-13Rα1抗体分子用于基因治疗。在这样的方法中，对象的细胞将用编码本发明的抗体分子的核酸进行转化。包含核酸的对象然后将内源地产生抗体分子。以前，Alvarez等，Clinical Cancer Research 6：3081-3087，2000，使用了基因治疗方法将单链抗ErbB2抗体导入了对象。Alvarez等公开的方法可以被容易地改造，以将编码本发明的抗hIL-13Rα1抗体的核酸导入到对象中。
编码本发明的任何多肽或抗体分子的核酸可以被导入到对象中。在具体的实施方案中，抗体分子是人类单链抗体。
可以通过本技术领域任何已知的方法将核酸导入到对象的细胞中。在具体的实施方案中，核酸作为病毒载体的一部分被导入。可用于衍生载体的具体病毒的例子包括慢病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘苗病毒、杆状病毒、甲病毒、流感病毒，以及具有所需细胞向性的其它重组病毒。
各个公司生产商业化病毒载体，包括但不限于AVIGEN，Inc.(Alameda，CA；AAV载体)、Cell Genesys(Foster City，CA；逆转录病毒、腺病毒、AAV载体和慢病毒载体)、CLONTECH(逆转录病毒和杆状病毒载体)、Genovo，Inc.(Sharon Hill，PA；腺病毒和AAV载体)、GENVEC(腺病毒载体)、IntroGene(Leiden，Netherlands；腺病毒载体)、Molecular Medicine(逆转录病毒、腺病毒、AAV和疱疹病毒载体)、Norgen(腺病毒载体)、Oxford BioMedica(Oxford，UnitedKingdom；慢病毒载体)和Transgene(Strasbourg，France；腺病毒、痘苗病毒、逆转录病毒和慢病毒载体)。
构建和使用病毒载体的方法在本技术领域中是已知的(参见例如Miller等，BioTechniques 7：980-990，1992)。在具体的实施方案中，病毒载体是复制缺陷型，也就是说，它们不能在靶细胞中自主复制，因此不具有感染性。复制缺陷的病毒可以是最小的病毒，即它只保留了其基因组上包壳基因组以产生病毒颗粒所必需的序列。完全或几乎完全缺失病毒基因的缺陷病毒也可以使用。缺陷病毒载体的使用允许被用于特定的、定位的区域中的细胞，而不用顾虑载体能够感染其它细胞。因此，可以特异性靶向特定的组织。
包含减毒的或缺陷的DNA病毒序列的载体的例子包括但不限于缺陷的疱疹病毒载体(Kanno等，Cancer Gen.Ther.6：147-154，1999；Kaplitt等，J.Neurosci.Meth.71：125-132，1997和Kaplitt等，J.Neuro Onc.19：137-147，1994)。
腺病毒是真核DNA病毒，可以被修饰以有效地将本发明的核酸递送到各种不同的细胞类型中。在某些情况下，需要减毒的腺病毒载体，例如Strafford-Perricaudet等，J.Clin.Invest.90：626-630，1992描述的载体。已经描述了各种不同的复制缺陷型腺病毒和最小的腺病毒载体(参见例如WO94/26914、WO94/28938、WO94/28152、WO94/12649、WO95/02697和WO96/22378)。本发明的复制缺陷型重组腺病毒可以通过本技术领域的专业人员已知的任何技术来制备(Levrero等，Gene101：195，1991；EP 185573；Graham，EMBO J.3：2917，1984；Graham等，J.Gen.Virol.36：59，1977)。
腺相关病毒(AAV)是相对尺寸小的DNA病毒，可以稳定和位点特异性的方式整合到它们感染的细胞的基因组中。它们能够感染广范围的细胞，而不会诱导对细胞生长、形态或分化的任何影响，它们没有被显示出参与了人类病状。已经描述了使用AAVs来源的载体在体外和体内转移基因(参见Daly等，Gene Ther.8：1343-1346，2001；Larson等，Adv.Exp.Med.Bio.489：45-57，2001；WO 91/18088和WO93/09239；美国专利Nos.4,797,368和5,139,941以及EP 488528B1)。
在另一个实施方案中，基因可以被导入到逆转录病毒载体中，例如在美国专利Nos.5,399,346、4,650,764、4,980,289和5,124,263；Mann等，Cell 33：153，1983；Markowitz等，J.Virol.，62：1120，1988；EP 453242和EP178220中描述的那样。逆转录病毒是感染***的细胞的整合病毒。
慢病毒载体可用作试剂，用于在几种类型的组织中直接递送和持续表达编码本发明的抗体分子的核酸，这些组织包括脑、视网膜、肌肉、肝和血液。载体可以在这些组织中有效地转导***的和不***的细胞，并维持抗体分子的长期表达。对于综述，参见Zufferey等，J.Virol.72：9873-80，1998和Kafri等，Curr.Opin.Mol.Ther.3：316-326，2001。在本技术领域中，慢病毒包装细胞系是可获得和已知的。它们促进了用于基因治疗的高滴度慢病毒载体的生产。例子是可四环素诱导的VSV-G假型慢病毒包装细胞系，它可以在至少3到4天内产生滴度高于106IU/ml的病毒粒子；参见Kafri等，J.Virol.73：576-584，1999。如果需要，可诱导的细胞系产生的载体可以被浓缩，以在体外和体内有效转导未***细胞。
辛德比斯(Sindbis)病毒是甲病毒属的成员，自从1953年开始它在世界的各个部分被发现，已经被广泛研究了。基于甲病毒、特别是辛德比斯病毒的基因转导，已经被很好地体外研究了(参见Straus等，Microbiol.Rev.，58：491-562，1994；Bredenbeek等，J.Virol.，67：6439-6446，1993；Ijima等，Int.J.Cancer 80：110-118，1999和Sawai等，Biochim.Biophyr.Res.Comm.248：315-323，1998。甲病毒载体的许多性质使得它成为正在开发的其它病毒衍生的载体***的理想替代物，这些性质包括表达构建物的快速工程化、产生感染性颗粒的高滴度原料、感染不***的细胞、以及高水平的表达(Strauss等，1994，同上)。已经描述了使用辛德比斯病毒进行基因治疗(Wahlfors等，Gene.Ther.7：472-480，2000和Lundstrom，J.Recep.Sig.Transduct.Res.19(1-4)：673-686，1999。
在另一个实施方案中，可以通过脂质体或用其它转染促进试剂(肽、聚合物等)将载体导入细胞。合成的阳离子脂类可用于制备脂质体，用于编码标记物的基因的体内和体外转染(Feigner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7417，1987和Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7851-7855，1987)。可用于转移核酸的脂类化合物和组合物被描述在WO 95/18863和WO 96/17823，以及美国专利No.5,459,127中。
将载体作为裸DNA质粒体内导入也是可能的。用于基因治疗的裸DNA载体可以通过本技术领域已知的方法导入到所需宿主细胞中，这些方法例如电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀、使用基因枪、或使用DNA载体转运物(参见例如Wilson等，J.Biol.Chem.267：963-967，1992；Williams等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：2126-2130，1991)。也可以使用受体介导的DNA递送方法(Wu等，J.Biol.Chem.263：14621-14624，1988)。美国专利Nos.5,580,859和5,589,466公开了在不使用转染促进试剂的情况下将外源DNA序列递送到哺乳动物中。最近，使用相对低的电压的高效体内DNA转移技术、被称为电转移，已经被描述(Vilquin等，Gene Ther.8：1091，2001；Payen等，Exp.Hematol.25：295-300，2001；Mir，Bioelectrochemistry 53：1-10，2001；WO 99/01157、WO 99/01158和WO 99/01175)。
适合于这种基因治疗方法并包含编码本发明的抗hIL-13Rα1抗体分子的核酸的药物组合物，被包含在本发明的范围内。
另一方面，本发明提供了使用本发明的抗体分子在目标样品中鉴定、分离、定量或拮抗IL-13Rα1的方法。在免疫化学分析方法、例如western印迹、ELISAs、放射免疫分析、免疫组织化学分析、免疫沉淀或其它本技术领域已知的免疫化学分析(参见例如《免疫技术实验指南》(Immunological Techniques Laboratory Manual)，Goers，J.主编，1993，Academic Press)或各种不同纯化方法中，抗体分子可以用作研究工具。抗体分子可以具有标记以便于与其相关的活性的方便的鉴定或测量。本技术领域的专业人员可以容易地熟悉可用于上述方法中的各种不同类型的可检测标记(例如酶、染料或其它可以被容易地检测或引起某些容易被检测的活性/结果的适合的分子)。
本发明的另一方面是包含本文公开的抗体分子或药物组合物以及使用说明书的试剂盒。试剂盒一般但不是必需包含指示试剂盒内含物的目标用途的标签。术语标签包括任何在试剂盒上或其中提供的、或伴随着试剂盒的书写的或记录的材料。
本发明的另一方面涉及本文公开的抗体与hIL-13Rα1受体之间的关键接触点的鉴定。该关键接触点通过导入影响受体与抗体的结合的特定突变来鉴定。更具体来说，已经发现用丙氨酸残基取代SEQ ID NO：101的233位的苯丙氨酸残基，导致抗体和突变的受体之间的结合与抗体和野生型受体之间的结合相比丧失。这是在10G5及其衍生物的表征中非常有用的发现。利用了233位氨基酸周围的区域的肽，将可用于产生其它具有类似特异性的单克隆抗体。因此，本发明包含了含有hIL-13R序列、带有Phe233Ala突变(即SEQ ID NO：120)的分离的肽，不论它们是全长的还是其包含突变的片段(例如5到350个氨基酸残基的片段)。此外，本发明还包括了在分析中使用该肽以评估10G5或10G5衍生物，鉴定对类似表位具有特异性的抗体，或可选地生产具有类似特异性的抗体。因此，在本发明的具体实施方案中，提供了筛选与保藏作ATCC保藏号No.PTA-6933的杂交瘤细胞系产生的抗体靶向hIL-13Rα1上相同区域的抗体分子的方法，该方法包括(a)分析目标抗体分子与下列分子的结合：(i)分离的hIL-13Rα1多肽SEQ ID NO：101，或其包含对应于SEQ ID NO：101的233位残基的氨基酸的片段；以及(ii)分离的hIL-13Rα1多肽或其片段的分离的多肽或片段，其中对应于SEQ ID NO：101的233位残基的氨基酸是丙氨酸而不是苯丙氨酸；(b)鉴定那些与步骤(a)(i)的分离的抗体或片段结合，但表现出与步骤(a)(ii)的分离的多肽或片段的结合显著降低的抗体；以及(c)回收在步骤(b)中鉴定的抗体。显著降低典型是指抗体和突变的受体之间的结合与抗体和野生型受体之间的结合相比降低了10倍以上。可用于本方法的多肽是SEQ ID NO：101的包含对应于SEQ ID NO：101的233位残基的氨基酸、并与保藏作ATCC保藏号No.PTA-6933的杂交瘤细胞系产生的抗体结合的片段，以及相应的其中对应于SEQ ID NO：101的233位残基的氨基酸是丙氨酸而不是苯丙氨酸的片段。例如，人类IL-13Rα1的细胞外区域(SEQ ID NO：101的1到317号氨基酸)可以与其相应的Phe233Ala突变体一起使用。
本发明的另一方面包括了分离的抗体，其(i)与保藏作ATCC保藏号No.PTA-6933的杂交瘤细胞系产生的抗体竞争与hIL-13Rα1的结合；(ii)抑制IL-13信号传导；并且(iii)其中hIL-13Rα1肽中对应于SEQID NO：101的233位的苯丙氨酸残基被丙氨酸残基的取代，导致该抗体和得到的突变体hIL-13Rα1肽之间的结合与该抗体和没有该取代的hIL-13Rα1肽之间的结合相比丧失。
通过下面的非限制性的实施例对本发明进行了更详细的描述。
实施例1：基于人类IL-13Rα1细胞外区域的重组蛋白的生产和纯化
使用本文描述的方法，从用稳定转染的(编码IL-13Rα1.ECR的pEFBOS-S-载体)CHO细胞克隆的条件培养基中纯化了包含人类IL-13Rα1的大部分细胞外区域(SEQ ID NO：101的3到317号氨基酸)的N-末端带有
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标签的融合蛋白。纯化的hIL-13Rα1.ECR蛋白(SEQ ID NO：103)被浓缩，然后在磷酸盐缓冲液(PBS)、0.02％v/vTWEENTM 20中脱盐，然后过滤除菌。典型的回收率为每升条件培养基0.4mg蛋白。蛋白在使用前储存在-80℃。
方法。使用标准程序，将包含编码人类IL-13Rα1的细胞外区域(ECR)以及IL-3信号序列和
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标签的融合物的cDNA的pEFBOS-S-
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表达载体转染到CHO细胞中，用于稳定表达。然后使用截留分子量为10kDa的膜通过超滤将CHO衍生的条件培养基浓缩10倍。将浓缩的培养基上样M2(抗
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)亲和层析柱，用浓度为100μg/ml的
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肽进行洗脱。将洗脱物通过冷冻干燥进行浓缩，然后使用装于柱(2.6cm×40cm)中的GF50SEPHAROSETM树脂将缓冲液更换为pH 8.0的Tris缓冲液。然后将更换过缓冲液的级份使用MONOTM Q 5/5柱进行阴离子交换层析。IL-13Rα1的蛋白水解片段被强烈持留，并与在较低盐浓度下洗脱的全长IL-13Rα1分离开。合并的级份和过滤除菌的最终产物通过SDS-PAGE和western印迹分离来评估。然后使用紫外吸光度对样品进行定量，其中1个吸光度单位大约为1mg/ml。
实施例2：生产人类抗人类IL-13Rα1单克隆抗体的杂交瘤细胞系的产生
转基因小鼠的免疫接种。使用实施例1的hIL-13Rα1.ECR免疫接种来自HCo7、HCo12和HCo7xHCo12株系(HUMABTM小鼠，Medarex，USA)的雄性和雌性转基因小鼠。对于第一次免疫来说，将20-50μghIL-13Rα1.ECR在完全Freund′s佐剂(CFA)中乳化，并通过腹膜内(i.p.)途径进行施用。对于随后的最少两次、最多三次腹膜内免疫来说，将20-50μg hIL-13Rα1.ECR在不完全Freund′s佐剂(IFA)中乳化。在用IFA中的hIL-13Rα1.ECR进行第二次或第三次免疫后，对血清取样(眼球后结节)，并通过ELISA按照本文的描述分析针对hIL-13Rα1.ECR的人类抗体。选择高响应性小鼠(血清滴度一般＞1∶3200)用于杂交瘤生产。在某些情况下，在该时间点不被用于杂交瘤生产的动物接受另一次用PBS中的20-50μg hIL-13Rα1.ECR进行的腹膜内免疫。再次通过ELISA分析这些动物的血清中针对hIL-13Rα1.ECR的人类抗体，并将高响应性小鼠用于杂交瘤生产。被选择用于杂交瘤生产的小鼠在进行脾细胞融合之前3-4天，用20-50μg hIL-13Rα1.ECR进行静脉内加强。
抗原特异性ELISA。使用下述的标准ELISA形式对小鼠血清或杂交瘤培养上清液(SNF)中能够与结合有hIL-13Rα1.ECR的板结合的mAbs进行评估。将平底96孔MAXISORPTM板(NUNC，InvitroTechnologies，#439454)用50μl PBS稀释的包含2.5μg/mlhIL-13Rα1.ECR的溶液包被，并在4℃温育过夜。在用PBS清洗两次后，将板用包含2％w/v脱脂奶粉的PBS(阻断缓冲液，200μl/孔)在37℃阻断1小时，然后再用包含0.1％v/v TWEENTM 20的PBS(清洗缓冲液)清洗两次。在每个孔中加入50μl测试的杂交瘤SNF或小鼠血清，将板在室温温育1小时。将板清洗三次。使用在包含1％w/v脱脂奶粉和0.1％v/v TWEENTM 20的PBS中稀释1000倍的抗人类IgG HRP偶联的第二反应试剂，检测被结合的人类mAbs。在板中每孔加入50μl抗人类IgG HRP偶联的第二反应试剂，室温1小时。然后将板清洗三次，用TMB底物显色，在450nm读取OD。
杂交瘤产生。选出的高响应性小鼠被处死，然后收集脾脏和相关的***。脾脏和***细胞与融合配偶体SP2/O的融合、以及随后杂交瘤的HAT(次黄嘌呤/氨基喋呤/胸腺嘧啶)(GIBCO-BRL，#21060-017)筛选，按照标准的程序来进行(《抗体实验指南》(Antibodies：A Laboratory Manual)，Harlow和Lane，Cold SpringHarbor Laboratory Press)。简单来说，离心被调整到室温，水浴调整到37℃，加热装置(heat block)调整到37℃。聚乙二醇(PEG)在37℃温育。制备了用于在融合完成后培养细胞的培养基。培养基包含杂交瘤无血清培养基(HSFM)(GIBCO-BRL，#12045-084)、5％超低IgG的FBS(FBS)(GIBCO-BRL，#16250-078)、2mM Glutamax-1(GIBCO-BRL，#35050-061)、50U/50μg/ml青霉素/链霉素(GIBCO-BRL，#15070-063)和1x HAT。将培养基温育到37℃。将SP2/O细胞收获并进行活细胞计数。细胞是健康的、活性***的和位于对数期的。存活率高于95％。SP2/Os在融合前培养在HSFM/5％超低IgG的FBS中，在融合前一天分成1∶2或1∶3。在融合当天，将动物处死，立即取出脾脏(如果需要的话以及***)，放置在冰上的无菌培养基中(Dulbecco′s改性的Eagles培养基(GIBCO-BRL，#11995-073)或DME)。从脾脏制备单细胞悬浮液，并在DME中清洗两次(1800rpm离心7分钟)，第二次清洗时加温。将SP2/O细胞用温热的DME清洗三次(1500rpm，7分钟)，以除去所有痕量的血清。每只小鼠的脾脏使用108个SP2/O细胞，用于两次分别的融合。将SP2/Os和脾细胞在同样的试管中合并到一起，在2100rpm(400g)离心5分钟。除去所有的DME，只留下合并的细胞沉淀。将DME放置在37℃加热装置中。在一分钟内将1ml温热的PEG逐滴加入到细胞沉淀中，同时用滴管轻轻搅动沉淀。继续轻轻搅动1分钟。在1分钟内逐滴加入1ml温热的DME并搅动。在1分钟内再加入另外1ml DME。然后在5分钟内加入20ml DME，同时缓慢搅动。然后将其在1500rpm离心5分钟。除去所有上清液，将细胞轻轻地重新悬浮在上述的培养基中。一只小鼠的脾脏被分装到5个微孔板的HAT培养基中，每个孔0.2ml。每3或4天通过从每个孔中取出大约0.1ml并用新鲜的HAT培养基代替，来对板进行补料。在7-10天检查孔中杂交瘤的生长(常规筛选在融合后10-14天)。事先确保至少有2-3天没有改变培养基，然后从每个孔中取出大约100μl上清液进行分析。阳性的被转移到1ml或2ml孔中，然后逐渐扩展到6孔板中。在该阶段杂交瘤不是纯系的。在HAT培养基中培养14天后，将杂交瘤在HT(GIBCO-BLR，#11067-030)(HSFM，5％超低IgGFBS，10ng/mlrhIL-6(R&D Systems，#206-IL-050)和HT)中继续培养大约两周，然后在物HT的培养基中培养。
杂交瘤的培养。通过限度稀释法对最初和后续的证实ELISA筛选中测试为阳性的杂交瘤进行克隆。通过ELISA筛选包含单一克隆的限度稀释孔，并选择阳性孔进行扩增。进行下一轮的限度稀释克隆，直到100％的孔测试为阳性。
为了产生用于抗体纯化的上清液(SNF)，将杂交瘤在T175cm2的烧瓶(Falcon，#3028)或转瓶(900cm2)(CORNING，#430849)中扩增。用于产生杂交瘤SNFs的培养基是添加有5％超低IgG的FBS、2mM谷氨酰胺和50U/50μg/ml青霉素/链霉素的HSFM。允许杂交瘤生长到铺满，在超过90％的细胞死亡后大约5-10天通过离心收获培养基。在mAb纯化之前，使用STERICUPTM过滤装置(MILLIPORE，#SCGPU11RE)(0.45μm)对所有条件培养基进行过滤。
纯化的mAbs的生产。使用标准的基于蛋白A亲和层析的策略从SNF中纯化单克隆抗体；参见例如下面的装置和试剂。HPLC：AKTA探测器(AMERSHAM Biosciences，Sweden)；柱子：蛋白A(HITRAPTM，1ml，Amersham Biosciences，Sweden)；缓冲液A：PBS，0.02％TWEENTM20；缓冲液B：0.1M甘氨酸，pH 2.8；以及缓冲液C：2M Tris，pH 8.0。
通过用5倍体积的缓冲液A清洗来制备柱子。将条件培养基上样到专用的柱上。使用100倍体积的缓冲液A进行清洗，用20ml(10×2ml)缓冲液B进行洗脱。收集到包含0.2ml缓冲液C的试管中。将柱子用缓冲液A清洗，储存在4℃下。使用截留分子量为10K的透析膜在包含0.02％TWEENTM 20的PBS中进行脱盐。mAb的纯度通过SDS-PAGE使用
Figure A20078003895400601
Blue染色来自证实。
通过280nm处的分光光度法分析对抗体进行定量，使用免疫球蛋白的消光系数，1.0吸收单位等价于1.34mg/ml抗体。
实施例3：抗人类IL-13Rα1单克隆抗体10G5对人类IL-13Rα1的亲和性的分析
基于BIACORETM的研究。使用标准的NHS/EDC化学方法，按照制造商的说明书，将实施例1的人类IL-13Rα1.ECR(40μg/ml，在20mM乙酸钠中，pH 4.2)以设定的固定化值例如1000RU，固定到传感器芯片上(CM5，Biosensor，Sweden)。使用pH 8.0的乙醇胺(1.0M)淬灭hIL-13Rα1.ECR固定化后残留的活性酯。
10G5(浓度范围为1.4nM到150nM，两倍稀释液)与固定化的hIL-13Rα1.ECR的结合的分析被进行双份。产生的传感图谱拟合于二价配体结合模型，能够同时推演出结合(ka)和解离(kd)速度，并用于确定结合亲和性(KD，Biaevaluation software，BIACORETM，Sweden)。
抗IL-13Rα1人类mAb 10G5的结合亲和性(KD)是大约254pM(n＝8)。
实施例4：抗人类IL-13Rα1单克隆抗体10G5与食蟹猴和小鼠IL-13Rα1的结合的分析
使用从食蟹猴脾脏和骨髓提取的mRNA，通过PCR克隆了编码食蟹猴IL-13Rα1(cyIL-13Rα1)的cDNA。食蟹猴和人类IL-13Rα1之间成熟序列是高度保守的，氨基酸同一性为大约97％(参见GENBANK登记号No.AAP78901)。
为了生产纯化的食蟹猴IL-13Rα1.ECR蛋白，将编码食蟹猴IL-13Rα1.ECR(GENBANK登记号No.AAP78901的9到325位氨基酸，或SEQ ID NO：104的1到317位氨基酸)的cDNA克隆到pEFBOS-S-载体中，以表达hIL-13Rα1.ECR的基本上如上所述的N-末端带有
Figure A20078003895400612
标签的融合蛋白。
小鼠的IL-13Rα1.ECR(GENBANK登记号No.009030的27到344位氨基酸或SEQ ID NO：105的1到318位氨基酸)也被表达，并作为基本上如上所述的N-末端带有
Figure A20078003895400621
标签的融合蛋白(mIL-13Rα1.ECR)被纯化。
使用基于BIACORETM的方法对mAb 10G5与小鼠和食蟹猴IL-13Rα1.ECR的可能的交叉反应性进行了评估。使用标准的固定化化学方法，将纯化的小鼠、人类和食蟹猴IL-13Rα1.ECR被分别固定化到传感器芯片(CM5，BIACORETM，Sweden)的三个通道上。以15μl/分钟的流速对单克隆抗体(浓度范围从312.5nM下降到125pM)与受体的结合进行了同时的评估。按照上面实施例3中的描述对mAb的亲和性进行了分析。
该分析的结果表明，与人类受体(大约254pM)相比，MAb 10G5对恒河猴受体显示出低10倍的亲和性(大约2.9nM)，与小鼠受体的结合可以被忽略。
实施例5：10G5与IL-13竞争与人类IL-13Rα1结合的能力的分析
通过在BIACORETM仪器上进行的竞争分析，评估了10G5与IL-13竞争与IL-13Rα1结合的能力。使用标准的NHS/EDC化学方法按照制造商的说明书，通过固定化人类IL-13，制备了传感器芯片。将hIL-13Rα1.ECR蛋白(8μg/mL)与过量mAb(50μg/mL)在室温温育2小时，然后注射在传感器芯片上。在传感图谱中固定的时间点，对与固定化的IL-13结合的hhIL-13Rα1.ECR蛋白水平进行记录，并除以在不存在mAb情况下结合的hIL-13Rα1.ECR蛋白的相应水平(“相对IL-13结合”)。结合比率小于1表明了mAb和IL-13竞争与IL-13Rα1的结合，而值大于等于1表明mAb与IL-13Rα1结合的位点不同于IL-13的结合位点。
发现mAb 10G5抑制了hIL-13Rα1.ECR蛋白与固定化的IL-13的结合。
实施例6：抗人类IL-13Rα1单克隆抗体拮抗IL-13和IL-4介导的细胞应答的能力的分析
标准的人类真皮成纤维细胞(NHDF)的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)分析。NHDF细胞已经被证实能够对IL-13作出应答产生噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)，针对IL-13Rα1的mAbs可以抑制这种应答。此外，已经证实NHDF细胞不表达γc受体，因此能够分析mAbs抑制IL-4的通过IL-4II类受体、即IL-4Rα加IL-13Rα1介导的活性的能力。由于物种的交叉反应性，人类和非人类灵长动物(例如恒河猴)的IL-13都可用于刺激噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的生产。
将NHDF细胞(Cambrex，#CC-2509)培养在添加有制造商的说明书推荐的添加剂的FGM培养基(Cambrex，#CC3132)(完全培养基)中。细胞每星期以1∶3或1∶5传代一次，并在使用前检测对IL-13的应答。为了评估hIL-13Rα1特异性mAbs的拮抗活性，将细胞以2×106/ml的浓度重新悬浮在包含20ng/ml PMA(SIGMA，#P8139)和20μg/ml多粘菌素(SIGMA，#P4932)的完全培养基中，并以1×105个细胞/孔的密度铺于96孔平底板中(COSTAR，#3595)。抗体滴定物被加入到细胞中，在包含5％CO2的加湿空气中于37℃温育30分钟。然后将重组IL-13(人类或非人类灵长动物)加入到板中，终浓度为30ng/ml，在包含5％CO2的加湿空气中于37℃温育过夜。然后取出上清液，通过ELISA分析噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的含量。对于IL-4诱导的分析来说，将重组IL-4(PHARMINGEN)代替IL-13加入到板中，终浓度为0.5ng/ml。
噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的ELISA方案。将
Figure A20078003895400631
-4板(DYNATECH，#3855)用溶解在PBS(INVITROGEN，#14190-144)中的4μg/ml小鼠抗人类噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)抗体(R&DSystems，MAB320)在4℃包被过夜。将板在室温阻断(200μl/孔，添加有1％BSA和0.05％TWEENTM 20的TBS)1小时，并清洗三次(清洗缓冲液，TBS加0.05％TWEENTM 20)。以50μl/孔的量加入来自NHDF细胞的测试SNF，将板在室温温育2小时，然后清洗三次。加入溶解在阻断缓冲液(60ml/孔)中的浓度为200ng/ml的生物素酰化的抗人类噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)抗体(R&D Systems，BAF320)，在室温温育1小时，然后清洗三次。加入溶解在铕缓冲液中(100μl/孔)浓度为100ng/ml的链亲和素-铕(Wallac，#1244-360)，在室温温育20分钟，然后清洗三次。加入150μl/孔的增强溶液(Wallac，#12244-105)，在室温温育1小时。使用VICTOR(PERKIN-ELMER)读板器对时间延迟的荧光进行读数。
重组人类噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)(R&D Systems，#320-EO)被用于建立标准曲线。该分析的结果表明10G5针对IL-13的EC50是0.25μg/ml，而针对IL-4的EC50是2.7μg/ml。
NHDF中IL-13/IL-4诱导的STAT6磷酸化分析。STAT6的磷酸化(pSTAT6)是IL-13/IL-4信号传导的基本要素，发生在受体二聚体化的几分钟内。IL-13Rα1特异性mAbs可以对IL-13和/或IL-4作出应答，阻断STAT6的磷酸化。
为了对其进行测定，将50μl RPMI培养基(#22400-071，INVITROGEN)中的2×106个NHDF细胞铺在96孔V型底聚丙烯PCR板(USA Scientific，#1442-9596)中。加入25μl具有所需浓度的抗IL-13RmAbs，将板在4℃温育30分钟。加入25μl重组hIL-13(100ng/ml)或hIL-4(PHARMINGEN，0.5ng/ml)，将板在PCR仪器中加热到37℃，保温20分钟。20分钟后，加入等体积的2X裂解缓冲液(100mMHEPES，200mM NaCl，2％v/v
Figure A20078003895400641
X100，100mM NaF，10mMDTT，蛋白酶抑制剂)，通过ELISA测量pSTAT6。
STAT6的ELISA方案。将
Figure A20078003895400651
-4板(DYNATECH，#3855)用溶解在PBS(INVITROGEN，#14190-144)(50μl/孔)中的10μg/ml抗人类磷酸化STAT6抗体(BD Transduction Labs，#621995)包被，并在4℃温育过夜。将板在室温阻断(200μl/孔，添加有1％BSA和0.05％TWEENTM 20的TBS)1小时，并清洗三次(清洗缓冲液，TBS加0.05％TWEENTM 20)。以50μl/孔的量加入测试裂解物，将板在室温温育2小时，然后清洗三次。加入溶解在阻断缓冲液中的浓度为2μg/ml的生物素标记的抗STAT6抗体(BD Transduction Labs，#621141，以20∶1的摩尔比率与生物素连接)(60μl/孔)，在室温温育1小时，然后清洗三次。加入溶解在铕缓冲液中浓度为100ng/ml的链亲和素-铕(Wallac，#1244-360)(100μl/孔)，在室温温育20分钟，然后清洗三次。加入(150μl/孔)增强溶液(Wallac，#12244-105)，在室温温育1小时。使用VICTOR(PERKIN-ELMER)读板器对时间延迟的荧光进行读数。
该分析的结果表明10G5对IL-13的EC50是1.0μg/ml，而对IL-4的EC50是1.3μg/ml。
实施例7：10G5鼠类抗体可变区的克隆和测序
从产生抗体10G5的杂交瘤细胞制备信使RNA，并使用寡聚-dT引物进行反转录，以产生cDNA。进行了几个独立的PCR反应。PCR反应在下面的条件下进行：94℃2分钟；94℃30秒、60℃30秒和68℃1分钟，共30个循环；以及68℃10分钟。在克隆抗体基因中也开发了两种可选的PCR条件：1)94℃2分钟；94℃30秒、68℃30秒和68℃1分钟，共30个循环；以及68℃10分钟；和2)94℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟，共30个循环。将PCR扩增子在1.2％琼脂糖凝胶上分离。对重链可变区来说，下面的引物组产生了PCR产物。对于重链可变区的5′末端来说，引物是VH5，5′-G GGG TCA ACC GCC ATCCTY G-3′(SEQ ID NO：114)，其中Y是C或T(简并2)；以及VH6，5′-GTC TCC TTC CTC ATC TTC CTG CCC-3′(SEQ ID NO：115)(简并1)；而用于VH的3′末端的引物是HA，5′-C CCA TCG GTC TTC CCCCTG GCA C-3′(SEQ ID NO：116)。对于轻链可变区来说，4个引物组产生了PCR产物。PCR产物被克隆到质粒pCK2.1(INVITROGEN)中。重链克隆的序列分析具有与种系VH5-51最佳的匹配。对于轻链可变区来说，用于产生与种系VL VKIII A27匹配最好的序列的5′末端引物是VK3，5′-YTC TTC CTC CTG CTA CTC TGGCTC-3′(SEQ ID NO：117)，其中Y是C/T(简并2)；以及VK4，5′-ATGGTG TTG CAG ACC CAG GTC TTC-3′(SEQ ID NO：118)(简并1)；而用于VL的3′末端的引物是KA，5′-G AAA TCT GGA ACT GCC TCTGTT GTG TGC CTG C-3′(SEQ ID NO：119)。
最初鉴定到的包含10G5的重链和轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列包含了前导序列和某些其它的下游序列(对于重链参见SEQ IDNOs：42和44，对于轻链参见SEQ ID NOs：46和48)。10G5的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示在图1和SEQ ID NOs：43和45中。10G5的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示在图2和SEQID NOs：47和49中。
实施例8：mAb与噬菌体展示的人类IL-13Rα1肽的结合的分析
人类IL-13Rα1细胞外区域的氨基酸序列的233位的苯丙氨酸突变成丙氨酸，导致了抗体10G5的结合与抗体和野生型人类IL-13Rα1细胞外区域的结合相比，发生了显著的降低。因此，Phe233被鉴定为受体上对于抗体10G5结合来说重要的残基。方便的是，基本上按照Lowman等，1991Biochem.30：10832-10838中描述的步骤，将人类IL-13Rα1细胞外区域或相应的Phe233Ala突变体通过C-末端与基因3蛋白的片段(249-406为氨基酸)进行了融合。然后将这些IL-13Rα1来源的肽展示在M13噬菌体上，并通过ELISA分析与固定化的10G5或1D9的结合。简单来说，将mAbs被动吸附在96孔MAXISORPTM板(NUNC)上，然后将用PBS缓冲液稀释的浓度为2.5μg/mL的mAb以100μl/孔的量温育过夜。丢弃包被溶液，通过与阻断缓冲液在室温温育1小时将板阻断，然后用清洗缓冲液清洗一次。然后将用包含1％w/v脱脂奶粉的PBS(稀释缓冲液)连续稀释的噬菌体样品转移到mAb包被的板中(100μL/孔)。在室温温育2小时后，将板清洗三次，将结合的噬菌体用抗M13IgG HRP偶联的多克隆抗体标记，通过加入TMB底物进行检测。TMB的显色通过加入2M硫酸水溶液进行淬灭，在450nm测量吸收值。
实施例9：抗体的鉴定
方法。将抗体10G5的重链可变区和轻链可变区序列(分别为SEQID NOs：43和47)克隆到Fab噬菌体展示载体pFab3d中(图3、4A和4B)，将来自真菌Glarea lozoyensis的PKS3位点的1929bp的XhoI/ApaI片段作为轻链构建物中的填充片段克隆到XhoI/ApaI位点中，然后在重链和轻链可变区CDR3中进行随机突变(每个文库具有≥108的功能多样性)。然后使用标准的噬菌体展示方法(参见例如《噬菌体展示实验指南》(Phage Display：A Laboratory Manual)，2001，Cold SpringHarbor Laboratory Press)将获得的突变体在溶液中针对生物素标记的人类和灵长动物(恒河猴和食蟹猴)的IL-13Rα1进行淘选。人类和灵长动物的序列已经在文献中公开；参见例如GENBANK登记号Nos.U62858、CAA70508和AAP78901。通过在每个后一轮的淘选中降低靶的浓度(例如10nM、1nM、0.1nM和0.01nM)，淘选的严紧性被有效增加了，由此在每个后续轮中富集了亲和性越来越高的噬菌体。噬菌体ELISA被用作初始分析方法，以确定噬菌体结合的重组Fabs识别固定化在链亲和素板上的生物素酰化的IL-13Rα1的能力(参见例如《噬菌体展示实验指南》(Phage Display：A Laboratory Manual)，同上)。Myc捕获ELISA和解离分析(本文描述的通用方案)被用作第二筛选工具。进行了BIACORETM表面等离子共振和KINEXATM动力学排斥分析，以对被鉴定的抗体的结合动力学进行表征。这些分析按照出版的制造商的方案进行。具体的抗体被转化成全长的IgG4亚类的抗体，以便在哺乳动物中表达、生产和表征(下面描述的通用方案)。
Myc捕获和解离分析。两种分析被平行开展。第一种(I)测量从周质制备物捕获的抗体的量。这确保了只从具有足够和相当量的抗体的孔中收集数据。第二种(II)测量了IL-13受体从板结合的抗体的解离。
分析方法(I)：将
Figure A20078003895400681
-4板(DYNATECH，#3855)用溶解在PBS(INVITROGEN，#14190-144)(50μl/孔)中的5μg/ml多克隆抗人类κ抗体(Immunology Consultants Lab，#GKBF-80A-K116)包被，并在4℃温育过夜。加入阻断缓冲液(200μl/孔)，将板在室温温育1小时。将板用清洗缓冲液清洗三次。以50μl/孔的量加入纯净的周质制备物，在室温放置2小时。将板用清洗缓冲液清洗三次。加入溶解在阻断缓冲液中的浓度为50μg/ml的人类γ球蛋白(Pierce，#31879)，留在4℃温育过夜。在早晨和下午用清洗缓冲液将板清洗三次，然后加入150μl/孔阻断缓冲液，同时整个过程在37℃温育。用清洗缓冲液将板清洗三次。使用溶解在阻断缓冲液(60μl/孔)中的1μg/ml生物素标记的抗Myc抗体(Upstate，#16-212)，在室温温育1小时来检测被结合的抗体。将板用清洗缓冲液清洗三次。加入溶解在铕缓冲液中(100μl/孔)浓度为100ng/ml的链亲和素-铕(Wallac，#1244-360)，在室温温育20分钟。进行最后的清洗步骤(三次)，并加入150μl/孔的增强溶液(Wallac，#12244-105)，在室温温育1小时。在VICTOR(PERKIN-ELMER)读板器上对板的时间延迟荧光进行读数。
分析方法(II)：将
Figure A20078003895400682
-4板(DYNATECH，#3855)用溶解在PBS(INVITROGEN，#14190-144)(50μl/孔)中的5μg/ml多克隆抗人类κ抗体(Immunology Consultants Lab，#GKBF-80A-K116)包被，并在4℃温育过夜。加入阻断缓冲液(200μl/孔)，将板在室温温育1小时。将板用清洗缓冲液清洗三次。以50μl/孔的量加入纯净的周质制备物，在室温放置2小时。将板用清洗缓冲液清洗三次。加入60μl/ml的400ng/ml
Figure A20078003895400683
-标记的人类IL13受体以及溶解在阻断缓冲液中的浓度为50μg/ml的人类γ球蛋白(Pierce，#31879)，置于4℃温育过夜。以两个6小时的时间间隔用清洗缓冲液将板清洗三次，然后加入150μl/孔的阻断缓冲液。温育在37℃进行。用清洗缓冲液将板清洗三次。使用溶解在阻断缓冲液中(60μl/孔)的1μg/ml生物素标记的抗
Figure A20078003895400691
抗体(IBI，#3081/6H2411)，在室温温育1小时来检测残留的IL-13受体。将板用清洗缓冲液清洗三次。在室温20分钟内加入溶解在铕缓冲液(100μl/孔)中浓度为100ng/ml的链亲和素-铕(Wallac，#1244-360)。进行最后的清洗步骤(三次)，并在室温1小时内加入150μl/孔的增强溶液(Wallac，#1244-105)。在Victor(PERKIN-ELMER)读板器上对板的时间延迟荧光进行读数。
向全长IgGs的转化。抗IL13Rα1单克隆抗体被转化成完整的IgG4亚类的抗体，以在哺乳动物中表达和生产。它们的可变区从相应的Fab载体通过PCR扩增，并按照阅读框架克隆到LONZA pCON抗体表达载体中，在抗体序列前带有前导序列。在载体中，所有轻链和重链恒定区的基因组DNA序列已经被工程化到载体中。表达由人类细胞肥大病毒(CMV)早期启动子驱动，后面跟有SV40多聚腺苷化信号。质粒具有用于质粒复制和氨苄青霉素选择标记的细菌序列，用于轻链的质粒pCONKAPPA具有编码谷氨酰胺合成酶的GS基因作为在哺乳动物中的选择标记。按照阅读框架融合可变区使得能够适当地表达完整抗体。通过设计，来自小鼠轻链和重链的前导序列被包含在抗体的开放阅读框架的前面。在ATG起始密码子的周围还包含了Kozak共有序列(只有斜体)，以增加蛋白的表达水平。设计了正向和反向引物用于4个可变区的PCR扩增。对于10G5轻链可变区来说，使用了正向引物5′-ATC GAT
Figure A20078003895400693
Figure A20078003895400695
GA AAT TGT GTT GAC GCA GTC T-3′(SEQ ID NO：88)和反向引物5′-CCA C
Figure A20078003895400696
TT TGA TTT CCA C-3′(SEQ ID NO：89)。对于10G5重链可变区来说，使用了正向引物5′-ACT G
Figure A20078003895400697
AT G
Figure A20078003895400701
GA GGT GCA GCT GGTGCA GTC T-3′(SEQ ID NO：90)和反向引物5′-ACC GAT
Figure A20078003895400702
TTG GTG GAG GCT-3′(SEQ ID NO：91)。前导序列用粗体和下划线标出，克隆位点(轻链和重链正向引物中的HindIII，轻链反向引物中的BsiWI和重链反向引物中的ApaI)用下划线和斜体标出。
使用这些引物对和带有10G5可变区序列的Fab载体，通过20个循环的PCR扩增了可变区。对于轻链来说，将PCR产物用HindIII和BsiWI消化，对于重链来说，用HindIII和ApaI消化。将酶消化过的PCR片段克隆到Lonza′s载体中(pCONKAPPA用于轻链，pCONGAMMA4用于重链)。然后将从pCONGAMMA4载体用NotI和SalI消化得到的相应重链的完整表达盒***到用同样的酶消化的相应轻链载体中。轻链和重链的完整开放阅读框架通过DNA序列分析进行证实。
抗体的表达、纯化和定性。将合并的轻链和重链质粒DNA或1∶1比例的相应的轻链和重链质粒DNA的混合物转染到293衍生的细胞系中。对于pCON载体来说，使用了来自INVITROGEN的293FREESTYLETM悬浮细胞系及其转染试剂。对于200ml的293FREESTYLETM细胞，使用了重链和轻链质粒DNA各100μg和300μl试剂进行转染。在收获前，将转染的细胞在37℃/5％CO2条件下温育7-8天。收获培养基、过滤，并使用低速MILLIPORE离心(浓缩器，MILLIPORE)进行浓缩。
结果。ELISA分析被显示在图5-8中。在图5-7中，活性明显不同的突变体是10G5H6(VHCDR3：SEQ ID NO：5；VLCDR3：SEQ IDNO：41)、10G5H5(VHCDR3：SEQ ID NO：4；VLCDR3：SEQ IDNO：41)、10G5H11(VHCDR3：SEQ ID NO：3；VLCDR3：SEQ ID NO：41)和10G5H33(VHCDR3：SEQ ID NO：25(其中在倒数第三个氨基酸残基上包含了The＝＞Ile残基的变化；VLCDR3：SEQ ID NO：41)。图8显示了突出的10个功能比10G5H6更有效的突变体。在图8中测试的突变体具有表4中所示的EC50值和重链和轻链CDR3区域。
表4
  抗体   VHCDR3   VLCDR3   EC50(μM)
  SJ2-66   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：28   1.757
  10G5H6   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：41   1.636
  SJ2-88   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：27   1.536
  SJ3-50   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：29   1.341
  SJ2-74   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：32   1.308
  SJ2-63   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：33   1.248
  SJ3-68   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：34   1.24
  SJ3-71   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：35   1.186
  SJ2-57   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：36   1.14
  SJ2-85   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：37   1.123
  SJ2-81   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：38   0.9334
对选出的抗体进行了
Figure A20078003895400711
分析。表5和6中所示的具体的全长抗体的数据包含了来自两个不同实验的数据。
表5
  抗体   VHCDR3   VLCDR3   KD
  10G5-1   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：38   54.84pM
  10G5-2   SEQ ID NO：22   SEQ ID NO：38   45.44pM
  10G5-4   SEQ ID NO：23   SEQ ID NO：38   66.93pM
表6
  抗体   VHCDR3   VLCDR3   KD
  10G5WT   SEQ ID NO：40   SEQ ID NO：41   861pM
  10G5H6   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：41   99.43pM
  10G5-2   SEQ ID NO：22   SEQ ID NO：38   31.44pM
  10G5-4   SEQ ID NO：23   SEQ ID NO：38   20.35pM
  10G5-6   SEQ ID NO：7   SEQ ID NO：38   26.8pM
对于Fab形式的各种不同的抗体进行了BIACORETM分析。表7和8显示了来自两个不同实验的数据：
表7
  抗体   VHCDR3   VLCDR3   KD
  10G5WT   SEQ ID NO：40   SEQ ID NO：41   4.5nM
  10G5H6   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：41   0.6nM
表8
  抗体   VHCDR3   VLCDR3   KD
  10G5WT   SEQ ID NO：40   SEQ ID NO：41   1.35nM
  10G5H11   SEQ ID NO：3   SEQ ID NO：41   106pM
  10G5R4-10   SEQ ID NO：15   SEQ ID NO：41   196pM
  10G5R4-11   SEQ ID NO：16   SEQ ID NO：41   233pM
  10G5R4-2A   SEQ ID NO：7   SEQ ID NO：41   817pM
  10G5R4-2B   SEQ ID NO：23   SEQ ID NO：41   116pM
  10G5SJ2-81   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：38   43pM
提供的数据说明了可以通过所进行的各种不同筛选和分析，鉴定对IL-13α1具有显著增强的亲和性的抗体。未包括的抗体通常被证明在其序列中包含共有的保守序列。更具体来说，从这些研究可以得出结论，(1)重链可变区CDR3结构域中的三个残基在突变后更倾向于对功能有正面影响，即SEQ ID NO：40的残基1、7和9；以及(2)轻链可变区CDR3结构域中的三个残基在突变后更倾向于对功能有正面影响，即SEQ ID NO：41的残基2、4和5。
也开发了具有***作的Fc区的抗体。在Fc区中的操作使得抗体表现出与FcγR受体或C 1q的降低的结合。与FcRn(也被称为新生儿受体或Brambell受体)的结合基本上不改变，抗体的半衰期也不改变。修饰的目的是为了产生不引起(或引起较低程度的)抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)、补体介导的细胞毒性(CMC)、或形成免疫复合物，同时保留正常的药物动力学(PK)性质的抗体。正如本领域技术人员所了解的，公开的人类抗体IgG结构(包含SEQ ID NO：92)可以与任何多种本文公开的VH和VL序列、以适合的Cκ或Cλ一起使用，来开发全长的抗体。
对选定的具有操作过的Fc的抗体进行
Figure A20078003895400731
分析。操作过的IgG形式的10G5-6的氨基酸和核苷酸序列分别显示在SEQ ID NOs：94和95中。表9概述了使用
Figure A20078003895400732
对选定的全长抗体进行双曲线Kd分析后获得的数据。
表9
  抗体   VHCDR3   VLCDR3   KD
  10G5-6IgG4   SEQ ID NO：7   SEQ ID NO：38   44.36pM
  10G5-6IgG2m4   SEQ ID NO：7   SEQ ID NO：38   30.79pM
  10G5WT IgG2m4   SEQ ID NO：40   SEQ ID NO：41   2.06pM
  10G5H6IgG2m4   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：41   94.64pM
以这种方式操作的抗体已经被发现显示出几种优于天然IgG同种型的优点。第一个是它们与C1q的结合不像IgG2那样强，使得它激活补体级联反应的效率较低。在生理相关的水平下，操作过的抗体也不与Fcγ受体结合，或表现出显著降低的结合，特别是FcγRI，这消除了(或显著降低了)任何不需要的NK细胞或T细胞活化；显著干扰了抗体介导ADCC的能力；并消除了(或显著降低了)抗体在体内可能的可选的下降。获得的抗体也保留了IgG2的半衰期和基本结构，这是非常令人满意的。在独立的研究中发现，当在SCID小鼠中试验时，独立的研究中，10G5-6IgG2m4的血液半衰期在306小时的量级。该半衰期与IgG2报道的数字相当；参见例如Zuckier等，1994Cancer Suppl.73：794-799。
实施例10：功能研究-噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)释放
NHDF的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)释放分析。NHDF细胞购自Cambrex(#CC-2509)，培养在添加有提供的添加剂的FGM培养基(Cambrex，#CC-3132)中，该培养基在下面被称为完全培养基。细胞每星期以1∶3或1∶5传代一次，并在使用前监测对IL-13的响应性。为了评估hIL-13Rα1抗体的拮抗活性，将细胞以2×106/ml的浓度重新悬浮在包含20ng/ml PMA(SIGMA，#P8139)和20μg/ml多粘菌素(SIGMA，#P4932)的完全培养基中，并以1×105个细胞/孔的密度铺于96孔平底板中(COSTAR，#3595)。抗体滴定物被加入到细胞中，在5％CO2培养箱中于37℃温育30分钟。然后以每种细胞因子的相应EC50的量使用重组恒河猴IL-13或重组人类IL-4(BD PHARMINGEN，#554605)，在5％CO2培养箱中于37℃温育过夜。取出上清液，通过免疫分析方法分析噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的含量。简单来说，将
Figure A20078003895400741
-4板(DYNATECH，#3855)用溶解在PBS(INVITROGEN，#14190-144)中的2μg/ml抗人类噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)抗体(PHARMINGEN，#555035)包被，在4℃温育过夜。将板在室温用阻断缓冲液阻断1小时，并用清洗缓冲液清洗三次。将来自NHDF细胞的上清液与重组人类噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)标准品(R&D Systems，#320-EO)一起加入到板中。将样品在室温捕获2小时，清洗，然后加入浓度为200ng/ml的生物素酰化的抗人类噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)检测抗体(PHARMINGEN，#555060)，室温1小时。将板进行清洗，室温20分钟内加入浓度为100ng/ml的链亲和素-铕(Wallac，#1244-360)。进行最后的清洗步骤，并在室温1小时内加入增强溶液(Wallac，#12244-105)。在VICTOR(PERKIN-ELMER)读板器上对板的时间延迟荧光进行读数。
结果。分析了正常人类真皮成纤维(NHDF)细胞在与IL-13α1特异性抗体接触后释放的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)。分析使用IL-13和/或IL-4作为刺激物来进行。当IL-13用作诱导剂时，最优化的抗体在这些类型的分析中比亲本形式的10G5的能力高至少2倍。功能差异的倍数的例子显示在图9中，其中使用IL-13作为刺激物时，10G5、10G5H6和10G5-6的IC50值被测定分别为310ng/mL(～2nM)、110ng/mL(～730pM)和70ng/mL(～467pM)。图10显示了使用IL-4作为刺激物时抗体对NHDF细胞的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)形成的抑制。实验用多种本发明描述的全长抗体来进行。与用IL-13刺激后NHDF细胞释放的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的抑制相关的数据概述在表10中。
表10
  抗体   VHCDR3   VLCDR3   EC50
  10G5WT   SEQ ID NO：40   SEQ ID NO：41   2.309μg/ml
  10G5-1   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：38   0.497μg/ml
  10G5-2   SEQ ID NO：22   SEQ ID NO：38   0.456μg/ml
  10G5-3   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：39   0.614μg/ml
  10G5-4   SEQ ID NO：23   SEQ ID NO：38   0.330μg/ml
  10G5-5   SEQ ID NO：23   SEQ ID NO：41   0.939μg/ml
  10G5H6   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：41   0.474μg/ml
与用IL-4刺激后NHDF细胞释放的噬酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)的抑制相关的数据概述在表11中。
表11
  抗体   VHCDR3   VLCDR3   EC50
  10G5WT   SEQ ID NO：40   SEQ ID NO：41   4.533μg/ml
  10G5-1   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：38   0.907μg/ml
  10G5-2   SEQ ID NO：22   SEQ ID NO：38   0.730μg/ml
  10G5-3   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：39   0.983μg/ml
  10G5-4   SEQ ID NO：23   SEQ ID NO：38   0.660μg/ml
  10G5-5   SEQ ID NO：23   SEQ ID NO：41   2.267μg/ml
  10G5H6   SEQ ID NO：5   SEQ ID NO：41   1.438μg/ml
实施例11：功能研究-STAT6磷酸化：
NHDF的STAT6磷酸化分析。NHDF细胞购自Cambrex(#CC-2509)，并培养在添加有所提供的添加剂的FGM培养基中(Cambrex，#CC-3132)。将50μl体积的RPMI培养基(INVITROGEN，#22400-071)中的2e6/ml的NHDF细胞铺在96孔V型底聚丙烯PCR板(USA Scientific，#1442-9596)中。加入25μl抗IL-13R抗体，并在4℃温育30分钟。加入25μl重组恒河猴IL-13或重组人类IL-4(PHARMINGEN)。将板在PCR仪器中加热到37℃20分钟，并立即加入等体积的2X裂解缓冲液(100μl)。通过免疫分析测量pSTAT6。将
Figure A20078003895400761
-4板(DYNATECH，#3855)用溶解在PBS(INVITROGEN，#14190-144)(50μl/孔)中的10μg/ml抗人类磷酸化STAT6抗体(BDTransduction Labs，621995)包被在4℃温育过夜。加入阻断缓冲液(200μl/孔)，室温1小时。用清洗缓冲液将板清洗三次。以50μl/孔的量加入裂解液，在室温温育2小时。用清洗缓冲液将板清洗三次。加入溶解在阻断缓冲液中(60μl/孔)的浓度为2μg/ml的生物素标记的抗STAT6抗体(BD Transduction Labs，以20∶1的摩尔比率连接)，室温1小时进行检测。用清洗缓冲液将板清洗三次。加入溶解在铕缓冲液(100μl/孔)中浓度为100ng/ml的链亲和素-铕(Wallac，#1244-360)，室温20分钟。用清洗缓冲液将板清洗三次。加入(150μl/孔)增强溶液(Wallac，#12244-105)，室温1小时，在VICTOR(PERKIN-ELMER)读板器上对板的时间延迟的荧光进行读数。
结果。在NHDF细胞中研究了抗体对IL-13和IL-4诱导的STAT6磷酸化的抑制。在这些类型的分析中，当使用IL-13作为诱导剂时，最优化的抗体的效力比亲本形式10G5高至少3倍。功能差异的倍数的例子显示在图11中，其中使用IL-13作为刺激物时，10G5和10G5H6的EC50值被测定分别为2.9μg/mL和0.8μg/mL。图12显示了使用IL-4作为刺激物时，抗体对NHDF细胞中STAT6磷酸化的抑制。该分析的结果表明，对于10G5和10G5H6来说，EC50分别为5.0μg/mL和1.8μg/mL。
实施例12：功能研究-TARC释放
胸腺和活化调控趋化因子(TARC)释放分析(狗、恒河猴和人类)。将血液收集在肝素化的
Figure A20078003895400771
试管(VWR，VT6480)中。在淋巴细胞分离培养基(ICN，50494X)上分离PBMCs。将PBMCs或全血铺于96孔平底板中(COSTAR，#2595)。加入抗体，在室温温育30分钟。加入重组恒河猴IL-13至终浓度为10ng/ml，在加湿的温箱中与CO2在37℃温育24-72小时。收集上清液或血浆(TARC可以早在24小时时就检测到，但是水平继续增加)。通过免疫分析测量TARC。将
Figure A20078003895400772
-4板(DYNATECH，#3855)用溶解在50μl/孔的PBS(INVITROGEN，#14190-144)中的2μg/ml抗人类TARC抗体(R&D，#AF364)包被。将板在4℃温育过夜。加入阻断缓冲液(200μl/孔)，在室温温育1小时。用清洗缓冲液将板清洗三次。以50μl/孔的量加入血浆或上清液，在室温温育2小时(血浆稀释到1∶2)。包含了标准曲线，从稀释2倍的20ng/ml的重组人类TARC开始。用清洗缓冲液将板清洗三次。加入溶解在阻断缓冲液中(60μl/孔)的浓度为250ng/ml的生物素标记的抗人类TARC抗体(RDI，#RDI-TarcabrPl，以20∶1的摩尔比率与生物素连接)，室温1小时进行检测。用清洗缓冲液将板清洗三次。加入100μl/孔溶解在铕缓冲液中浓度为100ng/ml的链亲和素-铕(Wallac，#1244-360)，室温20分钟。用清洗缓冲液将板清洗三次。加入150μl/孔增强溶液(Wallac，#12244-105)，室温温育1小时。在VICTOR(PERKIN-ELMER)读板器中对时间延迟的荧光进行读数。
结果。测量了在用10ng/mL IL-13刺激后，本发明的抗体对TARC释放的影响。例如，图13显示了例如10G5-6在人类全血中阻断IL-13刺激的TARC(CCL17)释放的能力。抗体产生了大约112ng/mL、即746pM的IC50。图14显示了在人类全血的IL-13刺激的TARC释放分析中另一种抗体10G5H6的功能与10G5WT(野生型)的比较。图15显示了在用恒河猴IL-13刺激恒河猴全血后，10G5-6和10G5H6在阻断TARC的释放中的效果。
实施例13：功能研究-抑制霍奇金氏病的细胞增殖
方法。对10G5、10G5H6和10G5-6进行了分析，以确定抗体是否能够有效抑制霍奇金氏病细胞系L1236的细胞增殖。以前已经在细胞因子IL-13方面对霍奇金氏和Reed-Sternberg细胞进行了研究；参见例如Kapp等，1999J.Exp.Med.189：1939-1945；Skinnider等，2001Blood97：250-255；Skinnider等，2002Blood 99：618-626；以及美国专利No.6,468,528，其分析方法也描述在其中。
结果。在本分析中，10G5给出了大约300ng/mL(2nM)的IC50，但是10G5H6和10G5-6都给出了大约50ng/ml(～330pM)的IC50，二者都代表了与亲本10G5IgG相比大约6倍的提高。参见图17。
序列表
<110>默克制药公司(Merck & Co.，Inc.)
     CSL有限公司(CSL Limited)
<120>白介素-13受体α1的高亲和性抗体拮抗物
     (HIGH AFFINITY ANTIBODY ANTAGONISTS OF INTERLEUKIN-13RECEPTOR ALPHA 1
<130>SCT091248-00
<150>US 60/852,884
<151>2006-10-19
<160>123
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic heavy chain CDR3optimized variant
<400>1
Phe Pro Asn Trp Gly Ala Leu Asp Gln
1               5
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic heavy chain CDR3optimized variant
<400>2
Val Pro Asn Trp Gly Ser Leu Asp Thr
1               5
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic heavy chain CDR3optimized variant
<400>3
Phe Pro Asn Trp Gly Ser Met Asp Ala
1               5
<210>4
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic heavy chain CDR3optimized variant
<400>4
Phe Pro Asn Trp Gly Ser Leu Asp His
1               5
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic heavy chain CDR3optimized variant
<400>5
Met Pro Asn Trp Gly Ser Phe Asp Tyr
1               5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic heavy chain CDR3optimized variant
<400>6
Met Pro Asn Trp Gly Ser Phe Asp Thr
1               5
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic heavy chain CDR3optimized variant
<400>7
Met Pro Asn Trp Gly Ser Leu Asp His
1               5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic heavy chain CDR3optimized variant
<400>8
Met Pro Asn Trp Gly Ser Phe Asp Ser
1               5
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic heavy chain CDR3optimized variant
<400>9
Met Pro Asn Trp Gly Ser Leu Asp Thr
1               5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic heavy chain CDR3optimized variant
<400>10
Met Pro Asn Trp Gly Ser Leu Asp Ala
1               5
<210>11
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic heavy chain CDR3optimized variant
<400>11
Met Pro Asn Trp Gly Ser Leu Asp Asn
1               5
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic heavy chain CDR3optimized variant
<400>12
Met Pro Asn Trp Gly Ala Leu Asp Ser
1               5
<210>13
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
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<400>13
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1               5
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<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
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<400>14
Met Pro Asn Trp Gly Ser Leu Asp Tyr
1               5
<210>15
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
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<400>15
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1               5
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<211>9
<212>PRT
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<220>
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<400>16
Met Pro Asn Trp Gly Ser Leu Asp Ser
1               5
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<211>9
<212>PRT
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<220>
<223>Synthetic heavy chain CDR3optimized variant
<400>17
Met Pro Asn Trp Gly Ser Leu Asp Gly
1               5
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<211>9
<212>PRT
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<220>
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<400>18
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1               5
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<212>PRT
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<220>
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<400>19
Cys Ala Arg Phe Pro Asn Trp Gly Ser Leu Asp His Trp Gly Gln Gly
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<210>20
<211>28
<212>PRT
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<220>
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<400>20
Cys Ala Arg Met Pro Asn Trp Gly Ser Leu Asp His Trp Gly Gln Gly
1               5                   10                  15
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
            20                  25
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<211>28
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
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<400>21
Cys Ala Arg Met Pro Asn Trp Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
1               5                   10                  15
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ile Lys Gly
            20                  25
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<211>12
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
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<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic variant sequence with optimized CDR3
<400>23
Val Arg Met Pro Asn Trp Gly Ser Leu Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
1               5                   10                  15
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ile Lys Gly
            20                  25
<210>24
<211>27
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic variant sequence with optimized CDR3
<400>24
Ala Arg Met Pro Asn Trp Gly Ser Leu Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
1               5                   10                  15
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Ile Lys Gly
            20                  25
<210>25
<211>25
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic variant sequence with optimized CDR3
<400>25
Phe Pro Asn Trp Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
1               5                   10                  15
Thr Val Ser Ser Ala Ser Ile Lys Gly
            20                25
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<211>9
<212>PRT
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<220>
<223>Synthetic heavy chain CDR3optimized variant
<400>26
Val Pro Asn Trp Gly Ser Leu Asp Ala
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<220>
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Gln Arg Tyr Ser Thr
1               5
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<211>5
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<220>
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<400>28
Gln Arg Tyr Ala Thr
1               5
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<211>5
<212>PRT
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<400>29
Gln Met Tyr Ser Thr
1               5
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<211>5
<212>PRT
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<220>
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<400>30
Gln Gln Val Gly Thr
1               5
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<212>PRT
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Gln Val Tyr Ser Thr
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<400>32
Gln Gln Tyr Ser Thr
1               5
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<211>5
<212>PRT
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<220>
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<400>33
Gln Ser Tyr Ser Thr
1               5
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<211>5
<212>PRT
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<220>
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<400>34
Gln Gln Tyr Ala Thr
1               5
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<211>5
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic light chain CDR3optimized variant
<400>35
Gln Gln Tyr Ser Ser
1               5
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<211>5
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
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<400>36
Gln Thr Tyr Ser Thr
1               5
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<211>5
<212>PRT
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<220>
<223>Synthetic light chain CDR3optimized variant
<400>37
Gln Gln Tyr Gly Ser
1               5
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<211>5
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic light chain CDR3optimized variant
<400>38
Gln Gln Tyr Ala Ser
1               5
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<211>5
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic light chain CDR3optimized variant
<400>39
Gln Gln Tyr Glu Ala
1               5
<210>40
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic 10G5heavy chain CDR3
<400>40
Phe Pro Asn Trp Gly Ser Phe Asp Tyr
1               5
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<211>5
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic 10G5l ight chain CDR3
<400>41
Gln Gln Tyr Glu Thr
1               5
<210>42
<211>414
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic 10G5VH sequence with leader and additional constant
     region
<400>42
tttgccctcg tccctggctt gttcctccaa ggagtctgtg ccgaggtgca gctggtgcag    60
tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag tctctgaaga tctcctgtaa gggttctgga    120
tacagcttta ccagctactg gatcggctgg gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag    180
tggatggggg tcatctatcc tggtgactct tataccagat acagcccgtc cttccaaggc    240
caggtcacca tctcagccga caagtccatc agcaccgcct acctgcagtg gagcagcctg    300
aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt gcgagattcc ccaactgggg ctcatttgac    360
tactggggcc agggaaccct ggtcaccgtc tcctcagcct ccaccaaggg ccca          414
<210>43
<211>354
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic 10G5VH sequence only
<400>43
gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc    60
tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg    120
cccgggaaag gcctggagtg gatgggggtc atctatcctg gtgactctta taccagatac    180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac    240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagattcccc    300
aactggggct catttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca          354
<210>44
<211>138
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic 10G5VH sequence with leader and additional constant
     region
<400>44
Phe Ala Leu Val Pro Gly Leu Phe Leu Gln Gly Val Cys Ala Glu Val
1               5                  10                  15
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu
            20                  25                  30
Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Val
    50                  55                  60
Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly
65                  70                  75                  80
Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
                85                  90                  95
Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
            100                 105                 110
Phe Pro Asn Trp Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
    130                 135
<210>45
<211>118
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic 10G5VH sequence only
<400>45
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Phe Pro Asn Trp Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>46
<211>369
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic 10G5VL sequence with leader and additional constant
     region
<400>46
ttcttcctcc tgctactctg gctcccagat accaccggag aaattgtgtt gacgcagtct    60
ccaggcaccc tgtctttgtc tccaggggaa agagccaccc tctcctgcag ggccagtcag    120
agtattagca gcagctactt agcctggtac cagcagaaac ctggccaggc tcccaggctc    180
ctcatctatg gtgcatccag cagggccact ggcatcccag acaggttcag tggcagtggg    240
tctgggacag acttcactct caccatcagc agactggagc ctgaagattt tgcagtgtat    300
tactgtcagc agtatgagac gttcggccaa gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg    360
gctgcacca                                                            369
<210>47
<211>312
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic 10G5VL sequence only
<400>47
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc    60
ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa    120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca    180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag    240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatgaga cgttcggcca agggaccaag    300
gtggaaatca aa                                                        312
<210>48
<211>123
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic 10G5VL sequence with leader and additional constant
     region
<400>48
Phe Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val
1               5                   10                  15
Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
            20                  25                  30
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
        35                  40                  45
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly
    50                  55                  60
Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly
65                  70                  75                  80
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp
                85                  90                  95
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Thr Phe Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
        115                 120
<210>49
<211>104
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic 10G5VL sequence only
<400>49
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Thr Phe Gly
                85                  90                  95
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100
<210>50
<211>445
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic 10G5-1，3heavy chain
<400>50
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Met Pro Asn Trp Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
            180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
    210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
                245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
            260                 265                 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
        275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
    290                 295                 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305                 310                 315                 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
                325                 330                 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
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Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
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Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
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Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
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Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Ser Phe Gly
                85                  90                  95
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
            100                 105                 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
        115                 120                 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
    130                 135                 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145                 150                 155                 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
                165                 170                 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
            180                 185                 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
        195                 200                 205
Gly Glu Cys
    210
<210>71
<211>104
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1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ala Ser Phe Gly
                85                  90                  95
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100
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<220>
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ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa    120
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cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatgctt cgttcggcca agggaccaag    300
gtggaaatca aacgtacggt ggctgcacca tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag    360
cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga ataacttcta tcccagagag    420
gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc    480
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ctctcctgca gggccagtca gagtattagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa    120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca    180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag    240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatgctt cgttcggcca agggaccaag    300
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<212>PRT
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<220>
<223>Synthetic 10G5-3light chain
<400>74
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Ala Phe Gly
                85                  90                  95
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
            100                 105                 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
        115                 120                 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
    130                 135                 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145                 150                 155                 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
                165                 170                 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
            180                 185                 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
        195                 200                 205
Gly Glu Cys
    210
<210>75
<211>104
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
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1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Ala Phe Gly
                85                  90                  95
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100
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<211>636
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<212>PRT
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<220>
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
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Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Thr Phe Gly
                85                  90                  95
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
            100                 105                 110
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
        115                 120                 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
    130                 135                 140
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
145                 150                 155                 160
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
                165                 170                 175
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
            180                 185                 190
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
        195                 200                 205
Gly Glu Cys
    210
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<211>104
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<220>
<223>Synthetic 10G5-5，8VL
<400>79
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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser
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Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
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Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
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Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Thr Phe Gly
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Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100
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<220>
<223>Synthetic 10G5-5，8VL
<400>81
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc    60
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<212>PRT
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<220>
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<220>
<223>Synthetic 10G5VL CDR1
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<220>
<223>Synthetic pFAB3D-10G5H construct
<400>86
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        35                  40                  45
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    50                  55                  60
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asp Ser
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala
                85                  90                  95
Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala
            100                 105                 110
Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Pro Asn Trp Gly Ser
        115                 120                 125
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
    130                 135                 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
145                 150                 155                 160
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
                165                 170                 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
            180                 185                 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
        195                 200                 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
    210                 215                 220
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225                 230                 235                 240
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Thr
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Ser Gly His His His His His His Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser
            260                 265                 270
Glu Glu Asp Leu Gly Gly Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser
        275                 280                 285
Ser Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly
    290                 295                 300
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser
305                 310                 315                 320
Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser
                325                 330                 335
Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met
            340                 345                 350
Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys
        355                 360                 365
Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile
    370                 375                 380
Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe
385                 390                 395                 400
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Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser
            420                 425                 430
Val Glu Cys Arg Pro Tyr Val Phe Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe
        435                 440                 445
Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe
    450                 455                 460
Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn
465                 470                 475                 480
Ile Leu Arg Asn Lys Glu Ser
                485
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<220>
<223>Synthetic pFAB3D-10G5L construct
<400>87
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Ser Arg Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro
            20                  25                  30
Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
        35                  40                  45
Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
    50                  55                  60
Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala
65                  70                  75                  80
Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                85                  90                  95
Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
Cys Gln Gln Tyr Glu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
        115                 120                 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
    130                 135                 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145                 150                 155                 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
            180                 185                 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
        195                 200                 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
    210                 215                 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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tacaggtgtc cactccgagg tgcagctggt gcagtct                             97
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<220>
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Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
        115                 120                 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
    130                 135                 140
Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145                 150                 155                 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
                165                 170                 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
            180                 185                 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
        195                 200                 205
Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225                 230                 235                 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
                245                 250                 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
            260                 265                 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
        275                 280                 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
    290                 295                 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305                 310                 315                 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325
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<223>Synthetic constant of IGG2M4
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agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg    120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca    180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgacctcca gcaactttgg cacgcagacc    240
tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgg    300
aaatgctgcg tggagtgccc accatgccca gcacctccag tggccggacc atcagtcttc    360
ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc    420
gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc    480
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt    540
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc    600
aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg    660
cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac    720
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg    780
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gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc    960
tccctgtctc ctggtaaa                                                  978
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<223>Synthetic 10G5-6heavy chain IGG2M4
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Met Pro Asn Trp Gly Ser Leu Asp His Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser
            180                 185                 190
Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys
    210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225                 230                 235                 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
                245                 250                 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
            260                 265                 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
        275                 280                 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
    290                 295                 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305                 310                 315                 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
                325                 330                 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
            340                 345                 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
        355                 360                 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
    370                 375                 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385                 390                 395                 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
                405                 410                 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
            420                 425                 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435                 440
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic 10G5-6heavy chain IGG2M4
<400>95
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tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg    120
cccgggaaag gcctggagtg gatgggggtc atctatcctg gtgactctta taccagatac    180
agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac    240
ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gagaatgccc    300
aactggggct cacttgacca ttggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagcctcc    360
accaagggcc catccgtctt ccccctggcg ccctgctcca ggagcacctc cgagagcaca    420
gccgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac    480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc    540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgacc tccagcaact ttggcacgca gacctacacc    600
tgcaacgtag atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agacagttga gcggaaatgc    660
tgcgtggagt gcccaccatg cccagcacct ccagtggccg gaccatcagt cttcctgttc    720
cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg    780
gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag    840
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc    900
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc    960
tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc    1020
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aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctccca tgctggactc cgacggctcc    1200
ttcttcctct acagcaagct aaccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaatgtcttc    1260
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg    1320
tctcctggta aa                                                        1332
<210>96
<211>444
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic 10G5H6heavy chain IGG2M4
<400>96
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Met Pro Asn Trp Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
        115                 120                 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
    130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
                165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser
            180                 185                 190
Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
        195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys
    210                 215                 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225                 230                 235                 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
                245                 250                 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
            260                 265                 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
        275                 280                 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
    290                 295                 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305                 310                 315                 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
                325                 330                 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
            340                 345                 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
        355                 360                 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
    370                 375                 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385                 390                 395                 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
                405                 410                 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
            420                 425                 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435                 440
<210>97
<211>336
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic construct containing Fc domain of IgG1
<400>97
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
1               5                   10                  15
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
            20                  25                  30
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
        35                  40                  45
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
    50                  55                  60
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
                85                  90                  95
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
            100                 105                 110
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
        115                 120                 125
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
    130                 135                 140
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
145                 150                 155                 160
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
                165                 170                 175
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
            180                 185                 190
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
        195                 200                 205
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
    210                 215                 220
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
225                 230                 235                 240
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
                245                 250                 255
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
            260                 265                 270
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
        275                 280                 285
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
    290                 295                 300
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
305                 310                 315                 320
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330                 335
<210>98
<211>332
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic construct containing Fc domain of IgG2
<400>98
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
1               5                   10                  15
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
            20                  25                  30
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
        35                  40                  45
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
    50                  55                  60
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser
65                  70                  75                  80
Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
                85                  90                  95
Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys
            100                 105                 110
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
        115                 120                 125
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
    130                 135                 140
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
145                 150                 155                 160
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
                165                 170                 175
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
            180                 185                 190
Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
        195                 200                 205
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
    210                 215                 220
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
225                 230                 235                 240
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
                245                 250                 255
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
            260                 265                 270
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
        275                 280                 285
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
    290                 295                 300
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
305                 310                 315                 320
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>99
<211>333
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic construct containing Fc domain of IgG4
<400>99
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
1               5                   10                  15
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
            20                  25                  30
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
        35                  40                  45
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
    50                  55                  60
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
65                  70                  75                  80
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
                85                  90                  95
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
        115                 120                 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
    130                 135                 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
145                 150                 155                 160
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
                165                 170                 175
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
            180                 185                 190
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
        195                 200                 205
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
    210                 215                 220
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
225                 230                 235                 240
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
                245                 250                 255
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
            260                 265                 270
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
        275                 280                 285
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
    290                 295                 300
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
305                 310                 315                 320
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
                325                 330
<210>100
<211>332
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic construct containing Fc domain of IgG2m4
<400>100
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
1               5                   10                  15
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
            20                  25                  30
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
        35                  40                  45
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
    50                  55                  60
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser
65                  70                  75                  80
Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
                85                  90                  95
Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys
            100                 105                 110
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
        115                 120                 125
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
    130                 135                 140
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
145                 150                 155                 160
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
                165                 170                 175
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr
            180                 185                 190
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
        195                 200                 205
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
    210                 215                 220
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
225                 230                 235                 240
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
                245                 250                 255
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
            260                 265                 270
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser
        275                 280                 285
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
    290                 295                 300
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
305                 310                 315                 320
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>101
<211>401
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>101
Ala Pro Thr Glu Thr Gln Pro Pro Val Thr Asn Leu Ser Val Ser Val
1               5                   10                  15
Glu Asn Leu Cys Thr Val Ile Trp Thr Trp Asn Pro Pro Glu Gly Ala
            20                  25                  30
Ser Ser Asn Cys Ser Leu Trp Tyr Phe Ser His Phe Gly Asp Lys Gln
        35                  40                  45
Asp Lys Lys Ile Ala Pro Glu Thr Arg Arg Ser Ile Glu Val Pro Leu
    50                  55                  60
Asn Glu Arg Ile Cys Leu Gln Val Gly Ser Gln Cys Ser Thr Asn Glu
65                  70                  75                  80
Ser Glu Lys Pro Ser Ile Leu Val Glu Lys Cys Ile Ser Pro Pro Glu
                85                  90                  95
Gly Asp Pro Glu Ser Ala Val Thr Glu Leu Gln Cys Ile Trp His Asn
            100                 105                 110
Leu Ser Tyr Met Lys Cys Ser Trp Leu Pro Gly Arg Asn Thr Ser Pro
        115                 120                 125
Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp His Arg Ser Leu Glu Lys Ile
    130                 135                 140
His Gln Cys Glu Asn Ile Phe Arg Glu Gly Gln Tyr Phe Gly Cys Ser
145                 150                 155                 160
Phe Asp Leu Thr Lys Val Lys Asp Ser Ser Phe Glu Gln His Ser Val
                165                 170                 175
Gln Ile Met Val Lys Asp Asn Ala Gly Lys Ile Lys Pro Ser Phe Asn
            180                 185                 190
Ile Val Pro Leu Thr Ser Arg Val Lys Pro Asp Pro Pro His Ile Lys
        195                 200                 205
Asn Leu Ser Phe His Asn Asp Asp Leu Tyr Val Gln Trp Glu Asn Pro
    210                 215                 220
Gln Asn Phe Ile Ser Arg Cys Leu Phe Tyr Glu Val Glu Val Asn Asn
225                 230                 235                 240
Ser Gln Thr Glu Thr His Asn Val Phe Tyr Val Gln Glu Ala Lys Cys
                245                 250                 255
Glu Asn Pro Glu Phe Glu Arg Asn Val Glu Asn Thr Ser Cys Phe Met
            260                 265                 270
Val Pro Gly Val Leu Pro Asp Thr Leu Asn Thr Val Arg Ile Arg Val
        275                 280                 285
Lys Thr Asn Lys Leu Cys Tyr Glu Asp Asp Lys Leu Trp Ser Asn Trp
    290                 295                 300
Ser Gln Glu Met Ser Ile Gly Lys Lys Arg Asn Ser Thr Leu Tyr Ile
305                 310                 315                 320
Thr Met Leu Leu Ile Val Pro Val Ile Val Ala Gly Ala Ile Ile Val
                325                 330                 335
Leu Leu Leu Tyr Leu Lys Arg Leu Lys Ile Ile Ile Phe Pro Pro Ile
            340                 345                 350
Pro Asp Pro Gly Lys Ile Phe Lys Glu Met Phe Gly Asp Gln Asn Asp
        355                 360                 365
Asp Thr Leu His Trp Lys Lys Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Gln Thr Lys
    370                 375                 380
Glu Glu Thr Asp Ser Val Val Leu Ile Glu Asn Leu Lys Lys Ala Ser
385                 390                 395                 400
Gln
<210>102
<211>17
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic 10G5VH CDR2
<400>102
Val Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>103
<211>324
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>103
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Glu Ser Arg Thr Glu Thr Gln Pro Pro Val
1               5                   10                  15
Thr Asn Leu Ser Val Ser Val Glu Asn Leu Cys Thr Val Ile Trp Thr
            20                  25                  30
Trp Asn Pro Pro Glu Gly Ala Ser Ser Asn Cys Ser Leu Trp Tyr Phe
        35                  40                  45
Ser His Phe Gly Asp Lys Gln Asp Lys Lys Ile Ala Pro Glu Thr Arg
    50                  55                  60
Arg Ser Ile Glu Val Pro Leu Asn Glu Arg Ile Cys Leu Gln Val Gly
65                  70                  75                  80
Ser Gln Cys Ser Thr Asn Glu Ser Glu Lys Pro Ser Ile Leu Val Glu
                85                  90                  95
Lys Cys Ile Ser Pro Pro Glu Gly Asp Pro Glu Ser Ala Val Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Gln Cys Ile Trp His Asn Leu Ser Tyr Met Lys Cys Ser Trp Leu
        115                 120                 125
Pro Gly Arg Asn Thr Ser Pro Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp
    130                 135                 140
His Arg Ser Leu Glu Lys Ile His Gln Cys Glu Asn Ile Phe Arg Glu
145                 150                 155                 160
Gly Gln Tyr Phe Gly Cys Ser Phe Asp Leu Thr Lys Val Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Ser Phe Glu Gln His Ser Val Gln Ile Met Val Lys Asp Asn Ala Gly
            180                 185                 190
Lys Ile Lys Pro Ser Phe Asn Ile Val Pro Leu Thr Ser Arg Val Lys
        195                 200                 205
Pro Asp Pro Pro His Ile Lys Asn Leu Ser Phe His Asn Asp Asp Leu
    210                 215                 220
Tyr Val Gln Trp Glu Asn Pro Gln Asn Phe Ile Ser Arg Cys Leu Phe
225                 230                 235                 240
Tyr Glu Val Glu Val Asn Asn Ser Gln Thr Glu Thr His Asn Val Phe
                245                 250                 255
Tyr Val Gln Glu Ala Lys Cys Glu Asn Pro Glu Phe Glu Arg Asn Val
            260                 265                 270
Glu Asn Thr Ser Cys Phe Met Val Pro Gly Val Leu Pro Asp Thr Leu
        275                 280                 285
Asn Thr Val Arg Ile Arg Val Lys Thr Asn Lys Leu Cys Tyr Glu Asp
    290                 295                 300
Asp Lys Leu Trp Ser Asn Trp Ser Gln Glu Met Ser Ile Gly Lys Lys
305                 310                 315                 320
Arg Asn Ser Thr
<210>104
<211>401
<212>PRT
<213>Macaca fascicularis
<400>104
Ala Pro Thr Glu Thr Gln Pro Pro Val Thr Asn Leu Ser Val Ser Val
1               5                   10                  15
Glu Asn Leu Cys Thr Val Ile Trp Thr Trp Asn Pro Pro Glu Gly Ala
            20                  25                  30
Ser Pro Asn Cys Ser Leu Trp Tyr Phe Ser His Phe Gly Asp Lys Gln
        35                  40                  45
Asp Lys Lys Leu Ala Pro Glu Thr Arg Arg Ser Lys Glu Val Pro Leu
    50                  55                  60
Asn Glu Lys Ile Cys Leu Gln Val Gly Ser Gln Cys Ser Thr Asn Glu
65                  70                  75                  80
Ser Glu Lys Pro Ser Ile Leu Val Glu Lys Cys Ile Ser Pro Pro Glu
                85                  90                  95
Gly Asp Pro Glu Ser Ala Val Thr Glu Leu Gln Cys Ile Trp His Asn
            100                 105                 110
Leu Ser Tyr Met Gln Cys Ser Trp Leu Pro Gly Arg Asn Thr Ser Pro
        115                 120                 125
Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp His Arg Ser Leu Glu Lys Ile
    130                 135                 140
Arg Gln Cys Glu Glu Ile Tyr Lys Glu Gly Gln Tyr Phe Gly Cys Ser
145                 150                 155                 160
Phe Asp Leu Thr Lys Val Lys Asp Ser Ser Phe Glu Gln His Ser Val
                165                 170                 175
Gln Ile Met Val Lys Asp Tyr Ala Gly Lys Ile Lys Pro Ser Phe Asn
            180                 185                 190
Ile Val Pro Leu Thr Ser Arg Val Lys Pro Asp Pro Pro His Ile Lys
        195                 200                 205
Asn Leu Ser Phe His Asn Gly Asp Leu His Val Gln Trp Glu Asn Pro
    210                 215                 220
Gln Asn Phe Ile Ser Arg Cys Leu Phe Tyr Glu Val Glu Val Asn Asn
225                 230                 235                 240
Ser Gln Thr Glu Thr His Asn Val Phe Ser Val Gln Glu Ala Lys Cys
                245                 250                 255
Gln Asn Pro Glu Phe Glu Arg Asn Val Glu Asn Thr Ser Cys Phe Met
            260                 265                 270
Val Pro Gly Val Leu Pro Asp Thr Leu Asn Thr Val Arg Ile Arg Val
        275                 280                 285
Lys Thr Asn Lys Leu Cys Tyr Glu Asp Asp Lys Leu Trp Ser Asn Trp
    290                 295                 300
Ser Gln Glu Met Ser Ile Gly Lys Lys Arg Asn Ser Thr Leu Tyr Ile
305                 310                 315                 320
Thr Met Leu Leu Ile Val Pro Val Ile Val Ala Gly Ala Ile Ile Val
                325                 330                 335
Leu Leu Leu Tyr Leu Lys Arg Leu Lys Ile Ile Ile Phe Pro Pro Ile
            340                 345                 350
Pro Asp Pro Gly Lys Ile Phe Lys Glu Met Phe Gly Asp Gln Asn Asp
        355                 360                 365
Asp Thr Leu His Trp Lys Lys Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Gln Thr Lys
    370                 375                 380
Glu Glu Thr Asp Ser Val Val Leu Ile Glu Asn Leu Lys Lys Ala Ser
385                 390                 395                 400
Gln
<210>105
<211>398
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>105
Thr Glu Val Gln Pro Pro Val Thr Asn Leu Ser Val Ser Val Glu Asn
1               5                   10                  15
Leu Cys Thr Ile Ile Trp Thr Trp Ser Pro Pro Glu Gly Ala Ser Pro
            20                  25                  30
Asn Cys Thr Leu Arg Tyr Phe Ser His Phe Asp Asp Gln Gln Asp Lys
        35                  40                  45
Lys Ile Ala Pro Glu Thr His Arg Lys Glu Glu Leu Pro Leu Asp Glu
    50                  55                  60
Lys Ile Cys Leu Gln Val Gly Ser Gln Cys Ser Ala Asn Glu Ser Glu
65                  70                  75                  80
Lys Pro Ser Pro Leu Val Lys Lys Cys Ile Ser Pro Pro Glu Gly Asp
                85                  90                  95
Pro Glu Ser Ala Val Thr Glu Leu Lys Cys Ile Trp His Asn Leu Ser
            100                 105                 110
Tyr Met Lys Cys Ser Trp Leu Pro Gly Arg Asn Thr Ser Pro Asp Thr
        115                 120                 125
His Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Tyr Ser Ser Leu Glu Lys Ser Arg Gln
    130                 135                 140
Cys Glu Asn Ile Tyr Arg Glu Gly Gln His Ile Ala Cys Ser Phe Lys
145                 150                 155                 160
Leu Thr Lys Val Glu Pro Ser Phe Glu His Gln Asn Val Gln Ile Met
                165                 170                 175
Val Lys Asp Asn Ala Gly Lys Ile Arg Pro Ser Cys Lys Ile Val Ser
            180                 185                 190
Leu Thr Ser Tyr Val Lys Pro Asp Pro Pro His Ile Lys His Leu Leu
        195                 200                 205
Leu Lys Asn Gly Ala Leu Leu Val Gln Trp Lys Asn Pro Gln Asn Phe
    210                 215                 220
Arg Ser Arg Cys Leu Thr Tyr Glu Val Glu Val Asn Asn Thr Gln Thr
225                 230                 235                 240
Asp Arg His Asn Ile Leu Glu Val Glu Glu Asp Lys Cys Gln Asn Ser
                245                 250                 255
Glu Ser Asp Arg Asn Met Glu Gly Thr Ser Cys Phe Gln Leu Pro Gly
            260                 265                 270
Val Leu Ala Asp Ala Val Tyr Thr Val Arg Val Arg Val Lys Thr Asn
        275                 280                 285
Lys Leu Cys Phe Asp Asp Asn Lys Leu Trp Ser Asp Trp Ser Glu Ala
    290                 295                 300
Gln Ser Ile Gly Lys Glu Gln Asn Ser Thr Phe Tyr Thr Thr Met Leu
305                 310                 315                 320
Leu Thr Ile Pro Val Phe Val Ala Val Ala Val Ile Ile Leu Leu Phe
                325                 330                 335
Tyr Leu Lys Arg Leu Lys Ile Ile Ile Phe Pro Pro Ile Pro Asp Pro
           340                 345                 350
Gly Lys Ile Phe Lys Glu Met Phe Gly Asp Gln Asn Asp Asp Thr Leu
        355                 360                 365
His Trp Lys Lys Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Gln Ser Lys Glu Glu Thr
    370                 375                 380
Asp Ser Val Val Leu Ile Glu Asn Leu Lys Lys Ala Ala Pro
385                 390                 395
<210>106
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic VH CDR1
<400>106
ggatacagct ttaccagcta ctggatcggc                                     30
<210>107
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic VH CDR2
<400>107
gtcatctatc ctggtgactc ttataccaga                                     30
<210>108
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic VH CDR3
<400>108
ttccccaact ggggctcatt tgactac                                        27
<210>109
<211>35
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic VL CDR1
<400>109
agggccagtc agagattagc agcagctact tagcc                               35
<210>110
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic VL CDR2
<400>110
ggtgcatcca gcagggccac t                                              21
<210>111
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic VL CDR3
<400>111
cagcagtatg agacg                                                     15
<210>112
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic 10G5-6VH CDR3
<400>112
atgcccaact ggggctcact tgaccat                                        27
<210>113
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic VL CDR3
<400>113
cagcagtatg cttcg                                                     15
<210>114
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic PCR primer
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(19)
<223>Y denotes C or T
<400>114
ggggtcaacc gccatcctyg                                                20
<210>115
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic PCR primer
<400>115
gtctccttcc  tcatcttcct gccc                                          24
<210>116
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic PCR primer
<400>116
cccatcggtc ttccccctgg cac                                            23
<210>117
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic PCR primer
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>Y denotes C or T
<400>117
ytcttcctcc tgctactctg gctc                                           24
<210>118
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic PCR primer
<400>118
atggtgttgc agacccaggt cttc                                           24
<210>119
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic PCR primer
<400>119
gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gc                                  32
<210>120
<211>401
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic IL-13alpha receptor 1polypeptide
<400>120
Ala Pro Thr Glu Thr Gln Pro Pro Val Thr Asn Leu Ser Val Ser Val
1               5                   10                  15
Glu Asn Leu Cys Thr Val Ile Trp Thr Trp Asn Pro Pro Glu Gly Ala
            20                  25                  30
Ser Ser Asn Cys Ser Leu Trp Tyr Phe Ser His Phe Gly Asp Lys Gln
        35                  40                  45
Asp Lys Lys Ile Ala Pro Glu Thr Arg Arg Ser Ile Glu Val Pro Leu
    50                  55                  60
Asn Glu Arg Ile Cys Leu Gln Val Gly Ser Gln Cys Ser Thr Asn Glu
65                  70                  75                  80
Ser Glu Lys Pro Ser Ile Leu Val Glu Lys Cys Ile Ser Pro Pro Glu
                85                  90                  95
Gly Asp Pro Glu Ser Ala Val Thr Glu Leu Gln Cys Ile Trp His Asn
            100                 105                 110
Leu Ser Tyr Met Lys Cys Ser Trp Leu Pro Gly Arg Asn Thr Ser Pro
        115                 120                 125
Asp Thr Asn Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp His Arg Ser Leu Glu LysIle
    130                 135                 140
His Gln Cys Glu Asn Ile Phe Arg Glu Gly Gln Tyr Phe Gly Cys Ser
145                 150                 155                 160
Phe Asp Leu Thr Lys Val Lys Asp Ser Ser Phe Glu Gln His Ser Val
                165                 170                 175
Gln Ile Met Val Lys Asp Asn Ala Gly Lys Ile Lys Pro Ser Phe Asn
            180                 185                 190
Ile Val Pro Leu Thr Ser Arg Val Lys Pro Asp Pro Pro His Ile Lys
        195                 200                 205
Asn Leu Ser Phe His Asn Asp Asp Leu Tyr Val Gln Trp Glu Asn Pro
    210                 215                 220
Gln Asn Phe Ile Ser Arg Cys Leu Ala Tyr Glu Val Glu Val Asn Asn
225                 230                 235                 240
Ser Gln Thr Glu Thr His Asn Val Phe Tyr Val Gln Glu Ala Lys Cys
                245                 250                 255
Glu Asn Pro Glu Phe Glu Arg Asn Val Glu Asn Thr Ser Cys Phe Met
            260                 265                 270
Val Pro Gly Val Leu Pro Asp Thr Leu Asn Thr Val Arg Ile Arg Val
        275                 280                 285
Lys Thr Asn Lys Leu Cys Tyr Glu Asp Asp Lys Leu Trp Ser Asn Trp
    290                 295                 300
Ser Gln Glu Met Ser Ile Gly Lys Lys Arg Asn Ser Thr Leu Tyr Ile
305                 310                 315                 320
Thr Met Leu Leu Ile Val Pro Val Ile Val Ala Gly Ala Ile Ile Val
                325                 330                 335
Leu Leu Leu Tyr Leu Lys Arg Leu Lys Ile Ile Ile Phe Pro Pro Ile
            340                 345                 350
Pro Asp Pro Gly Lys Ile Phe Lys Glu Met Phe Gly Asp Gln Asn Asp
        355                 360                 365
Asp Thr Leu His Trp Lys Lys Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Gln Thr Lys
    370                 375                 380
Glu Glu Thr Asp Ser Val Val Leu Ile Glu Asn Leu Lys Lys Ala Ser
385                 390                 395                 400
Gln
<210>121
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic VH CDR3
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>Xaa denotes Phe，Met，Gln，Leu or Val
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa denotes Ser or Ala
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>Xaa denotes Phe，Leu，Ala or Met
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>Xaa denotes Tyr，Gln，Lys，Arg，Trp，Hi s，Ala，Thr，Ser，Asn or
     Gly
<400>121
Xaa Pro Asn Trp Gly Xaa Xaa Asp Xaa
1               5
<210>122
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic VL CDR3
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa denotes Gln，Arg，Met，Ser，Thr or Val.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>Xaa denotes Tyr or Val.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa denotes Glu，Ala，Gly or Ser.
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>Xaa denotes Thr，Ala or Ser.
<400>122
Gln Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5
<210>123
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic VL CDR1
<400>123
agggccagtc agagtattag cagcagctac ttagcc                              36

Claims (18)

1.与人类白介素13受体α1结合的分离的抗体，其中
(a)所述抗体的重链可变区包含分别在SEQ ID NO：82，SEQ IDNO：83和SEQ ID NO：121中所示的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列；并且
(b)所述抗体的轻链可变区包含分别在SEQ ID NO：84，SEQ IDNO：85和SEQ ID NO：122中所示的CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列。
2.权利要求1的分离的抗体，还包含SEQ ID NO：92中所示的重链恒定区。
3.包含权利要求2的抗体和可药用载体的组合物。
4.与人类白介素13受体α1结合的分离的抗体，包含
(a)具有选自SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：67的氨基酸序列的重链可变区；
(b)具有选自SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：79的氨基酸序列的轻链可变区；或
(c)(a)和(b)的组合。
5.权利要求4的分离的抗体，其中所述抗体由保藏为ATCC保藏号PTA-6933的杂交瘤细胞系产生。
6.权利要求4的分离的抗体，还包含SEQ ID NO：92中所示的重链恒定区。
7.权利要求6的分离的抗体，其中重链可变区具有SEQ ID NO：63中所示的氨基酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO：71中所示的氨基酸序列。
8.包含权利要求6的抗体和可药用载体的组合物。
9.表现出与人类白介素13受体α1小于200pM的平衡解离常数(KD)并拮抗人类白介素13受体α1介导的活性的分离的抗体，其中
(a)所述抗体的重链可变区包含SEQ ID NO：63中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：63中所示的序列至少90％同源的序列；并且
(b)所述抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO：71中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：71中所示的序列至少90％同源的序列。
10.权利要求9的分离的抗体，其进一步的特征在于抗体与具有SEQ ID NO：120中所示的氨基酸序列的多肽的结合，和其与具有SEQID NO：101中所示的氨基酸序列的多肽的结合相比，表现出显著的降低。
11.权利要求9的分离的抗体，还包含SEQ ID NO：92中所示的重链恒定区。
12.包含权利要求11的抗体和可药用载体的组合物。
13.缓解由白介素13受体α1介导的活性引起或加剧的病症的方法，包括给需要治疗的对象施用有效量的权利要求2的组合物，由此缓解由白介素13受体α1介导的活性引起或加剧的病症。
14.权利要求13的方法，其中病症是哮喘、过敏、过敏性鼻炎、慢性鼻窦炎、花粉热、特异反应性皮炎、慢性阻塞性肺病、肺纤维变性、食管嗜曙红细胞增多症、硬皮病、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、纤维变性、炎症性肠病、溃疡性结肠炎、过敏性反应或癌症。
15.权利要求14的方法，其中癌症是霍奇金氏淋巴瘤、神经胶质瘤或肾癌。
16.编码与人类白介素13受体α1结合的抗体的可变区的分离的核酸，其中可变区包含
a)具有选自SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：67的氨基酸序列的重链可变区；或
b)具有选自SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：75和SEQ ID NO：79的氨基酸序列的轻链可变区。
17.包含权利要求16的核酸的载体。
18.包含权利要求17的载体的分离的宿主细胞。
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