可溶性VEGFR双功能融合受体、其制备方法及用途
技术领域
本发明属于生物技术领域,更具体地,本发明公开了一类双功能融合受体、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病,在各种疾病所致死亡中高居第二位。而且近年来,其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差,晚期转移率高,预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛,延长了生存时间,但这些方法均存在很大的局限性,其疗效难以进一步提高。
肿瘤的生长有两个明显不同的阶段,即从无血管的缓慢生长期转为有血管的快速增殖期,血管的生成使肿瘤能获得足够的营养而完成血管切换期,如果没有血管的生成,原发肿瘤的生长不超过1~2mm,转移则无法实现。血管内皮生长因子(VEGF)是一类能促进内皮细胞***增殖、促进新生血管的形成、提高血管通透性的生长因子,它与细胞表面的血管内皮生长因子受体结合,通过激活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能。在肿瘤组织中,肿瘤细胞、肿瘤侵入的巨噬细胞和肥大细胞能分泌高水平的VEGF,以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细胞,促进内皮细胞增殖、迁移,诱导血管形成,促进肿瘤持续生长,并提高血管通透性,引起周围组织纤维蛋白沉着,促进单核细胞、成纤维细胞内皮细胞侵润,有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管,促进肿瘤转移,因而抑制肿瘤血管生成被认为是当前最具有前途的肿瘤治疗方法之一。Genentech公司的抗癌新药Avastin(抗VEGF人源化抗体)已于2004年2月获得美国FDA批准上市,用于一线治疗转移性结直肠癌,并有望用于其它肿瘤,包括非小细胞肺癌和肾癌的治疗。此外,用可溶性受体阻断VEGF和VEGFR的传导途径也被证明是一种行之有效的方法。VEGF家族包括VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及PIGF(胎盘生长因子),它们之间的氨基酸序列高度同源,都与同型的酪氨酸激酶受体结合。血管内皮生长因子受体(VEGFR)属于酪氨酸激酶受体超家族,它们有相似的结构,均由胞外区、跨膜区、胞内区组成。目前发现的VEGFR主要有3种:VEGFR1(Flt-1),VEGFR2(KDR),VEGFR3。与VEGFR1结合的主要是VEGF、VEGF-B,与VEGFR2结合的主要是VEGF、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E,与VEGFR3结合的主要是VEGF-C、VEGF-D。VEGFR1和VEGFR2主要位于肿瘤血管内皮细胞表面,VEGFR1主要介导细胞骨架重排及引起细胞迁移,VEGF对内皮细胞的增殖、分化由VEGFR2介导。VEGFR3特异表达在淋巴内皮细胞中,在动脉、静脉、毛细血管内皮中基本没有表达。VEGF-C和VEGF-D可通过VEGF-C/VEGF-D/VEGFR3信号***发挥作用,从而导致肿瘤***的增生和***的转移[Neufeld G等,FASEB J,1999,13:9-22]。Regeneron制药公司将VEGFR1膜外区与抗体Fc进行融合,制备了VEGFR-Fc融合蛋白,它能与血管内皮细胞表面的VEGFR竞争性结合VEGF和VEGF-B,从而抑制VEGF和VEGF-B的生物活性,阻断新生血管的形成,实验结果表明VEGFR1-Fc具有比Avastin更强的抗肿瘤作用[Wulff C等,J ClinEndocrinol Metab.2001,86(7):3377-86.Holash J等,PNAS 2002,17:11393-11398]。但是,无论是Avastin还是VEGFR1-Fc都是通过阻断VEGF或/和VEGF-B所诱导的生物学功能,即抑制肿瘤的血管生成来发挥抗肿瘤作用。它们均不能与VEGF-C或VEGF-D相结合,而VEGF-C和VEGF-D可诱导肿瘤内***生成,进而促进肿瘤***转移,所以它们不能抑制肿瘤***转移。
因此,研究出既能与血管内皮细胞表面的VEGFR竞争性结合VEGF和VEGF-B,还能与VEGF-C或VEGF-D相结合,从而不仅抑制VEGF和VEGF-B的生物活性,阻断新生血管的形成,还能阻断VEGF-C和VEGF-D对肿瘤内***生成的诱导,防止肿瘤***转移的高效抗肿瘤药物一直是本领域的技术人员急待解决的问题。
发明内容
本发明公开了:
1.一种可溶性双功能VEGFR融合受体,为包含VEGFR1和VEGFR3在内的融合蛋白,既能与VEGF和VEGF-B结合,还能与VEGF-C或VEGF-D相结合。
2.上述1所述的可溶性双功能VEGFR融合受体,为VEGFRIg,其轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:8所示,重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:10所示的。
3.上述2所述的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFRIg的突变体,为VEGFRIgM,其轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:14所示,重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:10所示。
4.上述1所述的可溶性双功能VEGFR融合受体,为VEGFRFc,其特征在于有两个相同的多肽链通过二硫键结合,其中多肽链的氨基酸序列为SEQ ID NO:12所示。
5.一种分离的核酸分子,编码上述1-4任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体。
6.一种分离的核酸分子,编码上述2所述的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFRIg,其中编码轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:7,编码重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:9。
7.一种分离的核酸分子,编码上述3所述的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFRIg的突变体VEGFRIgM,其中编码轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO:13,编码重链的核苷酸序列为SEQ ID NO:9。
8.一种分离的核酸分子,编码上述4所述的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFRFc中的多肽链,具有SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。
9.一种载体,含有上述5、6、7、8任一所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列,其中载体可以为pDR1,pcDNA3.1(+),pcDNA3.1/ZEO(+),pDHFR之一。
10.上述9所述的载体,为pcDNA3.1(+)或pcDNA3.1/ZEO(+)。
11.一种宿主细胞,含有上述9所述的载体,为真核细胞。
12.上述11所述的宿主细胞,为哺乳动物细胞。
13.上述12所述的宿主细胞,为CHO细胞。
14.一种制备上述1-4任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体的方法,该方法包括:
a)在表达条件下,培养上述11-13任一所述的宿主细胞,表达双功能融合受体,
b)分离或纯化所述的双功能融合受体。
15.一种组合物,含有上述1-4任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体和药学上可接受的载体。
16.上述1-4任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体在制备抗肿瘤药物中的用途。
17.上述15所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。
18.上述16、17任一所述的用途,还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。
任何编码VEGFR1和VEGFR3的合适的DNA都适合于本发明,这样的结构包括从RT-PCR激活的淋巴细胞mRNA中分离得到的VEGFR 1,从根据embl|AR860556|AR860556中序列全基因合成的VEGFR 3,或从其他cDNA文库中获得的。
本发明中,任何合适的载体都可以使用,可以为pDR1(如图1),pCDNA3.1,pDHFF之一,表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。
哺乳动物或昆虫宿主细胞培养***可用于本发明的融合蛋白的表达,COS,CHO,NS0,sf9及sf21等均可适用于本发明。
可用的宿主细胞为含有上述载体的原核细胞,可以为DH5a,BL21(DE3),TG1之一。
本发明中公开的VEGFR双功能融合受体的制备方法为在表达条件下,培养上述的宿主细胞,从而表达双功能融合受体,分离或纯化所述的双功能融合受体。
利用上述方法,可以将融合蛋白纯化为基本均一的物质,例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。
可以利用亲和层析的方法对本发明公开的融合蛋白进行分离纯化,根据所利用的亲和柱的特性,可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。
在本发明的一个实施例中,本发明公开的上述可溶性双功能VECFR融合受体蛋白VEGFRIg是通过以下方法得到的:VEGFR1基因是通过RT-PCR激活的淋巴细胞mRNA中分离得到的,VEGFR 3基因根据embl|AR860556|AR860556中序列全基因合成,VEGFR 1基因信号肽和Ig 2-3区与轻链恒定区(k constant region)基因连接,并且被克隆到pDR1载体的HinDI11和EcoRI酶切位点之间,VEGFR3基因信号肽和Ig 1-2区与重链恒定区(I gG1 constant region)基因连接,同样被亚克隆到另一pDR载体的HinDI11和EcoRI酶切位点之间。上述质粒一起用脂质体法转染CHO-K1细胞,并用含600μg/ml G418和250μg/ml Zeocin的选择培养基筛选稳定表达可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFRIg的细胞克隆.利用Protein A柱通过亲和层析从细胞培养物的上清中纯化可溶性双功能VEGFR融合受体蛋白VEGFRIg。
在本发明的另一个实施例中,公开了上述可溶性双功能VECFR融合受体蛋白VEGFRFc的制备方法,为将上述获得的VEGFR3基因信号肽和Ig 1-2区与VEGFR 1基因I g 2-3区用overlapPCR的方法连接,再将获得的融合基因的3’端与人抗体Fc基因(SEQ ID NO:5)相连,并且被克隆到pDR1载体的HindIII和EcoRI酶切位点之间。上述质粒用脂质体法转染CHO-K1细胞,并用含600μg/ml G418的选择培养基筛选稳定表达可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFRFc的细胞克隆.利用Protein A柱通过亲和层析从细胞培养物的上清中纯化可溶性双功能VEGFR融合受体蛋白VEGFRFc。
发明的申请人对上述的可溶性双功能VECFR融合受体进亲和力检测、抑制HUVEC细胞增殖、体内抑瘤和抑制肿瘤转移等实验,实验结果表明,本发明公开的可溶性双功能VEGFR融合受体可以与VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D结合,同时具有可溶性VEGFR1和VEGFR3的功能,可以结合VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D四种血管内皮生长因子,阻断其信号传导通路。一方面,它能够能阻断血管内皮细胞的活化,增值,分化和迁移,既阻断肿瘤中新生血管的形成、减少肿瘤的供血和供氧,限制肿瘤的生长,又能降低血管通透性,减少肿瘤通过血管发生转移的机会。另一方面,它能够阻断淋巴内皮细胞的激活,阻断肿瘤中新生***的形成,阻止肿瘤细胞顺***转移的功能。这样,就几乎全部阻断VEGF/VEGFR传导途径,阻断肿瘤中内皮细胞***增殖、抑制新生血管的形成、降低血管通透性、减少肿瘤的供血和供氧,同时也可阻断肿瘤内***生成,抑制肿瘤的***转移,产生更强的抗肿瘤治疗疗效。此外,这个双功能融合受体VEGFR1/VEGFR3-Fc将具有比VEGFR1-Fc和VEGFR3-Fc更大的分子量,因而其半衰期将明显延长,实验表明,在相等剂量下,双功能融合受体具有比联合应用VEGFR1-Fc和VEGFR3-Fc更好的抗肿瘤治疗效果。
本发明公开上述可溶性双功能VECFR融合受体蛋白,可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效,这些制剂可以保证本发明公开的融合受体蛋白氨基酸核心序列的构像完整性,同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常情况下,对于液体制剂,通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年,对于冻干制剂,在30℃至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂,优选水针或冻干制剂,对于本发明公开的上述可溶性双功能VECFR融合受体蛋白的水针或冻干制剂,药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合,其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80);poloxamer(如poloxamer188);Triton;十二烷基硫酸钠(SDS);月桂硫酸钠;十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸;Pluronics;MONAQUATTM等,其加入量应使双功能VECFR融合受体蛋白的颗粒化趋势最小,溶液稳定剂可以为糖类,包括还原性糖和非还原性糖,氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸,醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合,溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态,等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一,缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。
上述制剂为包含双功能VECFR融合受体蛋白的组合物,在对包括人在内的动物给药后,抗肿瘤效果明显。具体来讲,对肿瘤的预防和/或治疗有效,可以作为抗肿瘤药物使用。
本发明所指的肿瘤,包括腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤,肿瘤组织的来源包括但不限于肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、***、***、皮肤、唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫。除了上述的肿瘤外,还可用于中枢神经***的肿瘤如胶质细胞多样性瘤、星细胞瘤等,此外眼部的肿瘤包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等,还包括内分泌腺肿瘤、神经内分泌***肿瘤、胃肠道胰腺内分泌***肿瘤,生殖***肿瘤及头颈部肿瘤等。这里不再一一列举。
本发明所称的抗肿瘤药物,指具有抑制和/或***的药物,可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低,它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现,还也减少或防止转移。
本发明中双功能VECFR融合受体蛋白及其组合物在对包括人在内的动物给药时,给药剂量因病人的年龄和体重,疾病特性和严重性,以及给药途径而异,可以参考动物实验的结果和种种情况,总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1~1800mg/天。
本发明公开的双功能VECFR融合受体蛋白及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药,用于肿瘤的治疗,这些抗肿瘤药包括1、细胞毒类药物(1)作用于DNA化学结构的药物:烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类;铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等;丝裂霉素(MMC);(2)影响核酸合成的药物:二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等;胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT-207、卡培他滨)等;嘌呤核苷合成酶抑制剂如6-巯基嘌呤(6-MP)和6-TG等;核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等;DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等;(3)作用于核酸转录的药物:选择性作用于DNA模板,抑制DNA依赖RNA聚合酶,从而抑制RNA合成的药物如:放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等;(4)主要作用于微管蛋白合成的药物:紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱;(5)其他细胞毒药:门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成;2、激素类抗***:三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等;芳香化酶抑制剂:氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等;抗雄激素:氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂:诺雷德、依那通等;3、生物反应调节剂:主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素;白细胞介素-2;胸腺肽类;4、单克隆抗体:美罗华(MabThera);Cetuximab(C225);赫赛汀(Trastuzumab)Bevacizumab(Avastin);5、其他括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物;细胞分化诱导剂如维甲类;细胞凋亡诱导剂。本发明公开的双功能VECFR融合受体蛋白及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。
附图说明
图1 pDR1表达载体结构示意图,hCMV表示人巨细胞病毒Major Immediate早期启动子;BGH pA表示Bovine growth hormone多腺苷化信号;SV40 ori表示SV40病毒早期复制起点;DHFR表示二氢叶酸还原酶基因;pUC origin为质粒复制起点;AMP为氨苄青霉素抗性基因;
图2.VEGFRIg-L基因结构示意图;
图3.VEGFRIg-H基因结构示意图;
图4 VEGFRIg双功能融合受体结构示意图;
图5.VEGFRFc基因结构示意图;
图6 VEGFRFc双功能融合受体结构示意图;
图7.双功能融合受体与VEGF-A结合力实验;
图8.双功能融合受体与VEGF-C结合力实验;
图9.双功能融合受体与VEGF-A的竞争抑制曲线;
图10.双功能融合受体与VEGF-C的竞争抑制曲线;
图11.双功能融合受体抑制VEGF-A引起的HUVEC细胞增殖活性实验
图12.双功能融合受体抑制VEGF-C引起的HUVEC细胞增殖活性实验
图13.双功能融合受体体内血药浓度时间曲线
图14.可溶性双功能VEGFR融合受体体内抑制肿瘤生长曲线
具体实施方式
以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明,不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述,如那些用于构建载体和质拉的方法,将编码蛋白的基因***到这样的载体和质拉的方法或将质粒引入宿主细胞的方法.这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的,并且在许多出版物中都有所描述,包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd edition,Cold spring Harbor Laboratory Press.
实施例1.人抗体轻、重链恒定区和Fc区基因的克隆
用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞,用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA,根据文献(Cell,1980,22:197-207)和文献(Nucleic AcidsResearch,1982,10:4071-4079)报道的序列分别设计引物扩增抗体重链和轻链恒定区基因,并用引物FC有义:GAAGCTTAATAATGGCCCGGGCGAGCCCAAATCTTGTGAC和FC反义:CGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGG扩增抗体Fc区。PCR反应均采用热启动,反应条件:94℃分钟;94℃ 45秒,60℃ 45秒,72℃ 1分10秒,30个循环;72℃10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中,测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6分别显示了Fc区的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH、pGEM-T/CL和pGEM-T/Fc。
实施例2:可溶性双功能VEGFR融合受体的构建
用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞,用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA,以引物VEGFR11有义:TAAGCTTGCCGCCACCATGGTCAGCTACTGGGACACCGGGGTCCTGCTGTGCGCGCTGCTCAGCTGTCTGCTTCTCACAGGATCTAGTTCAGGTTCAAAATTAAAAGATCCTG,VEGFR12反义:CAGATGGTGCAGCCACAGTGCCCGGGCCTGCTTTATCATATATATGCACTGAGG(Invitrogen公司合成),做RT-PCR获得VEGFR1基因Ig1-3区,装入PGEM-T载体(PGEM-T/VEGFR1),VEGFR3基因根据embl|AR860556|AR860556中序列请上海生物工程技术服务有限公司全基因合成,VEGFR 1基因信号肽(以引物VEGFR11有义:TAAGCTTGCCGCCACCATGGTCAGCTACTGGGAC;VEGFR11反义:ACGAAAGGTCTACCTCCGGAACTAGATCCTGTGAGAAG以PGEM-T/VEGFR1为模板扩增)和Ig 2-3区(以引物VEGFR12有义:TCCGGAGGTAGACCTTTCG;VEGFR12反义:CAGATGGTGCAGCCACAGTGCCCGGGCCTGCTTTATCATATATATGCACTGAGG,以PGEM-T/VEGFR1为模板扩增)与人抗体轻链恒定区(k constant region)基因(以引物LC有义:ACTGTGGCTGCACCATCTGT;LC反义:GAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTG以pGEM-T/CL为模板)以overlapPCR连接(序列见SEQ ID NO:1),并且被克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中,挑选阳性克隆,测序正确,以HinDIII和EcoRI酶切(Promega公司产品),经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得1kb的酶切片断与同酶切的质粒pDR1(图7)用T4 DNA连接酶(Invitrogen公司产品)进行连接,构建成真核表达载体pDR(VEGFRIg-L)。图2为VEGFRIg-L的基因结构图。SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8分别显示了VEGFRIg-L的核苷酸和氨基酸序列。
VEGFR3基因信号肽和I g 1-2区(以引物VEGFR31有义:TAAGCTTGCCGCCACCATGCAGCGGGGCGCCGCGCTGTGCCTGCGACTGTGGCTCTGCCTGGGACTCCTGGACGGCCTGGTGAGTGACTACTCCATGACCCCCCCGACCTTGAACATC;VEGFR31反义:AGCTAGCGCCTGTGATGTGCACCAGGAAG,以PGEM-T/VEGFR1为模板扩增),经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中,筛选阳性克隆测序。将测序正确的克隆用HindIII和NheI双酶消化,回收700bp酶切片断与与同酶切的质粒pGEM-T/CH连接,挑选正确克隆后以HinDI11和EcoRI酶切,经琼脂糖凝胶电泳纯化回收2.3kb片段,与同酶切的质粒pDR1(图9)用T4 DNA连接酶(Invitrogen公司产品)进行连接,构建成真核表达载体pDR(VEGFRIg-H)。图3为VEGFRIg-H的基因结构图。SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10分别显示了VEGFRIg-H的核苷酸和氨基酸序列。
于3.5cm组织培养皿中接种3×105CHO-K1细胞,细胞培养至90%-95%融合时进行转染:取质粒10μg(质粒pDR(VEGFRIg-H)4μg,质粒pDR(VEGFRIg-L)6μg)和20μl Lipofectamine2000 Reagent[Invitrogen公司产品]分别溶于500μl无血清DMEM培养基,室温静置5分钟,将以上2种液体混合,室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成,其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基,然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中,CO2孵箱培养4小时后补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基,置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418和250μg/mlZeocin的选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆:小鼠抗人IgG(CH2)包被于ELISA板,4℃过夜,用2%BSA-PBS于37℃封闭2小时,加入待测的培养上清和标准品(Human myeloma IgGl,κ),37℃孵育2小时,加入HRP-小鼠抗人IgG(CH3)进行结合反应,37℃孵育1小时,加入TMB于37℃作用5分钟,最后用H2SO4终止反应,测OD450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养,用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化VEGFRIg融合受体,经测序,和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10序列一致,将纯化融合受体用PBS进行透析,最后以紫外吸收法定量。图4为VEGFRIg融合受体结构图。
上述获得的VEGFR3基因信号肽和I g 1-2区与VEGFR 1基因I g 2-3区用overlapPCR的方法连接,经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得1.3kb并且被克隆到pGEM-T载体体(Promega公司产品)中,挑选阳性克隆,测序正确,以HinDI11和SmaI双酶切(Promega公司产品),经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得1.3kb的酶切片断N端连接PGEM-T/Fc(I gG1 Fc)(Sequence 9),挑选阳性克隆,,以HinDI11和EcoRI双酶切(Promega公司产品),经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得2kb的酶切片段与同酶切的质粒pDR1用T4 DNA连接酶(Invitrogen公司产品)进行连接,构建成真核表达载体pDR(VEGFRFc)。图5为VEGFRFc的基因结构图。SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12分别显示了VEGFRFc的核苷酸和氨基酸序列。
于3.5cm组织培养皿中接种3×105CHO-K1细胞,细胞培养至90%-95%融合时进行转染:取pDR(VEGFRFc)质粒10μg和20μlLipofectamine2000 Reagent[Invitrogen公司产品]分别溶于500μl无血清DMEM培养基,室温静置5分钟,将以上2种液体混合,室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成,其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基,然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中,CO2孵箱培养4小时后补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基,置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418的选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆:小鼠抗人IgG(CH2)包被于ELISA板,4℃过夜,用2%BSA-PBS于37℃封闭2小时,加入待测的培养上清和标准品(Human myelomaIgG1,κ),37℃孵育2小时,加入HRP-小鼠抗人IgG(CH3)进行结合反应,37℃孵育1小时,加入TMB于37℃作用5分钟,最后用H2SO4终止反应,测0D450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养,用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化VEGFRFc融合受体,经测序,与SEQ ID NO:12序列一致,将纯化融合受体用PBS进行透析,最后以紫外吸收法定量。图6为VEGFRFc融合受体结构图。
以pDR(VEGFRIg-L)为模板,以引物VEGFR1LCM有义:tccgtaGAGGACCTGattgaccaaagcaattccc和VEGFR1LCM反义:GGTCAATCAGGTCCTCTACGGAAGCTCTCTTATTT为点突变引物,以引物VEGFR1LC有义:Caagcttgccgccaccatggtcagctactgggacaccggggtcctgctgtgcgcgctgctcagctgtctgcttctcacaggatctagttccggaggtagacctttcgt;Lc antisense:GAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTG为首尾引物,用overlap的方法进行点突变,扩增产物,经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中,筛选阳性克隆测序。将测序正确的克隆用HinDIII和EcoRI酶切,经琼脂糖凝胶电泳纯化回收1kb片段,与同酶切的质粒pDR1(图1)用T4 DNA连接酶(Invitrogen公司产品)进行连接,构建成真核表达载体pDR(VEGFRIg-LM)。SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14分别显示了VEGFRIg-LM的核苷酸和氨基酸序列。
于3.5em组织培养皿中接种3×105CHO-K1细胞,细胞培养至90%-95%融合时进行转染:取质粒10μg(质粒pDR(VEGFRIg-H)4μg,质粒pDR(VEGFRIg-LM)6μg)和20μl Lipofectamine2000 Reagent[Invitrogen公司产品]分别溶于500μl无血清DMEM培养基,室温静置5分钟,将以上2种液体混合,室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成,其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基,然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中,CO2孵箱培养4小时后补加2ml含10%血清的DMEM完全培养基,置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418和250μg/mlZeocin的选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆:小鼠抗人IgG(CH2)包被于ELISA板,4℃过夜,用2%BSA-PBS于37℃封闭2小时,加入待测的培养上清和标准品(Human myeloma IgG1,κ),37℃孵育2小时,加入HRP-小鼠抗人IgG(CH3)进行结合反应,37℃孵育1小时,加入TMB于37℃作用5分钟,最后用H2SO4终止反应,测OD450值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养,用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化VEGFRIgM融合受体,经测序,与SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:10序列一致,将纯化融合受体用PBS进行透析,最后以紫外吸收法定量。
实验例
实验例1:可溶性双功能VEGFR融合受体亲和力检测实验-ELISA法
实验步骤:分别将VEGF、VEGF-C(R&D公司产品)用0.05mmol/L碳酸钠.碳酸氢钠缓冲液(pH 9.6)稀释成2ug/ml,100ul/孔,4℃包被过夜。3%脱脂奶室温封闭2h后,加入不同浓度的可溶性VEGFR融合受体VEGFR1Fc、VEGFR3Fc、VEGFRFc、VEGFRIg、VEGFRIgM,100ul/孔,每个浓度取3个平行孔,室温孵育2h。弃上清液,PBS洗涤3次,加入按效价稀释好的HRP标记的小鼠抗人IgG单抗(DAKO公司产品),50ul/孔,室温孵育45min。PBS充分洗涤后,OPD避光显色,加入2mol/L H2SO4终止反应后,置酶标仪(Elx型自动酶标比色仪,美国BIO-TEK公司)中测定492nm吸光度(A492)值。
实验结果:如图7,图8所示。
实验结果表明:可溶性VEGFR融合受体VEGFRIgM、VEGFRIg可同时结合VEGF-A、VEGF-C,且结合力与VEGFR1Fc和VEGFR3Fc相似,VEGFRFc与两者的结合较弱。而VEGFR1Fc仅能与VEGF-A结合,VEGFR3Fc仅能与VEGF-C结合。
实验例2:可溶性双功能VEGFR融合受体亲和力检测实验
实验步骤:不同量的可溶性VEGFR融合受体与50ng的VEGFR1Fc(分别为AP标记的VEGFR1Fc(见文章Suppression of tumor angiogenesis and growth by genetransfer of a soluble form of vascular endothelial growth factor receptorinto a remote organ.Takayama,-K,Cancer-Res.2000 Apr 15;60(8):2169-77)、VEGFR 3 Fc(见文章Inhibition of lymphangiogenesis withresulting lymphedema in transgenic mice expressing soluble VEGFreceptor-3 TAIJA
NATURE MEDICINE 2001 4 7 199-205)混合并在室温湿育1个小时。将混合物转移到用VEGF165(200ng/孔)或VEGF-C(200ng/孔)(R&D公司产品)包被的96孔微量滴定权并在室温继续温育2小时,然后将滴定板洗5次,加入AP的底物以对结合的VEGFRFc-AP分子定量.然后计算IC 50,即,50%抑制VEGFR融合受体与VEGF结合所需要的VEGFR融合受体浓度。如图9,图10所示,结果表明,可溶性VEGFR融合受体VEGFRIgM、VEGFRIg既能竞争性抑制VEGF-A与VEGFR1Fc的结合,又能竞争性抑制VEGF-C与VEGFR3Fc的结合,VEGFRFc对两者也有一定的竞争抑制作用,而VEGFR1Fc和VEGFR3Fc仅能抑制其相应融合受体的结合
实验例3:可溶性双功能VEGFR融合受体抑制HUVEC细胞增殖实验
实验步骤:取生长状态良好的HUVEC细胞,调整细胞浓度为2.5×104/ml,接种于96孔细胞培养板,200μl/孔,于37℃、5%CO2孵箱中培养24h后换无血清培养基,继续培养72h,加入不同浓度梯度的VEGFR融合受体,分别以VEGFR1Fc,VEGFR3Fc,无关抗体Rituximab为对照,每个浓度取3个平行孔,37℃孵育1h,加入终浓度为25ng/ml的VEGF-A或100ng/ml的VEGF-C继续培养24h后,加入10μl[3H].TdR(18.5kBq/孔),37℃孵箱中孵育7h,细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤膜上,采用[3H]液闪计数仪进行测定。如图11,图12所示,结果表明可溶性融合受体VEGFRIg、VEGFRIgM可同时抑制VEGF-A、VEGF-C引起的HUVEC细胞增殖,VEGFRFc对两者也有一定的竞争抑制作用,而VEGFR1Fc和VEGFR3Fc只能分别抑制VEGF-A、VEGF-C引起的HUVEC细胞增殖的活性。
实验例4:VEGF受体融合蛋白药代动力学检测
实验步骤:四周龄C57BL/6雌性小鼠(体重15-19g)皮下注射(s.c.)60μg(0.4μg/μl*150μl)/mice ①VEGFR1Fc、②VEGFR3Fc、③VEGFRIg、④VEGFRIgM,⑤PBS,分别于注射后1hr,6hr,24hr,48hr,4d,7d,10d,13d,16d,20d后取血,每只小鼠取血约100μl(内眦静脉取血)加0.1%的肝素混匀,离心4000rpm*20min。取上清,弃沉淀。ELISA检测血浆中抗体的浓度(以小鼠抗人CH3单克隆抗体包被96孔板,加血浆后,以HRP标记的小鼠抗人CH2单克隆抗体检测)。检测结果如图13所示,VEGFRIgM的体内半衰期较长,远远高于VEGFR1Fc。其24小时浓度达到最高,在6-48小时维持较高的浓度(6.3-8.5μg/ml)并持续到13天后仍有0.01μg/ml。
实验例5:可溶性双功能VEGFR融合受体体内抑制肿瘤生长实验
实验步骤:为检测可溶性双功能VEGFR融合受体体内抑瘤活性,首先用LM3细胞(人肝癌细胞),接种于到雌性重症免疫缺陷小鼠(第二军医大学实验动物中心)右胁侧皮下,接种肿瘤当天给予可溶性双功能VEGFR融合受体25mg/kg(VEGFRIgM、VEGFRIg)及对照VEGFR1Fc,VEGFR3Fc和PBS,然后隔天皮下注射持续4周.6周后,每3天测量肿瘤的长宽,计算肿瘤体积,结果如图14所示。结果表明:VEGFRIgM受体融合蛋组肿瘤大小显著小于VEGFRIg组及对照VEGFR1Fc,VEGFR3Fc和PBS组(P<0.01),
实验例6:可溶性双功能VEGFR融合受体体内抑制肿瘤转移实验
实验步骤:用LM3细胞(人肝癌细胞),接种于到雌性重症免疫缺陷小鼠(第二军医大学实验动物中心)右胁侧皮下,接种肿瘤当天给予可溶性双功能VEGFR融合受体25mg/kg(VEGFRIgM、VEGFRIg)及对照VEGFR1Fc,VEGFR3Fc和PBS,然后隔天皮下注射持续4周.6周后处死小鼠,检测***转移数目及转移***的大小。
实验结果见表1
表1可溶性双功能融合受体抑制肿瘤淋巴转移活性(x±s,n=10)
注:a,VEGFRIgM组与VEGFR1Fc组,P=0.007;b,VEGFR3Fc组与VEGFR1Fc组,P=0.007;c,VEGFRIg组与VEGFR1Fc组,P=0.008;d,VEGFRIg与VEGFRIgM组,P=0.009;e,与阴性对照组,p>0.3。(非配对t检验)
上述结果表明,VEGFR融合受体可明显抑制肿瘤的***转移。
从以上实验结果可以看出,本发明公开的上述可溶性双功能VEGFR融合受体达到了本发明的目的。
SEQUENCE LISTING
<110>上海中信国健药业有限公司
上海国健生物技术研究院
<120>可溶性VEGFR双功能融合受体、其制备方法及用途
<130>Wulff C等,J Clin Endocrinol Metab.2001,86(7):3377-86
<160>14
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>990
<212>DNA
<213>Gammal chain constant region DNA sequence
<400>1
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 990
<210>2
<211>318
<212>DNA
<213>Kappa chain constant region DNA sequence
<400>2
actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60
actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120
aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180
aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240
cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300
ttcaacaggg gagagtgt 318
<210>3
<211>693
<212>DNA
<213>Gammal chain Fc region DNA sequence
<400>3
ggcccgggcg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 60
gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 120
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 180
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 240
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 300
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 360
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 420
ccatctcggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 480
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 540
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg 600
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 660
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctg 693
<210>4
<211>330
<212>PRT
<213>Gammal chain constant region amino acid sequence
<400>4
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210>5
<211>106
<212>PRT
<213>Kappa chain constant region amino acid sequence
<400>5
Arg Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210>6
<211>231
<212>PRT
<213>Gammal chain Fc region amino acid sequence
<400>6
Gly Pro Gly Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10 15
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210>7
<211>936
<212>DNA
<213>VEGFRIg-L DNA sequence
<400>7
tccggaggta gacctttcgt agagatgtac agtgaaatcc ccgaaattat acacatgact 60
gaaggaaggg agctcgtcat tccctgccgg gttacgtcac ctaacatcac tgttacttta 120
aaaaagtttc cacttgacac tttgatccct gatggaaaac gcataatctg ggacagtaga 180
aagggcttca tcatatcaaa tgcaacgtac aaagaaatag ggcttctgac ctgtgaagca 240
acagtcaatg ggcatttgta taagacaaac tatctcacac atcgacaaac caatacaatc 300
atagatgtcc aaataagcac accacgccca gtcaaattac ttagaggcca tactcttgtc 360
ctcaattgta ctgctaccac tcccttgaac acgagagttc aaatgacctg gagttaccct 420
gatgaaaaaa ataagagagc ttccgtaagg cgacgaattg accaaagcaa ttcccatgcc 480
aacatattct acagtgttct tactattgac aaaatgcaga acaaagacaa aggactttat 540
acttgtcgtg taaggagtgg accatcattc aaatctgtta acacctcagt gcatatatat 600
gataaagcag gcccgggcac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat 660
gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga 720
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<210>8
<211>312
<212>PRT
<213>VEGFRI g-L Amino acid sequence
<400>8
Ser Gly Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile
1 5 10 15
Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr
20 25 30
Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu
35 40 45
Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile
50 55 60
Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala
65 70 75 80
Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln
85 90 95
Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val Lys
100 105 110
Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr Pro
115 120 125
Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys Asn
130 135 140
Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His Ala
145 150 155 160
Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys Asp
165 170 175
Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys Ser
180 185 190
Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Gly Pro Gly Thr Val
195 200 205
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
210 215 220
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
225 230 235 240
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
245 250 255
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
260 265 270
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
275 280 285
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
290 295 300
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
305 310
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<212>DNA
<213>VEGFRIg-H DNA sequence:
<400>9
agtgactact ccatgacccc cccgaccttg aacatcacgg aggagtcaca cgtcatcgac 60
accggtgaca gcctgtccat ctcctgcagg ggacagcacc ccctcgagtg ggcttggcca 120
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gactgcgagg gcacagacgc caggccctac tgcaaggtgt tgctgctgca cgaggtacat 240
gccaacgaca caggcagcta cgtctgctac tacaagtaca tcaaggcacg catcgagggc 300
accacggccg ccagctccta cgtgttcgtg agagactttg agcagccatt catcaacaag 360
cctgacacgc tcttggtcaa caggaaggac gccatgtggg tgccctgtct ggtgtccatc 420
cccggcctca atgtcacgct gcgctcgcaa agctcggtgc tgtggccaga cgggcaggag 480
gtggtgtggg atgaccggcg gggcatgctc gtgtccacgc cactgctgca cgatgccctg 540
tacctgcagt gcgagaccac ctggggagac caggacttcc tttccaaccc cttcctggtg 600
cacatcacag gcgctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 660
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tgggacagta gaaagggctt catcatatca aatgcaacgt acaaagaaat agggcttctg 840
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