CN101568332A - 抑制血管生成及治疗血管生成相关疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过施用含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物(如，含蛋白的组合物)在个体中抑制血管生成的方法。所述组合物的量有效抑制血管生成，但是在一些实施方式中，其不足以在个体中诱导明显的细胞毒性。本文所述的方法用于治疗血管生成相关疾病，如年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病、风湿性关节炎、银屑病和癌症。

Description

抑制血管生成及治疗血管生成相关疾病的方法
技术领域
[0001]本申请涉及抑制血管生成及治疗血管生成相关疾病的方法。具体而言，本申请涉及通过给予有效量的含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱(thiocolchicine)二聚体的组合物而抑制血管生成并治疗血管生成相关疾病的方法。
背景技术
[0002]血管生成是高度调控的生物过程，新的血管通过该过程形成。不受控的血管生成导致多种疾病。一种这样的疾病是年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration)(“AMD”)，其特征是新血管入侵进入眼的不同结构如黄斑和视网膜色素上皮细胞中。血管生成影响的另一种疾病是风湿性关节炎，其中关节的滑膜衬里(synovial lining)中的血管经历血管生成。除了形成新的血管网络，内皮细胞释放导致血管翳(pannus)生长和软骨破坏(cartilage destruction)的因子和活性氧种类。不受控的血管生成也与诸如糖尿病性视网膜病、银屑病、心血管再狭窄(restenosis)和新生血管性青光眼的疾病相关。
[0003]此外，血管生成也参与肿瘤形成和转移。例如，已经显示，直径增大到大于约2毫米的肿瘤必须获得它们自己的血液供应，并且通过诱导新毛细血管的生长来完成此。在这些新生血管嵌入肿瘤中之后，它们提供肿瘤生长所必需的营养及生长因子，并促进肿瘤细胞的转移。
[0004]特定靶向血管生成的抗血管生成剂已经被开发用于治疗血管生成相关疾病。参见，例如，美国专利号6,919,309；美国专利申请公布号2006/0009412；和PCT申请公布号WO04/027027和WO05/117876。此外，靶向已形成血管的药剂(所谓的“血管靶向剂”或VTA)也已经被开发。这些药剂据认为这样发挥功能：选择性地使内皮细胞的微管细胞骨架不稳定，引起细胞形状的重大改变，这最终导致血管堵塞和血流停止。参见，例如，WO 2005/113532。
[0005]硫代秋水仙碱二聚体是疏水性化合物，其在以前已经被描述。参见，例如，美国专利号6,627,774。这些化合物具有双重作用机理，即，所述化合物具有抗微管活性和拓扑异构酶I抑制活性。Raspaglio等，Biochem.Pharmacol.2005，69(1)：113-21。纳米颗粒白蛋白结合的硫代秋水仙碱二聚体制剂Nab-5404和Nab-5676已经被开发作为细胞毒性化学治疗剂用于治疗癌症。参见，例如，Bernacki等，Proc.Amer.Assoc.CancerRes.，vol.46，2005#2390和PCT专利申请号PCT/US2006/006167。已经发现：当以24mg/kg，qdx5静脉给约时，Nab-5404能够诱导A121卵巢肿瘤异体移植物中的肿瘤完全退化和治愈。
[0006]本文提到的所有出版物、专利、专利申请和公布专利申请的公开内容在此以其整体引入作为参考。
发明概述
[0007]本发明在一方面提供在个体中抑制血管生成的方法，包括给予该个体含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)的组合物，其中所述组合物处于有效抑制血管生成的量，并且其中所述组合物的量不足以在该个体中诱导显著的细胞毒性。在一些实施方式中，提供一种在个体中抑制血管生成的方法，包括给予该个体有效量的组合物，所述组合物包含秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)，其中所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)在所述组合物中的量(即每次给药的量)在约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mg/m2体表的任一以下。在一些实施方式中，提供抑制个体中血管生成的方法，包括给予该个体有效量的组合物，所述组合物含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)，其中秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)在所述组合物中的量在约0.05、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或0.6mg/kg的任一以下。在一些实施方式中，所述组合物如下给药：至少约每三周一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次或每天一次中的任一种。在一些实施方式中，所述组合物被给药(中断或不中断)至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月中的任一种。在一些实施方式中，所述组合物通过静脉内、眼内、动脉内、口服、局部或吸入途径中任一种给药。
[0008]用在本文所述方法中的组合物可进一步包含生物相容性聚合物，例如载体蛋白。例如，在一些实施方式中，提供抑制个体中血管生成的方法，包括给予所述个体包含载体蛋白(如白蛋白)和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)的组合物，其中所述组合物的量有效抑制血管生成，并且其中所述组合物的量不足以在该个体中诱导明显的细胞毒性。在一些实施方式中，提供抑制个体中血管生成的方法，包括给予该个体有效量的包含载体蛋白(如白蛋白)和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)的组合物，其中所述组合物中秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)的量在约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mg/m2体表的任一以下。在一些实施方式中，提供抑制个体中血管生成的方法，包括给予该个体有效量的包含载体蛋白(如白蛋白)和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)的组合物，其中所述组合物中秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)的量在约0.05、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或0.6mg/kg的任一以下。在一些实施方式中，所述含有载体蛋白的组合物基本上不含(如不含)表面活性剂。在一些实施方式中，所述组合物如下给药：至少约每三周一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次或每天一次中任一种在一些实施方式中，所述组合物被给药(中断或不中断)至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月中任一种。在一些实施方式中，所述组合物通过静脉内、眼内、动脉内、口服、局部或吸入途径中任一种给药。
[0009]用在本文所述方法中的组合物可包含颗粒(如微粒或纳米颗粒)，其包含载体蛋白(如白蛋白)和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体。例如，在一些实施方式中，提供抑制个体中血管生成的方法，包括给予该个体包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒含有载体蛋白(如白蛋白)和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)，其中所述组合物处于有效抑制血管生成的量，并且其中所述组合物的量不足以在个体中诱导明显的细胞毒性。在一些实施方式中，提供抑制个体中血管生成的方法，包括给予该个体有效量的包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒含有载体蛋白(如白蛋白)和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)，其中所述组合物中秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)的量在约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mg/m2体表的任一以下。在一些实施方式中，提供抑制个体中血管生成的方法，包括给予该个体有效量的包含纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒含有载体蛋白(如白蛋白)和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)，其中所述组合物中秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)的量在约0.05、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或0.6mg/kg的任一以下。在一些实施方式中，所述组合物如下给药：至少约每三周一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次或每天一次中任一种。在一些实施方式中，所述组合物被给药(中断或不中断)至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月中任一种。在一些实施方式中，所述组合物通过静脉内、眼内、动脉内、口服、局部或吸入途径中任一种给药。
[0010]在一些实施方式中，所述组合物中的颗粒具有不大于约200nm的平均直径。在一些实施方式中，含有颗粒的组合物基本不含(如不含)表面活性剂。在一些实施方式中，所述组合物中的蛋白(如白蛋白)与秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的重量比为约18∶1或更小，如约9∶1或更小。在一些实施方式中，秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体用载体蛋白(如白蛋白)包被。在一些实施方式中，所述组合物中的颗粒具有不大于约200nm的平均直径，并且所述组合物基本不含(如不含)表面活性剂。在一些实施方式中，所述组合物中的颗粒(特别地，纳米颗粒)具有不大于约200nm的平均直径，并且秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体用蛋白(如白蛋白)包被。上述特征的其它组合也考虑在内。在一些实施方式中，所述颗粒组合物为Nab-5404。包含其它秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的颗粒组合物也可以包含一种或多种上述特征。
[0011]本文所述的秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体包含秋水仙碱、硫代秋水仙碱或其衍生物的两个(相同或不同)亚单元。在一些实施方式中，所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体包含至少一个硫代秋水仙碱亚单元。在一些实施方式中，所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体包含两个硫代秋水仙碱亚单元。在一些实施方式中，所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体是式(I)的化合物：
Figure A20068005611200101
[0012]其中每个亚单元中的B是甲氧基或甲硫基，R2当与R3一起选取时是甲氧基、羟基或亚甲二氧基(methylenedioxy)；R3当与R2一起选取时是甲氧基、羟基或亚甲二氧基。在一些实施方式中，X含有至少一个碳原子。
[0013]在一些实施方式中，所述秋水仙碱或秋水仙碱二聚体是式(II)的化合物：
Figure A20068005611200102
[0014]其中B1是甲氧基或甲硫基，B2是甲氧基或甲硫基，n是从0到8的整数，Y是CH2基团，或者当n为1时，Y也可以是式NH的基团。在一些实施方式中，n是0、1、2、3、4、5、6、7或8中任一种(例如选自它们)。在一些实施方式中，n是1。在一些实施方式中，n是1且Y是NH。在一些实施方式中，n是2。
[0015]在一些实施方式中，B1和B2都是甲氧基。在一些实施方式中，B1和B2都是甲硫基。在一些实施方式中，B1是甲氧基且B2是甲硫基。在一些实施方式中，B1是甲硫基且B2是甲氧基。在一些实施方式中，所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体是下述任一种(并且在一些实施方式中选自)：IDN5404、IDN5676、IDN5800和IDN5801。在一些实施方式中，所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体是IDN5404。在一些实施方式中，所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体是IDN5676。
[0016]在一些实施方式中，提供抑制个体中血管生成的方法，包括给予该个体含有纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包含白蛋白和IDN5404、IDN5676、IDN5800和IDN5801任一种(以下分别命名为“Nab-5404”、“Nab-5676”、“Nab-5800”和“Nab-5801”)。在一些实施方式中，提供抑制个体中血管生成的方法，包括给予该个体Nab-5404(或Nab-5676、Nab-5800和Nab-5801中任一种)，其中所述Nab-5404(或Nab-5676、Nab-5800和Nab-5801中任一种)处于有效抑制血管生成的量，并且其中Nab-5404(或Nab-5676、Nab-5800和Nab-5801中任一种)的量不足以诱导个体中明显的细胞毒性。在一些实施方式中，提供抑制个体中血管生成的方法，包括给予该个体有效量的Nab-5404(或Nab-5676、Nab-5800和Nab-5801中任一种)，其中Nab-5404(或Nab-5676、Nab-5800和Nab-5801中任一种)的量在约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mg/m2体表中任一以下。在一些实施方式中，提供抑制个体中血管生成的方法，包括给予该个体有效量的Nab-5404(或Nab-5676、Nab-5800和Nab-5801中任一种)，其中Nab-5404(或Nab-5676、Nab-5800和Nab-5801中任一种)的量在约0.05、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或0.6mg/kg的任一以下。在一些实施方式中，所述组合物如下给药：至少约每三周一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次或每天一次中任一种。在一些实施方式中，所述组合物被给药(中断或不中断)至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个月中任一种。在一些实施方式中，所述组合物通过静脉内、眼内、动脉内、口服、局部或吸入途径中任一种给药。
[0017]本文所述的方法通常用于血管生成相关疾病的治疗。在一些实施方式中，所述血管生成相关疾病是非肿瘤性血管生成相关疾病，包括例如，眼病(如黄斑变性、糖尿病性视网膜病或新生血管性青光眼)、心血管疾病(如再狭窄和动脉粥样硬化)、皮肤病(如银屑病)和关节炎(如风湿性关节炎)。
[0018]例如，在一些实施方式中，提供治疗个体中非肿瘤性血管生成相关疾病的方法，包括给予该个体含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物，其中所述组合物处于有效治疗非肿瘤性血管生成相关疾病的量。在一些实施方式中，所述组合物的量不足以在该个体中诱导明显的细胞毒性。在一些实施方式中，提供治疗个体中非肿瘤性血管生成相关疾病的方法，包括给予该个体含有载体蛋白(如白蛋白)和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)的组合物，其中所述组合物处于有效治疗个体中所述非肿瘤性血管生成相关疾病的量。在一些实施方式中，所述组合物的量不足以在该个体中诱导明显的细胞毒性。在一些实施方式中，提供治疗个体中非肿瘤性血管生成相关疾病的方法，包括给予该个体含有颗粒(如纳米颗粒)的组合物，所述颗粒包含载体蛋白(如白蛋白)和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)，其中所述组合物处于有效治疗非肿瘤性血管生成相关疾病的量。在一些实施方式中，所述组合物的量不足以在该个体中诱导明显的细胞毒性。在一些实施方式中，提供治疗个体中非肿瘤性血管生成相关疾病的方法，包括给予该个体Nab-5404(或Nab-5676、Nab-5800或Nab-5801)，其中Nab-5404(或Nab-5676、Nab-5800或Nab-5801)处于有效治疗非肿瘤性血管生成相关疾病的量。在一些实施方式中，所述Nab-5404(或Nab-5676、Nab-5800或Nab-5801)的量不足以在该个体中诱导明显的细胞毒性。
[0019]在一些实施方式中，所述血管生成相关疾病是肿瘤相关性疾病，包括例如癌症和良性肿瘤。能够通过本文所述方法治疗的癌症包括，但不限于：乳腺癌、结肠直肠癌(colorectal cancer)、直肠癌、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)、非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkinslymphoma)(NHL)、肾脏细胞癌、***癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波希肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、良性肿瘤(carcinoid carcinoma)、头颈癌(head and neck cancer)、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，所述癌症为实体肿瘤(solid tumor)(如转移性实体肿瘤)。通过举例，治疗癌症的方法在下面被进一步描述。
[0020]例如，在一些实施方式中，提供治疗个体中癌症的方法，包括给予该个体包含秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物，其中所述组合物处于有效治疗癌症的量，并且其中所述组合物的量不足以在该个体中诱导明显的细胞毒性。在一些实施方式中，提供治疗个体中癌症的方法，包括给予该个体含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物，其中所述组合物处于有效治疗癌症的量，并且其中所述组合物中秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的量在秋水仙碱或秋水仙碱二聚体相应的最大耐受剂量(“MTD”)的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、11％、12％、13％、14％或15％中任一以下。在一些实施方式中，提供治疗个体中癌症的方法，包括给予该个体含有载体蛋白(如白蛋白)和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)的组合物，其中所述组合物处于有效治疗癌症的量，并且其中所述组合物的量不足以在该个体中诱导明显的细胞毒性。在一些实施方式中，提供治疗个体中癌症的方法，包括给予该个体含有载体蛋白(如白蛋白)和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)的组合物，其中所述组合物处于有效治疗癌症的量，并且其中所述组合物中秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的量在秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体相应的MTD的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、11％、12％、13％、14％或15％中任一以下。在一些实施方式中，提供治疗个体中癌症的办法，包括给予该个体含有颗粒(如纳米颗粒)的组合物，所述颗粒包含载体蛋白(如白蛋白)和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)，其中所述组合物处于有效治疗癌症的量，并且其中所述组合物的量不足以在个体中诱导明显的细胞毒性。在一些实施方式中，提供治疗个体中癌症的方法，包括给予该个体含有颗粒(如纳米颗粒)的组合物，所述颗粒包含载体蛋白(如白蛋白)和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)，并且所述组合物中秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404)的量在秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体相应的MTD的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、11％、12％、13％、14％或15％中任一以下。在一些实施方式中，提供治疗个体中癌症的方法，包括给予该个体Nab-5404(或Nab-5676、Nab-5800或Nab-5801)，其中Nab-5404(或Nab-5676、Nab-5800或Nab-5801)处于有效治疗癌症的量，并且其中Nab-5404(或Nab-5676、Nab-5800或Nab-5801)的量不足以在该个体中诱导明显的细胞毒性。在一些实施方式中，提供治疗个体中癌症的方法，包括给予该个体Nab-5404(或Nab-5676、Nab-5800或Nab-5801)，其中Nab-5404(或Nab-5676、Nab-5800或Nab-5801)处于有效治疗癌症的量，并且其中Nab-5404(或Nab-5676、Nab-5800或Nab-5801)的量在Nab-5404(或Nab-5676、Nab-5800或Nab-5801)相应的MTD的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、11％、12％、13％、14％或15％中任一以下。
[0021]也提供用于本文所述方法的药物组合物、单位剂量、试剂盒和制品。
[0022]应该理解，本文所述的各种实施方式的一个、一些或所有性质可以被组合，以形成本发明的其它实施方式。
附图简述
[0023]图1A显示使用MX-1乳腺癌细胞，Nab-5404对微管形成的作用。图1B显示使用MX-1乳腺癌细胞，Nab-5676对微管形成的作用。
[0024]图2A-2C显示用对照载体(PBS，2A)、0.6μg/ml Nab-5404(2B)和μg/ml Nab-5676(2C)处理后，在MX-1细胞中染色微管网络的显微照片。
[0025]图3显示根据微血管/小管(microvessel/tubule)形成而评估的Nab-5404、Nab-5676和CA4P的抗血管生成活性。细胞在第1天用不同的化合物温育并在第12天染色。图3A-3D提供用对照载体(3C)、0.01μg/ml Nab-5404(3A)、0.01μg/ml Nab-5676(3B)和0.01μg/ml CA4P(3D)处理后小管形成的显微照片。
[0026]图4显示用浓度范围为0.0到100μg/ml的Nab-5404、Nab-5676和CA4-P处理的细胞的小管长度的比较。
[0027]图5显示根据微血管/小管形成或破坏(disruption)而评估的Nab-5404和Nab-5676的抗血管生成活性。细胞在第8天用不同的化合物温育并在第11天染色。图5A-5C提供用对照载体(5A)、0.01μg/mlNab-5404(5B)和0.01μg/ml Nab-5676(5C)处理之后小管形成的显微照片。图5D显示用浓度范围为0.0到10μg/ml的Nab-5404和Nab-5676处理的细胞的小管长度的比较。
[0028]图6显示根据微血管/小管形成或破坏而评估的Nab-5404抗血管生成活性。细胞在第11天用各种浓度的化合物温育并在第12天染色。图6A到6F提供用对照载体(6A)、0.001μg/ml Nab-5404(6B)、0.01μg/ml Nab-5404(6C)、0.1μg/ml Nab-5404(6D)、1μg/ml Nab-5404(6E)和10.0μg/ml Nab-5404(6F)处理后小管形成和破坏的显微照片。
[0029]图7显示根据微血管/小管形成或破坏而评估的Nab-5676抗血管生成活性。细胞在第11天用各种浓度的化合物温育并在第12天染色。图7A到7F显示用对照载体(7A)、0.001μg/ml Nab-5676(7B)、0.01μg/ml Nab-5676(7C)、0.1μg/ml Nab-5676(7D)、1μg/ml Nab-5676(7E)和10.0μg/ml Nab-5676(7F)处理后小管形成和破坏的显微照片。
[0030]图8显示根据微血管/小管形成或破坏而评估的CA4P的抗血管生成活性。细胞在第11天用各种浓度的化合物温育并在第12天染色。图8A到8C显示分别用0.01、0.1和1.0μg/ml的CA4P处理后小管形成和破坏的显微照片。
[0031]图9显示根据微血管或小管形成或破坏而评估的Nab-5404、Nab-5676和CA4P的抗血管生成活性的比较。细胞在第11天用化合物温育并在第12天染色。该图显示用浓度范围在0.0到10μg/ml内的每种化合物处理的细胞的小管长度。
[0032]图10显示利用2周期低剂量/高剂量方案，Nab-5404对异种移植鼠科模型中HT-29肿瘤生长的作用。第一周期剂量为1.7、2.5或3.4mg/kg，0-14天；第二周期剂量为20、30或40mg/kg，15-30天。图10A显示从第0天到第40天的平均肿瘤体积(n＝10)。图10B显示第0天到第40天内小鼠体重减轻的平均百分数。
[0033]图11显示利用2周期低剂量/高剂量方案，Nab-5676对异种移植鼠科模型中HT-29肿瘤生长的作用。第一周期剂量为1.7、2.5或3.4mg/kg，0-14天；第二周期剂量为20、30或40mg/kg，15-30天。图11A显示从第0天到第40天的平均肿瘤体积(n＝10)。图11B显示第0天到第40天小鼠体重减轻的平均百分数。
[0034]图12显示CA4P对异种移植鼠科模型中HT-29肿瘤生长的作用。在HT-29肿瘤达到900mm3体积后用100mg/kg处理它们。图12A显示从第28天到第41天的平均肿瘤体积(n＝10)；正方形＝载体对照，菱形＝CA4P处理。图12B显示第28天到第41天内小鼠体重减轻的平均百分数；正方形＝载体对照，菱形＝CA4P处理。
发明详述
[0035]本发明部分基于我们的观察：含有硫代秋水仙碱二聚体的组合物，特别地，硫代秋水仙碱二聚体的含白蛋白的纳米颗粒制剂，更特别地，IDN-5404的含白蛋白的纳米颗粒制剂(“Nab-5404”)和IDN-5676的含白蛋白的纳米颗粒制剂(“Nab-5676”)在抑制微血管形成和体外破坏已形成的微血管方面有效。Trieu等，97th AACR Annual Meeting，Abstract No.3823。这些活性的IC50值显著低于所述组合物体外细胞毒性活性所要求的值。我们进一步观察到：含有硫代秋水仙碱二聚体的组合物，特别地，硫代秋水仙碱二聚体的含白蛋白的纳米颗粒(如Nab-5404和Nab-5676)，以显著低于所述组合物的相应最大耐受剂量(MTD)的剂量有效阻止体内肿瘤生长。这些观察表明：含有硫代秋水仙碱二聚体或其类似物(如秋水仙碱二聚体)的组合物具有抗血管生成和血管靶向活性，所述活性与它们的细胞毒性作用无关。当以有效且无细胞毒性的量给药时，所述组合物能够选择性地靶向新血管的生长并阻断血流，而不引起靶组织中明显的细胞死亡。
[0036]有效且无细胞毒性量的秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体(即不足以诱导明显细胞毒性的量)是治疗非肿瘤性血管生成相关疾病以便最小化所述化合物的细胞毒性作用期望的。有效且无细胞毒性的量对治疗癌症也是有利的。利用细胞毒性药剂的传统化学疗法通常以等于或接近药剂最大耐受剂量的剂量进行，以最大化该药剂的细胞毒性作用。但是，这种高剂量方案需要延长的无治疗期间，以允许正常宿主细胞恢复。同时，肿瘤细胞也可能在无治疗期间恢复生长。这会增加发展抗药物肿瘤细胞的风险。无细胞毒性剂量(即数量)的秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体允许在治疗周期无明显间断的治疗，因此降低了发展药物抗性的风险。此外，无细胞毒性的剂量将发展由药物引起的明显全身毒性(如体重减轻)和副作用的可能性减到最小。
[0037]因此，本发明一方面提供抑制个体中血管生成的方法(包括靶向已发生的血管化作用)，包括给予该个体含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物，其中所述组合物处于有效抑制血管生成的量，并且其中所述组合物的量不足以在该个体中诱导明显的细胞毒性。在一些实施方式中，所述方法包括给予该个体含有载体蛋白(如白蛋白)和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物，其中所述组合物处于有效抑制血管生成的量，并且其中所述组合物的量不足以在该个体中诱导明显的细胞毒性。
[0038]在另一方面，本发明提供治疗个体中非肿瘤性血管生成相关疾病的方法，包括给予所述个体含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物，其中所述组合物处于有效治疗非肿瘤性血管生成相关疾病的量。在一些实施方式中，所述方法包括给予该个体含有载体蛋白和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物，其中所述组合物处于有效治疗非肿瘤性血管生成相关疾病的方法。
[0039]另一方面，本发明提供治疗个体中肿瘤相关疾病的方法，包括给予该个体含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物，其中所述组合物处于有效***相关疾病的量，并且其中所述组合物的量不足以在该个体中诱导明显的细胞毒性。在一些实施方式中，所述方法包括给予该个体含有载体蛋白和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物，其中所述组合物处于有效治疗癌症的量，并且其中所述组合物的量不足以在该个体中诱导明显的细胞毒性。
[0040]也提供用于本文所述方法的药物组合物、单位剂量、试剂盒和制品。
[0041]一般提到的“所述组合物”或“组合物”包括并适用本发明的组合物。本发明也提供含有本文所述成分的药物组合物。
[0042]术语“个体”为哺乳动物，包括人类。个体包括但不限于人、牛、猪、猫、狗、鼠或灵长类。在一些实施方式中，所述个体为人。在一些实施方式中，所述个体为用于研究血管生成或血管生成相关疾病(一种或多种)的实验动物模型。
[0043]本公开包括本文提到的化合物的所有立体异构体，包括对映异构体和非对映异构体。除非立体化学在结构上有明确的表示，公开的结构意欲包括所有可能的立体化学变型。本公开包括所公开的任何手性化合物的所有对映异构体，它们或者是基本纯的左旋或右旋形式，或在旋光混合物中，或是任意比率的对映异构体。本公开包括上式中提到的化合物的任何非对映异构体，它们处于基本纯的非对映异构形式和所有比率的混合物的形式。本公开也包括本文提到的化合物的所有溶剂合物，包括本文提到的化合物的所有水合物。本公开也包括所有多晶型物(polymorph)，包括本文提到的化合物的晶体和非晶体形式。本公开也包括本文提到的化合物的所有盐，特别是药学上可接受的盐。本文公开的化合物的代谢产物和前体药物也被本公开包含。在本文公开的化合物的所有用途中，本公开也包括所述化合物的任意或全部立体化学、对映异构体、非对映异构体、溶剂合物、水合物、多晶型物、晶体、非晶体、盐、药学上可接受的盐、代谢产物和前体药物变型的用途。
[0044]应该理解，本文所述的本发明的方面和实施方式包括由方面和实施方式“组成(consisting of)”和/或“基本组成(consisting essentiallyof)”。
抑制血管生成的方法
[0045]本发明在一方面提供通过施用含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物(如，含载体蛋白的组合物)抑制个体中血管生成的方法。所述组合物处于有效抑制血管生成的量。但是，所施用的所述组合物的量不足以在该个体中诱导明显的细胞毒性。
[0046]“血管生成”用在这里指的是在组织或器官中产生新血管的过程。血管生成通常开始于由内皮细胞和白细胞释放的酶引起的血管基膜(basement membrane)的侵蚀。铺衬血管内腔的内皮细胞随后穿过基膜伸出。血管生成刺激物诱导内皮细胞迁移穿过被侵蚀的基膜。迁移的细胞在亲代血管外形成“新芽(sprout)”，在那里内皮细胞进行有丝***和增殖。内皮的新芽彼此融合形成毛细血管袢，产生新的血管。
[0047]“抑制血管生成”指的是减少、阻止或抑制个体中一个或多个组织内的血管生成，包括例如眼组织、心血管组织、皮肤组织、关节组织和肿瘤组织。血管生成的抑制可以通过影响血管生成过程的一个或多个步骤来实现，例如，通过减弱被激活的内皮细胞的迁移和存活，阻止细胞从亲代血管上“生芽”，和/或阻止新血管的形成。微血管密度的变化也包含在术语“抑制血管生成”中。术语“抑制血管生成”也包括破坏已建立的脉管***。“破坏已建立的脉管***”指的是阻塞、溶解或以其它方式影响由血管生成形成的已存在的脉管***的能力。脉管***的破坏可以是可逆的或不可逆的、部分的或全部的。
[0048]因此，本文提供的方法包括一个或多个以下的方面：抑制(如，减少、阻止或防止)内皮细胞迁移，抑制(如，减少、阻止或防止)内皮细胞从亲代血管上“生芽”，抑制(如，减少、阻止或防止)新血管的形成，以及靶向(如，阻塞、中断或破坏)由血管生成形成的已建立脉管***。在一些实施方式中，提供抑制(如，减少、阻止或防止)个体中血管形成的方法。在一些实施方式中，提供中断(如，阻塞、溶解或以其它方式影响)已建立的脉管***的方法。在一些实施方式中，提供降低个体组织中微血管密度的方法。
[0049]“有效量”指的是单剂量或多剂量给予个体后，在该个体中提供期望效果的组合物的量或剂量。例如，如果组合物的量足以在个体的一个或多个组织中降低、阻止或防止血管生成(如血管生成的一个或多个方面)，所述组合物处于“有效抑制血管生成的量”。用在治疗内容中的术语“有效量”指的是足以治疗特定病症、状况或疾病的化合物或组合物的量，如改善、缓和、减轻和/或延迟其一种或多种症状。有效量可以体外和/或体内测定。测定用于抑制血管生成的组合物的有效量的方法在本领域内已知。
[0050]在一些实施方式中，所述组合物的量对抑制眼组织中的血管生成有效。在一些实施方式中，所述组合物的量对抑制心血管组织中的血管生成有效。在一些实施方式中，所述组合物的量对抑制皮肤组织中的血管生成有效。在一些实施方式中，所述组合物的量对抑制关节组织中的血管生成有效。在一些实施方式中，所述组合物的量对抑制肿瘤组织中的血管生成有效。在一些实施方式中，所述组合物的量对抑制新血管形成有效。在一些实施方式中，所述组合物的量对抑制内皮细胞从亲代血管“生芽”有效。在一些实施方式中，所述组合物的量对抑制内皮细胞的迁移有效。在一些实施方式中，所述组合物的量对破坏已建立的脉管***有效。在一些实施方式中，所述组合物的量对抑制至少约5％、10％、20％、40％、50％或以上的血管生成(如血管生成的任意一个或多个方面)中任一有效。
[0051]如果组合物的量不足以使秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体引起个体中显著的细胞死亡，该组合物处于“不足以诱导显著细胞毒性的量”(也被称作“无细胞毒性的量”)。细胞毒性可以通过一种或多种下述方式测量。例如，无细胞毒性的量可以基于体外细胞存活率试验测定。无细胞毒性的量可以是不足以在体外细胞存活率试验中引起约50％或更多细胞死亡的量。在一些实施方式中，所述组合物的量不足以在体外细胞存活率试验中引起约40％或更多、30％或更多、20％或更多、10％或更多、5％或更多、4％或更多、3％或更多、2％或更多、或1％或更多中任一的细胞死亡。在一些实施方式中，所述组合物的量不足以在体外细胞存活率试验中引起任何可测量的细胞死亡。用于体外存活率试验的合适细胞包括但不限于肿瘤细胞(如MX-1乳腺癌细胞系、HepG2肝癌细胞系和HT-29结肠癌细胞系)和正常细胞(如原代大鼠肝细胞)。无细胞毒性的量也可以基于药物毒性的体内试验确定。例如，无细胞毒性的量可以是在体内细胞毒性试验中不足以杀死约50％或更多的测试种群的量。在一些实施方式中，秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的量在体内细胞毒性试验中不足以杀死约40％或更多、30％或更多、20％或更多、10％或更多、5％或更多、4％或更多、3％或更多、2％或更多、或1％或更多的测试种群中任一量。在一些实施方式中，所述组合物的量不足以在体内药物毒性试验中引起测试种群的任何死亡。无细胞毒性的量也可以基于诱导个体中明显全身毒性(如体重减轻)所需的秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的量确定，也就是说，如果药物的量不引起任何明显的全身毒性，则该药物的量是无细胞毒性的。例如，在一些实施方式中，无细胞毒性的量是引起约15％(包括，例如约10％、8％、5％或更少中任一量)以下体重减轻的量。
[0052]在一些实施方式中，每次给药时所述组合物中秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的量在约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15mg/m2任一以下。例如，秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的量可以在约0.25mg/m2体表到约15mg/m2、约0.25mg/m2到约10mg/m2、约0.25mg/m2到约8mg/m2、约0.25mg/m2到约4mg/m2以及约0.25mg/m2到约2mg/m2的范围内。在一些实施方式中，每次给药时所述组合物中秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的量在约0.05、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5或0.6mg/kg中任一以下。例如，秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的量可以在约0.05mg/kg到约0.5mg/kg、约0.08mg/kg到约0.3mg/kg和约0.1mg/kg到约0.2mg/mg的范围内。
[0053]在一些实施方式中，秋水仙碱和硫代秋水仙碱二聚体处于在中断或不中断的延长给药期间(如6个月或更长)内不引起药物抗性的量。在一些实施方式中，秋水仙碱和硫代秋水仙碱二聚体处于在个体中不引起明显副作用(如通常伴随化学疗法的副作用)的量。通常伴随化学疗法的副作用包括例如脱水、腹泻、恶心、呕吐、失明或视觉障碍及贫血。
[0054]所述组合物的给药频率包括但不限于下述任一：至少约每三周一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次或每天一次。在一些实施方式中，每次给药之间的间隔在约一周以下，如约6、5、4、3、2或1天中任一以下。在一些实施方式中，每次给药之间的间隔恒定。例如，给药可以每天、每两天、每三天、每四天、每五天或每周进行。在一些实施方式中，给药可以每天两次、每天三次或更频繁地进行。
[0055]所述组合物的施用可以在延长的时间段内延伸，例如从约一个月到约三年。例如，给药方案可以在约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30和36个月中任一的时间段内延长。在一些实施方式中，在给药方案中无间断。在一些实施方式中，每次给药之间的间隔不多于约一周。
[0056]本文所述的组合物可以通过本领域内任意途径给予个体，所述途径包括但不限于静脉内、腹膜内、眼内、动脉内、肺内、口服、囊泡内(intravesicular)、肌内、气管内、皮下、眼内、鞘内、透皮、透胸膜、动脉内、局部、吸入(如，作为喷雾的气雾)、透粘膜(如通过鼻粘膜)、皮下、透皮、胃肠的、关节内、脑池内、心室内、直肠的(即通过栓剂)、***的(即通过***栓(pessary))、颅内、尿道内、肝内和肿瘤内。在一些实施方式中，所述组合物被全身给药。在一些实施方式中，所述组合物被局部给药。在一些实施方式中，所述组合物通过静脉内、眼内、动脉内、口服、局部或吸入途径中任一种给药。
[0057]当所述方法涉及抑制眼组织内血管生成时，所述组合物可以直接施用到眼部或眼组织。所述组合物可以局部施用到眼部，如在滴眼剂中。所述组合物也可以通过注射到眼部或与眼部相关的组织给药。所述组合物可以通过眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、透隔膜(trans-septal)注射、巩膜下(subscleral)注射、脉络膜内注射、虹膜内(intracameral)注射、结膜下注射、眼球筋膜下注射(sub-Tenon’sinjection)、眼球后注射、眼球周围(peribulbar)注射或后近巩膜输送(posterior juxtascleral delivery)给药。所述组合物可被施用到，例如，玻璃体、房水(aqueous humor)、巩膜、结膜、巩膜和结膜之间的区域、视网膜脉络膜组织、黄斑或者个体眼中或眼部附近的其它区域。对于用于视网膜药物输送的示例性眼周途径的描述，参见Periocular routes forretinal drug delivery，Raghava等(2004)，Expert Opin.Drug Deliv.1(1)：99-114。所述组合物也可以作为植入物给予个体。优选的植入物是生物相容的和/或生物可降解的缓释制剂，其在一段时间内逐渐释放所述化合物。用于药物输送的眼部植入物在本领域内是公知的。参见例如，美国专利号5,501,856、5,476,511和6,331,313。所述组合物也可以使用离子电渗疗法给予个体，包括，但不限于在美国专利号4,454,151及美国专利申请公布号2003/0181531和2004/0058313中所述的离子运载方法。
治疗血管生成相关疾病的方法
[0058]本文所述的方法通常被用于血管生成相关疾病的治疗。“血管生成相关疾病”指的是血管生成是所述疾病的一个方面的疾病或病症。血管生成相关疾病可由异常的血管生成引起。在一些实施方式中，所述血管生成相关疾病至少部分由血管生成介导。在一些实施方式中，血管生成对血管生成相关疾病的发展是必要的。血管生成相关疾病在本领域内已知，并包括例如非肿瘤性血管生成相关疾病如黄斑变性、糖尿病性视网膜病、风湿性关节炎和本文所述的其它疾病。在一些实施方式中，所述血管生成相关疾病为肿瘤相关疾病，如癌症或良性肿瘤。
[0059]如本文所用，“治疗”是用于获得有益或期望的临床结果的方法。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括，但不限于下述任意一种或多种：一种或多种症状的缓解、疾病程度的减轻、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病扩散的阻止或延迟、疾病的发生或复发的阻止或延迟、疾病发展的延迟或减缓、疾病状态的缓和及消除(无论是部分还是全部)。也被“治疗”包括的是血管生成相关疾病的病理结果的减轻。本发明的方法考虑这些治疗方面的任一个或多个。
非肿瘤性血管生成相关疾病的治疗
[0060]本文所述的方法用于非肿瘤性血管生成相关疾病的治疗。
[0061]在一些实施方式中，所述方法用于眼组织中如角膜、视网膜、黄斑和脉络膜中非肿瘤性血管生成相关疾病的治疗。所述方法通常用于防止失明、视力丧失(如视敏度或视野的丧失)和/或由多种眼病导致的其它结果。在一些实施方式中，提供治疗包括年龄相关性黄斑变性(AMD)在内的黄斑变性的方法。AMD的临床特征是中央视觉的逐步丧失，所述中央视觉的逐步丧失是由于对视网膜区域中被称作黄斑的光感受器细胞的损伤的结果而发生的。AMD被广义地分为两个临床状态：湿形式(wet form)和干形式(dry form)，其中干形式构成全部病例的80-90％。所述干形式临床上以黄斑视网膜小疣(macular drusen)的存在为特征，所述视网膜小疣是位于视网膜色素上皮细胞(RPE)和布鲁赫氏膜之间的局部沉积，以及以地图状萎缩(geographic atrophy)为特征，所述地图状萎缩以伴随上覆的(overlying)光感受器萎缩的RPE细胞死亡为特征。湿AMD，其引发约90％的严重视力丧失，与黄斑区域中新生血管形成和这些新血管的渗漏相关。血液和液体的积存可以引起视网膜脱落，接着是迅速的光感受器变性和视力丧失。通常认为湿形式的AMD在干形式之后，并由干形式产生。
[0062]本文提供的方法特别用于湿形式的黄斑变性的治疗或抑制。眼组织中血管生成的抑制也防止或延迟黄斑变性的干形式向黄斑变性的湿形式的转变。本发明因此也提供黄斑变性干形式的治疗方法。本发明也包括治疗或预防黄斑变性的一个或多个方面或症状的方法，所述方面或症状包括，但不限于光感受器细胞的丧失、视力(包括例如视敏度和视野)丧失和视网膜脱落。其它相关方面，如光感受器变性、RPE变性、视网膜变性、脉络膜视网膜变性、视锥(cone)变性、视网膜功能障碍、视网膜损伤、布鲁赫氏膜损伤、RPE功能丧失、正常黄斑的细胞和/或胞外基质的组织结构完整性的丧失、黄斑中细胞功能的丧失和光感受器萎缩也被包括。
[0063]可以通过本文所述的方法治疗的其它非肿瘤性血管生成相关眼病包括但不限于：视网膜的新生血管形成、角膜的新生血管形成(如由砂眼、感染、炎症、移植或外伤引起的新生血管形成)、糖尿病性视网膜病、糖尿病性视网膜水肿、糖尿病性黄斑水肿、缺血性视网膜病、高血压视网膜病、闭塞性视网膜病(occlusive retinopathy)、早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity)、外伤后的新血管形成、感染后的新生血管形成、移植后的新生血管形成、视网膜脱落或视网膜变性后的新生血管形成、新生血管性青光眼、前房和/或前房角新生血管形成、脉络膜新生血管形成(CNV)、视网膜下新生血管形成、晶状体后纤维组织形成、眼组织胞浆菌病综合症(ocular histoplasmosis syndrome)、近视变性、血管样纹、眼色素层炎、发红、晶状体后纤维组织形成、眼组织胞浆菌病和原发性中心性浆液性脉络膜视网膜病变。在一些实施方式中，所述眼病为糖尿病性视网膜病。在一些实施方式中，所述眼病为新生血管性青光眼。
[0064]在一些实施方式中，提供治疗血管疾病的方法，所述血管疾病包括心血管病，如粥样动脉硬化、再狭窄、动脉粥样化和血管瘤。粥样动脉硬化是一种形式的慢性血管损伤，其中动脉壁中一些正常血管平滑肌细胞(VSMC)改变其性质并在动脉粥样硬化斑块中发展密集的毛细血管网络。这些脆弱的微血管可以引起出血，导致血液凝结，随后是到达心肌的血流减少和心脏病发作。再狭窄通常发生在冠状动脉搭桥手术、动脉内膜切除术和心脏移植之后，并且特别地发生在心脏球囊血管成形术、经皮腔内斑块旋切术(atherectomy)、激光切除或血管内支架置入之后。其涉及微血管的广泛生长。通过抑制心血管组织中的血管生成，本文提供的方法用于治疗这些心血管疾病。
[0065]在一些实施方式中，所述方法用于风湿性关节炎的治疗，其中关节中的血管经历血管生成，形成广泛血管化的组织，其侵入并破坏软骨。通过抑制关节组织中的血管生成，本文提供的方法用于治疗风湿性关节炎。也提供治疗血友病患者关节(hemophiliacjoint)的方法。
[0066]在一些实施方式中，所述方法用于治疗血管生成相关的皮肤病，其包括但不限于银屑病、硬皮病、作为感染结果的新生血管形成(如猫抓病、细菌溃疡等)和其它皮肤疾病。在一些实施方式中，所述方法用于治疗银屑病。银屑病是一种慢性皮肤病，其发生在全世界约3％的人口中。包括电子显微技术在内的组织学研究已经确定皮肤血管形成的改变是银屑病的显著特征。皮肤组织中血管生成的抑制因此对治疗银屑病有用。
[0067]可以通过本发明所述方法治疗的其它血管生成相关疾病包括，但不限于奥-韦二氏综合症、遗传性出血性毛细血管出血、斑块新生血管形成(plaque neovascularization)、毛细血管扩张、血管纤维瘤、血管瘤、伤口生肉芽(wound granularization)、子宫内膜异位等。此外，本发明也用于鼻息肉的治疗，特别是囊肿性纤维化患者的鼻息肉。
[0068]除了治疗血管生成相关疾病，本文所述的方法也可以用于调控或防止与血管生成相关的正常生理状况事件。例如，本发明的方法可以被用于减弱与***、胚胎植入、胎盘形成等相关的新生血管形成，并因此用于生育控制的目的。
[0069]本文提供治疗本文所述多种疾病的方法。在一些实施方式中，提供治疗个体中非肿瘤性血管生成相关疾病的方法，包括给予该个体含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物(如含有载体蛋白的组合物)，其中所述组合物处于有效治疗非肿瘤性血管生成相关疾病的量。在一些实施方式中，提供治疗个体中血管生成相关眼病(包括例如黄斑变性、糖尿病性视网膜病或新生血管性青光眼)的方法，包括给予该个体含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物(如含有载体蛋白的组合物)，其中所述组合物处于有效治疗所述眼病的量。在一些实施方式中，提供治疗心血管疾病(如再狭窄和粥样动脉硬化)的方法，包括给予该个体含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物(如含有载体蛋白的组合物)，其中所述组合物处于有效治疗所述心血管疾病的量。在一些实施方式中，提供治疗血管生成相关皮肤病(如银屑病)的方法，包括给予该个体含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物(如含有载体蛋白的组合物)，其中所述组合物处于有效治疗所述皮肤病的量。在一些实施方式中，提供治疗关节炎(如风湿性关节炎)的方法，包括给予该个体含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物(如含有载体蛋白的组合物)，其中所述组合物处于有效治疗关节炎的量。
[0070]在一些实施方式中，秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体组合物如下任一种给药：至少约每三周一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次或每天一次。在一些实施方式中，每次给药之间的间隔在约一周以下，如约6、5、4、3、2或1天中任一以下。在一些实施方式中，每次给药之间的间隔恒定。例如，给药可以每天、每两天、每三天、每四天、每五天或每周进行。在一些实施方式中，给药可以每天两次、每天三次或更频繁地进行。所述组合物的施用可以在延长的时间段内延伸(中断或不中断)，例如从约一个月到约三年。例如，给药方案可以在约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30和36个月中任一的时间段内延长(中断或不中断)。在一些实施方式中，在给药方案中无间断。在一些实施方式中，每次给药之间的间隔不大于约一周。
通过抑制血管生成***相关疾病的方法
[0071]本文所述的方法也用于肿瘤组织中血管生成的抑制，以及用于***相关疾病，如癌症和良性肿瘤。
[0072]抑制血管生成(例如通过抑制新血管形成或通过靶向已生成的血管)防止充足的营养和氧气被供应给肿瘤来支持其生长超过特定的尺寸。因为血管生成涉及原发性肿瘤生长和转移，本文提供的方法能够在原发性位置抑制肿瘤的瘤生长，以及防止肿瘤在继发性位置转移。在一些实施方式中，秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体抑制新血管形成。在一些实施方式中，秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体组合物破坏已建立的肿瘤脉管***。例如，所述组合物可以在可逆或不可逆的、部分或全部地选择性阻塞、分解或以其它方式影响肿瘤脉管***(有时是增殖肿瘤脉管***)方面有效。
[0073]本发明提供通过给予有效量的含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物***相关疾病的方法，其中所述组合物的量不足以诱导明显的细胞毒性(也被称作“无细胞毒性剂量”)。利用细胞毒性药剂的传统化学疗法通常在等于或接近该药剂的最大耐受剂量的剂量下进行，以便最大化该药剂的细胞毒性作用。但是，这种高剂量方案需要延长的无治疗期间，以允许正常宿主细胞恢复。同时，肿瘤细胞也可能在无治疗期间恢复生长。这会增加发展抗药物肿瘤细胞的风险。无细胞毒性剂量的秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体允许在治疗周期无明显间断的癌症治疗，因此降低了发展药物抗性的风险。
[0074]为了提供实例，治疗癌症的方法在此被进一步描述。应该理解，本说明书通常适用所有肿瘤相关性疾病，包括良性肿瘤。
[0075]在一些实施方式中，提供治疗该个体中癌症的方法，包括给予该个体含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物，其中所述组合物处于有效治疗癌症的量，并且其中每次给约的所述组合物中秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的量在按照相同或相似给药方案或传统给药方案的相同(或相似)制剂中相同(或相似)秋水仙碱或秋水仙碱二聚体的相应MTD的约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、11％、12％、13％、14％或15％中任一以下。在一些实施方式中，每次给药组合物中的秋水仙碱或硫代秋水仙碱的量在相应MTD的约1％到约15％之间，包括例如下述任一量：相应MTD的约1％到约12％、约1％到约10％、约1％到约8％、约1％到约5％、约1％到约3％。秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的MTD已知或可以由本领域技术人员容易地测定。例如，按照每周方案的Nab-5404的MTD约为90-100mg/m2体表。
[0076]在一些实施方式中，秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体组合物如下任一方式给药：至少约每三周一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次或每天一次。在一些实施方式中，每次给药之间的间隔在约一周以下，如约6、5、4、3、2或1天中任一以下。在一些实施方式中，每次给药之间的间隔恒定。例如，给药可以每天、每两天、每三天、每四天、每五天或每周进行。在一些实施方式中，给药可以每天两次、每天三次或更频繁地进行。所述组合物的施用可以在延长的时间段内延伸(中断或不中断)，例如从约一个月到约三年。例如，给药方案可以在约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30和36个月中任一的时间段内延长(中断或不中断)。在一些实施方式中，在给药方案中无间断。在一些实施方式中，每次给药之间的间隔不大于约一周。
[0077]可以通过本发明的方法治疗的癌症包括，但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这些肿瘤更具体的实例包括，但不限于鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃(gastric)或胃(stomach)癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌(heptoma)、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾脏(kidney)或肾(renal)癌、***癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、头颈癌、B-细胞淋巴瘤(包括低度/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)(low grade/follicular non-Hodgkin’s lymphoma)、小淋巴细胞(SL)NHL、中度/滤泡性NHL、中度弥散性NHL、高度免疫母细胞NHL、高度成淋巴细胞NHL、高度小非核裂细胞NHL、巨大肿瘤(bulky disease)NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS-相关淋巴瘤和沃尔丹斯特伦巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、毛细胞白血病、慢性成髓细胞白血病和移植后淋巴增生紊乱(PTLD)、以及与瘢痣性错构瘤病、水肿(如与脑瘤相关的水肿)和麦格氏综合征(Meigs′syndrome)相关的异常血管增生。本文所述的方法对治疗涉及广泛血管生成的癌症如鳞状细胞癌特别有用。
[0078]在一些实施方式中，提供治疗原发性肿瘤的方法。在一些实施方式中，提供治疗转移性癌症(即，已经从原发性肿瘤转移的癌症)的方法。在一些实施方式中，提供治疗晚期癌症的方法。在一些实施方式中，提供治疗乳腺癌(其可以是HER2阳性或HER2阴性)的方法，所述乳腺癌包括例如晚期乳腺癌、IV期乳腺癌、局部晚期乳腺癌和转移性乳腺癌。在一些实施方式中，所述癌症为肺癌，包括例如非小细胞肺癌(NSCLC，如晚期NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC，如晚期SCLC)和肺中晚期恶性实体瘤。在一些实施方式中，所述癌症为卵巢癌、头颈癌、胃部恶性肿瘤、黑素瘤(包括转移性黑素瘤)、结肠直肠癌、胰腺癌和实体瘤(如晚期实体瘤)。在一些实施方式中，所述癌症为下述任一种(并且在一些实施方式中选自下述)：乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非何杰金淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、***癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波希肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、良性肿瘤(carcinoidcarcinoma)、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤和多发性骨髓瘤。在一些实施方式中，所述癌症为实体瘤。
[0079]本文所述的方法可以在辅助设置(adjuvant setting)中实施。“辅助设置”指的是这样的临床设置：其中个体有癌症病史，并且通常(但非必须)已经对治疗有反应，所述治疗包括但不限于手术(如手术切除)、放射治疗和化学疗法。然而，由于他们的癌症病史，这些个体被认为处于发展所述疾病的风险下。“辅助设置”中的治疗或给药指的是随后的治疗模式。风险程度(即，当在辅助设置中个体被认为“高风险”或“低风险”时)取决于若干因素，最常见的是第一次治疗时的疾病程度。本文提供的方法也可以在新辅助设置中实施，即所述方法可在主要的/确定的治疗之前进行。在一些实施方式中，所述个体以前已经被治疗。在一些实施方式中，所述个体以前没有被治疗。在一些实施方式中，所述治疗为一线治疗(首要治疗，first line therapy)。
[0080]本文所述的方法可与癌症治疗的其它方法共同进行(例如，在联合治疗设置中)。例如，在一些实施方式中，所述方法包括第一治疗和第二治疗，所述第一治疗包括施用含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物。在一些实施方式中，所述第二疗法为化学疗法。在一些实施方式中，所述第二疗法为放射疗法。在一些实施方式中，所述第二疗法为手术。第一和第二疗法可以同时或顺序(即，第一疗法在第二疗法之前或之后进行)进行。在一些实施方式中，所述方法包括向个体共同施用(包括同时或顺序)含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物与第二化学治疗剂，其中所述组合物对抑制该个体中的血管生成有效，并且其中所述组合物处于不足以在该个体中诱导细胞毒性的量。在一些实施方式中，所述第二化学治疗剂是细胞毒性剂。
含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物
秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体
[0081]本文所述的方法包括含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体组合物的施用。“秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体”用在这里指的是含有秋水仙碱、硫代秋水仙碱或其衍生物的两个(相同或不同)亚单元的化合物。秋水仙碱或硫代秋水仙碱的“衍生物”包括但不限于与秋水仙碱或硫代秋水仙碱结构相似，或与秋水仙碱和硫代秋水仙碱在相同的总化学类别中的化合物。一般来说，秋水仙碱或硫代秋水仙碱的衍生物或类似物保持与秋水仙碱或硫代秋水仙碱相似的生物、药学、化学和/或物理性质(包括例如官能度)。在一些实施方式中，所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体包含至少一个硫代秋水仙碱亚单元。在一些实施方式中，所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体包含两个硫代秋水仙碱亚单元(在下文中称为“硫代秋水仙碱二聚体”)。在一些实施方式中，所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体包含两个秋水仙碱亚单元(在下文中称为“秋水仙碱二聚体”)。
[0082]在一些实施方式中，所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体是式(I)的化合物：
Figure A20068005611200301
[0083]其中每个亚单元中的B是甲氧基或甲硫基，R2当与R3一起选取时是甲氧基、羟基或亚甲二氧基(methylenedioxy)；R3当与R2一起选取时是甲氧基、羟基或亚甲二氧基，以及X是连接基团。
[0084]多种交联基团可以被用于引入连接基团X。本领域普通技术人员将认识到：二聚体的秋水仙碱或硫代秋水仙碱单体组分具有单个反应性氨基；如果有任何其它反应(亲核)基团存在于中间体上，它们可以使用本领域公知的基团被容易地保护。保护基团的实例参见，例如，Greene，T.W.和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，3rdedition，Wiley：New York，1999，其内容因此整体引入本文作为参考。因此，与胺官能度反应的多种交联基团可以被采用。
[0085]在一些实施方式中，连接基团X包含至少一个碳原子。例如，可购买到的(Sigma-Aldrich)试剂丙二酰氯Cl-C(O)-CH2-C(O)-Cl可用于形成秋水仙碱二聚体，其中X基团为-CH2-。相似地，各种长度的其它二酰基氯可以被用于形成期望长度的X基团。例如，在式(II)中，当n＝8且Y为CH2时，可购买的(Sigma-Aldrich)试剂十二烷二酰基二氯Cl-C(O)-(CH2)10-C(O)-Cl可以被用于合成所述二聚体，其中X基团为-(CH2)10-。对于Y为NH且n＝1的基团，试剂3-异氰酸根合丙酰氯(Organic Syntheses，Coll.Vol.6，p.715(1988)；Vol.59，p.195(1979))可以被用于合成连接基团X，此时X为-NH-CH2CH2-。其它熟知的交联试剂可以被用于产生X连接体。本领域普通技术人员参见Wong，Shan S.，Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking，CRC Press：Boca Raton，1991，特别是第33-38页第2章第IV(B)部分，涉及氨基基团反应剂；第75-103页第4章第II部分，涉及氨基基团反应交联连接体；和第209-220页第7章，涉及试剂交联反应的步骤和分析以及适合交联含氨基化合物的步骤。前述Wong的参考文献的全部内容以及特别是所列举的特定部分，因此被引入本文作为参考。
[0086]在一些实施方式中，所述秋水仙碱或秋水仙碱二聚体是式(II)的化合物：
Figure A20068005611200311
[0087]其中B1是甲氧基或甲硫基，B2是甲氧基或甲硫基，n是从0到8的整数，Y是CH2基团，或者当n为1时，Y也可以是式NH的基团。
[0088]在一些实施方式中，n是(并且在一些实施方式中选自)0、1、2、3、4、5、6、7或8中任一个。在一些实施方式中，n是1。在一些实施方式中，n是1且Y是NH。在一些实施方式中，n是2。
[0089]在一些实施方式中，B1和B2都是甲氧基。在一些实施方式中，B1和B2都是甲硫基。在一些实施方式中，B1是甲氧基且B2是甲硫基。在一些实施方式中，B1是甲硫基且B2是甲氧基。在一些实施方式中，所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体是下述任一(并且在一些实施方式中选自)：IDN5404、IDN5676、IDN5800和IDN5801。
[0090]在一些实施方式中，所述化合物是硫代秋水仙碱二聚体IDN5404。IDN5404是式(III)的化合物：
Figure A20068005611200321
[0091]在一些实施方式中，所述化合物是硫代秋水仙碱二聚体IDN5676。IDN5676是式(IV)的化合物：
Figure A20068005611200322
生物相容性聚合物和载体蛋白
[0092]在一些实施方式中，本文所述的秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体组合物进一步包括生物相容性聚合物，如载体蛋白。
[0093]用在这里，术语“生物相容的”描述了不以任何不利的方式明显改变或影响引入其中的生物***的物质。生物相容性聚合物包括天然出现或合成的生物相容物质，如蛋白质、多核苷酸、多糖(如，淀粉、纤维素、葡聚糖、藻酸盐、壳聚糖、胶质、透明质酸等)和脂质。合适的生物相容性聚合物包括，例如，天然出现或合成的蛋白质，如白蛋白、胰岛素、血红蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、α-2-巨球蛋白、纤维粘连蛋白、玻连蛋白、纤维蛋白原、酪蛋白等，以及它们任意两种或多种的组合。合成的聚合物包括，例如，聚亚烷基二醇(如线性或支链)、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酸、聚乙基噁唑啉(polyethyloxazoline)、聚丙烯酰胺、聚异丙基丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚交酯/乙交酯(polylactide/glycolide)等，和它们的组合。
[0094]术语“蛋白质”指的是任意长度(包括全长或片段)的氨基酸的多肽或聚合物，其可以是线性或支化的，包括修饰的氨基酸和/或被非氨基酸中断的氨基酸。该术语也包括已经天然修饰或通过***修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰。也包括在本术语内的例如是含有一个或多个氨基酸类似物(包括，例如非天然氨基酸等)，以及本领域内已知的其它修饰的多肽。本文所述的蛋白质可以是天然出现的，即从天然来源(如血液)获得或衍生的；或合成的(如化学合成或通过重组DNA技术合成)。
[0095]合适的载体蛋白的实例包括通常在血液或血浆中发现的蛋白质，其包括但不限于白蛋白、包括IgA在内的免疫球蛋白、脂蛋白、载脂蛋白B、α-酸糖蛋白、β-2-巨球蛋白、甲状腺球蛋白、转铁蛋白(transferin)、纤维粘连蛋白、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X等。在一些实施方式中，所述载体蛋白为非血液蛋白，如酪蛋白、α-乳清蛋白和β-乳球蛋白。所述载体蛋白可以是天然来源或合成制备。在一些实施方式中，所述载体蛋白为白蛋白，如人血清白蛋白。人血清白蛋白(HSA)是Mr为65K的高度可溶的球状蛋白，并且由585个氨基酸组成。HSA是血浆中最多的蛋白，并且构成人血浆胶体渗透压的70-80％。HSA的氨基酸序列含有总共17个二硫键、一个游离硫醇(thiol)(Cys 34)，和一个色氨酸(Trp 214)。HSA溶液的静脉使用已经显示为预防和治疗低血容量休克(hypovolumic shock)(参见，例如Tullis，JAMA，237，355-360，460-463，(1977)和Houser等，Surgery，Cynecology and Obstetrics，150，811-816(1980))，并且与交换输血联合用于新生儿高胆红素血症的治疗(参见，例如Finlayson，Seminars in Thrombosis and Hemostasis，6，85-120，(1980))。其它白蛋白也被考虑，如牛血清白蛋白。这些非人白蛋白的使用例如在非人哺乳动物中使用这些组合物的情况下可以是合适的，如兽医动物(包括家养宠物和农业动物)。
[0096]人血清白蛋白(HSA)具有多个疏水结合位置(对脂肪酸的总计为8个，所述脂肪酸为HSA的内源配体)并与很多组药物结合，特别是中性和带负电的疏水化合物(Goodman等，The Pharmacological Basisof Therapeutics，9th ed，McGraw-Hill New York(1996))。在HSA的亚域IIA和IIIA中已经提出两个高亲和性结合位置，它们是高度拉长的疏水袋(hydrophobic pocket)并且在表面附近具有带电的赖氨酸和精氨酸残基，所述残基作为极性配体特征的附着点发挥作用(参见，例如Fehske等，Biochem.Pharmcol.，30，687-92(1981)，Vorum，Dan.Med.Bull.，46，379-99(1999)，Kragh-Hansen，Dan.Med.Bull.，1441，131-40(1990)，Curry等，Nat.Struct.Biol.，5，827-35(1998)，Sugio等，Protein.Eng.，12，439-46(1999)，He等，Nature，358，209-15(1992)和Carter等，Adv.Protein.Chem.，45，153-203(1994))。
[0097]为了提供实例，载体蛋白在下文被进一步描述。应该理解，该描述普遍地适用生物相容性聚合物。
[0098]所述组合物中的载体蛋白(如白蛋白)通常作为秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的载体，即与不含载体蛋白的组合物相比，所述组合物中的载体蛋白使秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体更容易悬浮在水介质中或帮助保持悬浮液。这可以避免使用用于溶解秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的有毒溶剂，并因此可以降低由那些有毒溶剂引起的一种或多种副作用。在一些实施方式中，所述组合物基本不含表面活性剂，即当所述组合物被给予个体时，所述组合物中表面活性剂的量不足以在个体中引起一种或多种副作用。在一些实施方式中，所述组合物不含表面活性剂。
[0099]在一些实施方式中，所述载体蛋白与秋水仙碱或硫代秋水仙碱缔合，即所述组合物含有载体蛋白缔合的秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体。“缔合(Association)”或“缔合的(associated)”以通常含义被用在这里，并且指影响水性组合物中秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体行为和/或性质的载体蛋白。例如，与没有载体蛋白的组合物相比，如果所述载体蛋白使秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体更容易悬浮在水介质中，所述载体蛋白和所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体被认为是“缔合的”。作为另一实例，如果所述载体蛋白使水悬浮液中的秋水仙碱或硫代秋水仙碱稳定，所述载体蛋白与所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体是缔合的。例如，所述载体蛋白与所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体可以存在于颗粒或纳米颗粒中，其在本文被进一步描述。
[0100]如果秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体长时间保持悬浮在水介质中(如没有可见的析出或沉淀)，如至少约0.1、0.2、0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48、60或72小时中任一时间，则其在水悬浮液中是“稳定”的。所述悬浮液通常但是并非必需适合给予个体(如人)。悬浮液的稳定性通常(但并非必需)在储存温度(如室温(如20-25℃)或冷藏状态(如4℃))下进行评估。例如，如果在悬浮液制备后大约15分钟时，用肉眼或在1000倍光学显微镜下观察时，其没有显示出可见的凝絮或颗粒积聚，则该悬浮液在储存温度下是稳定的。稳定性也可以在加快的测试条件下评估，如在高于约40℃的温度下评估。
[0101]所述组合物中的载体蛋白和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体可以以多种形式缔合。例如，在一些实施方式中，所述载体蛋白与秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体相混合。在一些实施方式中，所述载体蛋白包封或包载秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体。在一些实施方式中，所述载体蛋白与秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体结合(如非共价结合)。在一些实施方式中，所述组合物可以展示一个或多个上述方面。
[0102]在一些实施方式中，所述组合物包括含有(在多种实施方式中，基本由其组成)秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体和载体蛋白(如白蛋白)的颗粒(如微粒或纳米颗粒)。在一些实施方式中，秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体用载体蛋白(如白蛋白)包被。在一些实施方式中，所述组合物包含纳米颗粒(即，均值或平均直径不大于约1000纳米(nm)的颗粒)，如不大于约900、800、700、600、500、400、300、200和100nm中任一。在一些实施方式中，所述组合物中纳米颗粒的均值或平均直径不大于约200nm。在一些实施方式中，所述组合物中纳米颗粒的均值或平均直径在约20到约400nm之间。在一些实施方式中，所述纳米颗粒的均值或平均直径在约40到约200nm之间。在一些实施方式中，所述纳米颗粒是可无菌过滤的。
[0103]本文描述的颗粒(如微粒或纳米颗粒)可存在于干制剂(如冻干的组合物)中或悬浮在生物相容性介质中。合适的生物相容性介质包括但不限于水、缓冲水介质、盐水、缓冲盐水、氨基酸的任选缓冲溶液、蛋白质的任选缓冲溶液、糖类的任选缓冲溶液、维生素的任选缓冲溶液、合成聚合物的任选缓冲溶液、含脂质的乳液等。
[0104]本文所述组合物中载体蛋白的量取决于所述组合物中药物试剂和其它组分而变化。在一些实施方式中，所述组合物含有的载体蛋白的量足以稳定水悬浮液中的秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体，例如，处于稳定的胶态悬浮液的形式(如微粒或纳米颗粒的稳定悬浮液)。在一些实施方式中，所述载体蛋白处于降低水介质中秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体沉淀率的量。对于含颗粒的组合物，所述载体蛋白的量也取决于秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体颗粒的尺寸和密度。
[0105]在一些实施方式中，所述载体蛋白以足以将水悬浮液中的秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体稳定在特定浓度的量存在。例如，所述组合物中秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的浓度为约0.01到约100mg/ml，包括例如下述任一：约0.01到约50mg/ml、约0.1到约50mg/ml、约1到约10mg/ml、约2mg/ml到约8mg/ml、约4到约6mg/ml、约5mg/ml。在一些实施方式中，秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的浓度至少约为下述任一：0.01mg/ml、0.03mg/ml、0.05mg/ml、0.08mg/ml、0.1mg/ml、0.3mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/ml、1mg/ml、1.3mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、40mg/ml和50mg/ml。在一些实施方式中，所述载体蛋白以避免使用表面活性剂的量存在，以便所述组合物不含或基本不含表面活性剂。
[0106]在一些实施方式中，液体形式的组合物包含约0.1％到约50％(w/v)(如约0.5％(w/v)、约5％(w/v)、约10％(w/v)、约15％(w/v)、约20％(w/v)、约30％(w/v)、约40％(w/v)或约50％(w/v))的载体蛋白。在一些实施方式中，液体形式的组合物包含约0.5％到约5％(w/v)的载体蛋白。
[0107]在一些实施方式中，载体蛋白如白蛋白与秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的重量比使得足量的秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体与细胞结合或被细胞运输。在一些实施方式中，载体蛋白如白蛋白与秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的重量比(w/w)为约0.01∶1到约100∶1、约0.02∶1到约50∶1、约0.05∶1到约20∶1、约0.1∶1到约20∶1、约1∶1到约18∶1、约2∶1到约15∶1、约3∶1到约12∶1、约4∶1到约10∶1、约5∶1到约9∶1或约9∶1。在一些实施方式中，载体蛋白(如白蛋白)与秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的重量比为约任意下述：18∶1或更小、15∶1或更小、14∶1或更小、13∶1或更小、12∶1或更小、11∶1或更小、10∶1或更小、9∶1或更小、8∶1或更小、7∶1或更小、6∶1或更小、5∶1或更小、4∶1或更小和3∶1或更小。
[0108]在一些实施方式中，所述组合物包含含有(在多种实施方式中，基本由其组成)硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404或IDN5676)和白蛋白的颗粒(如微粒或纳米颗粒)。所述颗粒(如微粒或纳米颗粒)可以具有不大于约10、9、8、7、6、5、4、3、2或1微米的均值或平均直径。在一些实施方式中，所述颗粒为纳米颗粒，即约1000纳米(nm)以下的颗粒。例如，所述纳米颗粒可以不大于约900、800、700、600、500、400、300、200和100nm中任一。在一些实施方式中，所述纳米颗粒的均值或平均直径不大于约200nm。在一些实施方式中，所述纳米颗粒的均值或平均直径在约20到约400nm之间。在一些实施方式中，所述纳米颗粒的均值或平均直径在约40到约200nm之间。在一些实施方式中，所述颗粒是可无菌过滤的。
[0109]在一些实施方式中，所述硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404或IDN5676)用白蛋白包被。在一些实施方式中，白蛋白与硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404或IDN5676)的重量比(w/w)为下述任一：约0.01∶1到约100∶1、约0.02∶1到约50∶1、约0.05∶1到约20∶1、约0.1∶1到约20∶1、约1∶1到约18∶1、约2∶1到约15∶1、约3∶1到约12∶1、约4∶1到约10∶1、约5∶1到约9∶1和约9∶1。在一些实施方式中，白蛋白与硫代秋水仙碱二聚体的重量比在下述任一以下：约18∶1或更小、15∶1或更小、14∶1或更小、13∶1或更小、12∶1或更小、11∶1或更小、10∶1或更小、9∶1或更小、8∶1或更小、7∶1或更小、6∶1或更小、5∶1或更小、4∶1或更小和3∶1或更小。
[0110]在一些实施方式中，含有硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404或IDN5676)和白蛋白的颗粒(如微粒或纳米颗粒)被悬浮在水介质中(如含有白蛋白的水介质)。例如，所述组合物可以是含有硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404或IDN5676)颗粒(如微粒或纳米颗粒)的胶态悬浮液。在一些实施方式中，所述组合物为干组合物(如冻干组合物)，其可以被重构为含硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404或IDN5676)颗粒的水悬浮液。在一些实施方式中，所述组合物中硫代秋水仙碱二聚体(如IDN5404或IDN5676)的浓度在约0.1到约100mg/ml之间，包括例如下述任一：约0.1到约50mg/ml、约0.1到约20mg/ml、约1到约10mg/ml、约2mg/ml到约8mg/ml、约4到约6mg/ml、约5mg/ml。在一些实施方式中，IDN5404或IDN5676的浓度至少约为下述任一：1.3mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、40mg/ml和50mg/ml。
[0111]在一些实施方式中，所述组合物IDN5404或IDN5676的纳米颗粒制剂(下文中称作Nab-5404或Nab-5676)。Nab-IDN5404和Nab-5676分别是由人血清白蛋白稳定的IDN5404和IDN5676的纳米颗粒制剂。这些纳米颗粒制剂可以通过美国专利号5,916,596和美国专利申请公布号2005/0004002所述的方法产生。当分散在合适的水介质，如0.9％氯化钠注射液或5％葡聚糖注射液中时，Nab-5404(或Nab-5676)形成硫代秋水仙碱二聚体的稳定胶态悬浮液。所述胶态悬浮液中颗粒的尺寸(即均值或平均直径)可在20nm到8微米范围内，优选的范围是约20-400nm。由于HSA自由溶解在水中，Nab-5404(或Nab-5676)可以以宽范围的浓度重构，从稀释的(0.1mg/ml IDN5404或IDN5676)到浓缩的(20mg/mlIDN5404或IDN5676)浓度，包括例如约2mg/ml到约8mg/ml，约5mg/ml。在一些实施方式中，IDN5404或IDN5676的浓度约为下述任一：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20mg/l。
药物组合物、单位剂量和试剂盒
[0112]本文也提供含有秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的药物组合物。所述药物组合物可适合本文所述的多种给药方式，包括例如全身或局部给药。所述药物组合物可以是滴眼剂、可注射溶液的形式，或适合吸入(通过口或鼻)或口服给药的形式。本文所述的药物组合物可以以单个单位剂量或以多剂量形式包装。在一些实施方式中，所述组合物适合施用于人。在一些实施方式中，所述组合物适合施用于哺乳动物，如，在兽医的环境下，家养宠物和农业动物。有多种所述组合物的合适制剂(参见，例如美国专利号5,916,596和6,096,331)。
[0113]在一些实施方式中，所述药物组合物包含秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体、载体蛋白和适合眼内注射的药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包含秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体、载体蛋白和适合局部施用于眼部的药学上可接受的载体。在一些实施方式中，所述药物组合物包含秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体、载体蛋白和适合动脉内注射的药学上可接受的载体。
[0114]所述药物组合物通常以无菌且基本等渗的组合物配制。对于注射而言，所述药物组合物可以是液态溶液的形式，例如，在生理相容的缓冲液如汉克斯液或林格溶液(Ringer’s solution)中。所述药物组合物也可以是固体的形式，并且在使用前立即再溶解或再悬浮。也包括冻干组合物。
[0115]对于口服制剂，所述药物组合物可以采用例如利用药学上可接受的赋形剂通过传统方法制备的片剂或胶囊的形式，所述药学上可接受的赋形剂如粘合剂(例如，预胶凝化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉甘醇酸钠)；或润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)。口服给药的液体制剂可以采用例如溶液、糖浆或悬浮液的形式，或它们可以以干产品呈现，用于使用前与水或其它合适载体构成。这些液体制剂可以通过传统的方法利用药学上可接受的添加剂制备，所述添加剂如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化的可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或***胶)；非水性载体(例如，ationd油、油性酯类、乙醇或分馏的植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯，或山梨酸)。所述制剂也可以视情况含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
[0116]本发明在一些实施方式中提供包含秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体、载体蛋白和适合施用于眼部的药学上可接受载体的组合物。这样的药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油等。盐溶液和葡聚糖水溶液、聚乙二醇(PEG)和甘油溶液也可以被用作液体载体，特别用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、甘油、丙烯、水等。所述药物组合物，如果希望，也可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲试剂。所述组合物的组分可被包在聚合物或纤维蛋白胶中，以提供受控的分子释放。这些组合物可以采用溶液、悬液、乳剂、软膏、凝胶或其它固体或半固体组合物等的形式。所述组合物通常具有4.5到8.0范围内的pH。所述组合物也必须被配制成具有与眼和眼组织的水状体相容的渗透值。这样的渗透值通常在约200到约400毫渗摩/千克水(mOsm/kg)的范围内，但是优选地为约300mOsm/kg。
[0117]在一些实施方式中，所述组合物按照常规步骤被配制为适合静脉内、腹膜内或玻璃体内注射的药物组合物。典型地，注射用组合物为在无菌等渗水缓冲液中的溶液。必要时，所述组合物也可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因以减轻注射位置的疼痛。一般来说，所述成分以单位剂型单独供应或混合在一起，例如，在标明活性药量的气密密封容器如安瓿或sachette中的干燥冻干粉末或无水浓缩物。在所述组合物要通过输注施用时，其可以被分散在含有无菌药物级水或盐水的输注瓶中。在所述组合物通过注射给药时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿，以便组分在施用前混合。
[0118]所述组合物可进一步包含其它组分，例如防腐剂、缓冲剂、张度剂、抗氧化剂和稳定剂、非离子润湿剂或澄清剂、增粘剂等。
[0119]用在溶液中的合适的防腐剂包括聚季铵盐-1、苯扎氯铵、乙基汞硫代水杨酸钠、氯丁醇、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、苯基乙醇、乙二胺四乙酸二钠、山梨酸、苄索氯铵等。典型地(但非必须地)，这些防腐剂在以按重量计0.001％到1.0％的量被使用。
[0120]合适的缓冲剂包括硼酸、碳酸氢钠和碳酸氢钾、硼酸钠和硼酸钾、碳酸钠和碳酸钾、醋酸钠、磷酸二氢钠等，其量足以维持pH在约pH6和pH8之间，并且优选地，在约pH7和pH7.5之间。
[0121]合适的张度剂是葡聚糖40、葡聚糖70、葡萄糖、甘油、氯化钾、丙二醇、氯化钠等，使得眼溶液的氯化钠等价物在0.9±0.2％的范围内。
[0122]合适的抗氧化剂和稳定剂包括亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、硫代亚硫酸钠、硫脲等。合适的润湿剂和澄清剂包括聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆282和泰洛沙泊(tyloxapol)。合适的增粘剂包括葡聚糖40、葡聚糖70、明胶、甘油、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、羊毛脂、甲基纤维素、矿油、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素等。
[0123]使用粘度增强剂以便为局部组合物提供大于单纯水溶液粘度的粘度可以是期望的，以增加靶组织对活性化合物的眼部吸收，或增加在眼部的保留时间。这样的粘度增效剂(viscosity building agent)包括例如，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素或本领域技术人员已知的其它物质。这些物质典型地在以按重量计0.01％到2％的量上被采用。
[0124]本文所述的组合物也可以包括其它试剂、赋形剂或稳定剂，以改善所述组合物的性质。例如，要通过提高纳米颗粒的负ζ电势来增加稳定性，某些带负电荷的组分可被添加。这些带负电荷的组分包括，但不限于胆酸的胆酸盐，所述胆酸包含甘氨胆酸、胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺胆酸、甘氨鹅脱氧胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、石胆酸、熊去氧胆酸、脱氢胆酸和其它胆酸；磷脂，包括卵磷脂(蛋黄)基的磷脂，其包括以下磷脂酰胆碱：棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬酯酰亚油酰磷脂酰胆碱、硬酯酰油酰磷脂酰胆碱、硬酯酰花生酰磷脂酰胆碱(stearoylarachidoylphosphatidylcholine)和二棕榈酰磷脂酰胆碱。其它磷脂包括L-α-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬酯酰磷脂酰胆碱(DSPC)、氢化大豆油磷脂酰胆碱(HSPC)和其它相关化合物。带负电荷的表面活性剂或乳化剂也适合作为添加剂，如胆甾醇基硫酸钠等。
[0125]也提供秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体组合物的单位剂型，例如，含有约0.1mg到约50mg的单位剂量，包括例如约0.2mg到约50mg、约0.5mg到约30mg、约1mg到约20mg或约15mg秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体。术语“单位剂型”指的是适合作为用于个体的单剂量的物理上分离的单位，每个单位含有与合适的药物载体、稀释剂或赋形剂结合的经计算可产生期望治疗效果的预定量的活性物质。这些单位剂型可以单个或多个单位剂量储存在合适的包装中，并也可以被进一步灭菌和密封。在一些实施方式中，提供秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体和载体蛋白的单位剂型，其适合眼内注射。在一些实施方式中，提供秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体和载体蛋白的单位剂型，其适合局部应用于眼部。在一些实施方式中，提供秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体和载体蛋白的单位剂型，其适合动脉内注射。
[0126]也提供在合适包装中含有本文所述组合物的制品。用于本文所述组合物(如眼用组合物)的合适包装在本领域内已知，并包括例如小瓶(vial)(如密封的小瓶)、小管(vessel)、安瓿、瓶、罐、软包装(如密封的聚酯膜或塑料袋)等。这些制品可被进一步灭菌和/或密封。
[0127]本发明也提供含有本文所述组合物(或单位剂型和/或制品)的试剂盒，并且其可进一步包含使用所述组合物的方法说明书，如本文所述的用法。本文所述的试剂盒可进一步包括从商业和用户立场上期望的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有用于实施本文所述任何方法的说明的说明书。例如，在一些实施方式中，所述试剂盒包括秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体、载体蛋白、适合眼内注射的药学上可接受载体，和一种或多种：缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有用于实施眼内注射的说明的说明书。在一些实施方式中，所述药物组合物包含秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体、载体蛋白、适合动脉内注射的药学上可接受的载体，和一种或多种：缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有用于实施动脉内注射说明的说明书。
[0128]尽管上述发明出于清楚理解的目的，已经通过阐述和举例相当详细地予以描述，但是对本领域普通技术人员来说是明显的是，一些小的变化和改动可以被实施。因此，所述描述和实例不应该被解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1.Nab-5404和Nab-5676的体外细胞毒性活性
[0129]Nab-5404和Nab-5676的细胞毒性活性使用MX-1乳腺癌、HepG2肝细胞瘤、HT-29结肠癌细胞系和正常原代大鼠肝细胞进行体外评估。在37℃使细胞暴露于一系列浓度增加的Nab-5404和Nab-567672小时。存活率使用Cell Titer Blue细胞存活率检测(cell viability assay)(Promega，Madison，WI)分析。使用Prism软件(GraphPad，San Diego，CA)利用单相指数衰减公式计算IC50。
[0130]Nab-5404显示出对抗HepG2肝细胞瘤细胞和原代大鼠肝细胞的细胞毒性活性，IC50分别为16和9μg/ml。Nab-5404和Nab-5676都对MX-l细胞显示出中等的细胞毒性，IC50分别为43和54μg/ml。Nab-5404和Nab-5676对抗HT-29细胞的活性低，IC50分别为1l0和149μg/ml。Nab-5676在HepG2细胞或原代大鼠肝细胞中显示出很小或不显示细胞毒性活性。结果归纳于表1。
表1
  细胞系   Nab-5404IC50(μg/ml)   Nab-5676IC50(μg/ml)
  MX-1乳腺癌   43   54
  HepG2肝细胞瘤   16   125
  HT-29结肠癌   110   149
  原代大鼠肝细胞   9   无活性
实施例2.Nab-5404和Nab-5676的抗微管活性
[0131]Nab-5404和Nab-5676的微管解聚活性使用MX-1乳腺癌细胞系进行测试。MX-1细胞在盖玻片上接种并用0.01到100μg/ml浓度范围的Nab-5404或Nab-5676在37℃处理2小时。温育后，细胞被固定并对微管蛋白和肌动蛋白染色。微管蛋白用单克隆抗微管蛋白抗体染色而肌动蛋白用荧光素标记的毒伞素(phalloidin)染色。微管网络使用ImagePro软件(MediaCybernetics，Inc.，Silver Spring MD)观察并分析。Nab-5404和Nab-5676对微管去稳定活性的IC50使用Prism软件(GraphPad，SanDiego，CA)计算。
[0132]Nab-5404和Nab-5676都显示出有效的微管解聚活性，计算的IC50分别为0.06μg/ml和0.12μg/ml(图1A和1B)。即使在测试的最低浓度0.6μg/ml，微管网络在用Nab-5404或Nab-5676温育2小时后被完全破坏(图2A-2C)。相反，肌动蛋白束不受任何药物浓度下的Nab-5404或Nab-5676的影响。
实施例3.Nab-5404和Nab-5676的抗血管生成活性
[0133]为研究Nab-5404和Nab-5676对血管生成的作用，所述化合物使用TCS CellWorks AngioKit模型(TCS CellWorks Ltd.，BotolphClaydon，Buckingham UK)在微血管形成检测中进行评估。AngioKit模型使用与其它人源细胞共培养的人内皮细胞。内皮细胞最初在培养基质中形成小岛，随后开始增殖并接着进入迁移期，在迁移期中它们移动穿过基质，形成线状小管结构。这些逐渐连接起来，形成小管网络，其与毛细血管床非常相似(在第9-11天)。小管对冯维勒布兰德因子、CD31(PECAM-1)和ICAM-2染色阳性。
[0134]除了Nab-5404和Nab-5676，已知的血管靶向剂考布他汀4-磷酸酯(combretastatin 4-phosphate，CA4P)，被测试体外抗血管生成活性。TCS CellWorks AngioKit模型按照制造商的说明被使用。如上文所述，人内皮细胞与人纤维母细胞在24孔板中共培养，并暴露于一系列浓度(0.01到100μg/ml)的Nab-5404、Nab-5676或CA4P。温育11或12天后，通过固定细胞并使用抗CD31的单克隆抗体、二抗偶联物和着色的底物染色来观察小管。小管的长度使用ImagePro软件分析并且每种化合物的IC50使用Prism软件计算。
[0135]Nab-5404和Nab-5676都抑制小管形成并且分解已形成的小管，显示出抗血管生成活性。在第一个试验中，细胞在第1天用所述组合物处理，并在第12天染色以分析小管形成的抑制。在第二个试验中，细胞在第8天处理并在第11天染色，而在第三个试验中，细胞在第11天处理并在第12天染色，这允许分析已形成小管的分解。
[0136]Nab-5404和Nab-5676都能够抑制新生微血管的形成(图3和4)。在第二个试验中，Nab-5404和Nab-5676都能够抑制小管形成和/或分解已形成的小管(图5)。Nab-5404在分解已形成的小管方面比Nab-5676更有效(图6、7和9)。Nab-5404的IC50计算为0.002μg/ml，其比IC50为0.02μg/ml的Nab-5676效力大10倍。Nab-5404在分解已形成的小管方面与CA4P(IC50＝0.003μg/ml)一样有效(图6、8和9)。
实施例4.Nab-5404和Nab-5676的抗肿瘤活性
[0137]Nab-5404和Nab-5676的抗肿瘤活性在异种移植小鼠模型中进行评估。在两个周期内针对已生成的HT-29结肠细胞肿瘤，体内测试化合物，第一周期为低剂量方案，接着是第二高剂量方案。伊立替康(Irinotecan)被用作本研究中的阳性对照。小鼠(n＝10)被分为8个组，其中Nab-5404和Nab-5676小鼠通过静脉内注射接受所述化合物。第一周期包括第0-14天每3天施用Nab-5404或Nab-5676，施用4个剂量，接着第二周期，其包括第15-30天每3天施用Nab-5404或Nab-5676，施用4个剂量。伊立替康每3天以60mg/kg的剂量通过静脉内注射施用，施用4个剂量。各组被显示于表2中，其中第一周期指的是第0-14天而第二周期指的是第15-30天。
[0138]表2
  处理   第一周期剂量   第一周期方案   第二周期剂量   第二周期方案
  对照载体
  伊立替康   60mg/kg   q3dx4
  Nab-5404   3.4mg/kg   q3dx4   40mg/kg   q3dx4
  Nab-5404   2.5mg/kg   q3dx4   30mg/kg   q3dx4
  Nab-5404   1.7mg/kg   q3dx4   20mg/kg   q3dx4
  Nab-5676   3.4mg/kg   q3dx4   40mg/kg   q3dx4
  Nab-5676   2.5mg/kg   q3dx4   30mg/kg   q3dx4
  Nab-5676   1.7mg/kg   q3dx4   20mg/kg   q3dx4
[0139]如图10和11所示，在较低的剂量，Nab-5404和Nab-5676都显著地抑制肿瘤生长，其中3.4、2.5和1.7mg/kg的Nab-5404的p值为0.02、0.007、0.001，而3.4、2.5和1.7mg/kg的Nab-5676的p值为0.04、0.003和0.0004。Nab-5404和Nab-5676在低剂量下的抗肿瘤活性表明这些化合物具有抗血管生成活性。在较高的剂量，与Nab-5676相比，用Nab-5404处理后有显著更大的肿瘤退化。基于体重减轻数据，在该模型中，具有显著肿瘤退化的Nab-5404的MTD为约30mg/kg。
[0140]在单独试验中考布他汀4-磷酸酯(CA4P)也被给予患有HT-29肿瘤的小鼠。在肿瘤达到900mm3时，用载体或CA4P以100mg/kg的报告MTD基于每天给药4剂量处理小鼠(n＝10)。发现CA4P在该肿瘤模型中无活性，与对照载体没有差别(图12)。
[0141]尽管上述发明出于清楚理解的目的，已经通过阐述和举例相当详细地予以描述，但是对本领域普通技术人员来说是明显的是，一些小的变化和改动可以被实施。因此，所述描述和实例不应该被解释为限制本发明的范围。

Claims (31)

1.抑制个体中血管生成的方法，包括给予所述个体包含载体蛋白和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物，其中所述组合物处于有效抑制血管生成的量，并且其中所述组合物的量不足以在所述个体中诱导明显的细胞毒性。
2.治疗个体中非肿瘤性血管生成相关疾病的方法，包括给予所述个体包含载体蛋白和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物，其中所述组合物的量有效治疗所述非肿瘤性血管生成相关疾病。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述非肿瘤性血管生成相关疾病为眼病。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述眼病为年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病或新生血管性青光眼。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述非肿瘤性血管生成相关疾病为心血管疾病。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述心血管疾病是再狭窄或动脉粥样硬化。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述非肿瘤性血管生成相关疾病为风湿性关节炎或银屑病。
8.如权利要求2所述的方法，其中所述组合物的量不足以在所述个体中诱导明显的细胞毒性。
9.治疗个体中癌症的方法，包括给予所述个体包含载体蛋白和秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的组合物，其中所述组合物是有效治疗癌症的量，并且其中所述组合物的量不足以在所述个体中诱导明显的细胞毒性。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述组合物中所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的量为所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的相应MTD的约15％以下。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述癌症为实体瘤。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述癌症为转移性实体瘤。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体是式(II)的化合物：
Figure A2006800561120003C1
其中：
B1是甲氧基或甲硫基；
B2是甲氧基或甲硫基；
n是从0到8的整数；
Y是CH2基团，或当n为1时，Y也可以为式NH的基团。
14.如权利要求13所述的方法，其中Y为CH2。
15.如权利要求13所述的方法，其中n为1且Y为NH。
16.如权利要求13所述的方法，其中B1和B2都是甲硫基。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述化合物为IDN5404。
18.如权利要求13所述的方法，其中所述化合物为IDN5676。
19.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述组合物中所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的量在约15mg/m2以下。
20.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述组合物每周施用一次。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述组合物被无间断地施用约3个月以上。
22.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述组合物基本不含表面活性剂。
23.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述载体蛋白为白蛋白。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述白蛋白与秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的比率在约18∶1以下。
25.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述组合物包含含有所述载体蛋白和所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的纳米颗粒。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述载体蛋白为白蛋白。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述白蛋白与所述秋水仙碱或硫代秋水仙碱二聚体的比率在约18∶1以下。
28.如权利要求25所述的方法，其中所述纳米颗粒具有200nm或更小的平均直径。
29.如权利要求25所述的方法，其中所述组合物基本不含表面活性剂。
30.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述组合物为Nab-5404。
31.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述个体为人。
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