CN101565418B

CN101565418B - 酰胺衍生物及其用途

Info

Publication number: CN101565418B
Application number: CN2008100365109A
Authority: CN
Inventors: 蒋华良; 李洪林; 李剑; 黄瑾; 朱进; 陈曈; 车鹏; 刘彦青; 卢伟强; 陈莉莉; 沈旭; 洛夫; 希金弗
Original assignee: East China University of Science and Technology; Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: East China University of Science and Technology; Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2008-04-23
Filing date: 2008-04-23
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2028-04-23
Also published as: CN101565418A

Abstract

本发明涉及一种酰胺衍生物及其用途。本发明公开了一类N-(4-取代氨酰基苯基)-5-取代呋喃-2-甲酰胺化合物，并测试该类化合物在体外酶水平实验测试中抑制falcipain-2的活性，结果证明其具有较强的falcipain-2抑制活性。因此，本发明所提供的N-(4-取代氨酰基苯基)-5-取代呋喃-2-甲酰胺类化合物可作为疟原虫食物泡内半胱氨酸蛋白酶(falcipain-2)抑制剂，从而阻止疟原虫在宿主体内的进一步增殖。

Description

酰胺衍生物及其用途

技术领域

本发明涉及一种酰胺衍生物及其用途，具体地说，涉及一种N-(4-取代氨酰基苯基)-5-取代呋喃-2-甲酰胺类化合物及其用途。

背景技术

疟疾是地球上发生最频繁的寄生虫病，是由按蚊进行传播、具有潜在致命危险的疾病。随着已有抗疟药物的耐药性的不断增加，疟疾的发病率日益增加，亟待具有新型治疗作用的抗疟药物的发现。

红细胞内期的疟原虫在其酸性食物泡内水解宿主的血红蛋白以获得自身生命所需的能量和氨基酸。生物学研究表明，在疟原虫的食物泡内包涵一系列的水解酶，如天冬氨酸蛋白酶(plasmepsins)，半胱氨酸蛋白酶(falcipains)，和金属蛋白酶(falcilysins)。这些酶已成为疟疾化学治疗的潜在的靶标。

半胱氨酸蛋白酶是M_τ约为21000～30000的蛋白质，在pH值为4～6.5时具有最高水解活性，它的活性部位具有半胱氨酸残基。疟原虫的半胱氨酸蛋白酶属于木瓜蛋白酶家族。已知的疟原虫半胱氨酸蛋白酶有四个亚型，falcipain-1，falcipain-2A，falcipain-2B，falcipain-3。Falcipain 1是第一个表达得到的疟原虫半胱氨酸蛋白酶，其生物学研究表明，它对疟原虫的无性生殖阶段并无影响，但能显著的影响卵囊的功能。Falcipain-2A，falcipain-2B具有97％的同源性，仅在氨基酸序列的7位有所不同。通过寡核苷酸探针的监测发现，falcipain-2BmRNA的表达水平比falcipain-2A低。然而falcipain-2A和falcipain-2B在疟原虫营养体晚期其表达的时间依赖性和峰值极为相似，这表明两种不同的亚型具有相似的生物学功能。Falcipain-3与falcipain-2在催化域有66.6％的同源性，但是它们表达的阶段有所不同。Falcipain-2在营养体阶段表达达到最高峰，而falcipain-3在更为成熟的疟原虫阶段表达达到高峰。在这几种亚型中，对于falcipain-2的研究最多，因此其抑制剂的开发亦受到更为广泛的关注。

近年来，“计算机辅助药物设计”(Computer-Aided Drug Design，CADD)已成为现代药物研究与开发的一个重要方法和工具。运用计算机辅助药物设计平均而言能缩短新药研究周期0.9年，节省研究与开发费用1.3亿美元。因此，CADD方法已广泛地应用于先导化合物的发现与优化。计算机辅助高通量虚拟已经成为目前常用的一种计算机辅助药物发现方法。其原理是运用超级计算机通过分子对接的方法在多达数百万的小分子化合物库中寻找可以与某一特定疾病靶标蛋白结合的化学结构，为进一步的分子、细胞、动物和临床研究提供高效可靠的小分子先导化合物。

综上所述，以半胱氨酸蛋白酶falcipain-2作为靶标，结合CADD和各种水平的生物活性测试试验，设计并合成的小分子化合物，对开发抗疟药物具有重要的现实意义。

发明内容

本发明综合运用CADD和基于BIAcore的SPR实验，发明人已经找到了一个N-(4-取代氨酰基苯基)-5-取代呋喃-2-甲酰胺化合物，运用合理药物设计方法针对此化合物进行结构修饰，并测试此类化合物在体外酶水平实验测试中抑制falcipain-2的活性，结果证明其具有较强的falcipain-2抑制活性。

本发明所说的N-(4-取代氨酰基苯基)-5-取代呋喃-2-甲酰胺类化合物，具有式I所示结构：

式I中：R₁为氢，C₁-C₆直链或支链的饱和或不饱和烷基，C₃-C₇饱和或不饱和环烷基，5-7元芳(香)环基，5-7元杂环基，取代的5-7元芳(香)环基或取代的5-7元杂环基；

R₂为甲基或R₃OCH₂-，R₃为5-7元芳(香)环基或取代的5-7元芳(香)环基；X为C或S＝O；

其中，所述取代的5-7元芳(香)环基和取代的5-7元杂环基中的取代基选自：卤素、C₁-C₆直链或支链烃基、羟基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄不饱和烃氧基、羧基、酯基、C₁-C₆羧基烷氧基、C₁-C₆酯基烷氧基、C₁-C₆羧基烷基、C₁-C₆酯基烷基、氰基、硝基、氨基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、巯基或C₁-C₄酰基中一种、二种或二种以上，取代基的个数为1～4；

所述杂环基的杂原子为氧、硫或/和氮，杂原子的个数为1～3。

在本发明一个优选技术方案中，X为S＝O时，其具有式I_A所示结构：

式I_A中：R₁为氢，5-7元芳(香)环基，5-7元杂环基，取代的5-7元芳(香)环基或取代的5-7元杂环基；

R₂为甲基或R₃OCH₂-，R₃为5-7元芳(香)环基或取代的5-7元芳(香)环基；

其中，所述取代的5-7元芳(香)环基和取代的5-7元杂环基中的取代基选自：卤素、C₁-C₆直链或支链烃基或C₁-C₄烷氧基中一种、二种或二种以上，取代基的个数为1～4；

所述杂环基的杂原子为氮，杂原子的个数为1～3。

更优选的R₁为氢、含氮6元杂环基或由C₁-C₄烷氧基取代的含氮6元杂环基；

更优选的R₂为甲基或R₃OCH₂-，R₃为6元芳(香)环基或取代的6元芳(香)环基，其中所述的取代的6元芳(香)环基的取代基为卤素或C₁-C₃烷基，取代基的个数为1～4。

在本发明另一个优选技术方案中，X为C时，其具有式I_B所示结构：

式I_B中：R₁为氢，5-7元芳(香)环基，5-7元杂环基，取代的5-7元芳(香)环基或取代的5-7元杂环基；

R₂为R₃OCH₂-，R₃为5-7元芳(香)环基或取代的5-7元芳(香)环基；

更优选的R₂为R₃OCH₂-，R₃为6元芳(香)环基或取代的6元芳(香)环基，其中所述的取代的6元芳(香)环基的取代基为卤素或C₁-C₃烷基，取代基的个数为1～4。

附图说明

图1阳性对(Z-Phe-Arg-pNAHCl)照和化合物I_A-1与FP-2蛋白相结合的动力学曲线图，

其中各条线由上到下代表的化合物浓度依次为1x10^-5M、5x10^-6M、2.5x10^-6M、1.25x10^-6M、6.25x10^-7M、3.125x10^-7M和0。

图2.化合物I_A-1和I_A-5的IC₅₀值。

具体实施方式

一种制备本发明所述的N-(4-取代氨酰基苯基)-5-取代呋喃-2-甲酰胺类化合物的方法，其主要合成路线如下所示：

合成路线中：Ac为乙酰基(CH₃CO)，Y为卤素(F、Cl、Br或I)，R₁的含义与前文所述相同。

具体包括如下步骤：

式I_A所示化合物的制备：

1)将5-氯甲基呋喃-2-甲酸甲酯、R₃OH(如取代芳基酚)、无机碱与有机溶剂混合，回流过夜；蒸除大部分溶剂，加水，有机溶剂萃取，干燥，蒸干溶剂，得到5-(取代芳基氧甲基)呋喃-2-甲酸甲酯(式II所示化合物)。

2)将步骤1)中得到的化合物II与无机碱投入到适量甲醇中，50℃搅拌过夜；蒸除大部分溶剂，加水，用盐酸调pH＝1，析出固体，抽滤得5-(取代芳基氧甲基)呋喃-2-甲酸(式III所示化合物)。

3)室温下R₁取代胺在碱性溶液中与对-乙酰氨基苯磺酰氯反应，温度在40℃～45℃，搅拌12～36小时。将反应液倾入水中，有机溶剂萃取，得到的有机层经干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离得4-乙酰氨基-N-R₁取代苯磺酰胺。将此磺酰胺投入到10％的氢氧化钠水溶液中回流2小时，控制反应液温度在70℃～80℃，浓盐酸调pH＝4-5，析出大量固体，经抽滤，水洗，干燥得产物4-氨基-N-R₁取代苯磺酰胺(式IV所示化合物)。

4)将步骤2)中得到的化合物投入适量卤代试剂中回流2小时，减压浓缩得5-(取代芳基氧甲基)呋喃-2-甲酰卤(式V所示化合物)，不经纯化直接用于下步反应。

用少量干燥的卤代烃(如二氯甲烷)溶解甲酰卤(式V所示化合物)。室温搅拌下，滴入步骤3)中得到的化合物IV与吡啶的混合溶液中。室温反应过夜，加水，用盐酸调pH＝2～3，析出固体，抽滤，水洗、干燥得到化合物N-[(4-R₁取代氨磺酰)苯基]-5-芳基氧甲基呋喃-2-甲酰胺(目标化合物之一)。

或

1)将氢氧化钠溶于水中，控温0℃～5℃，依次滴加氧化剂(如溴等)和5-甲基呋喃-2-甲醛，维持此温度，搅拌反应1～3小时，反应液用***萃取两次，水层用盐酸调pH＝1，析出大量固体，抽滤，水洗得5-甲基呋喃-2-甲酸(式VII所示化合物)。

2)将步骤1)中得到的化合物VII投入适量卤代试剂中回流2小时，减压浓缩得5-甲基呋喃-2-甲酰卤(式VIII所示化合物)，不经纯化直接用于下步反应。

用少量干燥的卤代烃(如二氯甲烷)溶解化合物VIII。室温搅拌下，滴入4-氨基-N-R₁取代苯磺酰胺(式IV所示化合物)与吡啶的混合溶液中。室温反应过夜，加水，用盐酸调pH＝2～3，析出固体，抽滤，水洗、干燥得到化合物N-[(4-R₁取代氨磺酰)苯基]-5-甲基呋喃-2-甲酰胺(目标化合物之二)

式I_B所示化合物的制备：

1)在四氢呋喃溶剂中，R₁取代胺、对-硝基苯甲酰卤(对-硝基苯甲酰氯)和有机碱回流反应，搅拌12～36小时。将反应液倾入水中，有机溶剂萃取，得到的有机层经干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离得4-硝基-N-R₁取代苯甲酰胺。将此酰胺投入到10％ Pd-C的醋酸水溶液(70％，V/V)中反应30小时，控制反应液温度在20℃～40℃，抽滤，浓缩得产物4-氨基-N-R₁取代苯甲酰胺(式VI所示化合物)。

2)5-(取代芳基氧甲基)呋喃-2-甲酰卤(式V所示化合物)溶于少量干燥的卤代烃(如二氯甲烷)中，室温搅拌下，滴入由步骤1)中得到的化合物VI与吡啶的混合溶液中。室温反应过夜，加水，用盐酸调pH＝2～3，析出固体，抽滤，水洗得化合物N-[(4-R₁取代氨甲酰)苯基]-5-芳基氧甲基呋喃-2-甲酰胺(目标物之三，式I_B所示化合物)。

在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例中的所有参数以及其余的说明，除另有说明外，都是以质量(克)为单位。

实施例1

5-(4-氯-3-甲基苯氧甲基)呋喃-2-甲酸甲酯(化合物II-1)的制备

将2.5克5-氯甲基呋喃-2-甲酸甲酯、2.2克4-氯-3-甲基苯酚、2.6克碳酸钾与40毫升乙腈混合，回流过夜；蒸除大部分溶剂，加水，乙酸乙酯萃取，酯层干燥，蒸干溶剂，得到白色固体3.8克，收率94.5％。mp 56-58℃；¹H-NMR(DMS0-d₆，500MHz)δ2.29(s，3H)，3.81(s，3H)，5.14(s，2H)，6.80(d，1H)，6.91(dd，1H)，7.07(d，1H)，7.20(d，1H)，7.30-7.33(m，2H)；MS(EI)m/z 280(M⁺)。

实施例2

5-(4-氯-3-甲基苯氧甲基)呋喃-2-甲酸(化合物III-1)的制备

将1.7克II-1与0.5克一水合氢氧化锂投入到20毫升甲醇中，50℃搅拌过夜。蒸除大部分溶剂，加水，用盐酸调pH＝1，析出固体，抽滤得白色固体(III-1)1.58克，收率97.5％。mp 194-195℃；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ2.28(s，3H)，5.11(s，2H)，6.74(d，1H)，6.89(dd，1H)，7.05(d，1H)，7.20(d，1H)，7.30(d，1H)；MS(EI)m/z 266(M⁺)。

实施例3

4-氨基-N-(6-甲氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺(化合物IV-1)的制备

室温下将1.0克4-乙酰氨基苯磺酰氯加入到1.87克6-甲氧基嘧啶-4-胺与15毫升的吡啶溶液中，于45℃搅拌24小时。将反应液倾入水中，乙酸乙酯萃取，酯层用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离(洗脱剂∶甲醇/氯仿＝1∶20)得4-乙酰氨基-N-(6-甲氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺，为橙色固体1.36克，收率52.8％。mp 223-224℃；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ2.07(s，3H)，3.84(s，3H)，6.33(s，1H)，7.75(d，2H)，7.86(d，2H)，8.41(s，1H)；MS(EI)m/z 322(M⁺)。

将1.2克4-乙酰氨基-N-(6-甲氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺投入到15毫升10％的氢氧化钠水溶液中回流2小时；控制反应液温度在70～80℃之间，浓盐酸调pH＝4～5，析出大量固体，经抽滤，水洗，干燥得4-氨基-N-(6-甲氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺(IV-1)，为黄色固体，0.58克，收率55.9％。mp 201-203℃；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ3.81(s，3H)，6.29(s，1H)，6.57(d，2H)，7.53(d，2H)，8.37(s，1H)；MS(EI)m/z 280(M⁺)。

实施例4

N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(4-氯-3-甲基苯基)氧甲基]呋喃-2-甲酰胺(I_A-1)的制备

将0.5克II-1与3毫升二氯亚砜混合，回流搅拌2小时，减压浓缩，残余物用少量干燥的二氯甲烷溶解。将上述溶液于室温搅拌下，滴入0.58克IV-1与吡啶的混合溶液中。室温反应过夜，加水，用盐酸调pH＝2～3，析出固体，水洗，得到白色固体(I_A-1)0.5克，收率50.5％。mp 134-136℃；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ 2.28(s，3H)，3.77-3.81(m，5H)，6.28(s，1H)，6.81(d，1H)，6.91(dd，1H)，7.86-7.92(m，6H)，8.36(s，1H)；MS(EI)m/z 528(M⁺)。

实施例5

N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(4-氯苯基)氧甲基]呋喃-2-甲酰胺(化合物I_A的一种(I_A-2))的制备

将4-氯-3-甲基苯酚替换成4-氯苯酚，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-4，得棕色固体0.33克，收率32.8％(最后一步收率)。mp 71-74℃；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ3.94(s，3H)，4.93(s，2H)，6.62(d，2H)，6.66(d，1H)，6.95(d，2H)，7.00(d，1H)，7.23(s，1H)，7.34(d，2H)，7.55(d，2H)，8.57(s，1H)；MS(EI)m/z 515(M⁺)。

实施例6

N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(3-甲基苯基)氧甲基]呋喃-2-甲酰胺(化合物I_A的一种(I_A-3))的制备

将4-氯-3-甲基苯酚替换成3-甲基苯酚，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-4，得淡黄色固体0.87克，收率81.1％(最后一步收率)。mp 195-197℃；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ2.29(s，3H)，3.85(s，3H)，5.14(s，2H)，6.35(s，1H)，6.81(t，2H)，6.85(m，1H)，6.88(s，1H)，7.19(t，1H)，7.41(m，1H)，7.90-7.95(m，4H)，8.42(s，1H)；MS(EI)m/z 494(M⁺)。

实施例7

N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-(苯基氧甲基)呋喃-2-甲酰胺(化合物I_A的一种(I_A-4))的制备

将4-氯-3-甲基苯酚替换成苯酚，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-4，得淡黄色固体1.01克，收率92.4％(最后一步收率)。mp 195-196℃；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ3.85(s，3H)，5.16(s，2H)，6.35(s，1H)，6.82(d，1H)，6.99(t，1H)，7.06(d，2H)，7.33(t，2H)，7.41(m，1H)，7.90-7.96(m，4H)，8.42(s，1H)；MS(EI)m/z 480(M⁺)。

实施例8

N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(2，4-二氯-3，5-二甲基苯基)氧甲基]呋喃-2-甲酰胺(化合物I_A的一种(I_A-5))的制备

将4-氯-3-甲基苯酚替换成2，4-二氯-3，5-二甲基苯酚，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1-4，得淡黄色固体0.4克，收率92.4％(最后一步收率)。mp 214-216℃；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ2.34(s，3H)，2.40(s，3H)，3.74(s，3H)，5.23(s，2H)，6.08(s，1H)，6.83(d，1H)，7.27(s，1H)，7.40(d，1H)，7.78-7.81(m，4H)，8.20(s，1H)；MS(EI)m/z 576(M⁺)。

实施例9

N-(4-氨磺酰苯基)-5-[(4-氯-3-甲基苯基)氧甲基]呋喃-2-甲酰胺(化合物I_A的一种(I_A-6))的制备

将4-氨基-N-(6-甲氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺(IV-1)替换成4-氨基苯磺酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1、2、4，得淡黄色固体0.52克，收率65.4％(最后一步收率)。mp 216-217℃；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ2.31(s，3H)，5.16(s，2H)，6.83(d，1H)，6.93(dd，1H)，7.09(d，1H)，7.33(d，1H)，7.41(m，1H)，7.80(d，2H)，7.92(m，2H)；MS(EI)m/z 420(M⁺)。

实施例10

4-氨基-N-(6-甲氧基嘧啶-4-)苯甲酰胺(化合物VI-1)的制备

在四氢呋喃溶剂中，6-甲氧基嘧啶-4-胺、4-硝基苯甲酰氯和吡啶回流反应，搅拌12小时。将反应液倾入水中，二氯甲烷萃取，得到的有机层经干燥，过滤，减压蒸除溶剂，残余物柱层析分离得4-硝基-N-(6-甲氧基嘧啶-4-)苯甲酰胺。将此酰胺投入到10％ Pd-C的醋酸水溶液(70％，V/V)中反应30小时，控制反应液温度在20～40℃之间，抽滤，浓缩得产物4-氨基-N-(6-甲氧基嘧啶-4-)苯甲酰胺(VI-1)，直接投入下步反应。

实施例11

N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨酰基]苯基]-5-[(4-氯-3-甲基苯基)氧甲基]呋喃-2-甲酰胺(I_B-1)的制备

将4-氨基-N-(6-甲氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺(IV-1)替换成4-氨基-N-(6-甲氧基嘧啶-4-)苯甲酰胺VI-1，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1、2、4，得白色固体0.26克，收率28.6％(最后一步收率)。mp 216-219℃；¹H-NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ2.29(s，3H)，3.92(s，3H)，5.15(s，2H)，6.81(d，1H)，6.91(dd，1H)，7.08(d，1H)，7.32(d，1H)，7.40(d，1H)，7.60(s，1H)，7.88(d，2H)，8.03(d，2H)，8.60(s，1H)；MS(EI)m/z 492(M⁺)。

实施例12

N-(4-氨酰基苯基)-5-[(4-氯-3-甲基苯基)氧甲基]呋喃-2-甲酰胺(化合物I_B的一种(I_B-2))的制备

将4-氨基-N-(6-甲氧基嘧啶-4-)苯磺酰胺(IV-1)替换成4-氨基苯甲酰胺，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例1、2、4，得白色固体0.36克，收率49.3％(最后一步收率)。mp 244-245℃；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ2.31(s，3H)，5.16(s，2H)，6.82(d，1H)，6.93(dd，1H)，7.09(d，1H)，7.33(d，1H)，7.39(d，1H)，7.82(d，2H)，7.87(d，2H)；MS(EI)m/z 384(M⁺)。

实施例13

将2.9克氢氧化钠溶于15毫升水中，控温2℃～3℃，一次滴加2克溴和1克5-甲基呋喃-2-甲醛，加毕，控温0～5℃搅拌反应1小时。反应液用***萃取两次(5mL x 2)，水层用浓盐酸调pH＝1，抽滤，水洗得黄色固体产物5-甲基呋喃-2-甲酸0.63克，收率55.3％。mp 109-110℃；¹H-NMR(DMSO-d₆，500MHz)δ2.34(s，3H)，6.29(d，1H)，7.12(d，1H)。

实施例14

N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-甲基呋喃-2-甲酰胺(化合物I_A-7)的制备

以5-甲基呋喃-2-甲酸为原料，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例3-4，得淡黄色固体0.79克，收率51.2％(最后一步收率)。mp 234-236℃；¹H-NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ2.37(s，3H)，3.83(s，3H)，6.33(s，2H)，7.27(s，1H)，7.90(m，4H)，8.39(s，1H)；MS(EI)m/z 388(M⁺)。

实施例15

N-(4-氨磺酰苯基)-5-甲基呋喃-2-甲酰胺(化合物I_A-8)的制备

以5-甲基呋喃-2-甲酸和4-氨基苯磺酰胺为原料，其余所需原料、试剂及制备方法同实施例4，得淡黄色固体0.98克，收率88.3％(最后一步收率)。mp 249-262℃；¹H-NMR(DMSO-d₆，400MHz)δ2.38(s，3H)，6.33(s，1H)，7.27(s，1H)，7.76(d，2H)，7.89(s，2H)；MS(EI)m/z 280(M⁺)。

实施例16

本发明化合物I_A-1与Falcipain-2蛋白酶结合活性测定：

Falcipain-2蛋白酶与I_A-1结合活性的筛选和动力学常数的测定基于SPR(表面等离子共振)原理，使用的仪器是Biacore 3000(Biacore AB，Uppsala，Sweden)。

(1)Falcipain-2质粒(pQE30-Fal2)的构建

根据Falcipain-2 cDNA序列设计引物，正向和反向引物分别为5’CGTGGATCCCAAATGAATTATGAAG3’和5’ATATGTCGACTTATTCAATTAATGGAATG3’，包含BamH I和Sal I酶切位点，通过PCR扩增Falcipain-2片段，将酶切后的PCR产物和表达载体pQE30连接后鉴定正确，转化入大肠杆菌M15(Qiagen)进行表达。

(2)Falcipain-2(FP-2)蛋白的表达与纯化

将构建好的质粒pQE30-Fal2转入大肠杆菌M15中得到表达工程菌，将工程菌培养于含100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的10mL LB培养基中培养过夜(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L)。然后按1∶100转接入1L含氨苄青霉素和卡那霉素的新鲜LB培养基中，37℃下，220转/分培养。当OD600达到约0.8时，加入IPTG至终浓度0.5mM，同时将温度降到25℃培养12小时进行蛋白的诱导表达。4000转/分离心30分钟收集菌体，收集好后放于-80℃超低温冰箱保存过夜。将菌体用20mL的buffer1(20mM Tris-Cl，0.5MNaCl，and 10mM imidazole，pH8.0)悬起，将悬浮液冰浴上超声波破碎(300W，工作30分钟，一次5秒，中间间隔10秒)。破碎后得到的细胞匀浆在4℃，以10000转/分离心30分钟，弃上清，用20mL的buffer 2(6M guanidine HCl 20mM Tris-Cl 250mM NaCl 20mMimidazole，pH8.0)溶解沉淀，室温下温和搅拌1小时，10000转/分离心30min，并将上清上样到用Binding buffer 2(6M guanidine HCl，20mM Tris-Cl，250mM NaCl，pH8.0)平衡好的Ni² ⁺-NTA柱上，先后用Wash buffer 1(8M urea，20mM Tris-Cl，500mM NaCl pH8.0)和Washbuffer 2(8M urea，20mM Tris-Cl，30mM imidazole)各30ml洗去非特异性结合的杂蛋白，再用Elution buffer(8M urea，20Mm Tris-Cl，1M imidazole)10ml洗去目的蛋白，用SDS-PAGE检测蛋白的分子量和纯度。

(3)FP-2包涵体蛋白的复性

将纯化得到的蛋白加入10mM DTT，37℃下温浴45分钟后，将蛋白溶液稀释到10μg/ml进行透析(透析液：100mM Tris-Cl，1mM EDTA，20％ glycerol，250mM L-arginine，1mMGSH，1mM SSG，pH8.0)过夜。将透析好的蛋白浓缩即可用作酶抑制活性的测定。

(4)FP-2蛋白的偶联

彻底清洗Biacore 3000机器后，用HBS-EP缓冲液(10mM Hepes，150mM NaCl，3mMEDTA and 0.005％(v/v)surfactant P20，pH7.4)平衡机器至基线平稳。0.2MN-ethyl-N’-dimethylaminopropyl carbodiimide(N-乙基-N’-二甲基氨丙基碳二亚胺)和50mMMN-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)1∶1混和，以5μL/min进样7分钟以活化芯片表面。FP-2蛋白用10mM乙酸钠，pH4.2，稀释至终浓度为69μg/ml，以5μL/min流速进样。最后，用1M盐酸乙醇胺，pH8.5以5μL/min流速进样7分钟，封闭芯片表面，最终FP-2蛋白的偶联量为9300RU左右。

(5)化合物筛选

底物Z-Phe-Arg-pNA HCl(Bachem AG)作为阳性对照。I_A-1用100％ DMSO溶解，母液浓度为10mM。用HBS-EP缓冲液稀释化合物，至终浓度为1μM和10μM，DMSO的终浓度为0.1％。根据I_A-1与芯片上FP-2蛋白的结合的RU(Response Unit，共振单位)值，判断化合物是否具有结合活性。有结合活性的化合物可进行详细的动力学实验。结果证明I_A-1与FP-2蛋白有明显的结合。

(6)动力学测定

I_A-1用工作缓冲液HBS-EP(含0.1％ DMSO)，分别配成不同的浓度梯度，以30μl/min进样1min，解离2min，然后用相同缓冲液稳定2min。得到I_A-1与FP-2蛋白相互作用的传感图，再用Biacore分析软件中的1∶1(Langmuir)结合模型或稳态模型进行拟合，得到确切的动力学和热力学常数。

(6)试验结果：表1阳性对照和I_A-1与FP-2蛋白结合常数的测试结果

表1

实施例17

本发明化合物对falcipain-2蛋白酶百分抑制活性的测定

(1)Falcipain-2(FP-2)蛋白的表达与纯化和FP-2包涵体蛋白的复性

参见实施例16

(2)本发明化合物对FP-2酶抑制活性的测定

在197μL的100mM NaOAc，10mM DTT，pH5.5的buffer体系中加入FP-2蛋白(终浓度10μg/ml)和溶于DMSO的待测化合物溶液，终浓度10μM和0μM(阴性对照)，室温下孵育30min后用MD SpectraMax M5酶标仪于excitation 355nm；emission 460nm处连续测15min内的RFU值，计算出反应速率K_m，以下列公式得出待测化合物在10μM下百分抑制率，

计算公式为：

(对照组K_m值-实验组K_m值)/对照组K_m值×100％

(3)化合物活性测试结果见表2.：N-(4-取代氨酰基苯基)-5-取代呋喃-2-甲酰胺类化合物对falcipain-2抑制率数据

表2.

实施例18

本发明部分化合物对falcipain-2蛋白酶半数有效抑制浓度(IC₅₀)的测定

选取10μM抑制率在50％以上的化合物测IC₅₀，选择合适的化合物浓度梯度，实验方法和体系如实施例17。根据化合物在不同浓度下FP-2酶活的反应速率K_m，计算化合物在不同浓度下对FP-2酶活的抑制率，使用Sigmoidal公式用origin软件进行拟合得到化合物的IC₅₀值，结果见表3 N-(4-取代氨酰基)-5-取代呋喃-2-甲酰胺类化合物对falcipain-2酶活抑制IC₅₀和图2。

表3.

本发明的N-(4-取代氨酰基苯基)-5-取代呋喃-2-甲酰胺类化合物的制备方法具有反应条件温和、原料丰富易得、操作及后处理简单等优点，且本发明的化合物毒性很低。

本发明的N-(4-取代氨酰基)-5-取代呋喃-2-甲酰胺类化合物在计算机虚拟筛选以及在falcipain-2蛋白酶结合试验和酶抑制试验中均显示了阳性结果。应证了其药理作用机制。因此，本发明的化合物可用于制备falcipain-2抑制剂。

Claims

1.一种酰胺衍生物，其具有式I所示结构：

式I中：R₁为氢，C₁-C₆直链或支链的烷基，C₃-C₇环烷基，5-7元芳环基，5-7元杂环基，取代的5-7元芳环基或取代的5-7元杂环基；R₂为甲基或R₃OCH₂-，R₃为5-7元芳环基或取代的5-7元芳环基；X为C或S＝O；

其中，所述取代的5-7元芳环基和取代的5-7元杂环基中的取代基选自：卤素、C₁-C₆直链或支链烃基、羟基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄不饱和烃氧基、羧基、酯基、C₁-C₆羧基烷氧基、C₁-C₆酯基烷氧基、C₁-C₆羧基烷基、C₁-C₆酯基烷基、氰基、硝基、氨基、羟甲基、三氟甲基、三氟甲氧基、巯基或C₁-C₄酰基中一种、二种或二种以上，取代基的个数为1～4；所述杂环基的杂原子为氧、硫或/和氮，杂原子的个数为1～3；

但，不包括下列式A或式B所示化合物：

2.如权利要求1所述的酰胺衍生物，其特征在于，X为S＝O时，R₁为氢，5-7元芳环基，5-7元杂环基，取代的5-7元芳环基或取代的5-7元杂环基；R₂为甲基或R₃OCH₂-，R₃为5-7元芳环基或取代的5-7元芳环基；

其中，所述取代的5-7元芳环基和取代的5-7元杂环基中的取代基选自：卤素、C₁-C₆直链或支链烃基或C₁-C₄烷氧基中一种、二种或二种以上，取代基的个数为1～4；所述杂环基的杂原子为氮，杂原子的个数为1～3。

3.如权利要求2所述的酰胺衍生物，其特征在于，其中R₁为氢、含氮6元杂环基或由C₁-C₄烷氧基取代的含氮6元杂环基。

4.如权利要求2所述的酰胺衍生物，其特征在于，其中R₂为甲基或R₃OCH₂-，R₃为6元芳环基或取代的6元芳环基，其中所述的取代的6元芳环基的取代基为卤素或C₁-C₃烷基，取代基的个数为1～4。

5.如权利要求3或4所述的酰胺衍生物，其特征在于，所述的酰胺衍生物为N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(4-氯-3-甲基苯基)氧甲基]呋喃-2-甲酰胺、N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(4-氯苯基)氧甲基]呋喃-2-甲酰胺、N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(3-甲基苯基)氧甲基]呋喃-2-甲酰胺、N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-(苯基氧甲基)呋喃-2-甲酰胺、N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-[(2，4-二氯-3，5-二甲基苯基)氧甲基]呋喃-2-甲酰胺、N-(4-氨磺酰苯基)-5-[(4-氯-3-甲基苯基)氧甲基]呋喃-2-甲酰胺、N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨磺酰]苯基]-5-甲基呋喃-2-甲酰胺或N-(4-氨磺酰苯基)-5-甲基呋喃-2-甲酰胺。

6.如权利要求1所述的酰胺衍生物，其特征在于，X为C时，R₁为氢，5-7元芳环基，5-7元杂环基，取代的5-7元芳环基或取代的5-7元杂环基；R₂为R₃OCH₂-，R₃为5-7元芳环基或取代的5-7元芳环基；

其中，所述取代的5-7元芳环基和取代的5-7元杂环基中的取代基选自：卤素、C₁-C₆直链或支链烃基或C₁-C₄烷氧基中一种、二种或二种以上，取代基的个数为1～4。

7.如权利要求6所述的酰胺衍生物，其特征在于，其中R₁为氢、含氮6元杂环基或由C₁-C₄烷氧基取代的含氮6元杂环基。

8.如权利要求6所述的酰胺衍生物，其特征在于，其中R₂为R₃OCH₂-，R₃为6元芳环基或取代的6元芳环基，所述的取代的6元芳环基的取代基为卤素或C₁-C₃烷基，取代基的个数为1～4。

9.如权利要求7或8所述的酰胺衍生物，其特征在于，所述的酰胺衍生物为N-[[(4-(6-甲氧基嘧啶-4-)氨酰基]苯基]-5-[(4-氯-3-甲基苯基)氧甲基]呋喃-2-甲酰胺或N-(4-氨酰基苯基)-5-[(4-氯-3-甲基苯基)氧甲基]呋喃-2-甲酰胺。

10.如权利要求1～9中任意一项所述的酰胺衍生物在制备由疟原虫引起的疟疾的治疗药物中的应用；

其中：权利要求1所述的酰胺衍生物还包括式A或式B所示化合物。