CN101538604A - 纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法,属于生物技术领域。第一步,将收割后的稻草洗净、切断,干燥至恒重,在纤维素酶水解前,将切好的稻草用碱进行处理;第二步,将预处理后的稻草用里氏木霉ZM4-F3在摇床中进行水解产糖培养,用以产生还原糖;第三步,然后将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07接种到水解体系中,实现鼠李糖脂类表面活性剂的在线生产,以促进纤维素酶的水解。由于此种在线生产的添加方式可省去鼠李糖脂的提纯这一复杂工艺,因此可以有效的降低鼠李糖脂生物表面活性剂的生产成本,适用于工业生产。此外,鼠李糖脂的添加会有效提高纤维素酶的水解效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域的表面活性剂的生产方法,具体是一种纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法。
背景技术
微生物在代谢过程中分泌出的具有表面活性与界面活性、集亲水基与疏水基结构于同一分子内部的两亲性化合物,称为生物表面活性剂。生物表面活性剂包括许多不同的种类,如糖脂、脂肽、多糖-脂类复合物、磷脂、脂肪酸和中性脂等。生物表面活性剂可以促进土壤中难溶有机物的分散和吸收,可以增加憎水性有机化合物与液相之间的接触面,从而增强微生物活性,提高纤维素降解率以及堆肥效率。此外,在石油工业(如石油的生物降粘及提高原油采收率等)中生物表面活性剂也可发挥极大的作用。而且,与化学合成的表面活性剂相比,生物表面活性剂除具有降低表面张力、稳定乳化液和发泡等相同特性外,还具有化学合成表面活性剂所不具备的无毒、能生物降解等特性及生物兼容性,因此,近年来人们对生物表面活性剂的研究日益增多。但影响生物表面活性剂工业应用的主要障碍是其低产量和高成本。
经对现有技术的检索发现,中国专利公开号为CN1657613,专利名称为“利用生物表面活性剂提高绿色木霉纤维素酶活的方法”,该专利先将鼠李糖脂类生物表面活性剂分离纯化,然后添加至绿色木霉的固态或液态发酵培养基中,可以提高纤维素酶活力。但是,这种先分离纯化再添加的方法会大大增加鼠李糖脂的生产成本。
在纤维素酶水解体系中,至今未有采用生物表面活性剂的在线生产添加方式的相关技术报道。由于生物表面活性剂的在线生产可以省去生物表面活性剂的分离纯化工艺,既可有效的降低其生产成本,也可以有效提高纤维素的酶水解效率。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足,提供一种纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法,将里氏木霉ZM4-F3与铜绿假单胞菌BSZ-07分别用于纤维素酶的生产与鼠李糖脂类生物表面活性剂的生产。里氏木霉ZM4-F3与铜绿假单胞菌BSZ-07可分别由中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)与中国典型培养物保藏中心(CCTCC)购到。将铜绿假单胞菌BSZ-07直接添加至用里氏木霉ZM4-F3水解纤维素的体系中,从而实现鼠李糖脂类生物表面活性剂的在线生产方式。此种鼠李糖脂的在线生产添加技术能够达到降低生产成本,简化工艺流程的目的。
本发明是通过以下技术方案实现的,包括如下步骤:
第一步,将收割后的稻草洗净、切断,干燥至恒重,在纤维素酶水解前,将切好的稻草用碱进行处理;
所述将收割后的稻草洗净、切断,干燥至恒重,是指:将收割后的稻草用自来水冲洗4-5遍以去除杂质以及茎结,并切至1-2cm的小段,切好的稻草置于70℃烘箱中干燥至恒重,在室温下储存。
所述将剪切好的稻草用碱进行处理,是指:将10g剪好的稻草置于40ml 2%(体积浓度v/v)的氢氧化钠中,保持固液体质量比为1∶4,85℃水浴1h。用蒸馏水洗至中性,置于70℃烘箱中干燥至恒重。
第二步,将处理后的稻草用里氏木霉ZM4-F3进行水解产糖培养,用以产生还原糖。
所述用里氏木霉ZM4-F3进行水解产糖培养,是在30℃、200rpm摇床中进行。
所述里氏木霉ZM4-F3水解产糖培养,采用的培养基的成份为:稻草3g,麸皮1g,Mandels微量元素盐溶液0.5mL,营养盐10mL,蛋白胨0.1g,用蒸馏水定容至100mL,pH值调至4.8。其中所述营养盐中含有磷酸二氢钾0.4%,硫酸铵1.6%,硫酸镁0.1%,蒸馏水97.9%,这是指质量浓度。
第三步,然后将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07接种到第二步的稻草水解体系中,实现鼠李糖脂类表面活性剂的在线生产,以促进纤维素酶的水解。
所述第三步,具体为:将铜绿假单胞菌BSZ-07溶于50mL种子培养基中以制备种子悬液,保持密度为106孢子/mL。然后,取菌株的种子悬液5mL,接种到100mL发酵产表面活性剂培养基中,35℃、200r/min摇床中振荡培养24h至对数生长期,用于生产生物表面活性剂。将2-6mL处于对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07种子液接种到第二步的稻草水解体系中,其中稻草水解体系的体积为100mL。菌种在35℃、200r/min摇床中培养48h,用于稻草水解。该步骤中的种子培养基和发酵产生物表面活性剂培养基可以采用现有的培养基。
所述种子培养基成份为:牛肉膏3g,NaNO3 1g,(NH4)2SO4 1g,Na2HPO4 1.2g,KH2PO4 1g,MgSO4·7H2O 0.01g,CaCl2 0.002g,水1000mL,pH 6.5-7.0。
所述发酵产生物表面活性剂培养基的成份为:葡萄糖2g,酵母膏0.1g,NH4NO3 0.5g,机油2mL,KH2PO4 1g,Na2HPO4 1g,MgSO4·7H2O 0.02g,微量元素溶液0.5mL,水1000mL。
与不接种铜绿假单胞菌BSZ-07的纤维素酶水解对照样相比,鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产添加可对纤维素水解起显著的增效作用。由于鼠李糖脂的在线生产可以省去鼠李糖脂的提纯这一复杂工艺,因此可以有效降低其生产成本,使其成为一种较有潜力的添加方式。
本发明在纤维素酶产生菌-里氏木霉ZM4-F3水解稻草的过程中,向其中直接添加培养至对数生长期的鼠李糖脂生物表面活性剂产生菌-铜绿假单胞菌BSZ-07,实现了鼠李糖脂类生物表面活性剂的在线生产添加方式。由于此种在线生产的添加方式可省去鼠李糖脂的提纯这一复杂工艺,因此可以有效的降低鼠李糖脂生物表面活性剂的生产成本,适用于工业生产。此外,鼠李糖脂的添加会有效提高纤维素酶的水解效率。本发明可有效降低生物表面活性剂的生产成本、简化其生产工艺,并适用于大规模工业化生产。
所述的里氏木霉ZM4-F3,可由中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)购买,该菌种的保藏信息:里氏木霉(Trichoderma reesei)、中国工业微生物菌种保藏中心、北京市朝阳区霄云路32号、2006年5月、编号40360。
所述的铜绿假单胞菌BSZ-07,可由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)购买,该菌种的保藏信息:铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、中国典型培养物保藏中心、武汉市武昌区珞珈山、2006年5月、编号AB93066。
附图说明
图1是将铜绿假单胞菌BSZ-07以4%接种量直接接种至里氏木霉ZM4-F3水解纤维素体系中时,即实现在线生产鼠李糖脂类生物表面活性剂的添加方式与纤维素酶水解对照样产还原糖的比较图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
为了证实鼠李糖脂类生物表面活性剂的在线生产添加方式对纤维素酶水解的影响,利用752型紫外分光光度计测定了还原糖产量,并与单独纤维素酶水解体系的对照样进行了对比。
实施例1
将收割后的稻草用自来水冲洗4-5遍以去除杂质以及茎结,并切至1-2cm的小段。切好的稻草置于70℃烘箱中干燥至恒重,在室温下储存以备后续使用。在酶水解前,将剪切好的稻草用碱进行预处理,具体方法为:将10g剪好的稻草置于装有40ml 2%的氢氧化钠的锥形瓶中,保持固液体质量比为1∶4,85℃水浴1h。用蒸馏水洗至中性,置于70℃烘箱中干燥至恒重。
将预处理后的稻草用里氏木霉ZM4-F3在30℃、200rpm摇床中水解产糖培养。
然后将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07以2%接种量接种到稻草水解体系中,即:将铜绿假单胞菌BSZ-07溶于50mL种子培养基中以制备种子悬液,保持密度为106孢子/mL。然后,取菌株的种子悬液5mL,接种到100mL发酵产表面活性剂培养基中,35℃、200r/min摇床中振荡培养24h至对数生长期,用以生产生物表面活性剂。将2mL处于对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07种子液接种到稻草水解体系中,其中稻草水解体系的体积为100mL。菌种在35℃、200r/min摇床中培养48h,用于稻草水解。
本实施例中,所述里氏木霉ZM4-F3水解产糖培养,采用的培养基的成份为:稻草3g,麸皮1g,Mandels微量元素盐溶液0.5mL,营养盐(磷酸二氢钾0.4%,硫酸铵1.6%,硫酸镁0.1%,此处的百分含量指质量浓度)10mL,蛋白胨0.1g,用蒸馏水定容至100mL,pH值调至4.8。
所述种子培养基成份为:牛肉膏3g,NaNO3 1g,(NH4)2SO4 1g,Na2HPO4 1.2g,KH2PO4 1g,MgSO4·7H2O 0.01g,CaCl2 0.002g,水1000mL,pH 6.5-7.0。
所述发酵产表面活性剂培养基的成份为:葡萄糖2g,酵母膏0.1g,NH4NO30.5g,机油2mL,KH2PO4 1g,Na2HPO4 1g,MgSO4·7H2O 0.02g,微量元素溶液0.5mL,水1000mL。
本实施例采用里氏木霉ZM4-F3与铜绿假单胞菌BSZ-07实现鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产添加,以促进纤维素酶的水解。并与单独纤维素酶水解体系的对照样进行了对比。
研究发现,鼠李糖脂的在线生产添加方式,即将铜绿假单胞菌BSZ-07以2%接种量直接接种至里氏木霉ZM4-F3水解纤维素体系中时,自第48h起其还原糖产量即迅速增加。在对照样中,96h是里氏木霉ZM4-F3的最优产糖时间,此时其产还原糖量达最大值,为2.231g/l。而将铜绿假单胞菌BSZ-07以2%接种量直接接种至里氏木霉ZM4-F3水解纤维素体系中时,产糖84h时就可使还原糖量达2.277g/l。因此,此种鼠李糖脂的在线生产添加方式不仅能增加还原糖的产量,还能明显缩短最优产糖时间。
实施例2
将收割后的稻草用自来水冲洗4-5遍以去除杂质以及茎结,并切至1-2cm的小段。切好的稻草置于70℃烘箱中干燥至恒重,在室温下储存以备后续使用。在酶水解前,将剪切好的稻草用碱进行预处理,具体方法为:将10g剪好的稻草置于装有40ml 2%的氢氧化钠的锥形瓶中,保持固液体质量比为1∶4,85℃水浴1h。用蒸馏水洗至中性,置于70℃烘箱中干燥至恒重。
将预处理后的稻草用里氏木霉ZM4-F3在30℃、200rpm摇床中水解产糖培养。
然后将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07以4%接种量接种到稻草水解体系中:将铜绿假单胞菌BSZ-07溶于50mL种子培养基中以制备种子悬液,保持密度为106孢子/mL。然后,取菌株的种子悬液5mL,接种到100mL发酵产表面活性剂培养基中,35℃、200r/min摇床中振荡培养24h至对数生长期,用以生产生物表面活性剂。将4mL处于对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07种子液接种到稻草水解体系中,其中稻草水解体系的体积为100mL。菌种在35℃、200r/min摇床中培养48h,用于稻草水解。
其中,所述里氏木霉ZM4-F3水解产糖培养,采用的培养基的成份为:稻草3g,麸皮1g,Mandels微量元素盐溶液0.5mL,营养盐(磷酸二氢钾0.4%,硫酸铵1.6%,硫酸镁0.1%,此处的百分含量指质量浓度)10mL,蛋白胨0.1g,用蒸馏水定容至100mL,pH值调至4.8。
所述种子培养基成份为:牛肉膏3g,NaNO3 1g,(NH4)2SO4 1g,Na2HPO4 1.2g,KH2PO4 1g,MgSO4·7H2O 0.01g,CaCl2 0.002g,水1000mL,pH 6.5-7.0。
所述发酵产表面活性剂培养基的成份为:葡萄糖2g,酵母膏0.1g,NH4NO30.5g,机油2mL,KH2PO4 1g,Na2HPO4 1g,MgSO4·7H2O 0.02g,微量元素溶液0.5mL,水1000mL。
本实施例采用里氏木霉ZM4-F3与铜绿假单胞菌BSZ-07实现鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产添加,以促进纤维素酶的水解。并与单独纤维素酶水解体系的对照样进行了对比。
研究发现,鼠李糖脂的在线生产添加方式,即将铜绿假单胞菌BSZ-07以4%接种量直接接种至里氏木霉ZM4-F3水解纤维素体系中时,自第48h起其还原糖产量即迅速增加。在对照样中,96h是里氏木霉ZM4-F3的最优产糖时间,此时其产还原糖量达最大值,为2.231g/l。而将铜绿假单胞菌BSZ-07以4%接种量直接接种至里氏木霉ZM4-F3水解纤维素体系中时,产糖84h时就可使还原糖量达2.571g/l。因此,此种鼠李糖脂的在线生产添加方式不仅能增加还原糖的产量,还能明显缩短最优产糖时间。
实施例3
将收割后的稻草用自来水冲洗4-5遍以去除杂质以及茎结,并切至1-2cm的小段。切好的稻草置于70℃烘箱中干燥至恒重,在室温下储存以备后续使用。在酶水解前,将剪切好的稻草用碱进行预处理,具体方法为:将10g剪好的稻草置于装有40ml 2%的氢氧化钠的锥形瓶中,保持固液体质量比为1∶4,85℃水浴1h。用蒸馏水洗至中性,置于70℃烘箱中干燥至恒重。
将预处理后的稻草用里氏木霉ZM4-F3在30℃、200rpm摇床中水解产糖培养。
然后将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07以6%接种量接种到稻草水解体系中:将铜绿假单胞菌BSZ-07溶于50mL种子培养基中以制备种子悬液,保持密度为106孢子/mL。然后,取菌株的种子悬液5mL,接种到100mL发酵产表面活性剂培养基中,35℃、200r/min摇床中振荡培养24h至对数生长期,用以产生生物表面活性剂。将6mL处于对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07种子液接种到稻草水解体系中,其中稻草水解体系的体积为100mL。菌种在35℃、200r/min摇床中培养48h,用于稻草水解。
其中,所述里氏木霉ZM4-F3水解产糖培养,采用的培养基的成份为:稻草3g,麸皮1g,Mandels微量元素盐溶液0.5mL,营养盐(磷酸二氢钾0.4%,硫酸铵1.6%,硫酸镁0.1%,此处的百分含量指质量浓度)10mL,蛋白胨0.1g,用蒸馏水定容至100mL,pH值调至4.8。
所述种子培养基成份为:牛肉膏3g,NaNO3 1g,(NH4)2SO4 1g,Na2HPO4 1.2g,KH2PO4 1g,MgSO4·7H2O 0.01g,CaCl2 0.002g,水1000mL,pH 6.5-7.0。
所述发酵产表面活性剂培养基的成份为:葡萄糖2g,酵母膏0.1g,NH4NO30.5g,机油2mL,KH2PO4 1g,Na2HPO4 1g,MgSO4·7H2O 0.02g,微量元素溶液0.5mL,水1000mL。
本实施例采用里氏木霉ZM4-F3与铜绿假单胞菌BSZ-07实现鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产添加,以促进纤维素酶的水解。并与单独纤维素酶水解体系的对照样进行了对比。
研究发现,鼠李糖脂的在线生产添加方式,即将铜绿假单胞菌BSZ-07以6%接种量直接接种至里氏木霉ZM4-F3水解纤维素体系中时,自第48h起其还原糖产量即迅速增加。在对照样中,96h是里氏木霉ZM4-F3的最优产糖时间,此时其产还原糖量达最大值,为2.231g/l。而将铜绿假单胞菌BSZ-07以6%接种量直接接种至里氏木霉ZM4-F3水解纤维素体系中时,产糖84h时就可使还原糖量达2.432g/l。因此,此种鼠李糖脂的在线生产添加方式不仅能增加还原糖的产量,还能明显缩短最优产糖时间。
从图1可以看出,与只有里氏木霉ZM4-F3单独水解稻草时的对照样相比,铜绿假单胞菌BSZ-07与里氏木霉ZM4-F3共水解样品自第48h起的还原糖产量迅速增加并超过对照样之值。在对照样中,96h是里氏木霉ZM4-F3的最优产糖时间,此时其产还原糖量达最大值,为2.231g/L。而在共水解(即在线生产)样品中,产糖84h时就可使还原糖量达2.571g/L。因此研究结果表明,铜绿假单胞菌BSZ-07向稻草秸秆降解过程中的添加不仅能增加还原糖的产量,还能明显缩短稻草秸秆降解时间。
Claims (9)
1、一种纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法,其特征在于,包括如下步骤:
第一步,将收割后的稻草洗净、切断,干燥至恒重,在纤维素酶水解前,将切好的稻草用碱进行处理;
第二步,将处理后的稻草用里氏木霉ZM4-F3进行水解产糖培养,用以产生还原糖;
第三步,然后将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07接种到第二步的稻草水解体系中,实现鼠李糖脂类表面活性剂的在线生产,促进纤维素酶的水解。
2、根据权利要求1所述的纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法,其特征是,所述将收割后的稻草洗净、切断,干燥至恒重,是指:将收割后的稻草用自来水冲洗4-5遍以去除杂质以及茎结,并切至1-2cm的小段,切好的稻草置于70℃烘箱中干燥至恒重,在室温下储存。
3、根据权利要求1所述的纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法,其特征是,所述将剪切好的稻草用碱进行处理,是指:将10g剪好的稻草置于40ml 2%体积浓度的氢氧化钠中,保持固液体质量比为1∶4,85℃水浴1h,用蒸馏水洗至中性,置于70℃烘箱中干燥至恒重。
4、根据权利要求1所述的纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法,其特征是,所述用里氏木霉ZM4-F3进行水解产糖培养,是在30℃、200rpm摇床中进行。
5、根据权利要求1或4所述的纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法,其特征是,所述用里氏木霉ZM4-F3进行水解产糖培养,采用的培养基的成份为:稻草3g,麸皮1g,Mandels微量元素盐溶液0.5mL,营养盐10mL,蛋白胨0.1g,用蒸馏水定容至100mL,pH值调至4.8。
6、根据权利要求5所述的纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法,其特征是,所述营养盐中组分质量浓度:磷酸二氢钾0.4%,硫酸铵1.6%,硫酸镁0.1%,蒸馏水97.9%。
7、根据权利要求1所述的纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法,其特征是,所述第三步,具体为:将铜绿假单胞菌BSZ-07溶于50mL种子培养基中以制备种子悬液,保持密度为106孢子/mL;然后,取菌株的种子悬液5mL,接种到100mL发酵产表面活性剂培养基中,35℃、200r/min摇床中振荡培养24h至对数生长期;将2-6mL处于对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07种子液接种到稻草水解体系中,其中稻草水解体系的体积为100mL,菌种在35℃、200r/min摇床中培养48h,用于稻草水解。
8、根据权利要求7所述的纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法,其特征是,所述种子培养基成份为:牛肉膏3g,NaNO3 1g,(NH4)2SO41g,Na2HPO4 1.2g,KH2PO4 1g,MgSO4·7H2O 0.01g,CaCl2 0.002g,水1000mL,pH 6.5-7.0。
9、根据权利要求7所述的纤维素酶水解中鼠李糖脂生物表面活性剂的在线生产方法,其特征是,所述发酵产生物表面活性剂培养基的成份为:葡萄糖2g,酵母膏0.1g,NH4NO3 0.5g,机油2mL,KH2PO4 1g,Na2HPO4 1g,MgSO4·7H2O0.02g,微量元素溶液0.5mL,水1000mL。
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