CN101532051B - 一种检测adh2基因多态性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域,涉及一种检测ADH2基因多态性的方法。本发明通过ADH2基因及其多态相关碱基序列特征分析,用碱基错配创造酶切位点原理设计引物,其中一条引物根据突变位点邻近序列设计,引入错配碱基,使引物3’端和单碱基突变的一种突变型在PCR扩增后形成一个酶切位点,然后用相应内切酶进行酶切鉴定。经实验验证引物设计合理,PCR扩增顺利,扩增DNA片段可被内切酶HhaI、HinP1I和BstUI及其同工酶识别其多态类型,BSTUI酶切后电泳图条带清晰,易于辨认,所用内切酶价格便宜,易获得,经测序验证,不同基因型序列特征与预期结果一致。经人群样本验证该方法稳定可靠。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域,涉及一种ADH2基因多态性(rs1229984)检测方法。
背景技术
研究报道,乙醇摄入人体后很快经口腔、食道、胃、肠等消化,其中肝脏是其代谢最主要的器官,有90%-98%酒精在肝脏代谢。在正常情况下,低血浓度的乙醇主要经ADH乙醇氧化体系代谢,长期饮酒时高浓度乙醇则主要经微粒体乙醇氧化体系代谢[1]。在ADH***中的ADH2和ADH3存在基因多态现象,并表达不同的酶活性,进而影响机体对乙醇的易感性,其中最主要是ADH2,所以出现不同基因型的饮酒者对乙醇的敏感性,耐受性,酒后反应,饮酒行为等也有所不同,且其基因型的不同与引发疾病密切相关,是目前国内外的一个研究热点[2,3]。目前ADH2多态检测方法主要包括聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)[4]、等位基因特异PCR技术(AS-PCR)[3]、Taqman技术[5]和对抗两对引物PCR技术(PCR-CTPP)[6]等。现有技术均存在下述不足之处:Taqman等技术所需仪器和试剂花费巨大,通常为大型研究机构和公司使用;AS-PCR需两次PCR反应造成样品和试剂用量增加,其使用的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染染色步骤繁琐;PCR-CTPP方法应用中通过在引物的3’端区域引入一个人为不匹配碱基来提高延伸反应的特异性,且其多重PCR反应的特殊性均可导致非特异条带和体系不稳定等情况出现。
经典的PCR-RFLP方法由于其操作简便,快速,终点判断准确而在基因多态检测中最为常用,早期的ADH2基因多态检测中多用此方法,但其所需的MaeIII来源稀少且价格不菲,从而在一定程度上限制了相关研究的开展。因此,建立一种简便快速且经济的ADH2基因分型方法很有必要性。
研究表明,在SNP无限制性酶切位点或者限制性内切酶价格昂贵的情况下,可以通过设计包含酶切位点的错配引物来克服,即创造酶切位点法PCR(CreatedRestriction Site PCR,CRS-PCR)。其原理是根据单碱基突变位点的碱基替代情况设计引物,其中一条引物根据突变位点邻近序列设计,人为引入错配碱基,使得引物3’端和单碱基突变的一种突变型在PCR扩增后形成一个酶切位点,然后应用相应的内切酶进行酶切鉴定[7,8]。
与本发明有关的现有技术的参考文献有:
1张竹梅,边建超.乙醇代谢酶基因多态与肿瘤关系研究进展[J].中华医学遗传学杂志,2001,18(1):62-65
2郭坤亮,季克良,王昌禄.酒精代谢及其相关基因遗传多态性[J].酿酒科技,2005,13(7):36-38
3曹西蓉,吴德生.AS-PCR在ADH2、ALDH2基因多态型分析中的应用[J].环境与职业医学,2004,21(5):371-373
4SAITO K,YOKOYAMA T,YOSHIIKE N,et al.Do the ethanol metabolizingenzymes modify the relationship between alcohol consumption and bloodpressure?[see comment][J].Journal of Hypertension,2003,21(6):1097-1105
5HIRAKI A,MATSUO K,WAKAI K,et al.Gene-gene and gene-environmentinteractions between alcohol drinking habit and polymorphisms inalcohol-metabolizing enzyme genes and the risk of head and neck cancerin Japan[J].Cancer Science,2007,98(7):1087-1091
6TAMAKOSHI A HNKHWKKNSTIHHKTTTK.Duplex polymerase chain reaction withconfronting two-pair primers(PCR-CTPP)for genotyping alcoholdehydrogenase beta subunit(ADH2)and aldehyde dehydrogenase 2(ALDH2)[J].Alcohol & Alcoholism,2003,38(5):407-410
7张忠彬,朱人,夏昭林.应用CRS-RFLP技术检测hOGG1c.326位点的单核苷酸多态性[J].中国工业医学杂志,2004,17(5):293-295
8赵春江,李宁,邓学梅.应用创造酶切位点法检测单碱基突变[J].遗传,2003,25(3):327-329
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术存在的缺陷,提供一种检测ADH2基因多态性(rs1229984)方法。
本发明采用CRS方法设计适合的引物并选定廉价的内切酶进行PCR-RFLP多态检测,即采用CRS-PCR-RFLP的检测方法对ADH2多态进行检测。
本发明应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物,设计一对创造酶切位点引物扩增含多态的DNA片段,扩增后不同多态类型的DNA片段经限制性内切酶HhaI、HinP1I或者BstUI及其同工酶酶切后得电泳图谱,依据获得的电泳图谱条带类型判断ADH2基因多态类型。
本方法包括下述步骤:
1)序列搜索与多态位点确定,
确定ADH2多态位点为A/G多态rs1229984,位于第4染色体,第3外显子,基因组位置3240;
2)序列分析与引物设计,
上游P1:5’GGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATACA 3’
下游P2:5’CACTAACCACGAGGTCATCTGCG 3’
3)PCR扩增和RFLP分析;
4)基因型的判断;
5)ADH2基因多态结果鉴定。
本发明针对原有ADH2基因第3外显子3240位点多态(rs1229984)PCR-RFLP方法检测中内切酶价格昂贵且难以获得的缺点,应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物,设计一对创造酶切位点引物扩增含多态位点的DNA片段,扩增后不同多态类型的DNA片段经限制性内切酶HhaI、HinP1I或BstUI酶切后能显示不同的电泳图谱,依据条带类型可判断多态类型。引物设计后通过实验表明PCR扩增顺利,Bsh1236I(BstUI的同工酶)酶切后电泳图谱条带清晰,易于辨认。本发明所采用的限制性内切酶HhaI、HinP1I和BstUI内切酶价格便宜,易于获得,可任选其一进行酶切实验。经测序验证不同基因型序列特征,结果与预期完全一致。
附图说明
图1是ADH2基因3240位点PCR产物经Bsh1236I酶切后电泳图谱,
其中,M:DNA分子量标准;泳道1,2:AG;泳道3:GG;泳道4:AA。
图2是ADH2基因3种多态测序图。
具体实施方式
实施例1
1、序列搜索与多态位点确定
根据NCBI的GENE和SNP数据库,获取ADH2基因全序列及多态位点信息,确定拟研究多态位点。所述的ADH2基因全序列和ADH2多态位点信息从下述网页获得:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=89161207,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp ref.cgi?rs=1229984,
根据上述网页的信息和有关文献,本发明确定ADH2多态位点为A/G多态(rs1229984),位于第4染色体,第3外显子,基因组位置3240。
2、序列分析与引物设计
经序列分析得知:A/G多态可由Tsp45I、MslI和MaeIII三种内切酶(及其同工酶)识别,即A等位基因可被三种内切酶切开,而G等位基因不能被切开。如通过碱基错配PCR将多态位点后面第二位碱基A替换为G,则该多态可由HhaI、HinP1I和BstUI内切酶及其同工酶识别,即G等位基因可被两种内切酶切开,而A等位基因不能切开。HhaI、HinP1I和BstUI内切酶相比原有的三种内切酶具有价格优势(见表1),而且无商品化的MaeIII,另外多家公司均无MaeIII。
表1几种内切酶识别序列及其NEB公司价格
本发明根据上述分析选择错配碱基创造酶切位点方法设计引物,通过Bsh1236I(BstUI的同工酶)进行酶切识别。
首先根据序列确定上游引物的位置与长度,然后搜索适合的下游引物。本发明设计的引物如下述:
上游P1:5’GGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATACA 3’
下游P2:5’CACTAACCACGAGGTCATCTGCG 3’
设计引物及对应扩增序列如下述:
GGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATACA(上游引物5’-3’)
GGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATACAttttagaaacacaatttcaggaattt
gggtatgttaaattcatctagttacaatcttttctgaatctgaacagcttctctttattctgtagatggtggctg
GCGTCTACTGGAGCACCAATCAC(下游引物3’-5’)
其中,大写碱基为引物及其对应的基因组碱基,小写字母为PCR扩增的碱基序列,下划线A碱基为错配碱基用来消除引物二聚体和发夹结构,下划线C碱基为错配碱基用来创造酶切位点,黑体碱基a为多态位点碱基。扩增后加框部分序列由CACA或CGCA(其中第二个碱基A可为G代替即A/G多态)更改为CACG或CGCG,而HhaI和HinP1I识别CGCG序列,可用来判断基因型。扩增后多态位点处A开始四个碱基序列由ACAC或GCAC(其中第一个碱基A可为G代替即A/G多态)更改为ACGC或GCGC,而BstUI可识别GCGC序列,可用来判断基因型。HhaI、HinP1I酶切结果判断与BstUI电泳图谱相似。
3.PCR扩增和RFLP分析
仪器:9600型PCR仪(PE公司),微型电泳槽(Pharmacia Biotech,EPS1000),Gel Doc 2000凝胶成像仪(Bio-RAD公司)。试剂:2×PCR mix(MBI公司),限制性内切酶Bsh1236I(MBI公司),琼脂糖(BBI公司),引物由上海Sangon公司合成。
经知情同意提取397例人外周血基因组DNA用于实验验证。各取50ng的基因组DNA,每个引物0.2μmol/L,1×PCRmix,ddH2O组成25μl反应体系。PCR反应条件为首先94℃预变性5min,然后94℃变性30s,根据引物Tm值取60℃退火20s,72℃延伸20s,共30个循环后72℃延伸10min。PCR扩增后,取PCR产物10μl,加入5u内切酶和2μl 10×酶切缓冲液和ddH2O组成20μl反应体系,37℃水浴中酶切2~16h后,电泳后于凝胶成像仪观察成像。
4.基因型的判断
ADH2位点扩增后出现165bp片断,经Bsh1236I酶切后可出现165bp、142bp、23bp三种片断(其中23bp电泳图中不能看到)。检测结果发现ADH2出现野生型、杂合型和突变型三种基因型。酶切后基因型判断:野生型AA为165bp,杂合型AG有165bp和142bp两种片段,突变型GG为142bp。酶切图谱见图1。
5.ADH2基因多态结果鉴定
ADH2野生型、杂合型和突变型PCR产物随机各取一例进行测序鉴定(上海生工生物工程有限公司)。测序结果如图2,其中AA,GG,AG三种基因型测序图谱按对应位置上下依次排列,并将AA型测序图所对应的碱基序列显示在第一行。测序图中每个峰代表一个碱基,而不同颜色代表不同的碱基类型,A为绿色,T为红色,C为蓝色,G为黑色。其中单下划线字母A对应多态碱基所在位置,结果AA型测序显示多态位点为A,GG型显示为G,AG型显示为双峰,即AG杂合子。双下划线字母G为错配碱基所形成的序列,原序列中A在PCR扩增后改变为G,从而可与附近碱基形成酶切位点。测序结果与预期结果完全一致。
6.ADH2基因多态人群分布与Hardy-Weinberg遗传平衡检验
检测397例测试者ADH2基因多态性,其中ADH2野生型216例(54.41%),杂合型158例(占38.80%),突变型23例(占5.80%)。该基因多态分布经Hardy-Weinberg遗传平衡检验,均达到遗传平衡(P>0.05)。其频率与相关研究结果相似(张竹梅,刘茶珍,边建超,等.洛阳市汉族群体ADH2和ALDH2的基因多态性研究.遗传,2002,24(5):532-536)。
Claims (4)
1.一种检测ADH2基因多态性的方法,其特征是应用碱基错配创造酶切位点原理设计引物,设计一对创造酶切位点引物扩增含多态的DNA片段,扩增后不同多态类型的DNA片段经限制性内切酶HhaI、HinP1I或者BstUI及其同工酶酶切后得电泳图谱,依据获得的电泳图谱条带类型判断ADH2基因多态类型;包括下述步骤:
1)序列搜索与多态位点确定,
确定ADH2多态位点为A/G多态rs1229984,位于第4染色体,第3外显子,基因组位置3240;
2)序列分析与引物设计,
上游P1:5’GGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATACA 3’
下游P2:5’CACTAACCACGAGGTCATCTGCG 3’
3)PCR扩增和RFLP分析;
4)基因型的判断;
5)ADH2基因多态结果鉴定。
2.按权利要求1所述方法,其中所述的PCR扩增和RFLP分析步骤是:取50ng的基因组DNA,每个引物0.2μmol/L,1×PCRmix,ddH2O组成25μl反应体系,PCR反应条件为首先94℃预变性5min,然后94℃变性30s,根据引物Tm值取60℃退火20s,72℃延伸20s,共30个循环后72℃延伸10min;
PCR扩增后,取PCR产物10μl,加入5u内切酶和2μl 10×酶切缓冲液和ddH2O组成20μl反应体系,37℃水浴中酶切2~16h后,电泳后于凝胶成像仪观察成像。
3.按权利要求1所述方法,其中所述的基因型的判断步骤是:ADH2位点扩增后出现165bp片断,经Bsh1236I酶切后出现165bp、142bp和23bp三种片断,判断为ADH2的野生型、杂合型和突变型三种基因型;经酶切后基因型判断为:野生型AA为165bp,杂合型AG有165bp和142bp两种片段,突变型GG为142bp。
4.按权利要求1所述方法,其中所述的ADH2基因多态鉴定步骤是:
ADH2野生型、杂合型和突变型PCR产物随机各取一例进行测序鉴定,
其中AA,GG,AG三种基因型测序图谱按对应位置上下依次排列,AA型测序显示多态位点为A,GG型显示为G,AG型显示为双峰,即AG杂合子。
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