CN101531699B - 一种多肽固相合成法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多肽固相合成法，尤其涉及一种利用数字化模式确定工艺条件的固相合成多肽的方法。本发明的多肽固相合成法可提升产物收率，并降低了副反应发生率。

Description

一种多肽固相合成法
技术领域
本发明涉及一种多肽固相合成法，尤其涉及一种利用数字化模式确定工艺条件的固相合成多肽的方法。
背景技术
目前多肽的合成工艺主要有两种，分别为液相合成法和固相合成法，多肽液相合成基于将单个N-α保护氨基酸反复加到生长的氨基成份上。多肽固相合成一般以树脂为起始原料，逐个连接氨基酸得到多肽粗品，为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是被保护的。而反应物的羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。现阶段本领域多采用固相合成法，其优点主要表现在最初的反应物和产物都是连接在固相载体上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离。
在多肽固相合成中，氨基酸的极性以及空间位阻和缩合位置都会对多肽的合成难易程度造成影响。一般情况下，在缩合位置相同的条件下，氨基酸极性越大，缩合难度越小，空间位阻越大，缩合难度越大；氨基酸极性越小，缩合难度越大，空间位阻越小，缩合难度越小。同一个氨基酸缩合位置越靠后，缩合难度越大；缩合位置越靠前，缩合难度越小。因此在多肽合成过程中，要充分综合考虑氨基酸的极性以及空间位阻和缩合位置。在缩合反应过程中，反应时间和反应温度决定着最终产物的纯度和收率。反应时间过长，氨基酸链会从固相树脂中脱落，导致收率降低。反应时间过短，又不能达到反应终点，导致最终产物纯度降低。反应温度过低，也会造成反应到不了终点，反应温度过高，很易发生消旋副反应。
虽然目前多肽固相合成技术已采用全自动多肽合成仪来完成多肽固相合成反应程序，但如何根据不同反应物质所具有的不同极性参数、空间位阻和缩合位置来确定其合成反应过程中的反应时间和反应温度现已成为多肽固相合成反应中的一个尚待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽固相合成法，其缩合反应时间和温度可依据多肽固相合成反应中待反应的氨基酸的极性参数、空间位阻和缩合位置来确定。按照所得到的反应温度及时间利用全自动多肽合成仪进行多肽的合成，可提升产物收率，并降低了副反应发生率。
本发明提供的全自动多肽合成仪的缩合反应温度和缩合反应时间是如下设定的：
首先，将由表一得到的待反应氨基酸的极性参数、空间位阻和缩合位置参数代入公式d＝a+b+0.017n中求得d值，式中a为极性参数，b为空间位阻，0.017n为缩合位置参数，d为综合缩合参数：
表一
 氨基酸名称   极性参数   空间位阻   缩合位置参数
 甘氨酸Gly G   0.35   0.05   实际缩合过程
 丝氨酸Ser S   0.20   0.30   实际缩合过程
 丙氨酸Ala A   0.35   0.10   实际缩合过程
 苏氨酸Thr T   0.20   0.30   实际缩合过程
 缬氨酸Val V   0.30   0.40   实际缩合过程
 异亮氨酸Ile I   0.25   0.35   实际缩合过程
 亮氨酸Leu L   0.24   0.35   实际缩合过程
 酪氨酸Tyr Y   0.15   0.40   实际缩合过程
 苯丙氨酸Phe F   0.22   0.40   实际缩合过程
 组氨酸His H   0.15   0.35   实际缩合过程
 脯氨酸Pro P   不符合本公式   不符合本公式   不符合本公式
  天冬氨酸Asp D   0.15   0.40   实际缩合过程
  甲硫氨酸Met M   0.2   0.40   实际缩合过程
  谷氨酸Glu E   0.1   0.35   实际缩合过程
  色氨酸Trp W   0.25   0.45   实际缩合过程
  赖氨酸Lys K   0.10   0.40   实际缩合过程
  半胱氨酸Cys C   0.15   0.40   实际缩合过程
  精氨酸Arg R   0.1   0.40   实际缩合过程
  天冬酰胺Asn N   0.2   0.40   实际缩合过程
  谷氨酰胺Gln Q   0.18   0.45   实际缩合过程
然后，根据所得的综合缩合参数d，由表二得到相应缩合反应的缩合反应时间及缩合反应温度：
表二
  综合缩合参数   缩合时间(分钟)   缩合温度(℃)
  0.0-0.1   20-25   20-24
  0.1-0.2   20-25   21-25
  0.2-0.3   30-35   21-25
  0.3-0.4   35-40   25-29
  0.4-0.5   55-60   25-29
  0.5-0.6   75-80   29-33
  0.6-0.7   90-95   30-34
  0.7-0.8   120-125   33-37
  0.8-0.9   200-205   35-39
  0.9-1.0   200-205   40-44
脯氨酸的缩合时间为180-240分钟，缩合温度为30-35℃。
本发明所提供的多肽固相合成法，采用了数字化模式，将反应物的极性以及空间位阻标示成参数，根据多次实验总结的经验公式d＝a+b+0.017n，计算出反应物的综合缩合参数d；再根据多次试验经验总结出的表二，得到反应所需的反应温度和反应时间。按照所得到的反应温度及时间利用全自动多肽合成仪进行多肽的合成，提升了产物收率，降低了副反应发生率。
利用数字化模式进行固相合成得到的多肽，经过常规方法的分离、纯化，收率与常规方法相比提升10％以上，产品起始纯度提高5％。
附图说明
图1示出本发明的多肽固相合成法所合成的生长抑素的HPLC数据；
图2示出常规多肽固相合成法所合成的生长抑素的HPLC数据。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细描述。应当理解，这里描述的实施例只用于举例说明，并不用于限制本发明。
实施例1、生长抑素的固相合成法
本发明所述的固相合成法
实施例A1
将树脂装入全自动多肽合成仪的肽反应瓶中，将第一个经过羧基活化的氨基酸溶液加入全自动多肽合成仪的肽反应瓶中，根据下述表一计算综合缩合参数d，根据综合缩合参数d对照下述表二在控制程序中输入相应的反应温度和反应时间，进行缩合。按以上方法依次进行后面氨基酸的缩合，直到最后一个第14位氨基酸的缩合结束，得到带全保护基的树脂，洗涤全侧链保护的肽树脂后取出，自然干燥。加入切肽试剂进行切肽后进行减压浓缩、洗涤，通入纯氧，氧化后浓缩、过滤、纯化。
表一
 氨基酸名称   极性参数   空间位阻   缩合位置参数
 甘氨酸Gly G   0.35   0.05   实际缩合过程
 丝氨酸Ser S   0.20   0.30   实际缩合过程
 丙氨酸Ala A   0.35   0.10   实际缩合过程
 苏氨酸Thr T   0.20   0.30   实际缩合过程
 缬氨酸Val V   0.30   0.40   实际缩合过程
 异亮氨酸Ile I   0.25   0.35   实际缩合过程
 亮氨酸Leu L   0.24   0.35   实际缩合过程
 酪氨酸Tyr Y   0.15   0.40   实际缩合过程
 苯丙氨酸Phe F   0.22   0.40   实际缩合过程
 组氨酸His H   0.15   0.35   实际缩合过程
 脯氨酸Pro P   不符合本公式   不符合本公式   不符合本公式
 天冬氨酸Asp D   0.15   0.40   实际缩合过程
 甲硫氨酸Met M   0.2   0.40   实际缩合过程
 谷氨酸Glu E   0.1   0.35   实际缩合过程
 色氨酸Trp W   0.25   0.45   实际缩合过程
 赖氨酸Lys K   0.10   0.40   实际缩合过程
 半胱氨酸Cys C   0.15   0.40   实际缩合过程
 精氨酸Arg R   0.1   0.40   实际缩合过程
 天冬酰胺AsnN   0.2   0.40   实际缩合过程
 谷氨酰胺Gln Q   0.18   0.45   实际缩合过程
表二
  综合缩合参数   缩合时间(分钟)   缩合温度(℃)
  0.0-0.1   20-25   20-24
  0.1-0.2   20-25   21-25
  0.2-0.3   30-35   21-25
  0.3-0.4   35-40   25-29
  0.4-0.5   55-60   25-29
  0.5-0.6   75-80   29-33
  0.6-0.7   90-95   30-34
  0.7-0.8   120-125   33-37
  0.8-0.9   200-205   35-39
  0.9-1.0   200-205   40-44
具体操作为：
配料：
(1)称取H-Cys(Trt)-2-Cl-Trt-Resin树脂20g装于全自动固相合成仪(美国SCBio公司，型号CS936S)的反应瓶中，加入二甲基甲酰胺(DMF)适量，溶胀2小时。
(2)氨基酸缩合液的配制：称取Fmoc-Ser(tBu)-OH 11.50g，Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.93g，Fmoc-Phe-OH 11.63g，Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.93g，Fmoc-Lys(Boc)-OH 14.06g，Fmoc-Trp-OH 12.80g，Fmoc-Phe-OH 11.63g，Fmoc-Phe-OH 11.63g，Fmoc-Asn(Trt)-OH 17.90g，Fmoc-Lys(Boc)-OH 14.06g，Fmoc-Cys(Trt)-OH 17.58g，Fmoc-Gly-OH 8.93g，Fmoc-Ala-OH 9.34g并分别装入于13个三角瓶中，再向每个三角瓶中分别加入二环己基碳二亚胺(DCC)和DMF溶解，滤去沉淀，将滤液加入全自动合成仪储备瓶中，备用。
(3)配制30％哌啶DMF溶液、DMF(分析纯)、二氯甲烷(DCM)(分析纯)，分别加入全自动合成仪原料储备瓶中。
2、缩合：
在上述表一中查到所述各种氨基酸的极性参数，空间位阻及缩合位置，计算出综合缩合参数d，再根据d在上述表二中查出相应的反应温度和时间。所述各种氨基酸(按顺序)参数d及相应的反应温度及时间详见下表三：表三各种氨基酸参数d及相应的反应温度及时间表
  氨基酸名称   综合缩合参数d   缩合时间(分钟)   缩合温度(℃)
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   0.534   75   29
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.551   75   31
  Fmoc-Phe-OH   0.688   90   33
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.585   75   29
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.602   90   33
  Fmoc-Trp-OH   0.819   200   37
  Fmoc-Phe-OH   0.756   120   36
  Fmoc-Phe-OH   0.773   120   33
  Fmoc-Asn(Trt)-OH   0.770   120   35
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.687   90   31
  Fmoc-Cys(Trt)-OH   0.754   120   35
  Fmoc-Gly-OH   0.621   90   31
  Fmoc-Ala-OH   0.688   90   33
将表三中计算好的数据输入全自动化固相合成仪的控制***的SOM(生长抑素)2号程序中，运行SOM 2号程序脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc-)，缩合完后用配制好的DMF和DCM洗涤6次，当缩合进行到距理论反应结束时间还差十分钟时，用茚三酮乙醇溶液检测是否达到反应终点。若反应达到终点时，用30％哌啶DMF溶液洗涤1次，再用DMF洗涤3次。重复以上缩合步骤进入下一个氨基酸的缩合程序。直到所述13个氨基酸均缩合完毕，关闭固相合成仪。
3、切肽：
所述14个氨基酸反应缩合完毕后，80％的三氟乙酸(TFA)水溶液中加入5％苯酚配制为切肽试剂，按每10ml切肽试剂中加入精确称量的1g全保护的生长抑素树脂的比例加入切肽试剂和生长抑素树脂，反应1小时。反应结束后将切肽后所得溶液装入三角瓶，加入***，收集沉淀，晾干。
4、检测：
精确量取上述所得沉淀1g置于100ml容量瓶中，加入醋酸(分析纯)定容到100ml，摇匀，用分析型高效液相色谱仪检测，检测结果如图1所示。
5、结果：
  缩合前树脂重   缩合后树脂增重
  20.0g   40.01g
由图1可得使用本发明所述的固相合成法合成的生长抑素峰面积为236.375，归一化法主峰面积百分比为76.70％(不含溶剂峰)。
实施例A2
在本实施例中，除缩合时间及缩合温度外，其余反应步骤及其反应条件均与实施例A1相同。本实施例缩合时间及温度按表四确定：
表四各种氨基酸参数d及相应的反应温度及时间表
  氨基酸名称   综合缩合参数d   缩合时间(分钟)   缩合温度(℃)
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   0.534   76   30
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.551   76   30
  Fmoc-Phe-OH   0.688   91   32
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.585   76   30
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.602   91   32
  Fmoc-Trp-OH   0.819   201   38
  Fmoc-Phe-OH   0.756   121   34
  Fmoc-Phe-OH   0.773   121   34
  Fmoc-Asn(Trt)-OH   0.770   121   34
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.687   91   32
  Fmoc-Cys(Trt)-OH   0.754   121   33
  Fmoc-Gly-OH   0.621   91   32
  Fmoc-Ala-OH   0.688   91   32
实施例A3
在本实施例中，除缩合时间及缩合温度外，其余反应步骤及其反应条件均与实施例A1相同。本实施例缩合时间及温度按表五确定：
表五各种氨基酸参数d及相应的反应温度及时间表
  氨基酸名称   综合缩合参数d   缩合时间(分钟)   缩合温度(℃)
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   0.534   77   31
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.551   77   29
  Fmoc-Phe-OH   0.688   92   31
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.585   77   33
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.602   92   34
  Fmoc-Trp-OH   0.819   201   36
  Fmoc-Phe-OH   0.756   122   33
  Fmoc-Phe-OH   0.773   122   37
  Fmoc-Asn(Trt)-OH   0.770   122   36
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.687   92   33
  Fmoc-Cys(Trt)-OH   0.754   122   34
  Fmoc-Gly-OH   0.621   92   30
  Fmoc-Ala-OH   0.688   92   34
实施例A4
在本实施例中，除缩合时间及缩合温度外，其余反应步骤及其反应条件均与实施例A1相同。本实施例缩合时间及温度按表六确定：
表六各科氨基酸参数d及相应的反应温度及时间表
  氨基酸名称   综合缩合参数d   缩合时间(分钟)   缩合温度(℃)
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   0.534   78   33
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.551   78   32
  Fmoc-Phe-OH   0.688   93   34
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.585   78   31
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.602   93   31
  Fmoc-Trp-OH   0.819   203   35
  Fmoc-Phe-OH   0.756   123   35
  Fmoc-Phe-OH   0.773   123   36
  Fmoc-Asn(Trt)-OH   0.770   123   33
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.687   93   34
  Fmoc-Cys(Trt)-OH   0.754   123   36
  Fmoc-Gly-OH   0.621   93   34
  Fmoc-Ala-OH   0.688   93   30
实施例A5
在本实施例中，除缩合时间及缩合温度外，其余反应步骤及其反应条件均与实施例A1相同。本实施例缩合时间及温度按表七确定：
表七各种氨基酸参数d及相应的反应温度及时间表
  氨基酸名称   综合缩合参数d   缩合时间(分钟)   缩合温度(℃)
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   0.534   80   32
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.551   780   33
  Fmoc-Phe-OH   0.688   9095   30
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.585   80   32
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.602   95   30
  Fmoc-Trp-OH   0.819   205   39
  Fmoc-Phe-OH   0.756   125   37
  Fmoc-Phe-OH   0.773   125   35
  Fmoc-Asn(Trt)-OH   0.770   125   37
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.687   95   30
  Fmoc-Cys(Trt)-OH   0.754   125   37
  Fmoc-Gly-OH   0.621   95   33
  Fmoc-Al a-OH   0.688   95   31
B：常规缩合法
具体操作为：
配料：
(1)称取H-Cys(Trt)-2-Cl-Trt-Resin树脂20g装于全自动固相合成仪(美国SCBio公司，型号CS936S)反应瓶中，加入DMF适量，溶胀2小时。
(2)氨基酸缩合液的配制：称取Fmoc-Ser(tBu)-OH 11.50g，Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.93g，Fmoc-Phe-OH 11.63g，Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.93g，Fmoc-Lys(Boc)-OH 14.06g，Fmoc-Trp-OH 12.80g，Fmoc-Phe-OH 11.63g，Fmoc-Phe-OH 11.63g，Fmoc-Asn(Trt)-OH 17.90g，Fmoc-Lys(Boc)-OH 14.06g，Fmoc-Cys(Trt)-OH 17.58g，Fmoc-Gly-OH 8.93g，Fmoc-Ala-OH 9.34g分别装入三角瓶中，再在所述各个三角瓶中分别加入DCC和DMF溶解，滤去沉淀，将滤液加入全自动合成仪储备瓶中，备用。
(3)配制30％哌啶DMF溶液、DMF溶液(请给出浓度)、DCM溶液(请给出浓度)分别加入全自动合成仪原料储备瓶中。
2、缩合：
启动固相合成仪SOM 1号程序，设置反应温度28-32℃，缩合时间2小时。脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc-)缩合完后用配制好的DMF和DCM洗涤6次，当缩合进行到1小时50分时用茚三酮乙醇溶液检测是否达到反应终点。若反应达到终点，用30％哌啶DMF溶液洗涤1次，再用DMF洗涤3次。重复以上缩合步骤进入下一个氨基酸的缩合程序。直到所述13个氨基酸均缩合完毕，关闭固相合成仪。
3、切肽：
所述13个氨基酸反应缩合完毕后，用TFA水溶液中加入5％苯酚配制为切肽试剂，按每10ml切肽试剂中加入精确称量的1g全保护的生长抑素树脂的比例加入切肽试剂和生长抑素树脂，反应1小时。反应结束后将切肽后所得溶液装入三角瓶，加入***，收集沉淀，晾干。
4、检测：
精确量取上述所得沉淀1g置于100ml容量瓶中，加入20％醋酸溶液(w/w)定容到100ml，摇匀，用分析型高效液相色谱仪检测，检测结果如图2所示。
5、结果：
  缩合前树脂重   缩合后树脂增重
  20.0g   43.03g
由图2可得使用常规缩合法合成生长抑素峰面积为197.935，归一化法主峰面积百分比为69.53％(不含溶剂峰)。
实施例A1-A5实验所得的合成生长抑素峰面积和归一化法主峰面积百分比均大于B法所得数据，由此得出A1-A5方法得到的生长抑素的收率和纯度均超过常规技术所得。以下以实施例A1的数值与B法做比较来验证该结论：比较A1、B两种方法得到的生长抑素的收率和纯度：在两种方法下运用的树脂量和各氨基酸的量均相同的条件下，由图1和图2给出的数据可看出，A法合成生长抑素峰面积为236.375，归一化法主峰面积百分比为76.70％(不含溶剂峰)；B法合成生长抑素峰面积为197.935，归一化法主峰面积百分比为69.53％(不含溶剂峰)。因此，A法比B法在合成生长抑素上纯度提高76.70％-69.53％＝7.17％。合成工序纯度的提高将有利于后续的分离工序，并直接影响到最终成品的质量并最终有利于成品质量。A法比B法在合成生长抑素上收率提高(236.375*40.01-197.935*43.03)/(197.935*43.03)＝11.04％。
本发明所述的多肽固相合成法合成而得的生长抑素无论在产品收率还是在纯度上，都明显的优于常规合成法合成而得的生长抑素。另外，从缩合时间上来看，用常规合成法合成生长抑素共需26小时，而使用本发明所述的多肽固相合成法合成生长抑素只需22小时35分钟。因此，本发明所述的多肽固相合成法在生长抑素合成方面的运用可大大提高合成效率、产品纯度及收率，是一种具有很高优越性的新型多肽固相合成方法。
实施例2、降钙素的固相合成法
实施例C1
将树脂装入全自动多肽合成仪的反应瓶中，将一氨基酸溶液加入全自动多肽合成仪的反应瓶中，根据前述表一计算综合缩合参数d，根据综合缩合参数d对照前述表二在控制程序中输入相应的反应温度和反应时间，进行缩合。按以上方法将其余氨基酸逐个进行缩合，直到最后一个氨基酸的缩合结束，得到带全保护基的树脂，将全侧链保护的肽树脂洗涤后取出，红外灯下干燥。加入切肽试剂进行切肽后再进行减压浓缩、洗涤，加入浓氨水调至弱碱性后室温下搅拌，调至酸性后浓缩、过滤、纯化。具体操作如下：
配料：
(1)称取4-甲苯氢胺树脂(MBHA Resinx型树脂)10g装于全自动固相合成仪(美国SCBio公司，型号CS936S)反应瓶中，加入DMF适量，溶胀2小时。
(2)氨基酸缩合液的配制：称取Fmoc-L-Pro 9.177g，Fmoc-Thr(tBu)-OH10.812g，Fmoc-Gly-OH 10.108g，Fmoc-Ser(tBu)-OH 10.428g，Fmoc-Gly-OH8.087g，Fmoc-Thr(tBu)-OH 10.812g，Fmoc-Asn(Trt)-OH 16.230g，Fmoc-Thr(tBu)-OH 10.812g，Fmoc-Arg(pbf)-OH 17.646g，Fmoc-L-Pro 9.177g，Fmoc-Tyr(tBu)-OH 12.498g，Fmoc-Thr(tBu)-OH 10.812g，Fmoc-Gln(Trt)-OH16.611g，Fmoc-Leu 9.612g，Fmoc-Lys(Boc)-OH 12.744g，Fmoc-His(Trt)-OH16.856g，Fmoc-Leu 9.612g，Fmoc-Glu(OtBu)-OH 11.573g，Fmoc-Gln(Trt)-OH16.611g，Fmoc-Ser(tBu)-OH 10.428g，Fmoc-Leu 9.612g，Fmoc-Lys(Boc)-OH12.744g，Fmoc-Gly-OH 8.087g，Fmoc-Leu 9.612g，Fmoc-Val-OH 9.232g，Fmoc-Cys(Trt)-OH 15.931g，Fmoc-Thr(tBu)-OH 10.812g，Fmoc-Ser(tBu)-OH10.428g，Fmoc-Leu 9.612g，Fmoc-Asn(Trt)-OH 16.230g，Fmoc-Ser(tBu)-OH10.428g，Fmoc-Cys(Trt)-OH 15.931g，分别装入三角瓶中，再向所述各个三角瓶中分别加入DCC和DMF溶解，滤去沉淀，将滤液加入全自动合成仪储备瓶中，备用。
(3)配制30％哌啶DMF溶液、DMF溶液(请给出浓度)、DCM溶液(请给出浓度)分别加入全自动合成仪的原料储备瓶中。
2、缩合：
在前述表一中查到各氨基酸的极性参数，空间位阻及缩合位置，计算出综合缩合参数d，再根据综合缩合参数d在前述表二中查出相应的反应温度和时间。各氨基酸(按顺序)参数d及相应的反应温度及时间详见下表：
表八各氨基酸参数d及相应的反应温度及时间表
  氨基酸名称   综合缩合参数d   缩合时间(分钟)   缩合温度(℃)
  Fmoc-L-Pro   不符合本公式   240   34
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.534   75   31
  Fmoc-Gly-OH   0.451   55   27
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   0.568   75   29
  Fmoc-Gly-OH   0.485   55   29
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.602   90   33
  Fmoc-Asn(Trt)-OH   0.719   120   33
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.636   90   31
  Fmoc-Arg(pbf)-OH   0.653   90   33
  Fmoc-L-Pro   不符合本公式   240   35
  Fmoc-Tyr(tBu)-OH   0.737   120   33
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.704   120   35
  Fmoc-Gln(Trt)-OH   0.851   200   39
  Fmoc-Leu   0.828   200   37
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.755   120   33
  Fmoc-His(Trt)-OH   0.772   120   35
  Fmoc-Leu   0.879   200   39
  Fmoc-Glu(OtBu)-OH   0.756   120   33
  Fmoc-Gln(Trt)-OH   0.953   200   40
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   0.840   200   39
  Fmoc-Leu   0.947   200   42
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.874   200   37
  Fmoc-Gly-OH   0.791   120   35
  Fmoc-Leu   0.998   200   40
  Fmoc-Val-OH   1.125   200   42
  Fmoc-Cys(Trt)-OH   0.992   200   42
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.959   200   40
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   0.976   200   40
  Fmoc-Leu   1.083   200   40
  Fmoc-Asn(Trt)-OH   1.110   200   40
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   1.027   200   40
  Fmoc-Cys(Trt)-OH   1.094   200   40
将表五中计算好的数据输入全自动化固相合成仪的控制***的C(降钙 素)1号程序中，运行C1号程序，固相合成仪按照程序开始进入第一个氨基酸的缩合。脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc-)缩合完后用配制好的DMF和DCM洗涤6次，当缩合进行到距理论反应结束时间还有十分钟时，用茚三酮乙醇溶液检测是否达到反应终点。若经检测反应已达到终点，用30％哌啶DMF溶液洗涤1次，再用DMF洗涤3次。重复以上缩合步骤进入下一个氨基酸的缩合程序。直到所述32个氨基酸均缩合完毕，关闭固相合成仪。
3、切肽：
所述32个氨基酸反应缩合完毕后，将鲑鱼降钙素树脂取出洗涤后，红外灯下晾干。用80％的TFA水溶液中加入5％苯酚配制为切肽试剂，按每10ml切肽试剂中加入精确称量的1g全保护的鲑鱼降钙素树脂的比例加入切肽试剂和鲑鱼降钙素树脂，反应1小时。反应结束后将切肽后所得溶液装入三角瓶，加入***，收集沉淀。
4、检测：
精确称量上述所得沉淀1g置于100ml容量瓶中，加入醋酸(分析纯)定容到100ml，摇匀，用分析型高效液相色谱仪检测。
5、结果：
本发明所述的多肽固相合成法合成的鲑鱼降钙素的产品收率和纯度如下表所示：
  缩合前树脂重   缩合后增重   理论增重   收率
  10.0g   48.21g   41.88g   94.87％
实施例C2
在本实施例中，除缩合时间及缩合温度外，其余反应步骤及其反应条件均与实施例C1相同。本实施例缩合时间及温度按表九确定：
表九各种氨基酸参数d及相应的反应温度及时间表
  氨基酸名称   综合缩合参数d   缩合时间(分钟)   缩合温度(℃)
  Fmoc-L-Pro   不符合本公式   240   34
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.534   76   30
  Fmoc-Gly-OH   0.451   56   28
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   0.568   76   30
  Fmoc-Gly-OH   0.485   56   28
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.602   91   30
  Fmoc-Asn(Trt)-OH   0.719   121   34
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.636   91   32
  Fmoc-Arg(pbf)-OH   0.653   91   32
  Fmoc-L-Pro   不符合本公式   240   35
  Fmoc-Tyr(tBu)-OH   0.737   121   34
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.704   121   34
  Fmoc-Gln(Trt)-OH   0.851   201   38
  Fmoc-Leu   0.828   201   38
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.755   121   34
  Fmoc-His(Trt)-OH   0.772   121   34
  Fmoc-Leu   0.879   201   38
  Fmoc-Glu(OtBu)-OH   0.756   121   34
  Fmoc-Gln(Trt)-OH   0.953   201   41
  Fmoc-S er(tBu)-OH   0.840   201   38
  Fmoc-Leu   0.947   201   41
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.874   201   38
  Fmoc-Gly-OH   0.791   121   34
  Fmoc-Leu   0.998   201   41
  Fmoc-Val-OH   1.125   201   41
  Fmoc-Cys(Trt)-OH   0.992   201   41
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.959   201   41
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   0.976   201   41
  Fmoc-Leu   1.083   201   41
  Fmoc-Asn(Trt)-OH   1.110   201   41
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   1.027   201   41
  Fmoc-Cys(Trt)-OH   1.094   201   41
实施例C3
在本实施例中，除缩合时间及缩合温度外，其余反应步骤及其反应条件均与实施例C1相同。本实施例缩合时间及温度按表十确定：
表十各种氨基酸参数d及相应的反应温度及时间表
  氨基酸名称   综合缩合参数d   缩合时间(分钟)   缩合温度(℃)
  Fmoc-L-Pro   不符合本公式   240   30
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.534   77   29
  Fmoc-Gly-OH   0.451   57   26
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   0.568   77   31
  Fmoc-Gly-OH   0.485   57   27
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.602   92   31
  Fmoc-Asn(Trt)-OH   0.719   122   36
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.636   92   34
  Fmoc-Arg(pbf)-OH   0.653   92   30
  Fmoc-L-Pro   不符合本公式   240   31
  Fmoc-Tyr(tBu)-OH   0.737   122   37
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.704   122   37
  Fmoc-Gln(Trt)-OH   0.851   202   37
  Fmoc-Leu   0.828   202   36
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.755   122   36
  Fmoc-His(Trt)-OH   0.772   122   37
  Fmoc-Leu   0.879   202   35
  Fmoc-Glu(OtBu)-OH   0.756   122   37
  Fmoc-Gln(Trt)-OH   0.953   202   44
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   0.840   202   36
  Fmoc-Leu   0.947   202   44
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.874   202   39
  Fmoc-Gly-OH   0.791   122   33
  Fmoc-Leu   0.998   202   43
  Fmoc-Val-OH   1.125   202   44
  Fmoc-Cys(Trt)-OH   0.992   202   44
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.959   202   43
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   0.976   202   43
  Fmoc-Leu   1.083   202   43
  Fmoc-Asn(Trt)-OH   1.110   202   43
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   1.027   202   43
  Fmoc-Cys(Trt)-OH   1.094   202   43
实施例C4
在本实施例中，除缩合时间及缩合温度外，其余反应步骤及其反应条件均与实施例C1相同。本实施例缩合时间及温度按表十一确定：
表十一各种氨基酸参数d及相应的反应温度及时间表
  氨基酸名称  综合缩合参数d   缩合时间(分钟)   缩合温度(℃)
  Fmoc-L-Pro  不符合本公式   240   33
  Fmoc-Thr(tBu)-OH  0.534   79   32
  Fmoc-Gly-OH  0.451   59   25
  Fmoc-Ser(tBu)-OH  0.568   79   33
  Fmoc-Gly-OH  0.485   59   25
  Fmoc-Thr(tBu)-OH  0.602   94   32
  Fmoc-Asn(Trt)-OH  0.719   124   35
  Fmoc-Thr(tBu)-OH  0.636   94   33
  Fmoc-Arg(pbf)-OH  0.653   94   34
  Fmoc-L-Pro  不符合本公式   240   32
  Fmoc-Tyr(tBu)-OH  0.737   124   35
  Fmoc-Thr(tBu)-OH  0.704   124   33
  Fmoc-Gln(Trt)-OH  0.851   204   35
  Fmoc-Leu  0.828   204   34
  Fmoc-Lys(Boc)-OH  0.755   124   37
  Fmoc-His(Trt)-OH  0.772   124   36
  Fmoc-Leu  0.879   204   36
  Fmoc-Glu(OtBu)-OH  0.756   124   35
  Fmoc-Gln(Trt)-OH  0.953   204   42
  Fmoc-Ser(tBu)-OH  0.840   204   37
  Fmoc-Leu   0.947   204   43
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.874   204   36
  Fmoc-Gly-OH   0.791   124   36
  Fmoc-Leu   0.998   204   44
  Fmoc-Val-OH   1.125   204   40
  Fmoc-Cys(Trt)-OH   0.992   204   40
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.959   204   42
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   0.976   204   42
  Fmoc-Leu   1.083   204   42
  Fmoc-Asn(Trt)-OH   1.110   204   42
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   1.027   204   42
  Fmoc-Cys(Trt)-OH   1.094   204   42
实施例C5
在本实施例中，除缩合时间及缩合温度外，其余反应步骤及其反应条件均与实施例C1相同。本实施例缩合时间及温度按表十二确定：
表十二各种氨基酸参数d及相应的反应温度及时间表
  氨基酸名称   综合缩合参数d   缩合时间(分钟)   缩合温度(℃)
  Fmoc-L-Pro   不符合本公式   240   35
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.534   80   33
  Fmoc-Gly-OH   0.451   60   29
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   0.568   80   32
  Fmoc-Gly-OH   0.485   60   26
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.602   95   34
  Fmoc-Asn(Trt)-OH   0.719   125   37
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.636   95   30
  Fmoc-Arg(pbf)-OH   0.653   95   31
  Fmoc-L-Pro   不符合本公式   240   30
  Fmoc-Tyr(tBu)-OH   0.737   125   36
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.704   125   36
  Fmoc-Gln(Trt)-OH   0.851   205   36
  Fmoc-Leu   0.828   205   35
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.755   125   35
  Fmoc-His(Trt)-OH   0.772   125   33
  Fmoc-Leu   0.879   205   37
  Fmoc-Glu(OtBu)-OH   0.756   125   36
  Fmoc-Gln(Trt)-OH   0.953   205   43
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   0.840   205   35
  Fmoc-Leu   0.947   205   40
  Fmoc-Lys(Boc)-OH   0.874   205   35
  Fmoc-Gly-OH   0.791   125   37
  Fmoc-Leu   0.998   205   42
  Fmoc-Val-OH   1.125   205   43
  Fmoc-Cys(Trt)-OH   0.992   205   43
  Fmoc-Thr(tBu)-OH   0.959   205   44
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   0.976   205   44
  Fmoc-Leu   1.083   205   44
  Fmoc-Asn(Trt)-OH   1.110   205   44
  Fmoc-Ser(tBu)-OH   1.027   205   44
  Fmoc-Cys(Trt)-OH   1.094   205   44
可见，本发明所述的多肽固相合成法不但可以运用于13肽这样的中长肽的合成也可运用于鲑鱼降钙素这样由32个氨基酸组成的长肽合成。

Claims (4)

1.一种多肽固相合成方法，其特征在于，利用多肽合成仪进行多肽合成时，其缩合反应温度和缩合反应时间是如下设定的：
首先，将由表一得到的待反应氨基酸的极性参数、空间位阻和缩合位置参数代入公式d＝a+b+0.017n中求得d值，式中a为极性参数，b为空间位阻，0.017n为缩合位置参数，d为综合缩合参数：
表一
 氨基酸名称   极性参数   空间位阻   缩合位置参数  甘氨酸Gly G   0.35   0.05   实际缩合过程  丝氨酸Ser S   0.20   0.30   实际缩合过程  丙氨酸Ala A   0.35   0.10   实际缩合过程  苏氨酸Thr T   0.20   0.30   实际缩合过程  缬氨酸Val V   0.30   0.40   实际缩合过程  异亮氨酸Ile I   0.25   0.35   实际缩合过程  亮氨酸Leu L   0.24   0.35   实际缩合过程  酪氨酸Tyr Y   0.15   0.40   实际缩合过程  苯丙氨酸Phe F   0.22   0.40   实际缩合过程  组氨酸His H   0.15   0.35   实际缩合过程  脯氨酸Pro P   不符合本公式   不符合本公式   不符合本公式  天冬氨酸Asp D   0.15   0.40   实际缩合过程  甲硫氨酸Met M   0.2   0.40   实际缩合过程  谷氨酸Glu E   0.1   0.35   实际缩合过程  色氨酸Trp W   0.25   0.45   实际缩合过程  赖氨酸Lys K   0.10   0.40   实际缩合过程  半胱氨酸Cys C   0.15   0.40   实际缩合过程  精氨酸Arg R   0.1   0.40   实际缩合过程  天冬酰胺Asn N   0.2   0.40   实际缩合过程  谷氨酰胺Gln Q   0.18   0.45   实际缩合过程
然后，根据所得的综合缩合参数d，由表二得到相应缩合反应的缩合反应时间及缩合反应温度：
表二
  综合缩合参数   缩合时间(分钟)   缩合温度(℃)   0.0-0.1   20-25   20-24   0.1-0.2   20-25   21-25   0.2-0.3   30-35   21-25   0.3-0.4   35-40   25-29   0.4-0.5   55-60   25-29   0.5-0.6   75-80   29-33   0.6-0.7   90-95   30-34   0.7-0.8   120-125   33-37   0.8-0.9   200-205   35-39   0.9-1.0   200-205   40-44
所述待反应氨基酸为脯氨酸时，其缩合时间为180-600分钟，缩合温度为30-35℃，所述合成的多肽为14肽或32肽。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，根据所得的综合缩合参数d，由表十三得到相应缩合反应的缩合反应时间及缩合反应温度：
表十三
  综合缩合参数   缩合时间(分钟)   缩合温度(℃)   0.0-0.1   20-25   20-22   0.1-0.2   20-25   21-23   0.2-0.3   30-35   23-25   0.3-0.4   35-40   25-27   0.4-0.5   55-60   27-29   0.5-0.6   75-80   29-31   0.6-0.7   90-95   31-33   0.7-0.8   120-125   33-35   0.8-0.9   200-205   37-39   0.9-1.0   200-205   40-42
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述合成的14肽为生长抑素。
4.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其特征在于，所述合成的32肽为降钙素。
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