CN101530459A - 甘草黄酮制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种甘草黄酮在制备治疗抗高血脂和抗动脉粥样硬化药物中的应用。经药理实验证实，本发明的甘草黄酮制剂具有抗高血脂和抗动脉粥样硬化作用，与现有的治疗药物相比疗效相同，由于是利用了甘草废渣提取，因此成本低，性价比高，即充分利用了资源，又保护了环境。本发明制剂原料资源丰富，与其他西药相比，疗效好但不良反应少，具有良好的社会效益和经济效益。

Description

甘草黄酮制剂的应用

技术领域

本发明属药物用途，涉及甘草黄酮的药物用途，具体涉及甘草黄酮在制备抗高血脂、抗动脉粥样硬化剂药品中的应用。

背景技术

在我国，甘草药用历史悠久，得到广泛的应用。传统医学认为其有益气补中、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功效，有“十方九草”之说。甘草为豆科(Leguminosae)甘草属(GlycyrrhizaLinn.)多种植物的根和根茎。据《中华人民共和国药典》2005年版一部记载其原植物有3种，即乌拉尔甘草G.uralensis Fisch.、胀果甘草G.inflate Bat和光果甘草G.glabraL.。随着药学及其相关学科以及科研设备的发展，人们对甘草的认识也越来越丰富。甘草中主要含有甘草酸、甘草次酸、黄酮、生物碱和氨基酸等化学成分，具有广泛的生理活性。甘草酸和甘草次酸以前研究较深入，但近年来人们发现其中黄酮类成分有较强的生物活性，已成为新的研究热点。迄今为止，已从甘草中分离出150多个黄酮类化合物，可分为黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、查尔酮类、双氢黄酮类、双氢查尔酮类等(中国中药杂志.2003；28(7)：593-597)。甘草黄酮已经研究证明有抗肿瘤作用、抗氧化作用、抗HIV作用、抗溃疡作用、抗心律失常作用和保肝作用等，但甘草黄酮是否能有抗高血脂、抗动脉粥样硬化作用的研究尚未见有报道。

高血脂是指血中胆固醇(TC)和/或甘油三酯(TG)过高或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)过低，现代医学称之为血脂异常。具体的标准如下：总胆固醇(TC)高于5.72mmol/L异常；低密度脂蛋白胆固醇(LDL--C)高于3.64mmol/L异常；高密度脂蛋白胆固醇(HDL--C)低于0.91mmol/L异常；甘油三酯(TG)高于1.70mmol/L，即可称之为高血脂症。

血脂是人体中一种重要的物质，有许多非常重要的功能，但是不能超过一定的范围。如果血脂过多，容易造成“血稠”，在血管壁上沉积，逐渐形成小斑块(就是我们常说的“动脉粥样硬化”)。这些“斑块”增多、增大，逐渐堵塞血管，使血流变慢，严重时血流被中断。动脉粥样硬化性血管疾病(atheroscleroticVascular disease，ASVD)已经成为全球首位死亡原因。这种情况如果发生在心脏，就引起冠心病；发生在脑，就会出现脑中风；如果堵塞眼底血管，将导致视力下降、失明；如果发生在肾脏，就会引起肾动脉硬化，肾功能衰竭；发生在下肢，会出现肢体坏死、溃烂等。此外，高血脂可引发高血压、诱发胆结石、胰腺炎，加重肝炎、导致男性性功能障碍、老年痴呆等疾病。

中医认为，高脂血症属本虚标实之证，属痰、浊、瘀范畴，主要为肝、脾、肾三脏虚损，以肝肾不足为多见。病机一是饮食肥甘厚味，损伤脾胃，同时肝胆疏泄功能不畅，不能泌输精汁而引起脾之消谷、运化功能失调，转化为痰浊。二是肾之阴阳俱虚，相火妄动，致肝阳上亢，甚则化火，木旺则乘土，使脾胃输布功能失调，湿热郁结，痰浊内生。由于痰浊内滞、浸淫脉管、血行受阻，而出现胸痹心痛、昏厥等，与现代医学认为脂肪代谢紊乱是缺血性心脏病、脑血管病的发病因素之一吻合。降脂中药不仅能促进脂肪分解，抑制肠道胆固醇的吸收，且能提高高密度脂蛋白水平，促进胆固醇转运与清除。中药不仅药源丰富，且毒副作用小，同时能根据不同的症状，在辨证的基础上结合高脂血症的临床分类，合理选择不同中药，使之疗效更加确切，故具有广阔的应用前景。最近，我们从甘草分离的甘草黄酮，药理试验证明了甘草黄酮具有很强的抗高血脂和抗动脉粥样硬化作用，其作用强度与他汀类相近；这些作用的机制分析表明甘草黄酮是通过直接降血脂、抗氧化、调节载脂蛋白和减少炎症因子表达，从而达到产生抗高血脂和抗动脉粥样硬化的。将甘草黄酮开发为抗高血脂和抗动脉粥样硬化的药品具有良好的社会效益和经济效益。

发明内容

本发明的目的是提供甘草黄酮在制备治疗抗高血脂和抗动脉粥样硬化药物中的应用。

本发明的甘草黄酮是药物活性成分，按照常规的制剂工艺，可以以甘草黄酮为主要活性成分，加入常规的赋形剂、调味剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、粘合剂、增稠剂、增溶剂等药物辅料，制成任何一种适于临床上使用的剂型，如胶囊剂、片剂、口服液体剂等。制剂规格为按每粒(片)含甘草黄酮300mg。

本发明的另一个目的是提供甘草黄酮制剂在制备改善高血脂和动脉粥样硬化症状的药物中的应用。

由于本发明首次公开了甘草黄酮抗高血脂和抗动脉粥样硬化作用及作用机制，在治疗抗高血脂和抗动脉粥样硬化症状改善中的应用。因此，将甘草黄酮单独或与其它活性组份或辅料配合制成药剂，只要该药剂用于治疗高血脂和动脉粥样硬化，无论以何种给药方式，均属于本发明的保护范围。

本发明的甘草黄酮在制成上述剂型时，均具有治疗或改善高血脂和动脉粥样硬化的作用。任何药剂，如果其组份中含有以甘草黄酮成份制备成药，在其包装或说明书等标识上，以及在其他任何宣传品上，只要注明或提示具有治疗或改善高血脂和动脉粥样硬化的，都落入本发明的保护范围之内。

本发明的甘草黄酮来源于天然植物，因此，可以将甘草黄酮制成保健食品或保健药品。将甘草黄酮制成的保健食品或保健药品，如果在其包装或说明书等标识上注明或提示具有治疗或改善高血脂和动脉粥样硬化，也落入本发明的保护范围之内。

本发明首次证实了甘草黄酮具有抗高血脂和抗动脉粥样硬化作用，将甘草黄酮研发为高血脂和动脉粥样硬化症的治疗药物。它与现有的治疗药物相比，具有三个方面的优势：1)首先是可利用甘草废渣提取甘草黄酮，充分利用了资源，保护了环境；2)原料药物资源丰富，与现有的治疗药物(如银杏叶片)相比疗效相同，但性价比更高；3)与其他西药相比，疗效好但不良反应少。本发明甘草黄酮制剂具有良好的社会效益和经济效益。

附图说明

图1为本发明制剂的制备工艺流程。

图2为主动脉用油红O(oil red O)染色显示脂质沉淀。

图3为硝基酪氨酸(Nitrotyrosine)表达。

图4为硝基酪氨酸(Nitrotyrosine)表达区域的统计分析。

图5为羟基赖氨酸(Hexanoyl-lysine)表达。

图6为羟基赖氨酸(Hexanoyl-lysine)表达区域的统计分析。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例一、甘草黄酮治疗高脂血症和动脉粥样硬化

动物模型试验

我们首先模拟临床建立了高脂血症和动脉粥样硬化动物模型，应用该模型研究后发现本发明的甘草黄酮制备的药物，30mg/kg、60mg/kg、120mg/kg的剂量呈剂量依赖降低血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycefides，TG)和低密度脂蛋白(LDL-C)，升高高密度脂蛋白(HDL-C)含量。甘草黄酮呈剂量依赖升高载脂蛋白ApoA I和游离胆固醇LCAT，明显降低载脂蛋白ApoB。此外，经分析处理表明，甘草黄酮能提高抗动脉粥样硬化因子水平(HDL-C/TC)，呈剂量依赖降低血清及心肌组织MDA水平，升高血清及心肌组织SOD活性和GPx活性；甘草黄酮则呈剂量依赖减少高血脂模型降主动脉壁的脂质沉淀，减少降主动脉硝基酪氨酸(Nitrotyrosine)表达，减少降主动脉羟基赖氨酸(Hexanoyl-lysine)表达。这些作用与作用的机制分析表明，甘草黄酮能直接通过降血脂、抗氧化、调节载脂蛋白和减少炎症因子表达，从而达到产生抗高血脂和抗动脉粥样硬化的。具体实施方式如下：

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

胆固醇(上海蓝季科技发展有限公司，批号060920)

丙硫氧嘧啶(上海复星朝晖药业有限公司，批号060901)

牛磺胆酸钠(Sigma公司，批号066K1704)

总胆固醇(total cholesterol，TC)，甘油三酯(triglycefides，TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)试剂盒(浙江东瓯生物工程有限公司)

载脂蛋白ApoA I/B试剂盒(上海捷门生物技术合作公司)

游离胆固醇(LCAT)测定试剂盒(上海名典生物工程有限公司)

过氧化物歧化酶(SOD)，谷胱苷肽过氧化物酶(GPx)，丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)

1.1.2 动物

60只雄性SD大鼠随机分组，对照组10只，50只大鼠喂食高脂饲料8wk后分为5组：模型组(n＝10)，阳性对照药辛伐他汀组(n＝10)，甘草黄酮高、中、低3组(各n＝10)，自由饮水进食.

1.2 方法

1.2.1 高脂动物模型及药物处理

高脂饲料成分比例

30g/kg胆固醇

2g/kg去氧胆酸钠

100g/kg猪油

1g/kg丙基硫氧嘧啶

867g/kg基础饲料

50只大鼠喂食高脂饲料8wk后，随机取10只，与对照组10只一起测定各项指标。将50只喂食高脂饲料8wk的大鼠分为5组；对照组与模型组(等体积生理盐水)、辛伐他汀组(10mg/kg)、甘草黄酮(30mg/kg)、甘草黄酮(60mg/kg)、甘草黄酮(120mg/kg)混悬液灌胃给药，每日一次，连续灌胃8wk.

1.2.2 血液及标本取材实验8，16wk时各组动物禁食过夜，20g/L戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉后分离腹主动脉，穿刺取血8mL，静置过夜，离心，分离血清，取心脏左室游离壁于PBS液中清洗后置于液氮中保存待用.

1.2.3 血脂检测采用日立全自动生化分析仪7600检测8，16wk大鼠总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycefides，TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)含量。用载脂蛋白ApoA I/B试剂盒和游离胆固醇(LCAT)测定试剂盒测定Apo A I、ApoB和LCAT。

1.2.4 血清及心肌组织氧化指标检测取大鼠心脏1g，制备1∶5组织匀浆.3000r/min离心15min，吸取上清，按试剂盒所述方法测定大鼠血清及心肌MDA、GPx、SOD。

1.2.5 动脉样本的免疫组化检测取近心端的降主动脉，展开后用油红O(oil red O)染色。免疫组化硝基酪氨酸和HEL形成用Histofine Simple StainMAX PO试剂盒(Nichirei Co.，Tokyo，Japan)。简言之，动脉组织用含0.3％过氧化氢的甲醇浸泡以阻断内源性过氧化物酶活性。切片的显色，在4℃用抗硝基酪氨酸(Upstate Biotech，DBA，Milan，Italy)(diluted 1:1000)或者用抗HEL(Japan Institute for the Control of Aging，Shizuoka，Japan)(diluted 1:50)处理过夜，然后用二抗(Fab)过氧化酶复合物处理30min，用3，3’-diaminobenzidinetetrahydrochloride(DAB)在50mmol/L Tris-HCl buffer(pH7.5)含0.001％过氧化氢，然后Mayer’s haematoxylin复染。对照组切片用缓冲液或非特异性纯化兔抗IgG处理。最后用计算机影像分析软件(WinROOF，Mitani Co.，Fukui，Japan)计算出脂质沉淀的百分率。

1.2.6 统计学处理：实验结果用x±s表示，应用SPSS14.0统计软件进行组间比较的方差分析及LSD-t检验.

2 结果

2.1 甘草黄酮对高脂血症大鼠TC、TG、LDL-C和HDL-C的影响

8wk时模型组血清TC和LDL-C高于对照组(P<0.01)，HDL-C低于对照组(P<0.05)，TG没有统计学差异(P>0.05)，见表1和表2；16wk时TC、TG和LDL-C高于8wk时(P<0.01)，并高于对照组(P<0.01)，HDL-C低于对照组(P<0.01)。辛伐他汀组TC及TG均低于模型16wk组(P<0.05或P<0.01)，甘草黄酮呈剂量依赖降低TC、TG和LDL-C水平(P<0.05，表1).高剂量甘草黄酮组与辛伐他汀组作用强度相近。

2.2 甘草黄酮对高脂血症大鼠载脂蛋白ApoA I和ApoB、游离胆固醇(LCAT)、HDL-C/TC比率的影响

模型组与正常组比较，ApoA I，LCAT明显降低(P<0.001)，ApoB明显升高(P<0.001)；与模型组相比，甘草黄酮呈剂量依赖升高ApoA I和LCAT(P<0.05～P<0.001)，明显降低ApoB(P<0.05～P<0.001)。此外，经分析处理表明，甘草黄酮能提高抗动脉粥样硬化因子水平(HDL-C/TC)(P<0.01)，见表3和表4。

表1 对高脂血症大鼠TC和TG变化的影响(n＝8，x±s)

^▲▲P<0.01vs正常对照(8wk)；^###P<0.001vs正常对照(16wk)；^*P<0.05，^**P<0.01^***P<0.001vs模型组(16wk).

表2 对高脂血症大鼠LDL-C和HDL-C变化的影响(n＝8，x±s)

^▲▲P<0.01vs正常对照(8wk)；^###P<0.001vs正常对照(16wk)；^*P<0.05，^**P<0.01^***P<0.001vs模型组(16wk)

表3 对高脂血症大鼠载脂蛋白ApoA I和ApoB的影响(n＝8，x±s)

^###P<0.001vs正常对照；^*P<0.05，^**P<0.01^***P<0.001vs模型组.

表4 对高脂血症大鼠游离胆固醇(LCAT)和HDL-C/TC比率的影响(n＝8，x±s)

^###P<0.001vs正常对照；^*P<0.05，^**P<0.01^***P<0.001vs模型组.

2.3 血清及心肌中氧化指标模型8wk组血清及心肌组织MDA含量高于对照组(P<0.01)，血清及心肌组织GPx活性低于对照组(P<0.05或P<0.01)；模型16wk组MDA含量高于模型8wk组(P<0.01)，GPx和SOD活性低于模型8wk组。甘草黄酮呈剂量依赖降低血清及心肌组织MDA水平，升高血清及心肌组织SOD活性和GPx活性，活性作用与阳性对照药辛伐他汀一致，见表5。

表5 血清及心肌组织MDA、SOD和GPx动态比较(n＝8，x±s)

^▲P<0.05，^▲▲P<0.01vs正常对照(8wk)；^##P<0.01，^###P<0.01vs正常对照(16wk)；^*P<0.05，^**P<0.01^***P<0.001vs模型组(16wk).

2.4 对降主动脉脂质沉淀的影响

参见图1，对照组动物的降主动肉眼观察未见有脂质沉淀，而模型组动物可见明显的脂质沉淀，甘草黄酮则呈剂量依赖减轻脂质沉淀。图中脂质沉淀(箭头显示)主要在模型组，甘草黄酮组显示明显减轻，其中A：对照组；B：模型组；C：甘草黄酮60mg/kg。

2.5 对降主动脉硝基酪氨酸(Nitrotyrosine)表达的影响

参见图2，对照组动物的降主动未见有Nitrotyrosine表达，而模型组动物可见明显的Nitrotyrosine表达，甘草黄酮则呈剂量依赖减少Nitrotyrosine表达，参见图3。图2中模型组硝基酪氨酸表达阳性(箭头显示)，甘草黄酮组显示明显减轻硝基酪氨酸表达阳性，其中A：对照组；B：模型组；C：甘草黄酮60mg/kg。图3中^#P<0.01vs对照组；^*P<0.01vs模型组。

2.6 对降主动脉羟基赖氨酸(Hexanoyl-lysine，HEL)表达的影响

参见图4，对照组动物的降主动未见有HEL表达，而模型组动物可见明显的HEL表达，甘草黄酮则呈剂量依赖减少HEL表达，参见见图5。图4中模型组羟基赖氨酸表达阳性(箭头显示)，甘草黄酮组显示明显减轻羟基赖氨酸表达阳性，图中A：对照组；B：模型组；C：甘草黄酮60mg/kg。

3 讨论

动脉粥样硬化(AS)在我国发病率逐年增高，成为中老年人主要致死原因之一。血脂异常是动脉粥样硬化的重要危险因素，氧化应激及其介导的脂质过氧化反应在冠心病的发生发展中可能发挥重要作用。血脂异常情况下机体抗氧化能力下降，氧自由基生成增加，过量的氧自由基引起内皮细胞功能障碍，使细胞膜的稳定性、通透性失调，导致单核细胞粘附，脂质沉积于动脉内膜下。氧自由基使脂质过氧化反应在循环***持续发展，加重LDL、VLDL、HDL的氧化，尤其是氧化型低密度脂蛋白，可引发及促进AS病变。近年研究显示氧化应激还能影响细胞信号转导***，调控某些基因表达。细胞内氧化应激信号选择性诱导炎症相关基因表达可能是它们引发动脉粥样硬化斑块形成和发展共同的分子机制。一系列基础试验表明，氧化应激引起的细胞氧化还原状态的改变可激活丝裂原化蛋白激酶(mitogen activated p rotein kinase，MAPK)信号***和调节转录因子NF-κB、AP-1、过氧化物体增殖物激活受体(peroxisomeproliferator activated receptor，PPAR)的活性，从而引起炎症基因表达。

本实验用大鼠建立高脂血症模型，8、16wk时大鼠血脂明显增高，表明模型建立成功。经过8wk甘草黄酮和辛伐他汀治疗，使血清TG、TC、LDL和ApoB水平下降，使血清HDL、ApoA I和LCAT水平升高。但并没有达到正常水平，可能是由于甘草黄酮和辛伐他汀干预的同时继续高脂饲料喂养的原因，也提示甘草黄酮和他汀类药物治疗与合理的膳食能够良好控制高脂血症。胆固醇的逆向转运过程(reverse cholesterol transport，RCT)是组织细胞内过量胆固醇消除的重要途径，其中外周组织细胞的游离胆固醇经LCAT脂化作用，生成胆固醇酯并转运至HDL中，作为RCT的起始和关键环节。ApoA I是HDL的主要载脂蛋白，能激活LCAT。ApoB是一种含糖类的血浆载脂蛋白，携带的胆固醇在动脉壁沉积，导致AS的发生。本实验结果显示，甘草黄酮能明显降低高脂血症大鼠TC、TG、LDL-C、ApoB，升高HDL-C，ApoA I，提示甘草黄酮可有效纠正高脂血症动物的脂质代谢紊乱。从甘草黄酮能明显改善高脂血症大鼠LCAT酶活性来看，甘草黄酮降低血清TC的机制可能通过提高LCAT的活性来增加胆固醇的逆向转运，促进HDL-C对血浆及外周组织胆固醇的清除。血清脂质过氧化反应可诱导炎症因子及炎症反应。实验采用GPx、SOD和MDA作为评价甘草黄酮对高脂血症大鼠氧化应激损伤影响的指标，SOD是抗氧化防御体系中重要的金属酶类，能够清除超氧阴离子，保护细胞免受损伤，细胞外SOD具有抗AS作用。通过测定SOD活性高低可间接反映机体清除氧自由基的能力，GPx是清除氢过氧化物的重要酶类。MDA是脂质过氧化代谢产物，检测MDA水平可间接反映细胞受氧自由基损伤程度，Kishino等发现血液透析患者服用辛伐他汀24wk后也能使血浆MDA明显降低，Chen等通过食饵性兔AS研究认为，洛伐他汀减轻AS病变的机制之一是降低血液中的MDA含量。本实验观察到在模型组8wk时血清及心肌组织MDA含量均高于正常组，GPx活性较正常组下降，血清及心肌中SOD含量与正常组无明显差异，16wk时MDA下降较8wk明显，GPx活性进一步下降，16wk时血清及心肌SOD含量较正常组下降，提示在高脂血症状态下ROS大量生成，而清除存在障碍，机体氧化/抗氧化平衡被打破，脂质过氧化增加，增多的MDA又加重氧化损伤，引发及促进AS的发展，我们观察到随着血脂水平增高及高脂血症持续时间的延长，这种平衡向氧化应激倾斜。甘草黄酮有抗氧化应激损伤作用，主要是抑制脂质过氧化物的形成。我国学者研究发现氟伐他汀能够使心肌梗死后心肌中增高的LPO下降，增加GPx的表达，Rai等研究认为他汀类药物可能作用于血管内细胞NADPH氧化酶减少ROS的产生。本实验中经过甘草黄酮和辛伐他汀干预治疗8wk后大鼠血清及心肌组织中MDA水平下降，但并没有降至正常水平，SOD、GPx活性上升，表明甘草黄酮和辛伐他汀能够改善高脂状态下的大鼠脂质氧化的状况。这种作用可能与上调SOD、GPx含量及活性有关。高胆固醇血症可诱导的心肌组织硝基酪氨酸表达上调，在我们实验中也发现大鼠的降主动脉的硝基酪氨酸表达上调，与文献报道的结果一致，甘草黄酮和可明显减少基酪氨酸表达。许多的研究证明，蛋白的硝基化在认得动脉粥样硬化组织中已经被证明，在动脉粥样硬化的不同阶段有一定的相关性，甚至与病人的粥样斑块的不稳定性有关。硝基酪氨酸在体外实验中可直接增加动脉平滑肌细胞迁移，也是心血管发病机制的因素之一。

通过研究高脂血症状态下大鼠血清及心肌的氧化应激损伤指标，我们发现氧化应激可能参与AS的形成及发展，经过他汀类药物治疗后上述指标明显好转，提示他汀类药物能够缓解AS应激损伤，其具体机制有待进一步研究。

实施例2甘草黄酮制剂

甘草黄酮胶囊

1 处方

2 处方依据及处方的筛选过程

2.1 处方依据

根据药效学试验制订甘草黄酮胶囊，规格：甘草黄酮含量300mg/粒。

淀粉本方中为玉米淀粉，色泽好，吸湿性弱，产量大，价格低；为白色细微粉末，不溶于水和乙醇，在空气中很稳定，与大多数药物不起作用，吸湿而不潮解，遇水膨胀，为最为广泛的稀释剂和崩解剂，本方中主要用作稀释剂崩解剂。

羟丙基纤维素(L-HPC)本品为白色或白色或结晶性粉末，在水中不溶但可吸水溶胀，由于L-HPC粉末有很大的比表面积和孔隙率，故有较大的吸湿速度和吸水量，增加了膨胀性。本品用量，一般可为1％-5％左右，本方中用量为2％。

微粉硅胶，本品为轻质的白色粉末，无臭无味，不溶于水及酸，化学性质稳定，与绝大多数药物不发生反应，良好的流动性，对药物有较大的吸附力，亲水性能强，有利于药物的吸收，本品用量一般仅为0.15％-3％，因为主药甘草黄酮流动性差，本方中用于改善颗粒的流动性，用量为1.5％。

硬脂酸镁为白色粉末，细腻轻松，有良好的附着性，颗粒混合后分布均匀而不易分离，仅少量即可显示出良好的润滑作用，一般用量为0.3％-1％，本方中用量为0.5％。

2.2 处方的筛选过程：

设计以下三个处方(1000粒)规格：300mg/粒表6-1

按照以上三个处方试制样品，并进行以上处方筛选试验。

(1)、进行溶出度试验

①、测定方法

按中国药典2000年版第二部甘草黄酮胶囊溶出度测定法(附录XC第二法)操作，以0.1mol/L醋酸盐缓冲液(取无水醋酸钠82g加水7500ml，用冰醋酸pH值至5.0，加水使成10000ml)为溶剂，转速为每分钟50转，依法操作，按时取溶液经0.8μm微孔滤膜滤过，取续滤液在482nm处测定吸收度，计算溶出百分率。

②、溶出度测定结果

分别取供试品，按测定方法测定溶出度，取样时间5，10，15，20，25，30，45，60min，结果见表6-2

6-2 三个处方溶出度测定结果

根据上表对应的溶出度结果见表6-3。

表6-3 溶出度测定结果(n＝6X±S)

结果表明：处方3在20分钟溶出度可达到86.8％，30分钟溶出度几乎达到最大。处方1、处方2在20分钟吸光度仅有60分钟的60％，30分钟时溶出度为85％。根据中国药典在30分钟时溶出度达到80％，它们都符合药典要求。

由此可见，处方3中低取代羟丙基纤维素(L-HPC)的用量仅为2％，溶出速率明显快于处方1、处方2，可见本方3中加入L-HPC之后，有助于胶囊的崩解而加快了主药甘草黄酮溶出。

(2)、休止角试验：

按处方1、2、3制成颗粒，经口径7cm的长颈漏斗流下，并呈圆锥形状，测其休止角，结果见表6-4

表6-4

可见处方2、3的休止角小于处方1，说明处方2、3的流动性好于处方1。结论：微粉硅胶能显著改善颗粒的流动性能。

综上所述，处方3的溶出度、流动性好于处方1、2，所以选定处方3。

3 生产工艺

3.1 制备方法

制法：称取处方量的甘草黄酮、淀粉、和L-HPC混合，过60目的筛三次，混合均匀；加入10％的淀粉浆适量制软材，用16目制粒，600C干燥，用16目整粒后，加入微粉硅胶、硬脂酸镁混合均匀，用0号胶囊制成1000粒。

3.2 工艺条件的筛选

按处方进行试制1000粒样品。

3.2.1 堆密度试验

将试制的颗粒装入100ml量筒中，以一定的高度落下两次，(每次保持条件一致，松紧适宜，称其重量计算其堆密度，结果见表7-1

表7-1 堆密度试验数据(n＝3)

因此，根据以上数据可知，颗粒平均堆密度是0.46g/ml，每粒装量要求为30mg，所以选择0号胶囊。

3.2.2 吸湿性试验

考察环境湿度对胶囊填充过程中影响程度，为此测定了颗粒的吸湿性。

称取颗粒12份，每份约2g，精密称定，将其置于不同相对湿度环境下放置7天，测其重量变化，结果见表7-2。

表7-2 吸湿性测定数据表(n＝2)

可见，相对湿度在40-90％条件下颗粒重量基本没有变化，吸湿性没有明显增加。因此，可确定该品种的相对湿度要求不严格，在一般的生产环境下可以生产。不会因为水分对药物性质及稳定性造成影响。

4 工艺流程参见图6。

实施例3 甘草黄酮缓释放片处方及制备工艺

1 制剂处方组成

1.1 每1000片含下列物质

甘草苷芹糖                 300g

硬脂酸                     40g

HMPC                       200g

聚乙烯吡咯烷酮(K30)        80g

30％丙烯酸树脂IV号         适量

1.2 包衣液处方

(Y-1-7000)             60g(类白色)

乙醇                   1000ml

2.制备工艺

2.1 粘合剂的配制

精密称取丙烯酸树脂IV号适量，用95％乙醇配制成浓度为30％的溶液，备用。

2.2 片芯的制备

取处方量主药甘草黄酮与辅料A、C、聚乙烯吡咯烷酮充分混匀后过60目筛，加入30％丙烯酸树脂IV号适量，制成干湿适中的软材，24目筛制粒，50℃烘干30分钟，24目筛整粒，压片前加入1％B充分混匀，测定颗粒含量合格后，压片即得。

2.3 包衣

2.3.1 包衣的依据

甘草黄酮缓释片为薄膜衣片，同时考虑到美观等因素，本品制成薄膜衣片。

2.3.2 包衣液的配制

称取(Y-1-7000)适量，缓缓加入70％的乙醇溶液中，配制成6％的包衣液，在磁力搅拌器上不停地搅拌，直至完全溶解，即得。

2.3.3 取素片置包衣锅内，锅转速每分钟30～40转，锅内温度为40～50℃，不间断喷包衣液至素片上，直至均匀包上一层薄膜衣，干燥即得。

2.4 临界相对湿度的测定

在一定温度下，取按处方和工艺制得的颗粒适量，分别放置在不同的饱和盐溶液中，放置5天后，取出称重，以不同的饱和盐溶液的相对湿度作横坐标，颗粒在不同的饱和盐溶液中增重百分率作纵坐标，作曲线图，并作曲线的切线，所得两切线的交点为临界相对湿度，且从图得出临界相对湿度为74％。测定结果见下表8-1。

表8-1 临界相对湿度的测定

 

相对湿度	9％	32.5％	66％	75％	92.5％
						饱和盐溶液	H3PO4	CaCl2	NaNO2	NaCI	KNO3
颗粒重量(g)	0.0345	0.0939	0.2187	0.2868	0.9182
						增重百分率(％)	0.2350	0.9067	2.168	2.848	9.102

本品颗粒的临界相对湿度为74％(>50％)，说明本品颗粒在密封条件下不吸湿。

3.处方依据

3.1 剂量的确定

甘草黄酮缓释片其规格为300mg/片，本品临床上常规用量为每日300～900mg，在确定本品的剂量时，并考虑到方便病人服用，便于剂量调节，故确定为每片含甘草黄酮300mg。

3.2 处方筛选

3.2.1 辅料的干扰性试验

选择在333nm波长处无吸收干扰的辅料如C、聚乙烯吡咯烷酮、糊精、淀粉、甘露醇、A、B、丙烯酸树脂等，按处方配比取一片量辅料，加入容器中照含量测定项下方法，测定定量溶液的吸收度，实验结果表明在333nm波长处辅料无吸收。

3.2.2 处方筛选过程

甘草黄酮可溶于水，为了使药物缓慢释放，有效血药浓度能维持较长时间，以达到较好的治疗目的，因此，我们制成甘草黄酮缓释片，为骨架型。目前国内常用的缓释材料有：聚乙烯吡咯烷酮、乙基纤维素、A、羟丙甲纤维素、丙烯酸树脂等。以每片含甘草黄酮30mg，采用上述控释材料中的一种或数种以及不同规格、不同用量组方，进行体外释放度试验，从十多个缓释处方中发现1、2号处方缓释效果较好，但2号处方体外释放度最好，且颗粒的可压性、流动性和处方的重现性均佳，故确定处方2为本缓释片处方。

处方筛选过程如下表：表8-2

 

处方号	处方组成(1000片量)	判断标准	结果
				1	甘草黄酮        300g硬脂酸          100gHMPC            150g丙烯酸树脂II    20g20％(K90)       适量	硬度：9kg休止角：26°外观：尚可释放度2小时：41.9％6小时：74.5％12小时：98.5％	释放度略快，此处方不可行
2	甘草黄酮        300g硬脂酸          40gHMPC            200g(K30)           80g丙烯酸树脂5     适量	硬度：：10kg休止角：25°外观：好释放度2小时：39.7％6小时：66.2％12小时：87.1％	释放度好，可压性、流动性、外观等也好，本处方可行

 

3

甘草黄酮          300g丙烯酸树脂II      20g糊精              20g(K90)             20g硬脂酸            50g乙基纤维素        适量

硬度：：10kg休止角：27°外观：好释放度2小时：74.3％6小时：93.5％12小时：未测

释放度太快。此处方不可行

3.2.3 试制的三批样品检测结果

根据确定的处方和制备工艺，试制了三批样品，检测结果如下：

表8-3

 

批号	含量％	释放度％
			080219	98.79	2小时：40.56小时：63.912小时：85.3
080221	99.51	2小时：38.46小时：64.712小时：83.3
			080223	99.63	2小时：38.96小时：62.612小时：82.6

从三批试制样品检测结果表明：该品确定的处方和制备工艺可行。3.2.4以pH6.8的磷酸盐缓冲液作为本品的释放介质，方法采用转篮法(中国药典2000年版二部附录XC第一法)，转速为每分钟100转，取样点为1小时、3小时和10小时，据此我们重新测定了三批样品及进口片的释放度，结果如下：

表8-4

 

批号	释放度％
		080219	1小时：31.4     3小时：54.4    10小时：85.8
080221	1小时：32.1     3小时：54.4    10小时：85.9
		080223	1小时：32.1     3小时：54.1    10小时：84.1

同时对试制的样品(000906)进行了影响因素试验(光照试验、高温试验、高湿试验)，方法与结果如下：

(1)光照试验

在室温条件下，本品去除外包装将样品平摊在平皿里，在4500lux光强度下放置5、10天后取样检测。结果见表8-5。

(2)高温试验

本品去除上市包装分别于60℃的烘箱中放置5、10天后取样检测。结果见表8-6。

(3)高湿试验

本品去除上市包装分别放入恒湿器皿中，于25℃、相对湿度92.5％敞口放置考核5、10天后取样检测。结果见表8-7。

表8-5 光照试验结果

*指片芯色泽，薄膜衣均无变化(下同)

表8-6.高温试验结果

表8-7.高湿度试验结果

4.各辅料在处方中的作用

4.1A：具有疏水性，阻止药物的释放。

4.2 羟丙甲纤维素：为亲水性高分子纤维素材料，遇水形成凝胶，降低水向片内渗透的速率，延缓药物的释放，具有缓释作用。国内外已广泛用于缓控释制剂。

4.3 聚乙烯吡咯烷酮：为亲水性高分子材料，遇水形成凝胶，降低水向片内渗透的速率，延缓药物的释放，具有缓释作用。国内外已广泛用于缓控释制剂

4.4 丙烯酸类树脂：商品名为“Eudragit”，因其取代基不同分成各种型号，国外已广泛用来作为控缓释制剂的材料，也用作肠溶衣材料，本处方选择其作为粘合剂，利用其成膜性包裹药物，阻止药物在胃内释放速率。

4.5 B：为润滑剂。

4.6 Opadry：薄膜衣材料，主要成份为羟丙甲纤维素。

5.原辅料来源及质量标准

5.1 甘草黄酮：本实验室提取纯化，含量纯度为99％以上。

5.2 A：符合中国药典2005年版，上海延安油脂化工厂生产。

5.3 羟丙甲纤维素：符合美国药典(USP XXIII)，由上海Colorcon公司提供。

5.4 聚乙烯吡咯烷酮：符合美国药典，沈阳东北制药总厂生产。

5.5 丙烯酸树脂IV：符合中国药典2005年版，由连云港制碘厂生产。

5.6 B：符合中国药典2005年版，由上海葡萄糖厂生产。

5.7 Opadry：符合英国药典，由上海Colorcon公司提供。

Claims (4)

1.一种甘草黄酮制剂的应用，其特征在于：所述甘草黄酮制剂在制备治疗抗高血脂和抗动脉粥样硬化的药物中的应用。

2.一种甘草黄酮制剂的应用，其特征在于：所述甘草黄酮制剂在制备改善高血脂和动脉粥样硬化症状的药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的一种甘草黄酮制剂的应用，其特征在于：所制备的制剂以甘草黄酮为活性成分，单独或加入常规的赋形剂、调味剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、粘合剂、增稠剂或增溶剂中的一种或多种药物辅料制成，制剂规格为每粒或片含甘草黄酮300mg。

4.根据权利要求3所述的一种甘草黄酮制剂，其特征在于：所述制剂剂型为胶囊剂或片剂。

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