CN101526533B - 一种快速检测***的胶体金层析试纸条及制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速检测***的胶体金层析试纸条及制备方法，属于生物学免疫方法的检测技术领域。本发明的检测试纸条由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成，金标结合垫为吸附***衍生物金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用***衍生物偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线C线，两条线平行排列。本试纸条特异性强，敏感性高，检出最低限量可达到5ppb；简便、快速、时效性强，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，试纸条加入被检样品液后，在15分钟内即可判定检测结果；结果显示形象、直观、准确；节省费用，适用范围广，便于推广。
Description
技术领域
一种快速检测***的胶体金层析试纸条及制备方法，属于生物学免疫方法的检测技术领域。
背景技术
盐酸***，英文名称：Sibutramine Hydrochloride，其化学名称为：(±)N-{1-[1-(4-氯苯基)环丁基]-3-甲基丁基}-N，N-二甲胺盐酸盐一水合物，CAS号106650-56-0，分子式是C17H26ClN·HCl·H2O，分子量334，是***的盐酸盐水合物。该药由德国Kno ll公司研制，于1997年11月获美国FDA批准在美国上市；2000年5月，该药获国家药品监督管理局(SDA)批准在中国上市，用于治疗肥胖症。盐酸***为口服中枢作用的减肥药，它口服迅速被吸收，经肝脏首过效应，被肝脏的细胞色素P450 3A4同工酶代谢为两种活性产物，即单去甲基***(仲胺类，M1)和双去甲基***(伯胺类，M2)而产生作用。***体内代谢产物的主要作用机制是抑制去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的再摄取，增加突触间隙去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的浓度，引起食欲中枢饱胀感增强，产热量增加；而对去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的释放无明显影响。研究还表明，***及其胺类活性代谢产物无明显抗胆碱、抗组胺和单胺氧化酶抑制作用。适用于运动及饮食控制仍不能减轻的肥胖症。***常见的消化***不良反应主要有口干、厌食和便秘，还有少见的消化***不良反应为腹泻、胃肠炎和味觉异常，发生率一般＜1％，偶有肝和肾损害的报道。***具有升高血压和加快心率的作用，它对神经***不良反应有失眠、头痛、头昏、头晕等，也可有感觉异常、肢体痉挛、张力增加、思维异常、癫痫发作。2002年12月后，“药健”批准文号被取消，保健品从此分流成药品和食品。“曲美”、“赛尼可”等以化学药物成分为主的减肥保健品成为受到严格监管的药品，而以食品为主要成分的减肥保健品则成为了保健食品。
目前，我国减肥保健食品面临两个主要问题，一是虚假、夸大宣传，二是添加违禁药物。针对减肥市场上的保健减肥食品夸大、虚假宣传问题，国家有关部门给予了高度重视，并加大了执法力度，一批有夸大、虚假宣传的问题被集中曝光。然而相对于夸大宣传，在食品中添加一些药物及其结构改造物，此类违禁添加情况隐蔽，它不仅违反了食品卫生法规，而且由于消费者对食品、保健品安全性的信赖，不加限制地服用此类食品、保健品，对其健康的危害极大。对于这种违禁添加行为的监督和控制在技术上就显得比较困难。因大部分监督检验部门缺乏相应的检验方法和标准品，难以对产品中的该成分进行确证的检验，使得产品添加违禁药物情况难以查处。
现今盐酸***主要的分析方法有：高效液相色谱法、毛细管电泳法、LC-MS、LC-MS/MS、GC/MS、衍生化荧光分光光度法，紫外光谱法及薄层色谱法等。仪器分析法灵敏度高，结果准确，但是样品需经一系列复杂的处理净化，繁琐费时，所需仪器设备价格昂贵，而且只有特定的专业技术人员才能操作，不能进行现场检测，时效性差，难以推广。ELISA法以竞争性酶联免疫反应为检测原理，缩短了检测时间，可以定性定量检测。但ELISA方法需要配套的酶标仪和配套试剂，操作过程仍较复杂，而且国内外现处在研发阶段，因而ELISA方法的应用受到了较大限制。
发明内容
本发明的目的：针对现有检测***的技术的不足和缺陷，提供一种快速检测***的金标层析试纸条及制备方法，使其能更加快速、灵敏、简便地检测***残留。
本发明的技术方案：一种***胶体金层析检测试纸条，由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成，金标结合垫为吸附***衍生物金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用***衍生物偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线C线，两条线平行排列。
所述的衬板为不吸水的韧性材料；所述的韧性材料为硬质塑胶条，或不吸水硬纸条；
所述的样品垫为玻璃纤维棉，或为尼龙膜，或为聚偏二氟乙烯膜，或为聚酯膜；
所述的金标结合垫为吸附***衍生物金标抗体的玻璃纤维棉；
所述的包被膜为硝酸纤维素膜，或为纯纤维素膜，或为羧化纤维素膜；
所述的吸水垫为吸水滤纸或滤油纸。
所述的***衍生物金标抗体为胶体金标记的***衍生物多克隆抗体，所述的偶联***衍生物的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，或为鸡卵清白蛋白OVA。
试纸条的制备方法，首先制备偶联***衍生物载体蛋白，用于制备相应的检测线T线和抗体；制备***衍生物金标抗体，用于制备吸附***衍生物金标抗体的玻璃纤维棉；制备羊抗兔IgG抗体，用于制备对照线C线；
(1)、将双去甲基***M2与载体蛋白BSA进行偶联制备人工结合抗原M2-BSA；
(2)、将人工结合抗原M2-BSA按常规方法免疫制得抗***衍生物多抗；
(3)、用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液；
(4)、用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节胶体金溶液为pH9.0，将10mL胶体金溶液加入50mL烧杯中，用电磁搅拌器250rpm搅拌，逐滴加入150μL多抗溶液，平衡过夜，逐滴加入5％BSA，使BSA的终浓度为1％，持续搅拌5min，再将金标抗体溶液常温3000rpm离心15min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，余下的溶液体积以下称原体积，取该余下的红色上清溶液于4℃以11000rpm离心40min，溶液分为二层：透明上清及管底可流动的暗红色沉淀；轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用重悬液混悬，恢复原体积后再离心；重复2～4次，以彻底除去未结合的蛋白质，最后用重悬液将沉淀混悬为原体积的1/10，4℃保存备用，获得***衍生物胶体金标记抗体；
所述重悬液为含5％蔗糖的0.002mol/L pH9.0的硼酸钠缓冲液；
(5)、将1∶100～500稀释的***衍生物胶体金标记抗体吸附于玻璃纤维棉中，37℃干燥，制备***衍生物金标结合垫；
(6)、在包被膜上用***衍生物偶联的载体蛋白溶液印制直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制直线式隐形对照线C线，两条线平行排列；
(7)、试纸条的组装：将样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫由一端依次粘附在衬板上，即得到用于免疫检测的***胶体金层析检测试纸条。
胶体金层析试纸条检测反应原理
***(Sibutramine Hydrochloride)，因为分子量仅为335，属于小分子物质。本发明采用竞争法，即样品中的***和固定在包被膜上的包被抗原M2-OVA竞争胶体金标记的抗***多克隆抗体。
当试纸条以样品垫末端浸入样本后，样品溶液沿着试纸条通过毛细作用从下往上泳动，溶解金标垫上干燥的金标抗体，若待测样品中不存在待测药物，则金标抗体会直接泳动到检测线和硝酸纤维膜上的M2-OVA发生免疫反应，从而胶体金颗粒发生聚集，形成红色的线条，然后其他未结合的金标抗体继续通过毛细管作用向前泳动，与对照线上的羊抗兔二抗发生第二次免疫反应，同样形成红色线条，这样包被膜上就会有两条红色线条，表示样品为阴性。若待测样品中存在待测药品，则金标抗体首先会和样品中的检测物发生免疫反应，当未发生反应的金标抗体有剩余时，才会在检测线上与M2-OVA发生免疫反应，形成红色线条，其颜色强度弱于阴性时的线条强度；而当金标抗体全部和样品中的***发生免疫结合时，就不会再有抗体与对照线包被原结合，从而检测线就不会有红色线条出现。对照线是为检验金标免疫层析方法本身是否有效而设定的，所以无论样品中是否存在待测药物***，对照线都应该显现。如果对照线不显色，则说明试纸条失效。
本发明的有益效果：本发明的检测试纸条具有下列优点：
①特异性强，敏感性高。该胶体金层析检测试纸条以胶体金标记高亲和力的多克隆抗体为基础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金标记对抗体的特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此，试纸条具有较强的特异性和较高的敏感性，检出最低限量可达到5ppb。
②简便、快速、时效性强。使用胶体金层析检测试纸条和试纸卡，无需任何其它试剂和仪器，可现场操作，试纸条加入被检样品液后，在15分钟内即可判定检测结果。
③结果显示形象、直观、准确。检测试纸条均以显示红色线T线和C线作为检测结果阳性和阴性标记，即在包被膜上显示一条红色线C线时，表示在被检样品中含有被检物，显示两条红色线T线和C线时，表示在被检样品中不含被检物。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。
④节省费用，适用范围广，便于推广。使用检测试纸条，比用仪器分析和ELISA试剂盒的费用大幅下降。另外，试纸条的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括专业检验，海关检疫，卫生检疫，质量监测，加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。
附图说明
图1、***胶体金层析检测试纸条剖面结构示意图。
图2、***胶体金层析检测试纸条俯视结构示意图。
具体实施方式
要制成***检测试纸条，首先需要制备偶联***衍生物载体蛋白，用于制备相应的检测线(T线)和抗体；而且需要制备***衍生物金标抗体，用于制备相应的金标抗体纤维棉；另外需要制备羊抗兔IgG抗体，用于制备对照线(C线)。
1、***衍生物与载体蛋白偶联
混合酸酐法：将双去甲基***(M2)与载体蛋白BSA进行偶联制备人工结合抗原M2-BSA。具体制备方法如下：
20mg(0.06627mmol)双去甲基盐酸***溶液溶于1.5ml溶解有8mg(0.08mmol)丁二酸酐的吡啶溶液中，然后常温下避光搅拌23小时后用氮气吹干，再加N，N-二甲基甲酰胺DMF∶1，4-二氧六环体积比1∶1的混合溶剂1.2mL充分溶解后，加入21.2μL(0.08mmol)三丁胺在冰水中搅拌10分钟，再加入12μL(0.08mmol)氯甲酸异丁酯室温搅拌反应1h，为A液。称取100mg(0.00151mmol)牛血清白蛋白(BSA)溶于5.8mL pH8.5的硼酸纳缓冲溶液中，低温中保存，此液为B液。在低速搅拌下，在冰水中将活化的A液逐滴加入到B液中搅拌，滴完后转入室温下搅拌反应24h，离心去掉沉淀，取上清液即得人工抗原混合液。
透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用。
将人工抗原混合液移入透析袋中，用2×2L的0.01M的PBS溶液和2×2L的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：M2-BSA。
2、抗***衍生物多克隆抗体的制备
多抗制备：用M2-BSA抗原免疫新西兰白兔，免疫剂量为1mg/次，背部皮下多点注射。首免，用M2-BSA抗原与等量弗氏完全佐剂(FCA)混合，充分乳化；加强免疫，用M2-BSA抗原与等量弗氏不完全佐剂(FIA)混合，充分乳化，首免后3周进行，连续免疫4-5次，每次间隔2～3周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，-20℃冻存备用。
3、***衍生物金标抗体和金标物结合垫的制备
柠檬酸三钠还原法制备胶体金：由于氯化金极易吸湿，因此使用小剂量封装的氯化金时，必须一次配完。将1g的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1％的水溶液。放在4℃冰箱内保存，保存时间长达几个月至1年左右。再取1％的氯金酸溶液10mL，配制成浓度为0.1g/L的氯金酸溶液。取0.1g/L氯金酸溶液50mL放入锥形瓶，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾并持续2min，在100r/min磁力搅拌下，加入1％柠檬酸三钠水溶液2mL，保持温度和搅拌速度不变，继续搅拌加热6min，直至溶液呈透亮的酒红色。室温冷却，4℃保存备用。获得直径为20-40nm的胶体金溶液。
用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节胶体金溶液为pH9.0，将10mL胶体金溶液加入50mL烧杯中，用电磁搅拌器250rpm搅拌，逐滴加入150μL抗体溶液，平衡过夜。逐滴加入5％BSA，使BSA的终浓度为1％，持续搅拌5min，以饱和游离的胶体金。再将金标抗体溶液常温低速(3000rpm)离心15min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀。取红色上清溶液于4℃以11000rpm离心40min。溶液分为二层：透明上清及管底可流动的暗红色沉淀。轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用重悬液混悬，恢复原体积后再离心。如此重复2～4次。以彻底除去未结合的蛋白质。最后用重悬液将沉淀混悬为原体积的1/10，4℃保存备用，获得***衍生物胶体金标记抗体。
将1∶100～500稀释的***衍生物胶体金标记抗体吸附于精制玻璃纤维棉中，37℃干燥，制备***衍生物金标物结合垫。
实施例1：把选定浓度的包被抗原及羊抗兔IgG喷在包被膜上，分别作为检测线(T)和控制线(C)，在37℃烘箱干燥10min。以同样方法，将一定浓度的金标抗体包被在结合垫上。试纸条组成为一个衬板，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、包被膜和吸水垫。将贴好的板切割成3mm宽的条，然后将试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。
检测操作方法：将***胶体金层析检测试纸条样品端***待测样品液中，***深度不超过标记线，约10～20秒钟取出检测试纸条，水平放置，15分钟左右观察判定检测结果。
结果判定：如果在包被膜上仅有C线一条红线显现，表示检测结果为阳性，说明在待测样品中含有***；如果在包被膜上C线和T线两条红线都显现，表示检测结果为阴性，说明在待测样品中不含***或含量低于检测限；如果在包被膜上C线红线不显现，则表明试纸条已失效。
Claims (3)
1.一种***胶体金层析检测试纸条，其特征在于由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成，金标结合垫为吸附双去甲基***金标抗体的玻璃纤维棉，在包被膜上有用双去甲基***偶联的载体蛋白溶液印制的直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制的直线式隐形对照线C线，两条线平行排列；
所述的偶联双去甲基***的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA，或为鸡卵清白蛋白OVA。
2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征是：所述的衬板为不吸水的韧性材料；所述的韧性材料为硬质塑胶条，或不吸水硬纸条；
所述的样品垫为玻璃纤维棉，或为尼龙膜，或为聚偏二氟乙烯膜，或为聚酯膜；
所述的包被膜为硝酸纤维素膜，或为纯纤维素膜，或为羧化纤维素膜；
所述的吸水垫为吸水滤纸或滤油纸。
3.权利要求1所述试纸条的制备方法，其特征在于首先制备偶联双去甲基***载体蛋白，用于制备相应的检测线T线和抗体；制备双去甲基***金标抗体，用于制备吸附双去甲基***金标抗体的玻璃纤维棉；制备羊抗兔IgG抗体，用于制备对照线C线；
(1)、将双去甲基***M2与载体蛋白BSA进行偶联制备人工结合抗原M2-BSA；
(2)、将人工结合抗原M2-BSA按常规方法免疫制得抗双去甲基***多抗；
(3)、用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液；
(4)、用0.1mol/L K2CO3或0.1mol/L HCl调节胶体金溶液为pH 9.0，将10mL胶体金溶液加入50mL烧杯中，用电磁搅拌器250rpm搅拌，逐滴加入150μL多抗溶液，平衡过夜，逐滴加入5％BSA，使BSA的终浓度为1％，持续搅拌5min，再将金标抗体溶液常温3000rpm离心15min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀，余下的溶液体积以下称原体积，取该余下的红色上清溶液于4℃以11000rpm离心40min，溶液分为二层：透明上清及管底可流动的暗红色沉淀；轻吸并弃去上清液，将可流动的暗红色沉淀用重悬液混悬，恢复原体积后再离心；重复2～4次，以彻底除去未结合的蛋白质，最后用重悬液将沉淀混悬为原体积的1/10，4℃保存备用，获得双去甲基***胶体金标记抗体；
所述重悬液为含5％蔗糖的0.002mol/L pH 9.0的硼酸钠缓冲液；
(5)、将1∶100～500稀释的双去甲基***胶体金标记抗体吸附于玻璃 纤维棉中，37℃干燥，制备双去甲基***金标结合垫；
(6)、在包被膜上用双去甲基***偶联的载体蛋白溶液印制直线式隐形检测线T线，用羊抗兔IgG溶液印制直线式隐形对照线C线，两条线平行排列；
(7)、试纸条的组装：将样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫由一端依次粘附在衬板上，即得到用于免疫检测的***胶体金层析检测试纸条。
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