CN101514333B

CN101514333B - 一种免疫耐受型树突状细胞及其制备方法与专用培养基

Info

Publication number: CN101514333B
Application number: CN2009100809528A
Authority: CN
Inventors: 张毅; 苏永锋; 江小霞; 霍思维; 刘元林; 吴英; 毛宁
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Priority date: 2009-03-30
Filing date: 2009-03-30
Publication date: 2011-11-02
Anticipated expiration: 2029-03-30
Also published as: CN101514333A

Abstract

本发明公开了一种免疫耐受型树突状细胞及其制备方法与专用其培养基。所述培养基是在树突状细胞的培养基中加入间充质干细胞。所述制备方法是往所述培养基中，加入树突状细胞的前体细胞和诱导因子。所述间充质干细胞与树突状细胞的前体细胞的共培养比例是(1-2)∶(1-10)，优选为1∶1。树突状细胞的前体细胞为CD34⁺细胞。所述诱导因子包括GM-CSF、TNF-α、IL-4和LPS。本发明提供了免疫耐受型树突状细胞在制备机体免疫耐受药物中的应用。本发明的免疫耐受型树突状细胞可以低表达共刺激分子，减少炎性因子，增加抑制性细胞因子的分泌，具有成血管能力和抑制异体T细胞增殖。本发明操作简单、方便实用，建立了稳定的选择性活化树突状细胞的培养技术体系。

Description

一种免疫耐受型树突状细胞及其制备方法与专用培养基

技术领域

本发明涉及一种树突状细胞及其制备方法与专用培养基，特别涉及一种免疫耐受型树突状细胞及其制备方法与专用培养基。

背景技术

树突状细胞(dendritic cell，DC)是一种最重要的抗原提呈细胞，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。其参与抗原的识别、加工处理和提呈，是机体免疫的始动者，在免疫应答的诱导中具有独特而重要的作用，能激活T细胞及抗原特异性杀伤性T细胞，在抗肿瘤以及微生物免疫应答中发挥重要作用。近几年来DC相关研究已逐渐成为免疫学中一个不断升温的热点，有关DC的基础研究与临床应用越来越受到重视。早期研究DC时由于对其来源、分化发育和成熟等方面缺乏了解，只能从不同的组织中分离DC，这样获得的细胞数量极少，且大大限制了对其功能特征的研究。目前经体外诱导获得DC主要包括两种来源，即外周血单核细胞和造血干细胞(包括骨髓和脐血)。脐血因其来源方便，免疫原性弱，含有大量造血干细胞，因而成为诱导DC的最佳侯选细胞。有研究表明，经脐血CD34⁺造血干细胞诱导出的DC纯度更高，功能更强大。不同的DC细胞群在免疫反应中发挥不同，甚至相反的作用。常规诱导方法诱导的DC具有刺激机体免疫反应，杀伤病原体及肿瘤细胞的作用。近年研究发现，在抑制性细胞因子IL-10诱导下的DC(Alternatively Activated Dendritic Cells，AADC)是一种具有选择性免疫调节活性的树突状细胞，通过分泌抑制性细胞因子，降低炎性因子的分泌及成血管作用，引起机体免疫产生耐受，减轻炎症作用，与传统DC具有截然相反的功能，在自身免疫性疾病的治疗中有着非常广阔的应用前景。

间充质干细胞最早自骨髓中分离获得，是一类来源于中胚层的具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力，是骨髓造血微环境中多种基质细胞的前体。最新的研究表明间充质干细胞能够分泌IL-6、IL-12、PGE2、IL-10等免疫抑制性细胞因子，在基础及临床应用中都具有明显的减轻免疫反应作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫耐受型树突状细胞及其制备方法与专用培养基。

本发明提供的一种免疫耐受型树突状细胞的专用培养基，是在树突状细胞的培养基中加入作为滋养层的间充质干细胞。

所述树突状细胞的培养基是：含有5％-15％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM-LG培养基或胎牛血清浓度为5％-15％(体积百分含量)的完全1640培养基。

其中，所述间充质干细胞来源于人骨髓或商业化的人间充质干细胞株系。

本发明的另一目的在于提供一种免疫耐受型树突状细胞的制备方法，往上述的免疫耐受型树突状细胞的专用培养基中，加入树突状细胞的前体细胞和诱导因子，来制备免疫耐受型树突状细胞。

其中，所述间充质干细胞与树突状细胞的前体细胞共培养比例是(1-2)∶(1-10)；优选为1∶1。

所述树突状细胞的前体细胞来自人脐血或商业化的树突状细胞的前体细胞株系；所述树突状细胞的前体细胞为CD34⁺细胞。

上述诱导因子为GM-CSF、TNF-α、IL-4和LPS。

其中，所述GM-CSF的浓度为10ng-100ng/ml，优选为10-30ng/ml；所述TNF-α的浓度为10ng-100ng/ml，优选为10-30ng/ml；所述IL-4的浓度为10ng-100ng/ml，优选为10-30ng/ml；所述LPS的浓度为10ng-1000ng/ml，优选为100-1000ng/ml；其中，GM-CSF和TNF-α在加入树突状细胞的前体细胞的第1天加入培养基，IL-4在第6天加入培养基，LPS在第12天加入培养基。

上述培养的温度为35-38℃、CO₂浓度为5-8％(体积百分含量)、湿度为饱和湿度、培养时间是14天；所述温度优选为37℃、所述CO₂浓度优选为5％。

所述培养从开始起每3天换一次新鲜的所述培养基。

所述培养还包括继代培养。

本发明的又一目的在于提供按照上述制备方法所获得的免疫耐受型树突状细胞。

本发明的又一目的在于提供免疫耐受型树突状细胞在制备机体免疫耐受药物中的应用。

本发明的免疫耐受型树突状细胞低表达共刺激分子CD80、CD86，HLA-DR等，减少炎性因子，增加抑制性细胞因子IL-10、THF-β等的分泌，具有成血管能力和抑制异体T细胞增殖，可引起机体耐受，减轻炎症作用，因此本发明的免疫耐受型树突状细胞在制备自身免疫性疾病、移植排斥和过敏性疾病的药物中都具有重要意义。

本发明操作简单，方便实用，与现有方法的比较：利用的细胞因子少，费用低且扩增的细胞最大程度的模拟体内细胞的特性，因此本发明的方法在树突细胞的基础研究及临床应用上将具有广泛的前景。

附图说明

图1为细胞生长的形态学图片。

图2为流式细胞术鉴定DC表面标志结果。

图3为MSC-DC抑制异体T细胞增殖结果。

图4为RT-PCR电泳图。

图5为MSC-DC成管实验结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

本实验中用到的原料如下：Percoll(1.073g/ml)为Sigma公司产品；Ficoll(1.077g/ml)购自中国医学科学院血液病研究所；Percoll购自Sigma公司；胎牛血清(FBS)为Hyclone公司产品；流式细胞术相关鼠抗人单克隆抗体：CD14-PE、CD34-FITC、HLA-DR-FITC、、CD1a-FITC、CD83-PE、CD86-PE、CD80-PE均为BectonDickinson公司产品；PBS(8.0g NaCl、2.9g Na₂HPO₄、12H₂O、0.2g KCl、0.24g KH₂PO₄溶于1000ml去离子水中，调整PH值至7.4，非特殊指出，本文中所用PBS皆为此配方)；细胞因子TNF-α、GM-CSF、IL-4均为Peprotech公司产品；LPS为Sigma公司产品；RT-PCR试剂盒为Takara公司产品。

下述实施例所用引物为北京博迈德科技发展有限公司产品，具体引物序列如表1

表1.各目标因子引物序列

实施例1、间充质干细胞的获得既可以商业化途径购买(南京凯基生物公司)，也可以分离培养得到。

1、取健康成人骨髓2ml，等量PBS稀释后，加到淋巴细胞分离液(percoll)上，900g离心20分钟后吸取单个核细胞层，PBS洗两次弃上清，用含10％FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM-LG(Gibco公司)重悬，以1-2×10⁶cells/cm²高密度接种到75cm²培养瓶(Costa公司)中，37℃、5％CO₂孵箱中培养。48小时后换液，除去悬浮细胞，以后每3~4天全量换液，待细胞生长接近融合，0.25％胰酶(Sigma公司)消化、冻存后用于实验。

实施例2、免疫耐受型树突状细胞(MSC-DC)及DC、IL-10-DC的诱导

1、复苏间充质干细胞，接种24孔板，5×10⁴/孔。

2、获得CD34⁺细胞，既可以商业途径购买(南京凯基生物公司)，也可以通过MACS法分离脐血CD34⁺细胞。自医院取得的废弃脐血，加入等体积PBS，然后加入四分之一5％甲基纤维素，混匀后，离心1000rpm，10min。弃上清，加入PBS(pH值7.4)重悬，然后缓慢加入含有5ml Ficoll的试管中，1500rpm，20min。取中间单个核细胞层，PBS洗两次，1000rpm，10min。缓冲液A(含有0.5％ BSA；2mM EDTA-2Na⁺的PBS溶液)重悬后计数。离心后加入300μl缓冲液A/1×10⁸细胞，100ul阻断抗体(FcRBlocking Reagent)/1×10⁸细胞，100μl CD34磁珠抗体(CD34 Microbeads)/1×10⁸细胞。4℃孵育30min。缓冲液A洗一次后，弃上清。加入2ml缓冲液A，缓慢流过磁柱，待全部流完后加入2ml缓冲液A冲洗柱子。将柱子从磁架上取出，用1ml缓冲液A冲洗，所得细胞即为CD34⁺造血干细胞。

3、用含10％FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM-LG(Gibco公司)培养基来诱导培养树突状细胞；MAC-DC组待MSC贴壁后，按照2.5×10⁴/cm²加入CD34⁺细胞于MSC上；同时在第1天加入GM-CSF(20ng/ml)，TNF-α(20ng/ml)，每3天进行一次半量换液。第6天加入IL-420ng/ml。

对照组的普通DC组及IL-10组直接将CD34⁺细胞接种于24孔板上，其培养基是含10％FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM-LG(Gibco公司)培养基。普通DC组在第1天加入GM-CSF(20ng/ml)，TNF-α(20ng/ml)，每3天进行一次半量换液。第6天加入IL-4(20ng/ml)；而IL-10组在第1天加入GM-CSF(20ng/ml)，TNF-α(20ng/ml)，每3天进行一次半量换液，第6天加入IL-4(20ng/ml)和IL-10(20ng/ml)。

4、培养到第12天，加入LPS 1μg/ml，刺激48小时后，轻轻吹打上层细胞，离心后收集，冻存于液氮罐中备用。

实施例3、免疫耐受型树突状细胞(MSC-DC)的鉴定

1、细胞形态观察

在实施例1诱导培养的过程中，如图1所示(图1的A、B、C为MSC-DC在0、7、14天时的细胞形态照片，其中，B是在加入IL-4培养后的第1天拍摄的，C是在加入LPS后的第2天拍摄的；图1的D、E、F为常规诱导的DC在0、7、14天时的细胞形态照片)，可以发现，MSC-DC在诱导的7天左右开始增殖并少量伸出突起，而常规诱导的DC则胞体变大，突起数量明显增多，且细胞聚集在一起。14天时，两组细胞均有不同程度的增殖，但MSC-DC组细胞形态上仍保持圆型形态，而对照组已经伸出大量突起。

2、流式细胞仪检测其表面标志

计数细胞，调整细胞MSC-DC浓度至1×10⁶/ml，加入EP管，PBS洗一次，1500rpm离心10min；弃上清，残留100～200μl，吹打混匀细胞；分别加入单克隆抗体CD14、CD1a、CD83、CD86、CD80和HLA-DR，并设一管为空白对照；4℃，避光反应30min；PBS洗一次，1500rpm离心10min；弃上清，加入200μl PBS吹打混匀细胞，200μl的1％多聚甲醛固定，置4℃待测，3天内上流式细胞仪检测细胞的表面标志。

将IL-10诱导的IL-10-DC和常规诱导的DC经同样步骤后分别上流式细胞仪检测细胞的表面标志。

检测结果见表2和图2，可以看出：IL-10诱导的IL-10-DC的表面仅CD1a和CD83比常规诱导的DC表达低；而MSC-DC与常规诱导的DC相比，共刺激分子如CD86、CD80、HLA-DR均是低表达。

表2.三种方式诱导的DC表面的共刺激分子的表达量(％)

	CD1a	CD14	CD83	HLA-DR	CD86	CD80
							DC	81.8	7.5	23.3	90.0	91.3	13.3
MSC-DC	14.4	4.7	7.7	45.7	18.8	1.7
							IL-10-DC	28.7	89.9	4.8	91.4	90.0	77.4

3、³H掺入实验检测MSC-DC的功能

计数实施例1中收集的DC、IL-10-DC以及MSC-DC细胞，调整浓度至2×10⁶/ml；从献血者的离体血液中分离CD3⁺T细胞，调整浓度至1×10⁷/ml。按照T∶DC比例梯度1∶2，1∶5，1∶10，1∶20，1∶40，1∶80接种细胞至96孔板，培养液为含有20％FBS的1640培养液(Gibco)。共培养84小时后，加入1μci/ml的³H，继续培养12小时后收集细胞，用液体闪烁仪计数cpm值。每组设3个重复。T细胞增殖水平用刺激指数(SI)表示：SI＝(测定孔cpm-对照孔cpm)/对照孔cpm(对照组为CD3⁺T细胞单独培养后的³H吸收值cpm)

图3显示：各个树突状细胞抑制异体T细胞增值的能力为MSC-DC＞IL-10-DC＞DC，并且MSC-DC在T∶MSC-DC为1∶2时就有很强的抑制异体T细胞增殖的能力。

4、RT-PCR检测细胞因子及趋化因子的表达

总RNA采用TRizol试剂提取，以其为模板严格按照反转录试剂盒(TaKaRa公司)说明书要求逆转录合成cDNA，利用引物按照以下条件进行PCR扩增：94℃预变性2分钟，94℃30秒，56℃30秒，72℃60秒，共35个循环，最后72℃延伸5分钟。反应完毕，取10μlPCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳。电泳完毕在凝胶分析仪下进行观察并成像(图4)。

结果显示：与常规诱导的DC相比，MSC-DC能分泌IL-10和TGF-β等抑制性细胞因子，降低炎性细胞因子IL-12等分泌，同时低表达CCR5、CCR6等趋化因子。

5、成管实验检测MSC-DC的成管能力

(1)准备一块48孔细胞培养板(costa)和20-200μl的Tip头置于-20℃冷冻；Matrigel(Sigma)置于4℃解冻。

(2)48孔板取一孔用30μl Matrigel铺胶，用预冷的Tip头，动作迅速，以防Matrigel在室温下凝固过快导致胶面不平。37℃放置30min，使胶凝固。

(3)细胞计数，取2×10⁴MSC-DC和常规诱导的DC细胞分别加入铺完Matrigel胶的孔中，补加细胞培养基DMEM-LG至200μl，37℃，5％CO₂饱和湿度培养倒置显微镜观察成管结果，如图5所示。其中，

图5的A和B分别是MSC-DC和常规诱导的DC细胞在Matrigel胶上成管结果；图5的C是MSC-DC和常规诱导的DC细胞分别经过RT-PCR得到的电泳图。

从图5的A、B看出MSC-DC在Matrigel胶上具有成管能力，具有内皮细胞成血管网络的特性；而常规诱导的DC在Matrigel胶上不具有成管能力，说明MSC-DC能分泌成管相关细胞因子。

图5的C显示常规诱导的DC只能分泌少量的VGEF，而MSC-DC可以分泌大量的b-FGF和VEGF等血管诱导因子，诱导MSC-DC向成熟内皮细胞分化，参与血管形成，引起免疫耐受。

Claims

1.一种免疫耐受型树突状细胞的培养基，是在树突状细胞的培养基中加入作为滋养层的间充质干细胞；

所述树突状细胞的培养基是：含有5％-15％(体积百分含量)胎牛血清的DMEM-LG培养基。

2.如权利要求1所述的免疫耐受型树突状细胞的培养基，其特征在于：所述间充质干细胞来源于商业化的人间充质干细胞株系。

3.一种免疫耐受型树突状细胞的制备方法，其特征在于：是往权利要求1或2所述的免疫耐受型树突状细胞的培养基中，加入树突状细胞的前体细胞和诱导因子，来制备免疫耐受型树突状细胞；

所述间充质干细胞与树突状细胞的前体细胞共培养比例是(1-2)∶(1-10)；

所述诱导因子为GM-CSF、TNF-α、IL-4和LPS；

所述GM-CSF的浓度为10ng-100ng/ml；所述TNF-α的浓度为10ng-100ng/ml；所述IL-4的浓度为10ng-100ng/ml；所述LPS的浓度为10ng-1000ng/ml；其中，GM-CSF和TNF-α是在加入树突状细胞的前体细胞的第1天加入培养基，IL-4在第6天加入培养基，LPS在第12天加入培养基。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述间充质干细胞与树突状细胞的前体细胞共培养比例是1∶1。

5.如权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述树突状细胞的前体细胞来自人脐血或商业化的树突状细胞的前体细胞株系；所述树突状细胞的前体细胞为CD34⁺细胞。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述GM-CSF的浓度为10-30ng/ml；所述TNF-α的浓度为10-30ng/ml；所述IL-4的浓度为10-30ng/ml；所述LPS的浓度为100-1000ng/ml。

7.权利要求3-6任一所述的制备方法所获得的免疫耐受型树突状细胞。

8.权利要求7所述的免疫耐受型树突状细胞在制备机体免疫耐受药物中的应用。