CN101376897B - 采用含纤维素的原料制备乙醇的方法 - Google Patents

Abstract

一种采用含纤维素的原料制备乙醇的方法，该方法包括蒸汽***含纤维素的原料；将得到的蒸汽***产物与酶混合、酶解；发酵得到的酶解产物，其中，所述将蒸汽***产物与酶混合的方法包括将蒸汽***产物分批与酶混合，所述分批次数至少为2次，每批加入的蒸汽***产物的量至多为全部蒸汽***产物重量的60％；所述含纤维素的原料的含水量为30-60重量％。本发明的方法制备得到的乙醇的产率较高。

Description

采用含纤维素的原料制备乙醇的方法

技术领域

本发明是关于乙醇的制备方法，更具体地是关于采用含纤维素的原料制备乙醇的方法。

背景技术

现有技术的由含纤维素的原料，如秸秆制备乙醇的方法主要包括三个步骤：1、含纤维素的原料的预处理，2、纤维素的酶解；3、糖的发酵制乙醇。

含纤维素的原料一般为植物的根、茎和叶，包括秸秆。所述秸秆即农作物(一般为草本植物)收获果实后留下的根、茎和叶，主要为茎和叶，如玉米秸秆、高粱秸秆、谷类植物的秸秆、麦秸。秸秆的主要成分是木质纤维素。所述木质纤维素是纤维素、半纤维素和木质素的混合物。秸秆中纤维素、半纤维素和木质素通过共价键或非共价键紧密结合而成的木质纤维，约占秸秆总重量的70-90％。秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的含量会随不同来源的农作物或农作物的不同部分而有所区别。

含纤维素的原料的预处理方法一般为蒸汽***和/或酸水解进行预处理，以破坏木质素对纤维素和半纤维素的包埋。酸水解虽然能够破坏木质素，但是也会破坏纤维素，继而降低葡萄糖的产率，而且酸水解后还需要加大量碱中和才能进行酶解和发酵。因此更倾向只通过蒸汽***完成预处理过程，达到破坏木质素对纤维素和半纤维素的包埋作用。

纤维素被纤维素酶水解的反应通常称为酶解反应，又可以称为糖化反应，酶解的主要产物是单糖。纤维素在纤维素酶的作用下能够转化成葡萄糖，半纤维素在半纤维素酶的作用下能够转化成木糖等单糖，葡萄糖和木糖都可以用于发酵生产乙醇，比如酿酒酵母可以发酵葡萄糖制备乙醇，树干毕赤酵母可以发酵木糖制备乙醇。纤维素的非结晶结构是很容易被打破的，它可以完全降解成葡萄糖，然后由葡萄糖发酵成乙醇。但是，纤维素的结晶结构难以被破坏。另外，木质素是由苯基丙烷聚合而成的一种非多糖物质，由芳香烃的衍生物以-C-C-键、-O-键纵横交联在一起，其侧链又与半纤维素以共价键结合，形成一个十分致密的网络结构，将纤维素紧紧包裹在里面，不利于纤维素酶对纤维素的进攻，使得纤维素酶和半纤维素酶无法接触底物，因此，需要先对秸秆进行预处理，如对秸秆进行蒸汽***或者酸处理后再与纤维素酶和/或半纤维素酶接触，对纤维素进行水解。

CN1117835C公开了一种乙醇溶解汽爆秸秆木质素制备液体燃料的方法，该方法以汽爆秸秆为原料，在高压反应釜中，用乙醇萃取汽爆秸秆中的木质素；再用真空抽滤得到滤液，并将汽爆秸秆萃取渣进行同步糖化固态发酵乙醇，乙醇萃取液及真空抽滤所得滤液即为该方法制备的液体燃料。

所述汽爆秸秆原料的制备方法包括将切碎的麦草、稻草或玉米秆等植物原料装入汽爆罐，在1.2-1.7兆帕压力下，维持压力5-10分钟，之后，瞬间减压释放。

所述的乙醇萃取汽爆秸秆中的木质素的方法为在高压反应釜中，加入汽爆秸秆和乙醇，汽爆秸秆和乙醇的体积比为1∶10-1∶50，在1.5-2.0兆帕的压力范围内保持1-2小时。

所述的将汽爆秸秆萃取渣进行同步糖化固态发酵乙醇是指：在33-35℃范围内(发酵)，维持14-16小时，在38-40℃范围内(酶解)，维持68小时，并交替进行发酵2-3天。

CN1193099C公开了一种使用耐热型酵母从木素纤维素生物质中生产乙醇的方法，该方法包括以下步骤：

将木素纤维素生物质粉碎成颗粒大小为15-30毫米；对粉碎的木素纤维素生物质进行蒸汽***预处理，根据所用材料的类型保持1-3兆帕的压力和190-230℃的温度1-10分钟的时间，之后引发迅速减压；收集预处理过的物料并且通过过滤分离液体和固体部分，将固体部分引入发酵贮器中；向发酵贮器添加浓度为15FPU/克纤维素的纤维素酶和12.6国际单位/克纤维素的β-葡萄糖苷酶；给发酵贮器接种马克斯克鲁维氏酵母CECT 10875耐热型酵母培养物的悬浮液；将混合物在42℃下摇动72小时。

文献“对植物秸秆酒精生产工艺的介绍”，张学峰、兰玉成，酿酒，第29卷第4期，第37-38页，2002年7月，公开了一种利用植物秸秆生产酒精的方法，该方法包括将玉米秸秆除石除铁清洗后，切割成1.5厘米的小段，水浸40分钟，通入2.5兆帕蒸汽，保温8分钟，泄压，水洗十分之一的蒸汽***产物，并在所述十分之一的蒸汽***产物中培养里斯木酶产生纤维素酶，将所得培养物与另外十分之九的蒸汽***产物混合，保温50℃水解24小时，经过滤得到6％糖液，无机膜浓缩成20％以上的糖液，加入休哈塔酵母(0.8-1.2亿/毫升)，发酵24小时，产酒份10％，蒸馏得99.5％的酒精。

采用上述方法均可实现由含纤维素的原料制备乙醇的目的，但乙醇的产率较低，一般不超过20％。

发明内容

本发明的目的是克服现有的采用含纤维素的原料制备乙醇的方法制备得到的乙醇产率较低的缺陷，提供一种乙醇产率较高的采用含纤维素的原料制备乙醇的方法。

本发明的发明人发现，现有技术的采用含纤维素的原料制备燃料乙醇的方法中，含纤维素的原料，如秸秆原料通常是以液浆的形式存在，在将浆液状的全部秸秆原料直接与酶混合时，会使酶浓度降低，使酶活力下降。再者，将经过预处理的秸秆与酶混合酶解的方法通常为将破碎的秸秆颗粒一次全部加入到酶与水的混合液中与酶液混合，进行酶解糖化反应，或者，先将所用反应物料——经预处理的秸秆颗粒于反应罐中与水混合，然后在酶解温度下，将酶直接加入到反应罐中反应。尽管上述混合是在搅拌条件下进行的，但是秸秆颗粒仍然不容易与酶混合均匀。因为，经过预处理后的秸秆粒度变小，颗粒以及碎屑状的秸秆颗粒很容易互相粘连和团聚，因此一次将全部秸秆完全与酶混合，仅有部分秸秆能与酶充分接触，由于秸秆之间的粘连和团聚会有部分秸秆不能充分与酶接触，即使在搅拌下，也不能完全将秸秆打散。因此，酶解后纤维素转化为糖的转化率低，导致糖发酵得到的乙醇的产率较低。

此外，现有技术在蒸汽***含纤维素的原料时，通常认为所述含纤维素的原料例如玉米秸秆，必须充分水浸，才能够得到更好蒸汽***的效果，因为充分水浸可以使所述含纤维素的原料例如玉米秸秆内部含有大量的水，在蒸汽***时，所述含纤维素的原料例如玉米秸秆内部的水可以气化成水蒸汽，泄压时由所述含纤维素的原料例如玉米秸秆内部冲出，以由内向外充分破坏所述含纤维素的原料例如玉米秸秆包埋纤维素和半纤维素的木质素鞘，比如在上述“对植物秸秆酒精生产工艺的介绍”(张学峰、兰玉成，酿酒，第29卷第4期，第37-38页，2002年7月)方法中记载，需要将玉米秸秆水浸40分钟后，才进行蒸汽***。但是本发明的发明人又意外地发现，将各种含水量的玉米秸秆(青玉米秸秆以及干燥玉米秸秆)水浸40分钟后，玉米秸秆的含水量均高达80重量％以上，而蒸汽***的含纤维素的原料的含水量低，例如低于30重量％固然不好，但如果含纤维素的原料的含水量，如高于60重量％，也会降低乙醇的收率。

本发明提供了一种采用含纤维素的原料制备乙醇的方法，该方法包括蒸汽***含纤维素的原料；将得到的蒸汽***产物与酶混合、酶解；发酵得到的酶解产物，其中，所述将蒸汽***产物与酶混合的方法包括将蒸汽***产物分批与酶混合，所述分批次数至少为2次，每批加入的蒸汽***产物的量至多为全部蒸汽***产物重量的60％；所述含纤维素的原料的含水量为30-60重量％。

本发明的方法通过将蒸汽***产物分批与酶混合，使每批加入的蒸汽***产物都能与酶混合均匀并充分接触，并且在反应过程中，酶的浓度一直保持在较高的水平，因此，蒸汽***产物能与酶充分反应；此外，严格控制用于蒸汽***的含纤维素的原料的含水量为30-60重量％，又可以保证在蒸汽***条件下使含纤维素的原料内部的水气化成水蒸汽，在泄压时水蒸气由含纤维素的原料内部冲出，充分破坏含纤维素的原料中包埋纤维素和半纤维素的木质素鞘，以增加了含纤维素的原料中能与酶接触的纤维素比例，从而有效地提高了原料的糖转化率，因此大大提高了乙醇的产率。例如，在其它的酶解条件和蒸汽***条件都相同的情况下，实施例1的乙醇产率达24.2％，而对比例1的乙醇产率仅为18.7％，对比例2的乙醇产率仅为18.5％，提高幅度高达29.4-30.8％。

附图说明

图1为天然玉米秸秆的扫描电子显微镜照片；

图2为按照本发明对比例1的方法蒸汽***后秸秆的扫描电子显微镜照片；

图3为按照本发明对比例2的方法蒸汽***后秸秆的扫描电子显微镜照片；

图4为按照本发明实施例1的方法蒸汽***后秸秆的扫描电子显微镜照片。

具体实施方式

按照本发明，该方法包括蒸汽***含纤维素的原料；将得到的蒸汽***产物与酶混合、酶解；发酵得到的酶解产物，其中，所述将蒸汽***产物与酶混合的方法包括将蒸汽***产物分批与酶混合，所述分批次数至少为2次，每批加入的蒸汽***产物的量至多为全部蒸汽***产物重量的60％；所述含纤维素的原料的含水量为30-60重量％，优选为35-50重量％。

优选情况下，为了提高生产效率又同时能够保证蒸汽***产物与酶的充分混合、得到较高的蒸汽***产物浓度以及较高水平的酶作用速度，第一批与酶混合的蒸汽***产物的量为全部蒸汽***产物重量的20-60％，更优选为20-40％；第一批以后加入的蒸汽***产物的量为全部蒸汽***产物重量的40-80％，更优选为60-80％。

更优选情况下，所述分批次数为3次，第一批与酶混合的蒸汽***产物的量为全部蒸汽***产物重量的20-60％，更优选为20-40％；第二批加入的蒸汽***产物的量为全部蒸汽***产物重量的20-50％，更优选为20-40％；第三批加入的蒸汽***产物的量为全部蒸汽***产物重量的20-40％，更优选为20-30％。

不同来源的含纤维素的原料含水量差异很大，比如不同时期收购的玉米秸秆原料的含水量差异就很大，收割不超过一周的新鲜秸秆含水量达80重量％以上，但是经过晾晒风干的存储秸秆含水量可能只有10％。现有方法对于不同含水量的含纤维素的原料都一律采用同样条件水浸处理，造成含纤维素的原料的含水量过大，在蒸汽***条件下，泄压时含纤维素的原料内部的水分以液体形式冲出，达不到由内向外破坏含纤维素的原料中包埋纤维素和半纤维素的木质素鞘的作用。

根据本发明提供的方法，可以通过各种方式获得含水量为30-60重量％的含纤维素的原料。对于含水量存在差异的不同批次含纤维素的原料，可以进行不同的处理，比如对于含水量高的秸秆原料，可以45-90℃烘干部分水分，使之含水量降低到30-60重量％；对于含水量低的秸秆原料，可以采用控制水浸时间的方法，增加秸秆原料的含水量到30-60重量％；对于含水量正好在到30-60重量％的秸秆原料，可以直接进行蒸汽***。优选所述用于蒸汽***的含纤维素的原料的含水量为35-50重量％。除非特殊说明，本发明所述含纤维素的原料的含水量均是指含纤维素的原料的初始重量W1与在80-110℃下烘干至恒重的含纤维素的原料的干计重量W2之差，与含纤维素的原料的初始重量W1的重量百分比，即含水量(重量％)＝(W1-W2)/W1×100％。

根据本发明所述用含纤维素的原料制备乙醇的方法，可以采用现有技术常规的蒸汽***条件完成对含纤维素的原料的蒸汽***，例如，所述蒸汽***的温度可以为180-200℃，所述蒸汽***的压力可以为1.4-2.0兆帕，所述蒸汽***压力的维持时间可以为3-7分钟。更优选所述蒸汽***的温度为185-195℃，所述蒸汽***的压力为1.5-1.6兆帕，所述蒸汽***压力的维持时间为4-5分钟。在上述蒸汽***条件下都能充分破坏秸秆包埋纤维素和半纤维素的木质素鞘，实现本发明的目的。

为了保证酶具有最佳的反应活性，在将第一批蒸汽***产物与酶混合前，调节蒸汽***产物的pH值为大于3小于7，优选为4-5.5，以使得蒸汽***产物与酶混合后，酶具有最佳的反应活性。所述调节反应物料pH值的方法可以采用本领域技术人员公知的各种方法，如根据所得蒸汽***产物的pH值，在该蒸汽***产物中加入酸性物质或碱性物质。例如，所述酸性物质可以是硫酸、盐酸和磷酸中的一种或几种；所述碱性物质可以是氢氧化钠和/或氢氧化钾。

优选情况下，所述相邻的两个分批混合步骤之间还包括时间间隔。为了使酶能充分水解蒸汽***产物，提高糖的转化率，所述时间间隔优选为10-120分钟，更优选为30-60分钟。

为了使酶与反应原料混合的更均匀，所述蒸汽***产物的酶解优选在水存在的条件下进行，更优选在含有水与蒸汽***产物的悬浮液中进行。也就是说，本发明优选将第一批蒸汽***产物与酶混合时，加入水，将第一批蒸汽***产物与水混合制备悬浮液后，再将酶解所需全部酶与悬浮液混合，然后再按照本发明的方法继续分批加入蒸汽***产物。对所加入的水的量没有特别限定，优选情况下，所述水的加入量与全部蒸汽***产物的重量比为1-4∶1。更优选情况下，以第一批蒸汽***产物、水和酶混合后得到的混合物为基准，以蒸汽***产物的干重计，第一批蒸汽***产物的含量至少为1重量％，优选为1-20重量％，更优选为1.2-10重量％。在现有的由含纤维素的原料制备乙醇的方法中，在酶解时，由于含纤维素的原料的浓度太稀，导致生产周期长，生产效率低。而本发明的发明人发现，在酶解时控制第一批蒸汽***产物、水与酶混合后得到的混合物中蒸汽***产物的浓度，以第一批蒸汽***产物、水与酶混合后得到的混合物为基准，以蒸汽***产物的干重计，使蒸汽***产物的含量至少为1重量％，优选为1-20重量％，更优选为1.2-10重量％，既能够保证酶解的周期短，同时保证具有高的生产效率，即单糖的产率高。

由于本发明仅涉及对含纤维素的原料含水量以及由蒸汽***含纤维素的原料得到的蒸汽***产物的加料方式的改进，因此对用含纤维素的原料制备乙醇的方法的其它步骤没有特别的限制。

所述酶解使用的酶包括纤维素酶。所述纤维素酶可以通过各种方式获得，例如商购得到，或者通过使用产酶微生物分泌得到。

由于使用产酶微生物分泌得到的酶会含有各种副产物，因此优选直接加入酶。所述酶的用量越多越好，出于成本考虑，优选以每克含纤维素的原料的干重计，所述纤维素酶的用量为8-20酶活力单位，更优选为10-15酶活力单位。本发明所述纤维素酶的酶活力按照美国国家可再生能源实验室(NationalRenewable Energy Laboratory，NREL)提供的标准方法——纤维素酶活力测定NREL LAP-006测定，所述纤维素酶的酶活力单位为在该标准方法规定的测定条件下，1分钟内将1克Whatman No.1滤纸转化为葡萄糖所需酶的微克数。

所述酶解的温度可以为纤维素酶的任何最适作用温度，一般为45-55℃，更优选为48-52℃。所述酶解的时间理论上越长越好，考虑到设备利用率，优选所述酶解的时间为25-48小时，更优选为30-40小时。所述酶解时间从将酶与含纤维素的原料混合时开始计算，即，所述酶解时间指将含纤维素的原料与酶混合开始至将含纤维素的原料转化为糖后糖的含量不再增加所用的时间。因此，按照本发明，所述相邻的两个分批混合步骤之间的时间间隔也包括在所述酶解时间之内。

按照本发明的一个优选的实施方式，所述将蒸汽***含水量为30-60重量％的含纤维素的原料得到的蒸汽***产物酶解的方法包括先将第一批蒸汽***产物与水混合后加入酶解罐中，调节蒸汽***产物的pH值为大于3至小于7，并升温至48-52℃以达到酶的最佳反应活性条件，然后，在搅拌下，向酶解罐中加入酶，搅拌30-60分钟后，再加入第二批蒸汽***产物，搅拌反应30-60分钟后，加入第三批蒸汽***产物。所述水的量与全部蒸汽***产物的重量比为1-4∶1；所述第一批与酶混合的蒸汽***产物的量为全部蒸汽***产物重量的20-60％；第二批与酶混合的蒸汽***产物的量为全部蒸汽***产物重量的20-50％；第三批与酶混合的蒸汽***产物的量为全部蒸汽***产物重量的20-40％。且以第一批蒸汽***产物、水与酶混合后得到的混合物为基准，以蒸汽***产物的干重计，第一批蒸汽***产物的含量为1.2-10重量％。

所述纤维素酶为复合酶，至少包括C₁型纤维素酶、Cx型纤维素酶和纤维二糖酶三种酶。

C₁酶可以使结晶的纤维素转变为非结晶的纤维素。

C_x型纤维素酶又分为C_x1型纤维素酶和C_x2型纤维素酶两种。C_x1型纤维素酶为内切型纤维素酶，可以从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-1，4-糖苷键，生成纤维糊精和纤维二糖。C_x2型纤维素酶是一种外切型纤维素酶，可以从水合非纤维素分子的非还原端作用于β-1，4-糖苷键，逐一切断β-1，4-糖苷键生成葡萄糖。

纤维二糖酶则作用于纤维二糖，生成葡萄糖。

优选所述酶解使用的酶还包括半纤维素酶。因为半纤维素酶可以降解半纤维素成为溶于水的木糖，所以酶解使用的酶包括半纤维素酶，一方面可以更充分地暴露纤维素，增加纤维素与纤维素酶的接触几率，另一方面半纤维素降解产物木糖能够被树干毕赤酵母发酵生成乙醇，两方面作用都可以增加乙醇产率。以每克含纤维素的原料的干重计，所述半纤维素酶的用量为4.4-8.8酶活力单位。

本发明所述半纤维素酶的酶活力单位(U)为在50℃、pH＝4.8条件下，每分钟分解浓度为1重量％木聚糖溶液产生1微克还原糖(以木糖计)所需的酶量。

本发明所述半纤维素酶的活力指每克半纤维素酶所具有的活力单位。所述半纤维素酶的活力利用半纤维素酶在50℃、pH为4.8的条件下水解1重量％木聚糖产生还原糖(以木糖计)，所得还原糖与过量3，5-二硝基水杨酸(DNS)发生颜色反应，用分光光度计测得反应液550纳米的光吸收值与还原性糖(以木糖计)的生成量成正比关系测定。具体测定方法如下：

准确称取1.000克木聚糖，用0.5毫升pH＝4.8的0.1摩尔/升乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解，然后用去离子水定容到100毫升，得到1重量％木聚糖溶液；

称取30克四水合酒石酸钾钠放入500毫升锥形瓶内，加16克NaOH后，加50毫升去离子水，以5℃/分钟的速度水浴加热至固体物质溶解，加入1克3，5-二硝基水杨酸，至溶解，冷却至室温，用去离子水定容至100毫升，可得3，5-二硝基水杨酸(DNS)溶液；

将木糖80℃烘干至恒重，准确称取1.000克溶于1000毫升水中，加10毫克叠氮化钠防腐，得到1毫克/毫升的标准木糖溶液；

准确称取1.000克固体半纤维素酶或移取1毫升液体半纤维素酶原液，用0.5毫升pH＝4.8的0.1摩尔乙酸-乙酸钠缓冲溶液溶解，然后用去离子水定容到100毫升，得到稀释100倍的待测酶液；

分别将在50℃水浴加热60分钟的2毫升木糖梯度标准溶液(0.1毫克/毫升、0.2毫克/毫升、0.3毫克/毫升、0.4毫克/毫升和0..5毫克/毫升，所述木糖梯度标准溶液用去离子水与1毫克/毫升的标准木糖溶液混合制备)或去离子水(木糖空白对照)，与2毫升DNS混合沸水浴5分钟，冷却，去离子水定容15毫升后，用分光光度计在550纳米下分别测定反应后木糖梯度标准溶液的光吸收值，以光吸收值为横坐标，木糖浓度为纵坐标绘制标准曲线。由该标准曲线可得回归方程y＝bx+a，其中，x为光吸收值，y为木糖浓度，a为所得直线方程的截距，b为所得直线方程的斜率；

取0.2毫升待测酶液与1.8毫升所述1重量％木聚糖溶液或pH＝4.8的0.1摩尔/升乙酸-乙酸钠缓冲溶液(木聚糖空白对照)，按照与上述木糖梯度标准溶液相同的步骤测试光吸收值。并按照下式计算半纤维素酶的活力：

式中x为待测酶液的光吸收值，b和a与木糖浓度对光吸收值的回归方程中的b和a一致，n为酶的稀释倍数，60表示为酶促反应的时间为60分钟，5为取样倍数(这里从1毫升待测酶液中取出了0.2毫升进行测试)。

根据上述方法可以测定出具体的半纤维素酶的活力，进而计算出半纤维素酶的用量。

能够发酵戊糖和/或己糖的微生物都可以用于本发明的发酵过程，由于酿酒酵母是酿酒工业上普遍应用的耐酒精、副产物少、乙醇产率高的发酵己糖的微生物；树干毕赤酵母为既可以发酵戊糖也可以发酵己糖的微生物(参见“树干毕赤酵母连续发酵戊糖己糖生成酒精”，季更生等，南京林业大学学报自然科学版，第28卷第3期，第9-13页，2004年)，因此优选所述发酵所使用的酵母为树干毕赤酵母和/或酿酒酵母。以每克酶解产物计，所述发酵所使用的酵母的接种量为10³-10⁸菌落形成单位，更优选10⁴-10⁶菌落形成单位。本发明发酵所使用的酵母可以为商购酵母固体制剂(比如干酵母粉)或酵母菌种(比如ATCC编号2601的啤酒酵母)。所述酵母的菌落形成单位可以通过本领域公知的方法测定，比如亚甲基蓝染色活菌计数法。亚甲基蓝染色活菌计数法的具体方法如下：

将1克干酵母粉溶于10毫升无菌水中，或将1毫升菌种活化液用无菌水稀释至10毫升，加入0.5毫升0.1重量％亚甲基蓝，在35℃下保温30分钟。在10倍光学显微镜下，用血球计数板计数保温后的溶液中活菌的数目(死菌染色，活菌不染色)，可得1克干酵母或1毫升菌种活化液中活菌的数目，即菌落形成单位数。

所述酵母可以采用常规的方法接种，例如向酶解产物中加入5-15体积％的种子液。所述种子液可以为干酵母的水溶液或培养基溶液，也可以为干酵母或商购菌种的活化种子液。所述发酵的温度可以为任何适于酵母生长的温度，优选为30-36℃，更优选为32-35℃。所述发酵的时间可以为从接种开始至酵母生长的衰亡期出现(即发酵时间为迟滞期、对数期加上稳定期)的时间，优选发酵的时间为32-48小时，更优选32-40小时。发酵产物乙醇可以用常规的方法，根据不同工业产品的要求(比如燃料酒精要求乙醇的纯度达99％以上)分离并精制，比如蒸馏、浓缩、除水。

另外，蒸汽***的压力和温度可以灭菌，为防止在酶解过程中杂菌(主要是细菌)污染产生影响酶活力的毒素，并防止在发酵过程中杂菌污染影响酵母的生长，优选在酶解之前加入诸如工业青霉素的细菌抗生素，所述抗生素对酵母没有作用但可以抑制杂菌的生长。以每毫升酶解液或发酵液为基准，所述抗生素的加入量为1-10单位。所述酶解液包括蒸汽***产物、酶以及水，所述发酵液包括酶解产物和接种的酵母。

由于在蒸汽***的高温高压条件下，含纤维素的原料中的半纤维素会产生诸如糠醛、呋喃之类的抑制物，所述抑制物会降低酶的活力和发酵菌的活性，因此所述方法还包括在蒸汽***含纤维素的原料之后，酶解得到的蒸汽***产物之前，水洗所述蒸汽***产物。所述水洗是将蒸汽***产物与水混合，搅拌，使上述抑制物溶解在水中，然后离心分离蒸汽***产物，从而从蒸汽***产物中除去抑制物。理论上所述水洗的温度越高，能够溶解的抑制物越多，考虑到能耗，优选所述水洗的温度至少为60℃，更优选为60-80℃。由于水洗所加入的水越多，则溶解抑制物的溶剂越多，但是考虑到离心分离的能耗，优选以每克含纤维素的原料的干重计，所述水洗的加水量为2-10克，更优选为2-3克。

由于含纤维素的原料中可能会含有沙石杂质以及铁杂质，对蒸汽***设备会造成损害，因此本发明的制备乙醇的方法，可以包括在蒸汽***之前对含纤维素的原料进行除石除铁常规操作，比如以“风送”含纤维素的原料并磁铁吸引的方法进行除石除铁。沙石由于质量大，不能被风送到蒸汽***设备中，铁杂质由于磁铁的吸引也不会随原料进入蒸汽***设备中，从而可以完成除石除铁。此外，由于含纤维素的原料本身容易缠结而堵塞设备管路，因此，在进入蒸汽***设备前，优选使所述含纤维素的原料的大小为0.5-3厘米×0.2-1厘米×0.2-1厘米，更优选使所述含纤维素的原料的大小为1-2厘米×0.4-0.6厘米×0.5-1厘米。

下面结合实施例对本发明进行更详细的说明。

实施例1

本实施例用于说明本发明的采用含纤维素的原料制备乙醇的方法。

(1)蒸汽***

测试如图1所示的玉米秸秆原料，按照上述的方法测得玉米秸秆的含水量为20重量％，将原料切成1.5厘米×0.2厘米×0.5厘米的小段，用立式浸渍器(山东汶瑞机械有限公司)与重量为所述玉米秸秆原料重量的三分之一的水混合并浸泡，得到含水量为40重量％的玉米秸秆。取1000克含水量为40重量％的玉米秸秆，在195℃下以1.8兆帕的压力维持5分钟，然后泄压，完成蒸汽***。将所得的蒸汽***产物与70℃的水按照重量比1∶3搅拌混合30分钟，然后用LW400型卧螺离心机(张家港华大离心机制造有限公司)在900转/分钟转速下进行固液分离，共得到2000克固体蒸汽***产物(含水量为70重量％)。

所得固体蒸汽***产物中纤维素总重量和半纤维素总重量的测定：

取5克所述水洗后的蒸汽***产物在45℃下烘干至恒重1.5克，称量300.0毫克该干燥后的蒸汽***产物，放置于重80克的100毫升干燥三角烧瓶内。向所述三角烧瓶加入3.00毫升浓度为72重量％的硫酸溶液，搅拌1分钟。然后将三角烧瓶在30℃水浴中加热60分钟，每隔5分钟用搅拌一次以确保均匀水解。水浴结束后，用去离子水使硫酸的浓度稀释到4重量％。用布氏漏斗过滤所述稀释后的蒸汽***产物酸水解液，共得到滤液84毫升。将20毫升滤液转移至干燥50毫升的三角瓶中。使用2.5克碳酸钙调节该滤液的pH值至5.5，静置5小时，收集上层清液。0.2微米滤膜过滤收集的上层清液，所得上层清液的滤液用BioradAminex HPX-87P高效液相色谱(HPLC)分析。HPLC条件：进样量20微升；流动相为0.2微米滤膜过滤，并且超声振荡脱气的HPLC超纯水；流速为0.6毫升/分钟；柱温80-85℃；检测器温度80-85℃；检测器为折光率检测器；运行时间为35分钟。以0.1-4.0毫克/毫升浓度范围的D-(+)葡萄糖和0.1-4.0毫克/毫升浓度范围D-(+)木糖作为标准样品。HPLC分析得到蒸汽***产物酸水解液中葡萄糖浓度为1.73毫克/毫升，计算可得1克所述水洗后的蒸汽***产物酸水解能得到重量为0.145克的葡萄糖，因为浓度为72重量％的硫酸溶液可以将蒸汽***的产物的纤维素全部水解成葡萄糖，因此所得葡萄糖的重量是蒸汽***产物中纤维素的重量的1.11倍，即1克所述水洗后的蒸汽***产物中含纤维素0.131克，则2000克水洗蒸汽***产物中共含纤维素261克。HPLC分析得到蒸汽***产物酸水解液中木糖浓度为0.41毫克/毫升，计算可得1克所述水洗后的蒸汽***产物酸水解能得到重量为0.042克的木糖，因为浓度为72重量％的硫酸溶液可以将蒸汽***的产物中半纤维素全部水解成木糖，因此所得木糖的重量是蒸汽***产物中半纤维素的重量的1.14倍，即1克蒸汽***产物中含半纤维素0.037克，则2000克蒸汽***产物中共含半纤维素73.7克。

(2)酶解

向酶解罐中加入水，并在搅拌下，加入第一批步骤(1)取样测试后剩余的水洗蒸汽***产物，第一批加入的水洗蒸汽***产物的量为步骤(1)取样测试后剩余的全部水洗蒸汽***产物重量的35％，然后调节pH值为4，加热至52℃后，以每克秸秆的干重计，加入20酶活力单位的纤维素酶计算，全部秸秆的干重为600克，共加入12000酶活力单位(约80克酶)的纤维素酶(和氏璧生物技术有限公司)，并在52℃下保温混合30分钟；然后加入第二批水洗蒸汽***产物，第二批加入的水洗蒸汽***产物的量为步骤(1)取样测试后剩余的全部水洗蒸汽***产物重量的35％，并在52℃下保温混合50分钟；然后再加入第三批水洗蒸汽***产物，第三批加入的水洗蒸汽***产物的量为步骤(1)取样测试后剩余的全部水洗蒸汽***产物重量的30％，并在52℃下保温酶解38小时后得到酶解产物。所述水的加入量与全部水洗蒸汽***产物的重量比为2∶1。将酶解产物用布氏漏斗过滤，将20毫升滤液转移至干燥50毫升的三角瓶中，静置5小时，收集上层清液。0.2微米滤膜过滤收集的上层清液，按照上述步骤(1)所述高效液相条件，测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共276.1克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽***产物中被酶解的纤维素的重量共248.7克，按照下式计算纤维素转化率和单糖产率，计算结果见表1。每小时酶解的纤维素的量为6.33克。(以蒸汽***产物的干重计，以得到的混合物的重量为基准，第一批蒸汽***产物的含量为4.4重量％。)

纤维素转化率＝100％×被酶解的纤维素的重量/纤维素的总重量

单糖产率＝100％×酶解得到的葡萄糖重量/秸秆干重

(3)发酵

使酶解产物的温度降至35℃，以每克酶解产物的重量计，接种10⁵菌落形成单位的酿酒酵母(安琪超级酿酒高活性干酵母，湖北安琪酵母股份公司)，所得混合物在32℃下于发酵罐中搅拌培养40小时。在100℃蒸馏所得发酵产物，所得蒸馏馏分在78.3℃下二次蒸馏可得乙醇145.2克，按照下式计算乙醇产率，计算结果见表1。

乙醇产率＝100％×乙醇重量/秸秆干重

对比例1

本对比例说明采用含纤维素的原料制备乙醇的参比方法。

按照实施例1的方法制备乙醇，不同的是，按照文献“对植物秸秆酒精生产工艺的介绍”(张学峰、兰玉成，酿酒，第29卷第4期，第37-38页，2002年7月)所公开的方法，将秸秆原料在蒸汽***前先用水浸泡40分钟，测得浸泡后的玉米秸秆原料的含水量达到83重量％。然后取1000克含水量为83重量％的秸秆进行蒸汽***，水洗后共得到1500克固体蒸汽***产物(含水量为88.6重量％)。按照实施例1所述HPLC分析硫酸水解的蒸汽***产物的方法，测得1500克蒸汽***产物中共含纤维素71克，半纤维素20.4克。在酶解步骤(2)中将步骤(1)取样测试后剩余的水洗蒸汽***产物一次全部加入到含水的酶解罐中，然后与酶混合均匀，酶解时间为39小时20分钟。然后按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件，测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共59.9克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽***产物中被酶解的纤维素的重量共53.96克；二次蒸馏得到乙醇31.8克。并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率、单糖产率和乙醇产率，计算结果见表1。

对比例2

本对比例说明采用含纤维素的原料制备乙醇的参比方法。

按照实施例1的方法制备乙醇，不同的是，取1000克含水量为20重量％的玉米秸秆直接进行蒸汽***，水洗后共得到1600克固体蒸汽***产物(含水量为50重量％)。按照实施例1所述HPLC分析硫酸水解的蒸汽***产物的方法，测得1600克蒸汽***产物中共含纤维素344克，半纤维素96克。并按照上述对比例1的方法对蒸汽***产物进行酶解，然后按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件，测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共284.5克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽***产物中被酶解的纤维素的重量共256.3克；二次蒸馏得到乙醇147.9克。并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率、单糖产率和乙醇产率，计算结果见表1。

电镜观察结果：

用JSM-35CF扫描电镜放大1000倍观察对比例1、对比例2和实施例1的蒸汽***产物，结果分别如图2、图3和图4所示。从图2可以看出，由于秸秆原料内部没有水分可以气化成水蒸汽，因此蒸汽***不能由内向外充分破坏秸秆原料；从图3可以看出，对比例1玉米秸秆蒸汽***的效果并不好，纤维素仍然呈束状，并且纤维素表面残留有木质素鞘；而如图4所示的实施例1的蒸汽***效果很好，可以看到游离的纤维素。

实施例2

本实施例用于说明本发明的采用含纤维素的原料制备乙醇的方法。

(1)蒸汽***

取1000克含水量为50重量％的玉米秸秆，切成1.3厘米×0.4厘米×0.8厘米的小段，在190℃下以1.7兆帕的压力维持4分钟，然后泄压，完成蒸汽***，共得到1250克蒸汽***产物(含水量为60重量％)。

按照实施例1所述HPLC分析硫酸水解的蒸汽***产物的方法，测得1250克蒸汽***产物中共含纤维素213克，半纤维素63克。

(2)酶解

按照实施例1的方法酶解上述未经过水洗的蒸汽***产物，不同的是，在向酶解罐中加入水后，并在搅拌下，将蒸汽***产物分三批与酶混合，第一批加入的蒸汽***产物的量为取样测试后剩余的全部蒸汽***产物重量的60％，在50℃下保温混合100分钟；然后加入第二批蒸汽***产物，第二批加入的蒸汽***产物的量为取样测试后剩余的全部蒸汽***产物重量的20％，在50℃下保温混合30分钟；然后再加入第三批蒸汽***产物，第三批加入的蒸汽***产物的量为取样测试后剩余的全部蒸汽***产物重量的20％，在50℃下保温酶解37小时后得到酶解产物。按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件，测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共213.3克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽***产物中被酶解的纤维素的重量共192.2克，每小时酶解的纤维素的量为5.0克。(以蒸汽***产物的干重计，以得到的混合物的重量为基准，第一批蒸汽***产物的含量为9.0重量％。)

发酵步骤同实施例1，二次蒸馏得到乙醇110.1克。并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率、单糖产率和乙醇产率，计算结果见表1。

实施例3

本实施例用于说明本发明的采用含纤维素的原料制备乙醇的方法。

(1)蒸汽***

取1000克含水量为40重量％的玉米秸秆，切成1.2厘米×0.4厘米×0.7厘米的小段，在200℃下以1.7兆帕的压力维持6分钟，然后泄压，完成蒸汽***。将所得蒸汽***产物与75℃的水按照重量比1∶2.5搅拌混合50分钟，然后用离心泵LW400型卧螺离心机(张家港华大离心机制造有限公司)在900转/分钟转速下进行固液分离，共得到2000克固体蒸汽***产物(含水量为70重量％)。

按照实施例1所述HPLC分析硫酸水解的蒸汽***产物的方法，测得2000克蒸汽***产物中共含纤维素260克，半纤维素78克。

(2)酶解

按照实施例1的方法酶解上述蒸汽***产物，不同的是，在向酶解罐中加入水后，并在搅拌下，将水洗蒸汽***产物分三批与酶混合，第一批加入的水洗蒸汽***产物的量为取样测试后剩余的全部水洗蒸汽***产物重量的20％，在52℃下保温混合20分钟；然后加入第二批水洗蒸汽***产物，第二批加入的水洗蒸汽***产物的量为取样测试后剩余的全部水洗蒸汽***产物重量的40％，在52℃下保温混合40分钟；然后再加入第三批水洗蒸汽***产物，第三批加入的水洗蒸汽***产物的量为取样测试后剩余的全部水洗蒸汽***产物重量的40％，在52℃下保温酶解40小时后得到酶解产物。按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件，测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共268.1克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽***产物中被酶解的纤维素的重量共241.5克，每小时酶解的纤维素的量为5.90克。(以蒸汽***产物的干重计，以得到的混合物的重量为基准，第一批蒸汽***产物的含量为2.7重量％。)

(3)发酵

按照实施例1的方法发酵酶解产物，不同的是，使酶解产物的温度降至32℃，以每克酶解产物的重量计，接种10⁶菌落形成单位的酿酒酵母(安琪超级酿酒高活性干酵母，湖北安琪酵母股份公司)，所得混合物在32℃下于发酵罐中搅拌培养36小时；在100℃蒸馏所得发酵产物，所得蒸馏馏分在78.3℃下二次蒸馏可得乙醇140.7克。并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率、单糖产率和乙醇产率，计算结果见表1。

实施例4

本实施例用于说明本发明的采用含纤维素的原料制备乙醇的方法。

(1)蒸汽***

取1000克含水量为55重量％的玉米秸秆，切成2.0厘米×0.6厘米×0.8厘米的小段，在190℃下以1.55兆帕的压力维持7分钟，然后泄压，完成蒸汽***。将所得蒸汽***产物与65℃的水按照质量比1∶2搅拌混合40分钟，然后用离心泵LW400型卧螺离心机(张家港华大离心机制造有限公司)在900转/分钟转速下进行固液分离，共得到1800克固体水洗蒸汽***产物(含水量为75重量％)。

按照实施例1所述HPLC分析硫酸水解的蒸汽***产物的方法，测得1800克蒸汽***产物中共含纤维素184.5克，半纤维素56.2克。

(2)酶解

按照实施例1的方法酶解上述蒸汽***产物，不同的是，在向酶解罐中加入水后，并在搅拌下，将水洗蒸汽***产物分三批与酶混合，第一批加入的水洗蒸汽***产物的量为取样测试后剩余的全部水洗蒸汽***产物重量的10％，在52℃下保温混合10分钟；然后加入第二批水洗蒸汽***产物，第二批加入的水洗蒸汽***产物的量为取样测试后剩余的全部水洗蒸汽***产物重量的40％，在52℃下保温混合40分钟；然后再加入第三批水洗蒸汽***产物，第三批加入的水洗蒸汽***产物的量为取样测试后剩余的全部水洗蒸汽***产物重量的50％，在52℃下保温酶解40小时后得到酶解产物。所述水的加入量与全部水洗蒸汽***产物的重量比为2.5∶1。按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件，测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共188.6克。所述酶解得到的葡萄糖重量除以1.11，即蒸汽***产物中被酶解的纤维素的重量共169.9克，每小时酶解的纤维素的量为4.2克。(以纤维素原料的干重计，第一批含纤维素的原料的含量为0.95重量％。)

发酵步骤同实施例1，二次蒸馏得到乙醇97.1克。并按照实施例1的方法和公式计算纤维素转化率、单糖产率和乙醇产率，计算结果见表1。

实施例5

本实施例用于说明本发明的采用含纤维素的原料制备乙醇的方法。

(1)蒸汽***

取1000克含水量为55重量％的玉米秸秆，切成2.0厘米×0.6厘米×0.8厘米的小段，在190℃下以1.6兆帕的压力维持7分钟，然后泄压，完成蒸汽***。将所得蒸汽***产物与65℃的水按照质量比1∶2搅拌混合40分钟，然后用离心泵LW400型卧螺离心机(张家港华大离心机制造有限公司)在900转/分钟转速下进行固液分离，共得到1800克固体蒸汽***产物(含水量为75重量％)。

按照实施例1所述HPLC分析硫酸水解的蒸汽***产物的方法，测得1800克蒸汽***产物中共含纤维素184.5克，半纤维素56.2克。

(2)酶解

按照实施例1的方法酶解上述经过水洗的蒸汽***产物，不同的是，在向酶解罐中加入水后，并在搅拌下，加入第一批步骤(1)取样测试后剩余的水洗蒸汽***产物，第一批加入的水洗蒸汽***产物的量为步骤(1)取样测试后剩余的全部水洗蒸汽***产物重量的60％，然后调节反应物料的pH值为5，并加热至50℃后，以每克秸秆的干重计，加入20酶活力单位的纤维素酶计算，全部秸秆的干重为450克，共加入9000酶活力单位(约45克)的纤维素酶(和氏璧生物技术有限公司)和3600酶活力单位(约49.5克)的半纤维素酶(北京化学试剂公司)，并保温混合80分钟；然后加入第二批水洗蒸汽***产物，第二批加入的水洗蒸汽***产物的量为步骤(1)取样测试后剩余的全部水洗蒸汽***产物重量的40％，保温酶解40小时后得到酶解产物。并按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件，测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共188克，所述酶解得到的葡萄糖的重量除以1.11，即蒸汽***产物中被酶解的纤维素的重量共169.4克，测定并计算出酶解产物中的木糖共44.8克，所述酶解得到的木糖的重量除以1.14，即蒸汽***产物中被酶解的半纤维素的重量共39.3克，每小时酶解的纤维素和半纤维素的总重量为5.2克；并按照下述公式计算纤维素、半纤维素转化率和单糖产率，计算结果见表1。(以蒸汽***产物的干重计，以得到的混合的重量为基准，所述第一批蒸汽***产物的含量为5.66重量％。)

纤维素转化率＝100％×被酶解的纤维素的重量/纤维素的总重量

半纤维素转化率＝100％×被酶解的半纤维素的重量/半纤维素的总重量

单糖产率＝100％×(酶解得到的葡萄糖重量+酶解得到的木糖重量)/秸秆干重

(3)发酵

使酶解产物的温度降至34℃，以每克酶解产物的重量计，接种为10⁴菌落形成单位的酿酒酵母(安琪超级酿酒高活性干酵母，湖北安琪酵母股份公司)和10⁴菌落形成单位的树干毕赤酵母，所得混合物在33℃下于发酵罐中搅拌培养37小时。在100℃蒸馏所得发酵产物，所得蒸馏馏分在78.3℃下二次蒸馏可得乙醇119克，并按照实施例1的公式计算乙醇产率，计算结果见表1。

实施例6

本实施例用于说明本发明的采用含纤维素的原料制备乙醇的方法。

(1)蒸汽***

按照实施例2的方法对1000克含水量为50重量％的玉米秸秆进行蒸汽***，不同的是，完成蒸汽***后，将所得蒸汽***产物与60℃的水按照质量比1∶2搅拌混合40分钟，然后用离心泵LW400型卧螺离心机(张家港华大离心机制造有限公司)在900转/分钟转速下进行固液分离，共得到1785克水洗固体蒸汽***产物(含水量为72重量％)。

按照实施例1所述HPLC分析硫酸水解的蒸汽***产物的方法，测得1785克蒸汽***产物中共含纤维素215克，半纤维素60克。

(2)酶解

按照实施例5的方法对蒸汽***产物进行酶解，不同的是，在向酶解罐中加入水后，并在搅拌下，将蒸汽***产物分三批与酶混合，第一批加入的蒸汽***产物的量为取样测试后剩余的全部蒸汽***产物重量的40％，在50℃下保温混合50分钟；然后加入第二批蒸汽***产物，第二批加入的蒸汽***产物的量为取样测试后剩余的全部蒸汽***产物重量的30％，在50℃下保温混合30分钟；然后再加入第三批蒸汽***产物，第三批加入的蒸汽***产物的量为取样测试后剩余的全部蒸汽***产物重量的30％，在50℃下保温酶解38小时后得到酶解产物。且，以每克秸秆的干重计，加入20酶活力单位的纤维素酶计算，全部秸秆的干重为约500克，共加入10000酶活力单位(约60克)的纤维素酶(和氏璧生物技术有限公司)和4000酶活力单位(约60克)的半纤维素酶(北京化学试剂公司)。并按照实施例1步骤(1)所述高效液相条件，测定并计算出酶解产物中的葡萄糖共222.9克，所述酶解得到的葡萄糖的重量除以1.11，即蒸汽***产物中被酶解的纤维素的重量共200.8克，测定并计算出酶解产物中的木糖共48.4克，所述酶解得到的木糖的重量除以1.14，即蒸汽***产物中被酶解的半纤维素的重量共42.5克，每小时酶解的纤维素和半纤维素的总重量为6.34克；并计算纤维素、半纤维素转化率和单糖产率，计算结果见表1。(以蒸汽***产物的干重计，以得到的混合物的重量为基准，所述第一批蒸汽***产物的含量为4.54重量％。)

按照实施例5的方法对酶解产物进行发酵，所得蒸馏馏分在78.3℃下二次蒸馏可得乙醇138.7克，并按照实施例1的公式计算乙醇产率，计算结果见表1。

表1

实施例或对比例	实施例1	对比例1	对比例2	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5	实施例6
									纤维素转化率(％)	95.3	76.0	74.5	90.2	92.9	92.1	91.8	93.4
半纤维素转化率(％)	-	-	-	-	-	-	70.0	70.8
									单糖产率(％)	46.0	35.2	35.6	42.7	44.7	41.9	51.7	54.3
乙醇产率(％)	24.2	18.7	18.5	22.0	23.5	21.6	26.5	27.7

从上表1中的数据可以看出，采用本发明的含纤维素的原料制备乙醇的方法得到的乙醇的产率以及单糖的产率与对比例1和对比例2的方法比较均有明显的提高。

Claims (13)

1.一种采用含纤维素的原料制备乙醇的方法，该方法包括蒸汽***含纤维素的原料；将得到的蒸汽***产物与酶混合、酶解；发酵得到的酶解产物，其特征在于，所述将蒸汽***产物与酶混合的方法包括将蒸汽***产物分批与酶混合，所述分批次数至少为2次，每批加入的蒸汽***产物的量至多为全部蒸汽***产物重量的60％；所述含纤维素的原料的含水量为30-60重量％。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分批次数为3次，第一批与酶混合的蒸汽***产物的量为全部蒸汽***产物重量的20-60％；第二批加入的蒸汽***产物的量为全部蒸汽***产物重量的20-50％；第三批加入的蒸汽***产物的量为全部蒸汽***产物重量的20-40％。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，将第一批蒸汽***产物与酶混合时，该方法还包括加入水，以蒸汽***产物的干重计，以得到的混合物的重量为基准，第一批蒸汽***产物的含量至少为1重量％。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，以蒸汽***产物的干重计，以得到的混合物的重量为基准，第一批蒸汽***产物的含量至少为1.2-10重量％。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述含纤维素的原料的含水量为35-50重量％。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，相邻的两个分批混合步骤之间还包括时间间隔。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述时间间隔为10-120分钟。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述蒸汽***的温度为180-200℃，所述蒸汽***的压力为1.4-2.0兆帕，所述蒸汽***压力的维持时间为3-7分钟。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述酶解使用的酶包括纤维素酶，以每克含纤维素的原料的干重计，所述纤维素酶的用量为8-20酶活力单位；所述酶解的温度为45-55℃，所述酶解的时间为25-48小时，所述酶解的pH值为3.0-7.0。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述酶解使用的酶还包括半纤维素酶，以每克含纤维素的原料的干重计，所述半纤维素酶的用量为4.4-8.8酶活力单位。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵所使用的酵母为树干毕赤酵母和/或酿酒酵母；以每克酶解产物计，所述发酵所使用的酵母的接种量为10³-10⁸菌落形成单位，所述发酵的温度为30-36℃，发酵的时间为32-48小时。

12.根据权利要求1所述的方法，其中，所述含纤维素的原料为秸秆。

13.根据权利要求1或12所述的方法，其中，所述含纤维素的原料的大小为0.5-3厘米×0.2-1厘米×0.2-1厘米。

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