CN101490252A - 赋予除草剂抗性的新型epsp合酶基因 - Google Patents

Abstract

提供了用于将除草剂抗性或耐受性赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子的组合物和方法。提供了组合物，其包含赋予对于草甘膦除草剂的抗性或耐受性的多肽的编码序列。所述编码序列可以在DNA构建体或表达盒中使用以用于转化植物并在其中表达。所述组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。特别地，提供了相应于草甘膦抗性核酸序列的分离的核酸分子。另外，包括了相应于所述多核苷酸的氨基酸序列。特别地，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或者SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、28、29、30、31、32、33或34中所示的核苷酸序列。

Description

赋予除草剂抗性的新型EPSP合酶基因

发明领域

本发明提供了编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate)(EPSP)合酶的新型基因，其提供了除草剂抗性。这些基因可用于植物生物学、农作物育种和植物细胞培养。

发明背景

N-膦酰甲基甘氨酸，通常称为草甘膦，是重要的农艺学化合物。草甘膦抑制将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸转化成5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸的酶。这种酶(5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)；在本文中称为“EPSP合酶”)的抑制通过关闭莽草酸途径从而抑制芳香族氨基酸的生物合成而杀死植物细胞。

因为草甘膦类除草剂抑制芳香族氨基酸的生物合成，所以它们不仅杀死植物细胞，而且对于细菌细胞也有毒性。草甘膦抑制许多细菌的EPSP合酶，因此对这些细菌有毒。然而，某些细菌的EPSP合酶对草甘膦具有高耐受性。

对草甘膦毒性有抵抗力的植物细胞可以通过转化植物细胞以表达草甘膦抗性细菌EPSP合酶来产生。值得注意的是，来自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株CP4的细菌基因已用于在植物中在表达后赋予植物细胞以除草剂抗性。来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株CT7的突变的EPSP合酶在细菌细胞中赋予草甘膦抗性，并且将草甘膦抗性赋予植物细胞(美国专利号4,535,060；4,769,061；和5,094,945)。

美国专利6,040,497报告了突变型玉蜀黍EPSP合酶，其具有在位置102处的苏氨酸至异亮氨酸的置换和在位置106处的脯氨酸至丝氨酸的置换(“TIPS”突变)。此类改变将草甘膦抗性赋予该玉蜀黍酶。来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株CT7的突变的EPSP合酶在细菌细胞中赋予草甘膦抗性，并且被报告将草甘膦抗性赋予植物细胞(美国专利号4,535,060；4,769,061；和5,094,945)。He等人((2001)Biochim et Biophysica Acta 1568：1-6)已通过诱变以及在大肠杆菌(E.coli)和鼠伤寒沙门氏菌EPSP合酶基因之间的重组开发出了具有增加的草甘膦耐受性的EPSP合酶，并且提出在位置42(T42M)和位置230(Q230K)处的突变可能是造成所观察到的抗性的原因。

后续工作(He等人(2003)Biosci.Biotech.Biochem.67：1405-1409)显示，T42M突变(苏氨酸至甲硫氨酸)足以改善大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的酶的耐受性。这些酶包含有在其活性位点中的氨基酸置换，所述氨基酸置换阻止草甘膦的结合而不影响PEP或S3P的结合。在EPSP合酶的2个球状结构域之间的铰链区中发生的突变已显示出改变了草甘膦而非PEP的结合亲和力(He等人，2003，同上)。因此，此类酶即使在草甘膦存在下也具有高的催化活性。

由于除草剂抗性植物提供许多优点，所以用于鉴定具有草甘膦抗性活性的除草剂抗性基因的方法是希望的。

发明概述

提供了用于将除草剂抗性或耐受性赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子的组合物和方法。所述组合物包括编码除草剂抗性或耐受性多肽的核酸分子，包含那些核酸分子的载体，和包含所述载体的宿主细胞。所述组合物还包括针对除草剂抗性或耐受性多肽的抗体。如所描述的，本发明的核苷酸序列可以在DNA构建体或表达盒中使用以用于转化生物体并在其中表达，所述生物体包括微生物和植物。所述组合物还包括转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。另外，提供了用于产生由本发明的合成核苷酸编码的多肽的方法。

具体地，提供了编码除草剂抗性或耐受性多肽的分离的核酸分子及其变体。此外，还包括由赋予除草剂抗性或耐受性的多核苷酸编码的氨基酸序列及其变体。具体地，本发明提供了分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、28、29、30、31、32、33或34中所示的核苷酸序列，编码SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，以登记号NRRL B-30911、NRRL B-30912、NRRL B-30913、NRRL B-30914 N、NRRL B-30915、NRRLB-30916 N或NRRL B-30917 N保藏在细菌宿主中的除草剂抗性核苷酸序列，以及其变体和片段。还包括与本发明的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或者与本发明的序列杂交的核苷酸序列。

附图简述

图1A-1E显示了GRG25(SEQ ID NO：2)、GRG26(SEQ ID NO：4)、GRG27(SEQ ID NO：6)、GRG28(SEQ ID NO：8)、GRG29(SEQ ID NO：10)、GRG30(SEQ ID NO：12)和GRG31(SEQ ID NO：14)的氨基酸序列与其他草甘膦耐受性EPSP合酶基因的比对，所述其他草甘膦耐受性EPSP合酶基因包括GRG1(SEQ ID NO：15)、GRG5(SEQ ID NO：16)、GRG6(SEQ ID NO：17)、GRG7(SEQ ID NO：18)、GRG8(SEQ ID NO：19)、GRG9(SEQ ID NO：20)、GRG10(SEQ ID NO：21)、GRG12(SEQID NO：22)、GRG15(SEQ ID NO：23)、GRG20(SEQ ID NO：24)、GRG21(SEQ ID NO：25)、GRG22(SEQ ID NO：26)和GRG23(SEQ IDNO：27)。符号[*]表明，所述残基在该比对中的所有序列之中是相同的；[：]符号标明保守置换；[.]符号标明半保守置换。

发明详述

本发明涉及用于调节生物体特别是植物或植物细胞中的除草剂抗性的组合物和方法。所述方法包括用编码本发明的草甘膦抗性基因的核苷酸序列来转化生物体。具体地，本发明的核苷酸序列可用于制备对除草剂草甘膦显示出增加的耐受性的植物。因此，提供了经转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。组合物包括涉及微生物和植物中的除草剂耐受性的核酸和蛋白质以及经转化的细菌、植物、植物组织和种子。更具体而言，公开了草甘膦抗性基因(grg25、grg26、grg27、grg28、grg29、grg30、grg31、syngrg25、syngrg26、syngrg27、syngrg28、syngrg29、syngrg30和syngrg31)的核苷酸序列和由其编码的蛋白质的氨基酸序列。所述序列可用于构建用于随后转化到目的植物内的表达载体，用作用于分离其他草甘膦抗性基因的探针，用作选择标记等。因此，本发明的“草甘膦抗性”或“草甘膦耐受性”基因意指SED ID NO：1、3、5、7、9、11或13中所示的核苷酸序列，及其片段和变体(例如SEQ ID NO：28-34)，它们编码草甘膦抗性或耐受性多肽。同样地，本发明的“草甘膦抗性”或“草甘膦耐受性”多肽是具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14中所示氨基酸序列的多肽，及其片段和变体，它们赋予宿主细胞以草甘膦抗性或耐受性。

包含本发明的除草剂抗性核苷酸序列的质粒于2006年4月19日保藏于农业研究机构保藏中心(Agricultural Research ServiceCulture Collection，Northern Regional Research Laboratory(NRRL)，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604，United States of America)的永久收藏中，登记号为NRRL B-30911(grg25)、NRRL B-30912(grg26)、NRRL B-30913(grg27)、NRRLB-30914 N(grg28)、NRRL B-30915(grg29)、NRRL B-30916 N(grg30)和NRRL B-30917(grg31)。这种保藏将根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款进行维持。这种保藏仅仅为了本领域技术人员方便而进行，并非承认保藏是根据35 U.S.C.§112所要求的。

“草甘膦”意指N-膦酰甲基甘氨酸(包括其任何盐)的任何除草剂形式和导致在植物中产生草甘膦阴离子的其他形式。“除草剂抗性蛋白质”或由于“编码除草剂抗性的核酸分子”的表达而产生的蛋白质包括将下述能力赋予细胞的蛋白质：比不表达该蛋白质的细胞耐受更高浓度的除草剂，或比不表达该蛋白质的细胞更长时间地耐受某一除草剂浓度。“草甘膦抗性蛋白质”包括将下述能力赋予细胞的蛋白质：比不表达该蛋白质的细胞耐受更高浓度的草甘膦，或比不表达该蛋白质的细胞更长时间地耐受某一草甘膦浓度。“耐受”或“耐受性”意指存活或者以不容易与未经处理的细胞相区分的方式执行基本的细胞功能例如蛋白质合成和呼吸。

分离的核酸分子，及其变体和片段

本发明的一个方面涉及分离的或重组的核酸分子，其包含编码除草剂抗性蛋白质和多肽或其生物学活性部分的核苷酸序列；以及足以用作杂交探针以鉴定编码除草剂抗性的核酸的核酸分子。如本文所使用的，术语“核酸分子”意欲包括DNA分子(例如，重组DNA、cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)以及通过使用核苷酸类似物而产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。

编码本发明的蛋白质的核苷酸序列包括以登记号NRRL B-30911、NRRL B-30912、NRRL B-30913、NRRL B-30914 N、NRRL B-30915、NRRLB-30916 N和NRRL B-30917 N保藏在细菌宿主中的除草剂抗性核苷酸序列即SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、28、29、30、31、32、33和34中所示的序列，及其变体、片段和互补物。“互补物”意指这样的核苷酸序列，即其与给定的核苷酸序列充分互补，如此使得它可以与给定的核苷酸序列杂交从而形成稳定的双链体。关于由这些核苷酸序列编码的除草剂抗性蛋白质的相应氨基酸序列显示于SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12和14中。本发明还包括包含编码部分长度的除草剂抗性蛋白质的核苷酸序列的核酸分子，及其互补物。

“分离的”或“纯化的”核酸分子或者蛋白质或其生物学活性部分，基本上不含其他细胞材料或培养基(当通过重组技术生产时)，或者基本上不含化学前体或其他化学制品(当以化学方法合成时)。优选地，“分离的”核酸不含在该核酸所源自的生物体的基因组DNA中天然地位于该核酸侧翼的序列(即，位于该核酸的5′和3′末端处的序列)(优选蛋白质编码序列)。对本发明而言，当用于指核酸分子时，“分离的”不包括分离的染色体。例如，在各种实施方案中，分离的编码草甘膦抗性的核酸分子可以包含少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的在该核酸所源自的细胞的基因组DNA中天然地位于该核酸分子侧翼的核苷酸序列。基本上不含细胞材料的除草剂抗性蛋白质包括具有少于约30％、20％、10％或5％(干重)的非除草剂抗性蛋白质(在本文中也称为“污染蛋白质”)的蛋白质制剂。

本发明还包括这样的核酸分子，其为这些编码除草剂抗性的核苷酸序列的片段。“片段”意指编码除草剂抗性蛋白质的核苷酸序列的部分。核苷酸序列的片段可以编码除草剂抗性蛋白质的生物学活性部分，或者它可以是使用下文公开的方法而可以用作杂交探针或PCR引物的片段。作为除草剂抗性核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少约15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400个邻接核苷酸，或高至在本文公开的全长的编码除草剂抗性的核苷酸序列中存在的核苷酸的数目(例如，对于SEQ ID NO：1为1404个核苷酸；对于SEQ ID NO：3为1395个核苷酸；和对于SEQ ID NO：5为1368个核苷酸，等等)，这取决于所期望的用途。“邻接”核苷酸意指彼此紧邻的核苷酸残基。

本发明的核苷酸序列的片段一般将编码保留全长草甘膦抗性蛋白质的生物活性即除草剂抗性活性的蛋白质片段。“保留除草剂抗性活性”意指该片段将具有本文公开为SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的全长草甘膦抗性蛋白质的至少约30％、至少约50％、至少约70％或至少约80％的除草剂抗性活性。用于测量除草剂抗性活性的方法是本领域众所周知的。参见，例如，美国专利号4,535,060和5,188,642，所述专利各自通过提及而整体合并入本文。

编码除草剂抗性的核苷酸序列的片段(其编码本发明蛋白质的生物学活性部分)将编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450个邻接核苷酸，或高至在本发明的全长除草剂抗性蛋白质中存在的氨基酸的总数目(例如，对于SEQID NO：2为467个氨基酸；对于SEQ ID NO：4为464个氨基酸；和对于SEQ ID NO：6为455个氨基酸，等等)。

优选的本发明的除草剂抗性蛋白质由与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、28、29、30、31、32、33或34的核苷酸序列具有足够同一性的核苷酸序列编码。术语“具有足够同一性”意指这样的氨基酸或核苷酸序列，即通过使用本文描述的比对程序之一并采用标准参数，其与参照序列相比较具有至少约60％或65％序列同一性，约70％或75％序列同一性，约80％或85％序列同一性，或者约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。本领域技术人员将会认识到，这些值可以适当地进行调整以通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读码框定位等来确定由2个核苷酸序列所编码的蛋白质的相应同一性。

为了确定2个氨基酸序列或2个核酸的同一性百分比，就最佳比较目的来对序列进行比对。2个序列之间的同一性百分比是由所述序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性百分比＝相同位置的数目/位置(例如，重叠位置)的总数目x100)。在一个实施方案中，2个序列具有相同的长度。2个序列之间的同一性百分比可以使用与下文描述的那些类似的技术来进行确定，其中允许或不允许缺口。在计算同一性百分比中，通常计数准确的匹配。

2个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。用于2个序列比较的数学算法的非限制性例子是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264的算法，其在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中进行了修改。将此类算法整合入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLASTN和BLASTX程序中。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序(得分＝100、字长＝12)来进行，以获得与本发明的草甘膦抗性核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTX程序(得分＝50、字长＝3)来进行，以获得与本发明的除草剂抗性蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有缺口的比对，可以使用如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389中所描述的Gapped BLAST。备选地，PSI-Blast可以用于执行检测分子间的远距离关系的迭代搜索。参见Altschul等人(1997)(同上)。当利用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各个程序(例如，BLASTX和BLASTN)的缺省参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性例子是ClustalW算法(Higgins等人(1994)Nucleic Acids Res.22：4673-4680)。ClustalW比较序列并比对氨基酸或DNA序列的整体，因此可以提供关于整个氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法在几个商购可得的DNA/氨基酸分析软件包中使用，例如Vector NTI Program Suite(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)的ALIGNX模块。在用ClustalW比对氨基酸序列后，可以评估氨基酸同一性百分比。可用于ClustalW比对分析的软件程序的非限制性例子是GeneDoc^TM。GeneDoc^TM(Karl Nicholas)允许评估多个蛋白质之间的氨基酸(或DNA)相似性和同一性。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性例子是Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法。此类算法被整合入ALIGN程序(版本2.0)中，所述ALIGN程序是GCG序列比对软件包(可从Accelrys，Inc.，9865 Scranton Rd.，San Diego，California，USA获得)的一部分。当利用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分。

除非另有说明，采用Needleman和Wunsch(1970)(同上)的算法的GAP Version 10将被用于测定序列同一性或相似性，其中使用下述参数：关于核苷酸序列的同一性％和相似性％，使用50的GAP权重和3的长度权重，以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；关于氨基酸序列的同一性％或相似性％，使用8的GAP权重和2的长度权重，以及BLOSUM62评分矩阵。还可以使用等价的程序。“等价的程序”意指任何这样的序列比较程序，即对于所研究的任何2个序列，当与由GAPVersion 10产生的相应比对相比较时，产生具有相同的核苷酸残基匹配和相同的序列同一性百分比的比对。

本发明还包括变体核酸分子。编码除草剂抗性的核苷酸序列的“变体”包括编码本文公开的除草剂抗性蛋白质但由于遗传密码的简并性而保守性地不同的那些序列，以及如上所述具有足够同一性的那些序列。天然存在的等位基因变体可以使用众所周知的分子生物学技术来鉴定，例如如下所述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体核苷酸序列还包括合成衍生的核苷酸序列，其例如通过使用定点诱变产生但仍编码本发明中公开的除草剂抗性蛋白质，如下所述。本发明所包括的变体蛋白质是在生物学上有活性的，即它们保留了所需的天然蛋白质的生物活性，即除草剂抗性活性。“保留除草剂抗性活性”意指该变体将具有至少约30％、至少约50％、至少约70％或至少约80％的天然蛋白质的除草剂抗性活性。用于测量除草剂抗性活性的方法是本领域众所周知的。参见，例如，美国专利号4,535,060和5,188,642,所述专利各通过提及而整体合并入本文。

技术人员将会进一步意识到，可以通过突变将改变引入本发明的核苷酸序列内，从而导致编码的除草剂抗性蛋白质的氨基酸序列中的改变，而不改变该蛋白质的生物活性。因此，分离的核酸分子变体可以通过下述方式来制备：将一个或多个核苷酸置换、添加或删除引入本文公开的相应的核苷酸序列中，从而使得将一个或多个氨基酸置换、添加或删除引入所编码的蛋白质中。可以通过标准技术来引入突变，例如通过定点诱变和PCR介导的诱变。此类变体核苷酸序列也包括在本发明内。

例如，保守氨基酸置换可以在一个或多个预测的优选地非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以从除草剂抗性蛋白质的野生型序列中进行改变而不改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。在本领域中已定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β-分枝的侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。氨基酸置换可以在保留功能的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白质活性所需的。然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守残基中的保守或非保守改变。保守并且可能对于蛋白质活性而言必需的残基的例子包括，例如在图1的比对中所包含的所有蛋白质之间相同的残基。保守但可能允许保守氨基酸置换并仍保留活性的残基的例子包括，例如仅在图1的比对中所包含的所有蛋白质之间具有保守置换的残基。

Lys-22、Arg-124、Asp-313、Arg-344、Arg-386和Lys-411是来自大肠杆菌的EPSP合酶的保守残基(

等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：1376-1380)。对于EPSP合酶活性重要的保守残基还包括Arg-100、Asp-242和Asp-384(Selvapandiyan等人(1995)FEBS Letters 374：253-256)。Arg-27与S3P结合(Shuttleworth等人(1999)Biochemistry 38：296-302)。

备选地，可以通过沿着全部或部分编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变，来制备变体核苷酸序列，并且可以就赋予除草剂抗性活性的能力来筛选所得到的突变体，以鉴定保留活性的突变体。在诱变后，编码的蛋白质可以重组地表达，并且蛋白质的活性可以通过使用标准测定法技术来测定。

使用诸如PCR、杂交等的方法可以鉴定出相应的除草剂抗性序列，此类序列与本发明的序列具有实质的同一性。参见，例如，Sambrook J.和Russell D.W.(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)和Innis等人(1990)PCR Protocols；A Guide to Methods andApplications(Academic Press，NY)。

在杂交方法中，全部或部分除草剂抗性核苷酸序列可以用于筛选cDNA或基因组文库。用于构建此类cDNA和基因组文库的方法是本领域通常已知的，并且在Sambrook和Russell，2001(同上)中公开。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团例如³²P或任何其他可检测标记例如其他放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子进行标记。可以基于本文公开的已知的编码除草剂抗性的核苷酸序列，通过对合成的寡核苷酸进行标记来制备用于杂交的探针。可以另外使用基于在所述核苷酸序列或编码的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸残基而设计的简并引物。探针通常包含这样的核苷酸序列区域，所述核苷酸序列区域在严格条件下与本发明的编码除草剂抗性的核苷酸序列或其片段或变体的至少约12个，优选约25个，至少约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1300个连续核苷酸杂交。用于制备用于杂交的探针的方法是本领域通常已知的，并且公开于Sambrook和Russell，2001(同上)以及Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York)中，所述2个参考文献通过提及而合并入本文。

例如，本文公开的完整除草剂抗性序列，或者其一个或多个部分，可以用作能够与相应的除草剂抗性序列和信使RNAs特异性地杂交的探针。为了达到在各种条件下的特异性杂交，此类探针包括独特的并且长度为至少约10个核苷酸或长度为至少约20个核苷酸的序列。此类探针可以用于通过PCR从所选择的生物体中扩增出相应的除草剂抗性序列。这种技术可以用于从所需生物体中分离另外的编码序列，或用作诊断测定法以测定生物体中编码序列的存在。杂交技术包括铺板的DNA文库的杂交筛选(噬斑或菌落；参见，例如，Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。

此类序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”意指这样的条件，即在所述条件下探针将与其靶序列杂交，达到相比与其他序列来说可检测地更大的程度(例如，为背景的至少2倍)。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下是不同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定出与探针100％互补的靶序列(同源探测)。备选地，可以调整严格条件以允许序列中的一些错配，从而使得检测出较低程度的相似性(异源探测)。一般地，探针长度为小于约1000个核苷酸，优选地长度小于500个核苷酸。

通常，严格条件是这样的条件，其中在pH 7.0-8.3下盐浓度小于约1.5M Na离子，通常约0.01-1.0M Na离子浓度(或其他盐)，以及温度对于短探针(例如，10-50个核苷酸)为至少约30℃，和对于长探针(例如，超过50个核苷酸)为至少约60℃。严格条件还可以用添加去稳定剂如甲酰胺来达到。示例性的低严格性条件包括于37℃用30-35％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液进行杂交，和于50-55℃在1X-2X SSC(20X SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中进行洗涤。示例性的中等严格性条件包括于37℃在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％ SDS中进行杂交，和于55-60℃在0.5X-1X SSC中进行洗涤。示例性的高严格性条件包括于37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％ SDS中进行杂交，和于60-65℃在0.1X SSC中进行洗涤。任选地，洗涤缓冲液可以包含约0.1％-约1％ SDS。杂交的持续时间一般少于约24小时，通常为约4-约12小时。

特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因素是离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交物，T_m可以从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的等式中进行估计：T_m=81.5℃+16.6(log M)+0.41(％ GC)-0.61(％ form)-500/L；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，％ GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，和L是以碱基对计的杂交物的长度。T_m是这样的温度，在该温度下50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交(在限定的离子强度和pH下)。对于每1％的错配，T_m减少约1℃；因此，可以调整T_m、杂交和/或洗涤条件，以与所需同一性的序列杂交。例如，如果寻求具有≥90％同一性的序列，那么T_m可以减少10℃。一般地，严格条件被选择为在限定的离子强度和pH下比关于特定序列和其互补物的热解链点(T_m)低约5℃。然而，极端严格条件可以利用在比热解链点(T_m)低1、2、3或4℃下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用在比热解链点(T_m)低6、7、8、9或10℃下的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用在比热解链点(T_m)低11、12、13、14、15或20℃下的杂交和/或洗涤。使用该等式、杂交和洗涤组成以及所需T_m，普通技术人员应当理解，内在地描述了杂交和/或洗涤溶液的严格性中的改变。如果所希望的错配程度导致低于45℃(水性溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的T_m，那么优选增加SSC浓度，从而使得可以使用更高的温度。关于核酸杂交的详细指导可见下述参考文献：Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等人，编辑，(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章(GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York)。参见Sambrook等人(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork)。

分离的蛋白质及其变体和片段

除草剂抗性蛋白质也包括在本发明中。“除草剂抗性蛋白质”意指具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14中所示的氨基酸序列的蛋白质。还提供了其片段、生物学活性部分和变体，并且它们可以用于实践本发明的方法。

“片段”或“生物学活性部分”包括这样的多肽片段，所述多肽片段包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14中所示的编码除草剂抗性蛋白质的氨基酸序列的部分，并保留除草剂抗性活性。除草剂抗性蛋白质的生物学活性部分可以是例如长度为10、25、50、100或更多个氨基酸的多肽。此类生物学活性部分可以通过重组技术来制备，并且就除草剂抗性活性来进行评估。用于测量除草剂抗性活性的方法是本领域众所周知的。参见，例如，美国专利号4,535,060和5,188,642，所述专利各自通过提及而整体合并入本文。如本文所使用的，片段包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的至少8个邻接氨基酸。然而，本发明包括其他片段，例如该蛋白质中超过约10、20、30、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸的任何片段。

“变体”意指这样的蛋白质或多肽，其具有与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12或14的氨基酸序列至少约60％、65％，约70％、75％、80％、85％，或者90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列。变体还包括由这样的核酸分子编码的多肽，所述核酸分子在严格条件下与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、28、29、30、31、32、33或34的核酸分子或其互补物杂交。变体包括由于诱变而在氨基酸序列方面不同的多肽。本发明所包括的变体蛋白质是生物学上有活性的，即它们继续拥有所希望的该天然蛋白质的生物活性，即保留了除草剂抗性活性。用于测量除草剂抗性活性的方法是本领域众所周知的。参见，例如美国专利号4,535,060和5,188,642，所述专利各自通过提及而整体合并入本文。

细菌基因，例如本发明的grg25、grg26、grg27、grg28、grg29、grg30、grg31、syngrg25、syngrg26、syngrg27、syngrg28、syngrg29、syngrg30和syngrg31基因，在开放读码框的起始附近十分经常具有多个甲硫氨酸起始密码子。通常，在这些起始密码子中的一个或多个处的翻译起始将导致功能蛋白质的产生。这些起始密码子可以包括ATG密码子。然而，诸如芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)的细菌还将密码子GTG识别为起始密码子，并且在GTG密码子处起始翻译的蛋白质在第一个氨基酸处包含甲硫氨酸。此外，常常事先不确定这些密码子中的哪一些天然地在细菌中使用。因此，应当理解，备选的甲硫氨酸密码子之一的使用可能导致产生赋予除草剂抗性的grg25、grg26、grg27、grg28、grg29、grg30、grg31、syngrg25、syngrg26、syngrg27、syngrg28、syngrg29、syngrg30和syngrg31的变体。这些除草剂抗性蛋白质包括在本发明中，并且可以在本发明的方法中使用。

还包括了针对本发明的多肽或者其变体或片段的抗体。用于产生抗体的方法是本领域众所周知的(参见，例如Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.；美国专利号4,196,265)。

改变或改善的变体

应认识到，可以通过各种方法来改变grg25、grg26、grg27、grg28、grg29、grg30、grg31、syngrg25、syngrg26、syngrg27、syngrg28、syngrg29、syngrg30和syngrg31的DNA序列，并且这些改变可以导致编码这样的蛋白质的DNA序列，所述蛋白质具有与分别由grg25、grg26、grg27、grg28、grg29、grg30或grg31所编码的氨基酸序列不同的氨基酸序列。这种蛋白质可以以各种方式进行改变，包括SEQ IDNO：1、3、5、7、9、11、13、28、29、30、31、32、33或34的一个或多个氨基酸的氨基酸置换、删除、截短和***，包括高至约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约100个或更多氨基酸置换、删除或***。

用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，可以通过DNA中的突变来制备本文公开的GRG蛋白的氨基酸序列变体。这还可以通过几种诱变形式之一和/或在定向进化中来完成。在某些方面，氨基酸序列中所编码的改变将基本上不影响蛋白质的功能。此类变体将具有所希望的除草剂抗性活性。然而，应当理解，GRG25、GRG26、GRG27、GRG28、GRG29、GRG30或GRG31赋予除草剂抗性的能力可以通过此类技术对本发明的组合物的一种用途来进行改善。例如，可以在这样的宿主细胞中表达GRG25、GRG26、GRG27、GRG28、GRG29、GRG30或GRG31，所述宿主细胞显示出高比率的在DNA复制期间的碱基错掺入，例如XL-1Red(Stratagene，La Jolla，CA)。在此类菌株中进行繁殖后，可以分离出本发明的DNA(例如通过制备质粒DNA，或者通过经由PCR进行扩增并将所得到的PCR片段克隆到载体中)，在非诱变菌株中培养grg突变，并鉴定对于除草剂例如草甘膦具有改善的抗性的经突变的基因，例如通过在浓度渐增的草甘膦中培养细胞，并对于赋予针对浓度增加的草甘膦的耐受性的克隆进行测试。

备选地，可以在氨基或羧基末端处对许多蛋白质的蛋白质序列进行改变而基本上不影响活性。这可以包括通过现代分子方法例如PCR而引入的***、删除或改变，所述方法包括借助于在PCR扩增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白质编码序列的PCR扩增。备选地，所添加的蛋白质序列可以包括完整的蛋白质编码序列，例如本领域通常用于产生蛋白质融合物的那些序列。此类融合蛋白常常用于(1)增加目的蛋白质的表达；(2)引入结合结构域、酶活性或表位以有助于蛋白质纯化、蛋白质检测或本领域已知的其他实验用途；或(3)将蛋白质的分泌或翻译靶向至亚细胞器，例如革兰氏阴性菌的壁膜间隙，或真核细胞的内质网，后者常常导致蛋白质的糖基化。

本发明的变体核苷酸和氨基酸序列还包括衍生自诱变和重组操作程序例如DNA改组的序列。使用此类操作程序，可以将一个或多个不同的除草剂抗性蛋白质编码区用于制备具有所需性质的新的除草剂抗性蛋白质。以这种方式，从包含这样的序列区域的相关序列多核苷酸群体中产生重组多核苷酸的文库，所述序列区域具有充分的序列同一性并可以在体外或体内进行同源重组。例如，使用这种方法，可以在本发明的除草剂抗性基因和其他已知的除草剂抗性基因之间改组编码目的结构域的序列基序，以获得编码具有改善的目的性质例如增加的草甘膦抗性活性的蛋白质的新基因。用于此类DNA改组的策略是本领域已知的。参见，例如，Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature 370：389-391；Crameri等人(1997)Nature Biotech.15：436-438；Moore等人(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-4509；Crameri等人(1998)Nature 391：288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。

温度谱(temperature spectrum)

已在植物中进行了草甘膦代谢的几项研究，并且揭示，草甘膦不被植物代谢或者非常缓慢地代谢。草甘膦快速渗透角质层，并且经过相当长的时间段转移遍及植物各处(在下列文献中进行了综述：Kearney和Kaufman，编辑(1988)Herbicides；Chemistry，Degradation & Mode of Action Marcel Dekker，Inc.，New York，3：1-70；以及Grossbard和Atkinson，编辑(1985)The HerbicideGlyphosate Butterworths，London，第25-34页)。因此，在农艺学上重要的植物中进行草甘膦暴露之后的持续的时间段内草甘膦耐受性可能是必需的。如果在生长季节期间温度经常超过30℃，那么采用在升高的温度下保持活性的草甘膦耐受性EPSP合酶将是有利的。

在本发明的一个实施方案中，EPSP合酶在高于或低于外界环境温度(ambient environmental temperature)的温度下展示出热稳定性。“热稳定性”意指所述酶在高于或低于外界环境温度的温度下，比在那个温度下不是热稳定的EPSP合酶在更长的时间段内是有活性的。例如，在高于或低于外界环境温度的温度下，热稳定的EPSP合酶在超过约1小时，超过约2小时，约3小时，约4小时，约5小时，约6小时，约7小时，约8小时，约9小时，约10小时，约11小时，约12小时，约13小时，约14小时，约15小时，约20小时，约25小时或更长时间内具有酶促活性。对于本发明而言，“外界”环境温度为约30℃。在某些实施方案中，高于外界温度(ambienttemperature)是等于或高于约32℃，约34℃，约37℃，约40℃，约45℃，约50℃，约55℃，约60℃，约65℃或更高的温度。低于外界温度是等于或低于约28℃，低于约27℃，约26℃，约25℃，约23℃，约20℃，约18℃，约15℃，约10℃，等于或低于约5℃，或约0℃的温度。用于测定EPSP合酶活性的方法在本文其他地方更详细地进行讨论。对于本发明而言，当它以约90％-100％、约80％-约90％、约70％-约80％、约60％-约70％或约50％-约60％的在那种酶的最适温度下观察到的最大活性水平发挥作用时，该热稳定的EPSP合酶被视为是有活性的。

在另一个实施方案中，本发明的EPSP合酶的最适温度高于或低于野生型草甘膦耐受性EPSP合酶的最适温度。对于本发明而言，野生型草甘膦耐受性EPSP合酶是在外界环境温度下具有最大活性的酶(例如，在2006年11月29日提交的美国专利申请号11/605,824中以GRG23进行描述的草甘膦耐受性EPSP合酶，所述专利通过提及而整体合并入本文)。“最适”意指例如当经过多个温度范围进行测量时，对于EPSP合酶观察到最大活性。在非限制性实例中，在本发明的方法中使用的EPSP合酶可以在约0℃-约10℃、约10℃-约20℃、约20℃-约30℃、约30℃-约40℃、约40℃-约50℃、约50℃-约60℃、约60℃-约70℃或约70℃-约80℃下具有最佳活性。

因此，本发明提供了用于在高于或低于外界环境温度的温度下增加草甘膦耐受性的方法和组合物。在一个实施方案中，所述方法包括将编码草甘膦耐受性EPSP合酶的核苷酸序列引入植物中，所述草甘膦耐受性EPSP合酶在高于或低于外界温度的温度下是热稳定的；并且分别在高于或低于外界环境温度的温度下使所述植物进行生长。在具体实施方案中，生长温度在所述植物的生长季节期间以平均至少约2小时/天，至少约3小时/天，至少约4小时/天，至少约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约14、约16、约18、约20、至少约22小时/天，或直至约24小时/天的时间高于或低于外界温度。

在另一个实施方案中，所述方法包括将编码除了SEQ ID NO：35、36或37之外的其他草甘膦耐受性EPSP合酶的核苷酸序列引入植物中，所述草甘膦耐受性EPSP合酶具有高于外界环境温度的最适温度；使所述植物与除草有效浓度的草甘膦接触；和在这样的温度下使所述植物生长，所述温度超过外界环境温度至少1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时或更多小时/天，共至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天(在将草甘膦施用至植物后)，其中温度超过外界环境温度的那些天出现在植物的生长季节期间。在另一个实施方案中，所述方法包括将编码除了SEQ ID NO：38之外的其他草甘膦耐受性EPSP合酶的核苷酸序列引入植物中，所述草甘膦耐受性EPSP合酶具有低于外界环境温度的最适温度；使所述植物与除草有效浓度的草甘膦接触；和在这样的温度下使所述植物生长，所述温度低于外界环境温度至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时或更多小时/天，共至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天(在将草甘膦施用至植物后)，其中温度超过外界环境温度的那些天出现在植物的生长季节期间。

在另外一个实施方案中，所述方法包括将编码草甘膦耐受性EPSP合酶的核苷酸序列引入植物中，所述草甘膦耐受性EPSP合酶在高于外界环境温度的温度下是热稳定的；使所述植物与除草有效浓度的草甘膦接触；和在高于外界环境温度的温度下使所述植物生长，其中所述温度高于外界环境温度至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时或更多小时/天，共至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天(在将草甘膦施用至植物后)，其中温度超过外界环境温度的那些天出现在植物的生长季节期间。在一个非限制性实例中，所述热稳定的EPSP合酶为SEQID NO：14中所示。备选地，所述方法包括将编码草甘膦耐受性EPSP合酶的核苷酸序列引入植物中，所述草甘膦耐受性EPSP合酶在低于外界环境温度的温度下是热稳定的；使所述植物与除草有效浓度的草甘膦接触；和在这样的温度下使所述植物生长，所述温度低于外界环境温度至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时或更多小时/天，共至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天(在将草甘膦施用至植物后)，其中温度超过外界环境温度的那些天出现在植物的生长季节期间。

在各种实施方案中，在高于或低于外界环境温度的温度下热稳定的，或者在低于或高于外界环境温度的温度下具有热最佳值的草甘膦耐受性EPSP合酶不是植物来源的EPSP合酶。“植物来源的”意指天然植物EPSP合酶序列，或与天然植物序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或至少约99％同一的序列。参见，例如在美国专利申请公开号20060143727、20030049814、20030079246、20030200560、2004148650和20050223436；美国专利号5188642、6040497、7214535、7169970、6867293、7183110、5094945、6225114、7141722、7045684、5312910、6566587和RE037287中描述的植物来源的草甘膦耐受性EPSP合酶序列，所述专利中的每一个通过提及而整体合并入本文。

细菌或植物细胞的转化

本文提供了新型的分离的基因，其赋予针对除草剂的抗性。还提供了本发明的GRG蛋白的氨基酸序列。由这种基因的翻译所产生的蛋白质允许细胞在存在一定浓度的除草剂的情况下运转，所述除草剂的浓度在其他情况下对于细胞(包括植物细胞和细菌细胞)有毒。在本发明的一个方面，grg25、grg26、grg27、grg28、grg29、grg30、grg31、syngrg25、syngrg26、syngrg27、syngrg28、syngrg29、syngrg30和syngrg31基因可用作标记来评估细菌或植物细胞的转化。用于检测植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚胎或其后代中转基因的存在的方法是本领域众所周知的。

通过改造本发明的基因以从已知在待测试的生物体中刺激转录的启动子进行表达并正确地翻译从而产生完整的GRG肽，并且将细胞置于在其他情况下有毒的除草剂浓度中，可以借助于其对除草剂的抗性而鉴定出已用所述DNA转化的细胞。“启动子”意指发挥功能以指导下游编码序列转录的核酸序列。启动子连同其他转录和翻译调节核酸序列(也称为“控制序列”)一起是目的DNA序列表达所必需的。

细菌细胞的转化通过本领域已知的几种技术之一来完成，包括但不限于，电穿孔或化学转化(参见，例如Ausubel(编辑)(1994)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，Indianapolis，IN)。赋予针对有毒物质的抗性的标记可用于从未转化的细胞(不包含或不表达测试DNA的那些细胞)中鉴定出转化的细胞(已摄取并表达测试DNA)。在本发明的一个方面中，grg25、grg26、grg27、grg28、grg29、grg30、grg31、syngrg25、syngrg26、syngrg27、syngrg28、syngrg29、syngrg30和syngrg31基因可用作标记以评估细菌或植物细胞的转化。

植物细胞的转化可以以类似方式来完成。“植物”意指整个植株、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚胎及其后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如，愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。“转基因植物”或“转化的植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织指已将外源核酸序列或DNA片段引入或整合到植物细胞内的植物。“稳定的转化”意指，引入植物内的核苷酸构建体整合到植物的基因组中并能够由其后代遗传。

可以修饰本发明的grg基因以获得或增强在植物细胞中的表达。本发明的除草剂抗性序列可以在用于在目的植物中表达的表达盒中提供。“植物表达盒”包括能够导致在植物细胞中从开放读码框表达蛋白质的DNA构建体，包括重组DNA构建体。所述盒以5′-3′的转录方向包含与本发明的DNA序列可操作地连接的转录起始区(即，启动子，特别是异源启动子)，和/或在植物中具有功能的转录和翻译终止区(即，终止区)。所述盒可以另外还包含至少一种待共转化到生物体中的另外的基因，例如选择标记基因。备选地，所述另外的基因可以在多个表达盒上提供。此类表达盒以具有多个限制位点的形式提供，所述限制位点用于***除草剂抗性序列以处于调节区的转录调节之下。

启动子对于植物宿主和/或本发明的DNA序列来说可以是天然的或类似的，或者外源的或异源的。此外，启动子可以是天然序列或者备选地是合成序列。当启动子对于植物宿主是“天然的”或“同源的”时，意指所述启动子在该启动子所引入的天然植物内存在。当启动子对于本发明的DNA序列是“外源的”或“异源的”时，意指所述启动子对于可操作地连接的本发明DNA序列来说不是天然的或天然存在的启动子。“异源的”一般指这样的核酸序列，所述核酸序列对于它们所存在于其中的细胞来说不是内源的或者不是天然基因组的一部分，并且已通过感染、转染、显微注射、电穿孔、微粒轰击等加入细胞中。“可操作地连接”意指启动子和第二序列之间的功能连接，其中启动子序列起始并介导相应于第二序列的DNA序列的转录。一般地，可操作地连接意指，被连接的核酸序列是邻接的，并且在必需使2个蛋白质编码区联合在一起时是邻接的并在同一读码框中。

通常，此类构建体还将包含5′和3′非翻译区。此类构建体可以包含“信号序列”或“前导序列”，以有助于目的肽的共翻译或翻译后运输至某些细胞内结构，例如叶绿体(或其他质体)、内质网或高尔基体，或者被分泌。例如，基因可以经改造以包含信号肽从而有助于将肽转移至内质网。“信号序列”意指已知或怀疑导致穿过细胞膜的共翻译或翻译后肽运输的序列。在真核生物中，这通常涉及分泌到高尔基体内，其中具有某些发生的糖基化。“前导序列”意指当被翻译时导致足以引发肽链共翻译运输至亚细胞器的氨基酸序列的任何序列。因此，这包括通过进入内质网内，进入液泡、质体(包括叶绿体、线粒体)等中来对运输和/或糖基化实施靶向的前导序列。还可以优选改造植物表达盒以包含内含子，从而使得内含子的mRNA加工是表达所需的。

“3′非翻译区”意指位于编码序列下游的核苷酸序列。多腺苷酸化信号序列和编码能够影响向mRNA前体的3′末端添加多腺苷酸束的调节信号的其他序列是3′非翻译区。“5′非翻译区”意指位于编码序列上游的核苷酸序列。

其他上游或下游非翻译元件包括增强子。增强子是用于增加启动子区的表达的核苷酸序列。增强子是本领域众所周知的，并且包括但不限于，SV40增强子区和35S增强子元件。

终止区可以对于转录起始区来说是天然的，可以对于本发明的除草剂抗性序列来说是天然的，或可以衍生自另一种来源。方便的终止区可从根瘤土壤杆菌的Ti质粒中获得，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶的终止区。还可参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell 2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene 91：151-158；Ballas等人(1989)NucleicAcids Res.17：7891-7903；和Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。

在本发明的一个方面，对于给定的多肽例如本发明的多肽来设计合成DNA序列。合成DNA序列的开放读码框在细胞中的表达导致产生本发明的多肽。合成DNA序列可以用于简单地去除不想要的限制性核酸内切酶位点，以促进DNA克隆策略，改变或去除任何潜在的密码子偏倚，改变或改善GC含量，去除或改变备选的读码框，和/或改变或去除可能存在于天然DNA序列中的内含子/外显子剪接识别位点、多腺苷酸化位点、Shine-Delgarno序列、不想要的启动子元件等。还可能的是，合成DNA序列可用于将其他改善引入DNA序列中，例如引入内含子序列，形成作为与细胞器靶向序列(例如，叶绿体转运肽、质外体/液泡靶向肽或者导致所得到的肽保留在内质网中的肽序列)的蛋白质融合物进行表达的DNA序列。可以使用宿主细胞偏爱的密码子来合成所述合成基因以获得改善的表达，或者可以通过以宿主偏爱的密码子使用频率使用密码子来合成所述合成基因。参见，例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11；美国专利号6,320,100；6,075,185；5,380,831；和5,436,391，美国公开申请号20040005600和20010003849，和Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，其通过提及而合并入本文。

在一个实施方案中，目的核酸被靶向叶绿体以进行表达。以这种方式，当目的核酸不直接***叶绿体内时，表达盒将另外包含编码转运肽的核酸以将目的基因产物导向叶绿体。此类转运肽是本领域已知的。参见，例如Von Heijne等人(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等人(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等人(1986)Science 233：478-481。

可以就在叶绿体中的表达来优化被靶向叶绿体的目的核酸，以解决植物细胞核和这种细胞器之间的在密码子使用方面的差异。以这种方式，可以使用叶绿体偏爱的密码子来合成目的核酸。参见，例如，美国专利号5,380,831，通过提及而合并入本文。

通常，这种“植物表达盒”将被***“植物转化载体”中。“转化载体”意指对于细胞的有效转化来说所必需的DNA分子。此类分子可以由一个或多个表达盒组成，或可以组织入超过一个的“载体”DNA分子中。例如，二元载体是植物转化载体，其利用2个非邻接DNA载体来编码用于植物细胞转化的所有必需的顺式和反式作用功能(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science 5：446-451)。“载体”指设计用于在不同宿主细胞之间进行转移的核酸构建体。“表达载体”指具有将异源DNA序列或片段引入、整合入外源细胞中并在其中表达该异源DNA序列或片段的能力的载体。

这种植物转化载体可以由对于实现植物转化所需的一个或多个DNA载体构成。例如，利用由超过一种邻接DNA区段构成的植物转化载体是本领域中常见的实践。这些载体在本领域中通常称为“二元载体”。二元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于土壤杆菌介导的转化，其中对于实现有效转化所需的DNA区段的大小和复杂性相当大，并且将功能分散到分开的DNA分子上是有利的。二元载体通常包括质粒载体，所述质粒载体包含对于T-DNA转移所需的顺式作用序列(例如左边界和右边界)、经改造从而能够在植物细胞中表达的选择标记、和“目的基因”(经改造从而能够在对于其希望产生转基因植物的植物细胞中表达的基因)。在这种质粒载体上还存在有细菌复制所需的序列。顺式作用序列以允许有效转移到植物细胞内并在其中表达的方式排列。例如，选择标记基因和目的基因位于左和右边界之间。通常，第二质粒载体包含介导T-DNA从土壤杆菌转移到植物细胞的反式作用因子。这种质粒通常包含毒力功能(Vir基因)，其允许用土壤杆菌感染植物细胞，并通过在边界序列处进行切割和vir介导的DNA转移来转移DNA，如本领域中所了解的(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in Plant Science，5：446-451)。几类土壤杆菌属菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可以用于植物转化。第二质粒载体不是通过其他方法例如微粒轰击、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等转化植物所必需的。

植物转化

本发明的方法涉及将核苷酸构建体引入植物内。“引入”意指以使得该构建体进入植物细胞内部的方式将核苷酸构建体呈递给植物。本发明的方法不要求使用用于将核苷酸构建体引入植物的具体方法，只要求使该核苷酸构建体进入植物的至少一个细胞的内部。用于将核苷酸构建体引入植物内的方法是本领域已知的，包括但不限于，稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导的方法。

一般而言，植物转化法涉及将异源DNA转移到靶植物细胞(例如，未成熟或成熟的胚胎、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)中，随后应用最大阈值水平的合适选择(取决于选择标记基因，在这种情况下为“草甘膦”)，以从未转化的细胞群体中回收经转化的植物细胞。通常将外植体转移到新鲜供应的相同培养基中并进行常规培养。随后，在置于补充有最大阈值水平的选择试剂(例如，“草甘膦”)的再生培养基上后，使经转化的细胞分化成幼芽。然后将幼芽转移至选择性生根培养基中以用于回收生根的幼芽或小植物。然后，转基因小植物生长为成熟植物并产生能育的种子(例如，Hiei等人(1994)The Plant Journal 6：271-282；Ishida等人(1996)NatureBiotechnology 14：745-750)。通常将外植体转移到新鲜供应的相同培养基中并进行常规培养。用于产生转基因植物的技术和方法的概括性描述可以在Ayres和Park(1994)Critical Reviews in PlantScience 13：219-239以及Bommineni和Jauhar(1997)Maydica 42：107-120中找到。因为经转化的材料包含许多细胞；所以经转化的和未转化的细胞存在于受试靶愈伤组织或组织或细胞群的任何部分中。杀死未转化的细胞并允许经转化的细胞增殖的能力导致产生经转化的植物培养物。通常，去除未转化的细胞的能力是快速回收经转化的植物细胞和成功产生转基因植物的限制条件。然后，分子和生物化学法可以用于证实转基因植物的基因组中存在整合的异源目的基因。

转基因植物的产生可以通过几种方法之一来进行，包括但不限于，通过土壤杆菌将异源DNA引入植物细胞内(土壤杆菌介导的转化)，用与粒子附着的异源外源DNA轰击植物细胞，和用于转移DNA的各种其他非粒子直接介导的方法(例如，Hiei等人(1994)The PlantJournal 6：271-282；Ishida等人(1996)Nature Biotechnology 14：745-750；Ayres和Park(1994)Critical Reviews in Plant Science13：219-239；Bommineni和Jauhar(1997)Maydica 42：107-120)。

用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见，例如，Svab等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12：601-606。该方法依赖于包含选择标记的DNA的基因枪递送并通过同源重组将该DNA靶向质体基因组。此外，质体转化可以通过核编码且质体指导的RNA聚合酶的组织偏爱的表达，经由沉默的质体携带的转基因的反式激活来完成。此类***已在McBride等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7301-7305中得到报道。

已转化的细胞可以依照常规方法生长为植物。参见，例如，McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5：81-84。然后，可以让这些植物进行生长，并用相同的转化株或不同株进行授粉，并且鉴定出具有所需表型特征的组成型表达的所得到的杂种。可以生长两代或更多代以确保所需表型特征的表达被稳定地维持和遗传，并随后收获种子以确保已获得了所需表型特征的表达。以这种方式，本发明提供了经转化的种子(也称为“转基因种子”)，其具有本发明的核苷酸构建体，例如稳定地整合入其基因组内的本发明的表达盒。

植物

本发明可以用于转化任何植物种类，包括但不限于，单子叶植物和双子叶植物。目的植物的例子包括但不限于，玉米(玉蜀黍)、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒属植物、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油籽油菜、芸苔属物种(Brassicasp.)、苜蓿、黑麦、粟、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘类树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳洲坚果、杏树、燕麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。

蔬菜包括但不限于，番茄、莴苣、青豆、利马豆、豌豆，以及甜瓜属(Cucumis)的成员，例如黄瓜、罗马甜瓜和香瓜。观赏植物包括但不限于，杜鹃花、绣球、木槿、玫瑰花、郁金香、水仙花、矮牵牛、康乃馨、一品红和菊花。优选地，本发明的植物是农作物植物(例如，玉蜀黍、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒属植物、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油籽油菜等)。

本发明特别适合于单子叶植物家族的任何成员，包括但不限于，玉蜀黍、稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、黑麦、甘蔗、菠萝、薯蓣、洋葱、香蕉、椰子和枣椰子。

植物转化的评估

在将异源外源DNA引入植物细胞内后，通过各种方法来证实异源基因已转化或整合入植物基因组中，所述方法例如为分析与整合的基因相关的核酸、蛋白质和代谢产物。

PCR分析是在移植到土壤中之前的较早阶段时就整合的基因的存在来筛选转化的细胞、组织或幼芽的快速方法(Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。PCR使用对目的基因或土壤杆菌载体背景等特异的寡核苷酸引物来进行。

可以通过基因组DNA的Southern印迹分析来证实植物转化(Sambrook和Russell，2001，同上)。一般而言，从转化体中提取总DNA，用合适的限制酶消化，在琼脂糖凝胶中进行分级，并转移至硝酸纤维素或尼龙膜上。随后，用例如放射标记的³²P靶DNA片段来探测膜或“印迹”，以根据标准技术(Sambrook和Russell，2001，同上)来证实引入的基因整合到植物基因组中。

在Northern分析中，从转化体的特定组织中分离RNA，在甲醛琼脂糖凝胶中进行分级，并根据本领域常规使用的标准操作程序印迹到尼龙滤纸上(Sambrook和Russell，2001，同上)。随后，通过采用本领域已知的方法将滤纸与衍生自本发明的多核苷酸的放射性探针杂交来测试由grg25、grg26、grg27、grg28、grg29、grg30、grg31、syngrg25、syngrg26、syngrg27、syngrg28、syngrg29、syngrg30和syngrg31编码的RNA的表达(Sambrook和Russell，2001，同上)。

可以对转基因植物进行Western印迹法和生物化学测定法等，以通过标准操作程序来确定由除草剂抗性基因编码的蛋白质的存在(Sambrook和Russell，2001，同上)，其中使用与除草剂抗性蛋白质上存在的一种或多种表位结合的抗体。

用于增加植物产量的方法

提供了用于增加植物产量的方法。所述方法包括将包含本文公开的grg序列的多核苷酸引入植物或植物细胞中。如本文所定义的，植物的“产量”指由植物产生的生物量的品质和/或数量。“生物量”意指任何经测量的植物产物。生物量产生方面的增加是在所测量的植物产物的产量方面的任何改善。增加植物产量具有几种商业应用。例如，增加植物叶生物量可以增加用于人或动物消费的叶菜的产量。此外，增加叶生物量可以用于增加植物衍生的药物或工业产物的生产。产量的增加可以包括任何统计学上显著的增加，包括但不限于，至少1％的增加，至少3％的增加，至少5％的增加，至少10％的增加，至少20％的增加，至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更大的增加。

在具体方法中，植物用有效浓度的除草剂进行处理，其中除草剂施用导致提高的植物产量。“有效浓度”意指允许植物中产量增加的浓度。对于目的除草剂而言此类有效浓度一般是本领域已知的。可以依照用于除草剂施用的常用技术，在苗前或苗后将除草剂施用至包含农作物的田地，所述农作物已通过本发明的grg基因的异源表达而变得对于所述除草剂具有抗性。

还提供了用于在植物或植物部分中赋予除草剂抗性的方法。在这样的方法中，将本文公开的grg多核苷酸引入植物中，其中所述多核苷酸的表达导致草甘膦耐受性或抗性。经由这种方法产生的植物可以用有效浓度的除草剂进行处理，并且对于所述除草剂展示出增加的耐受性。在本申请中，除草剂的“有效浓度”是足以减缓或终止植物或植物部分生长的量，所述植物或植物部分对于所述除草剂不是天然具有抗性的或者未被赋予对于所述除草剂的抗性。

在另一个实施方案中，提供了用于在植物或植物部分中赋予除草剂抗性的方法，其中如上所述，所述植物或植物部分在高于或低于外界环境温度下生长。在更高或更低温度下具有热稳定性的或在更高或更低温度下具有最适温度的、耐受草甘膦的EPSP合酶可用于在此类条件下生长的植物中赋予草甘膦耐受性。

用于控制田地中的杂草的方法

还提供了用于在包含植物的田地中选择性地控制杂草的方法。在一个实施方案中，植物种子或植物由于本文公开的grg多核苷酸***植物种子或植物中而是草甘膦抗性的。在具体方法中，植物用有效浓度的除草剂进行处理，其中除草剂的施用导致杂草或其他未转化的植物的选择性控制。“有效浓度”意指这样的浓度，其控制杂草或其他未转化的植物的生长或散布而不显著影响草甘膦抗性植物或植物种子。关于目的除草剂的此类有效浓度一般是本领域已知的。可以依照用于除草剂施用的常规技术，在种子芽前或芽后将除草剂施用于包含植物或植物种子的田地，所述植物或植物种子已被赋予了对除草剂的抗性。

提供了下述实施例，这是为了举例说明而不是为了限制。

实验

实施例1.ATX8909的分离

通过将土壤样品铺板在包含草甘膦作为唯一磷源的HEPES矿物盐培养基(HMSM)上来分离ATX8909。因为HMSM不包含芳香族氨基酸，所以菌株必须对草甘膦具有抗性以便在这种培养基上生长。

将2克土壤重悬浮于约10ml水中，涡旋振荡15秒，并允许其沉降15分钟。将10μl菌环量的这种悬浮液加入至补充有10mM草甘膦的3ml HMSM(pH 7.0)中。HMSM包含(每升)：10g葡萄糖、2gNH₄SO₄、9.53g HEPES、1.0ml 0.8M MgSO₄、1.0ml 0.1M CaCl₂、1.0ml痕量元素溶液(在100ml的1000x溶液中：0.1g FeSO₄·7H₂O、0.5mg CuSO₄·5H₂O、1.0mg H₃BO₃、1.0mg MnSO₄·5H₂O、7.0mg ZnSO₄·7H₂O、1.0mg MoO₃、4.0g KCl)。使该培养物在摇动培养箱中于28℃生长4天，然后将20μl用于接种包含10mM草甘膦作为唯一磷源的2.5ml新鲜HMSM。2天后，将20μl用于接种另外新鲜的2.5ml培养基。5天后，将20μl用于接种新鲜的2.5ml培养基。在充分生长后，通过将1μl环在包含HMSM琼脂(含有100mM草甘膦作为唯一磷源)的琼脂平板的表面上进行划线来将该培养物铺板在固体培养基上，并贮存于28℃。然后，将该培养物再次铺板以用于分离。由于其在高草甘膦浓度存在下生长的能力而选择出命名为ATX8909的一种特别的菌株。

如上所述分离出菌株ATX1367、ATX1394、ATX21307、ATX21310、ATX21315和ATX21318，并且发现它们在包含直至300mM草甘膦的液体基本培养基中生长。采用本领域已知的方法通过16S rDNA测序或脂肪酸含量来测试所述菌株中的每一种，以对该菌株进行鉴定。菌株鉴定显示在表1中：

表1

 

菌株名称	菌株ID	EPSP合酶基因名称
			ATX8909	Arthrobacter arilaiti	grg25
ATX21307	分枝节杆菌(Arthrobacter ramosus)	grg26
			ATX21310	Gram+(没有与MIDI数据库的匹配)	grg27
ATX21315	产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)	grg28
			ATX1367	饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)	grg29
ATX1394	饲料类芽孢杆菌	grg30
			ATX21318	多食/屎鞘氨醇杆菌(Sphingobacteriummultivorum/faecium)	grg31

实施例2.草甘膦抗性EPSP合酶的克隆

从在表1中所描述的菌株中提取基因组DNA，并且将所得到的DNA用限制酶Sau3A 1进行部分消化，从而产生大小约5千碱基的DNA片段。在琼脂糖凝胶上按大小选择这些DNA分子，纯化，并连接到用BamHI预消化的LAMBDA 

载体臂中。然后，将连接的臂包装到噬菌体颗粒中，并且如本领域已知的测定噬菌体滴度。通过本领域已知的方法来扩增所得到的文库，从而产生3 x 10⁷-3 x 10⁸PFU/mL的文库滴度。对于每个独立的文库，随后用来自经扩增的文库的噬菌体以及M13辅助噬菌体一起共转染大肠杆菌(XL1 Blue MRF’)，以允许将该文库大量切出为感染性环状ssDNA的形式，如本领域已知的(Short等人(1988)Nucleic Acids Research 16：7583-7600)。在共转染的细胞离心后，将包含噬菌体的上清液加热至65-70℃并持续15-20分钟，以使任何残留的λ噬菌体颗粒丧失能力。将所得到的ssDNA质粒文库的稀释物转染到感受态大肠杆菌XL-Blue MRF’(aroA)细胞(XL1Blue MRF’)的新鲜培养物中。将所得到的经转染的细胞铺板在包含卡那霉素、0.1mM IPTG和0mM、20mM或50mM的草甘膦的M63平板上。

用于转染的大肠杆菌XL-Blue MRF’(aroA)表达F-菌毛，并且还包含编码内源性大肠杆菌EPSP合酶的aroA基因的缺失。这种菌株在本文中也称为ΔaroA。这种ΔaroA菌株不能在缺乏芳香族氨基酸的基本培养基上进行生长，除非补充有功能性EPSP合酶。因为草甘膦是典型的、草甘膦敏感的EPSP合酶例如I型EPSP合酶的有效抑制剂，所以表达非草甘膦抗性的EPSP合酶的经转染的克隆能够在缺乏草甘膦的M63平板上生长，但不能在包含20mM或50mM草甘膦的M63上生长。为了在包含20mM或50mM草甘膦的M63平板上生长，细胞必须包含表达EPSP合酶的质粒，所述EPSP合酶(1)能够补偿这些细胞的ΔaroA突变，和(2)对于草甘膦具有抗性。因此，这种筛选方法允许鉴定包含草甘膦抗性EPSP合酶的克隆。

挑取在20mM或50mM草甘膦上生长的菌落，并且通过限制性消化来分析它们的质粒以鉴定具有共有的限制图谱的质粒。各质粒通过本领域已知的方法来进行测序，其中优选赋予了针对50mM草甘膦的抗性的质粒。

使用本领域已知且理解的这种方法，并有时关于每个文库对该方法进行修饰，对于表1的7种菌株中的每一种菌株鉴定了包含EPSP合酶基因的文库克隆。

实施例3.EPSP合酶的DNA和蛋白质序列

通过本领域众所周知的方法，对于表2中的克隆中的每一个测定了草甘膦抗性EPSP合酶的DNA序列。

grg25。grg25的DNA序列在本文中以SEQ ID NO：1提供。grg25的预测的翻译产物(GRG25)在本文中以SEQ ID NO：2提供。

grg26。grg26的DNA序列在本文中以SEQ ID NO：3提供。grg26的预测的翻译产物(GRG26)在本文中以SEQ ID NO：4提供。

grg27。grg27的DNA序列在本文中以SEQ ID NO：5提供。grg27的预测的翻译产物(GRG27)在本文中以SEQ ID NO：6提供。

grg28。grg28的DNA序列在本文中以SEQ ID NO：7提供。grg28的预测的翻译产物(GRG28)在本文中以SEQ ID NO：8提供。

grg29。grg29的DNA序列在本文中以SEQ ID NO：9提供。grg29的预测的翻译产物(GRG29)在本文中以SEQ ID NO：10提供。

grg30。grg30的DNA序列在本文中以SEQ ID NO：11提供。grg30的预测的翻译产物(GRG30)在本文中以SEQ ID NO：12提供。

grg31。grg31的DNA序列在本文中以SEQ ID NO：13提供。grg31的预测的翻译产物(GRG31)在本文中以SEQ ID NO：14提供。

syngrg31。syngrg31的合成DNA序列在本文中以SEQ ID NO：28提供。syngrg1的预测的翻译产物与grg31的预测的翻译产物相同，并在本文中以SEQ ID NO：14提供。

syngrg25。syngrg25的合成DNA序列在本文中以SEQ ID NO：29提供。syngrg1的预测的翻译产物与grg25的预测的翻译产物相同，并在本文中以SEQ ID NO：2提供。

syngrg26。syngrg26的合成DNA序列在本文中以SEQ ID NO：30提供。syngrg1的预测的翻译产物与grg26的预测的翻译产物相同，并在本文中以SEQ ID NO：4提供。

syngrg27。syngrg27的合成DNA序列在本文中以SEQ ID NO：31提供。syngrg1的预测的翻译产物与grg27的预测的翻译产物相同，并在本文中以SEQ ID NO：6提供。

syngrg28。syngrg28的合成DNA序列在本文中以SEQ ID NO：32提供。syngrg1的预测的翻译产物与grg28的预测的翻译产物相同，并在本文中以SEQ ID NO：8提供。

syngrg29。syngrg29的合成DNA序列在本文中以SEQ ID NO：33提供。syngrg1的预测的翻译产物与grg29的预测的翻译产物相同，并在本文中以SEQ ID NO：10提供。

syngrg30。syngrg30的合成DNA序列在本文中以SEQ ID NO：34提供。syngrg1的预测的翻译产物与grg30的预测的翻译产物相同，并在本文中以SEQ ID NO：12提供。

包含grg25、grg26、grg27、grg28、grg29、grg30和grg31EPSP合酶基因中的每一个的克隆保藏于NRRL，并且分配有表2中的保藏号。

表2.包含草甘膦抗性EPSP合酶的克隆

 

EPSPS	产生EPSPS的菌株	在pBKCMV中的原始分离物	NRRL编号
				GRG25	ATX8909	pAX1932	NRRL B-30911
GRG26	ATX21307	pAX1933	NRRL B-30912
				GRG27	ATX21310	pAX1934	NRRL B-30913
GRG28	ATX21315	pAX1935	NRRL B-30914N
				GRG31	ATX21318	pAX1936	NRRL B-30915
GRG30	ATX1394	pAX1937	NRRL B-30916N
				GRG29	ATX1367	pAX1938	NRRL B-30917N

蛋白质GRG25-GRG31中的每一种通过BLAST搜索而显示出与NCBI数据库中的EPSP合酶的同源性。与每种GRG酶具有最高蛋白质序列同一性的EPSPS酶在下表中列出。

表3.GRG25-GRG31与已知EPSP合酶的同源性

 

蛋白质                   具有同源的EPSPS酶的菌株                 ％同一性

GRG25               皮诺卡氏菌(Nocardiafarcinica)                  50.5GRG26               节杆菌属物种(Arthrobacter sp.)FB24             82.9GRG27               节杆菌属物种FB24                               78GRG28               节杆菌属物种FB24                               81.4GRG29               嗜热共生小杆菌(Symbiobacterium thermophilum)  51.6GRG30               嗜热共生小杆菌                                 51.3GRG31               脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)              43.3

实施例4.将新型草甘膦抗性EPSP合酶克隆到大肠杆菌表达载体中

将包含在表2的克隆中的EPSP合酶基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pRSF1b(Invitrogen)中。所得到的克隆通过DNA测序来证实，并用于诱导每种EPSP合酶在大肠杆菌中的表达。然后，如本领域已知的，纯化表达的具有His标签的蛋白质。

实施例5.EPSP合酶的草甘膦抗性

将pRSF1b克隆铺板在包含抗生素和0mM或50mM草甘膦的M63+平板上。于37℃生长2天后对生长进行评分。观察到所有这7种EPSP合酶在大肠杆菌细胞中赋予针对50mM草甘膦的抗性(表4)。

表4.草甘膦筛选

 

EPSPS	在pRSF1B中的克隆	在50mM草甘膦上的生长
			载体	-	-
GRG25	pAX1939	+++
			GRG26	pAX1940	+++
GRG27	pAX1941	+++
			GRG28	pAX1942	+++
GRG30	pAX1944	+++
			GRG29	pAX1943	+++
GRG31	pAX1945	+++

实施例6.GRG31酶促活性的最适温度

构建将GRG31的表达置于病毒T7启动子的控制下的载体(pAX3535)，并将其用于转化具有在3′处紧邻乳糖诱导型启动子的病毒T7基因的大肠杆菌菌株。在IPTG诱导后，通过标准方法将GRG31蛋白质纯化至同质。为了测量酶促活性，将纯化的GRG31酶在包含HEPES(50mM，pH 7)和50mM KCl的缓冲液中稀释至合适的测定法浓度，并随后于10、20、30、40、50或60℃温育15分钟。在温育后，将酶加热至90℃ 1分钟以使酶变性，然后冷却至4℃。然后，将由每次反应产生的磷酸加入至第二个测定法中，所述第二个测定法包含肌苷、嘌呤核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶、辣根过氧化物酶和荧光底物

 Red(于2005年12月1日提交的美国专利申请号60/741,166)。在室温下温育15分钟后，使用Gemini XPS分光荧光计(Molecular Devices Corporation，Sunnyvale，CA)来定量荧光产物。测量EPSP合酶产物的形成，并在表5中表示为最大活性的百分比。

表5.GRG31的最适温度

 

温度，℃	最大活性的百分比
		10	42％
20	62％
		30	69％
40	80％
		50	100％
60	96％
		70	67％
80	36％

实施例7.GRG31酶促活性的热稳定性

构建将GRG31的表达置于病毒T7启动子的控制下的载体(pAX3535)，并将其用于转化具有在3′处紧邻乳糖诱导型启动子的病毒T7基因的大肠杆菌菌株。在IPTG诱导后，通过标准方法将GRG31蛋白质纯化至同质。为了测量酶促活性，将纯化的GRG31酶在包含HEPES(50mM，pH 7)和50mM KCl的缓冲液中稀释至合适的测定法浓度，并随后于37℃温育0、2、6或22小时。并排地将对照样品于4℃进行温育。在每个时间点上，从每个样品中取出等分试样，并在50μl的最终体积中进行酶促测定法，所述最终体积包含0.5mM莽草酸-3-磷酸、200uM磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、1U/ml黄嘌呤氧化酶、2U/ml核苷磷酸化酶、2.25mM肌苷、1U/ml辣根过氧化物酶、2mM草甘膦、50mM HEPES/KOH pH7.0、100mM KCl和 Red(Invitrogen)(根据制造商的说明书)。通过添加莽草酸-3-磷酸来开始测定法。使用Spectramax Gemini XPS荧光分光计(Molecular Dynamics，激发：555nm；发射：590nm)来测量EPSP合酶活性。将EPSP合酶热稳定性计算为，相对于在并排地于4℃进行温育的对照样品中的酶促活性而言，于37℃在每个时间点上的酶促活性的百分比(表6)。

表6.GRG31的热稳定性

 

时间，小时	对照的百分比
		0	100％
2	86％
		6	68％
22	29％

实施例8.改造grg25、grg26、grg27、grg28、grg29、grg30、grg31 以及syngrg25、syngrg26、syngrg27、syngrg28、syngrg29、syngrg30 和syngrg31以用于植物转化

通过PCR从全长cDNA模板扩增关于每一种所述grg基因的开放读码框(ORF)。在PCR过程中给ORF的每个末端添加Hind III限制位点。此外，紧挨该基因的起始密码子的5′处添加核苷酸序列ACC，以增加翻译效率(Kozak(1987)Nucleic Acids Research 15：8125-8148；Joshi(1987)Nucleic Acids Research 15：6643-6653)。使用本领域众所周知的技术来克隆PCR产物并进行测序，以确保在PCR期间没有引入突变。用例如Hind III来消化包含grg PCR产物的质粒，并分离包含完整ORF的片段。

可以产生类似构建体，其包含通过本领域已知的方法与本发明的多核苷酸连接的叶绿体靶向序列。

将包含EPSP合酶(并包含或不包含叶绿体靶向序列)的DNA片段克隆到质粒中，例如在pAX200的Hind III位点处。pAX200是包含稻肌动蛋白启动子(McElroy等人(1991)Molec.Gen.Genet.231：150-160)和PinII终止子(An等人(1989)The Plant Cell1：115-122)的植物表达载体。将来自这种中间质粒的启动子-基因-终止子片段(或启动子-前导序列-基因-终止子片段)亚克隆到质粒例如pSBll(JapanTobacco，Inc.)中，以形成在本文中例如称为pSB11GRG25的最终质粒。如此地组织pSB11GRG25，即使得包含例如启动子-grg25-终止子构建体(或启动子-前导序列-grg25-终止子构建体)的DNA片段可以通过合适的限制酶而切出，并且还用于通过气溶胶束注射(aerosolbeam injection)转化到植物中。通过限制性消化和凝胶电泳，以及通过在横跨各个克隆接头处进行测序来验证pSB11GRG25的结构。相同方法可用于对于本文描述的每一种grg基因产生最终质粒。

通过使用本领域众所周知的三亲株交配操作程序并且在包含抗生素的培养基上铺板，来使该质粒移动到根瘤土壤杆菌菌株LBA4404内，所述菌株LBA4404还具有质粒pSB1(Japan Tobacco，Inc.)。质粒pSB11GRG25携带壮观霉素抗性但却是窄宿主范围质粒，并且在土壤杆菌中不能复制。当pSB11GRG25通过同源重组而整合到广宿主范围质粒pSB1中时，产生抗生素抗性菌落。所得到的共整合产物通过Southern杂交来进行验证。具有共整合物的土壤杆菌菌株可以用于通过PureIntro方法(Japan Tobacco)来转化玉蜀黍。

实施例9.将grg25、grg26、grg27、grg28、grg29、grg30、grg31、 syngrg25、syngrg26、syngrg27、syngrg28、syngrg29、syngrg30和 syngrg31转化到植物细胞中

最佳地在授粉后8-12天收集玉蜀黍穗。从穗中分离胚胎，并且大小0.8-1.5mm的那些胚胎优选用于转化。将胚胎以盾盖侧向上的方式放置在合适的温育培养基上，例如DN62A5S培养基(3.98g/L N6盐；1mL/L(的1000x母液)N6维生素；800mg/L L-天冬酰胺；100mg/L肌醇；1.4g/L L-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(的1mg/mL母液)2，4-D)。然而，除DN62A5S外的培养基和盐也是合适的并且是本领域已知的。将胚胎在黑暗中于25℃温育过夜。但是，本身无需将胚胎温育过夜。

将所得到的外植体转移至网眼方阵(30-40个/平板)，转移至渗透培养基上并保持大约30-45分钟，随后转移至束射平板(beamingplate)(参见，例如，PCT公开号WO/0138514和美国专利号5,240,842)。

使用气溶胶束加速器，将被设计为在植物细胞中表达本发明的GRG蛋白的DNA构建体加速进入植物组织中，其中使用基本上如PCT公开号WO/0138514中描述的条件。在束射(beaming)后，将胚胎在渗透培养基上温育约30分钟，并置于温育培养基上于25℃在黑暗中过夜。为了避免不适当地破坏经束射的外植体，在转移至恢复培养基前使它们温育至少24小时。然后，胚胎在恢复期培养基上于25℃在黑暗中扩散约5天，随后转移至选择培养基。取决于所利用的特定选择的性质和特征，使外植体在选择培养基中温育高达8周。在选择期后，将所得到的愈伤组织转移至胚胎成熟培养基，直至观察到成熟的体细胞胚的形成。然后，将所得到的成熟的体细胞胚置于低光照下，并且通过本领域已知的方法起始再生过程。允许所得到的幼芽在生根培养基上生根，并且将所得到的植物转移至苗盆(nursery pot)中并繁殖成转基因植物。

材料

表7.DN62A5S培养基

 

组分	每升	来源
			Chu’s N6基本盐混合物(Prod.No.C 416)	3.98g/L	Phytotechnology Labs

 

Chu’s N6维生素溶液(Prod.No.C 149)	1mL/L(的1000x母液)	Phytotechnology Labs
			L-天冬酰胺	800mg/L	Phytotechnology Labs
肌醇	100mg/L	Sigma
			L-脯氨酸	1.4g/L	Phytotechnology Labs
酪蛋白氨基酸	100mg/L	Fisher Scientific
			蔗糖	50g/L	Phytotechnology Labs
2，4-D(Prod.No.D-7299)	1mL/L(的1mg/mL母液)	Sigma

用1N KOH/1N KCl将该溶液的pH调整至pH5.8，以直至3g/L的浓度添加Gelrite(Sigma)，并将该培养基进行高压灭菌。在冷却至50℃后，添加2ml/L的5mg/ml硝酸银母液(PhytotechnologyLabs)。

实施例10.通过土壤杆菌介导的转化将grg25、grg26、grg27、grg28、 grg29、grg30、grg31、syngrg25、syngrg26、syngrg27、syngrg2g、 syngrg29或syngrg31转化到玉蜀黍植物细胞中

最佳地在授粉后8-12天收集穗。从穗中分离胚胎，并且大小0.8-1.5mm的那些胚胎优选用于转化。将胚胎以盾盖侧向上的方式放置在合适的温育培养基上，并在黑暗中于25℃温育过夜。然而，本身无需将胚胎温育过夜。使胚胎与包含合适载体(用于Ti质粒介导的转移)的土壤杆菌菌株接触约5-10分钟，并随后铺板在共培养培养基上约3天(25℃，在黑暗中)。在共培养后，将外植体转移至恢复期培养基约5天(于25℃，在黑暗中)。取决于所利用的特定选择的性质和特征，使外植体在选择培养基中温育高达8周。在选择期后，将所得到的愈伤组织转移至胚胎成熟培养基，直至观察到成熟的体细胞胚的形成。然后，将所得到的成熟的体细胞胚置于低光照下，并且如本领域已知的来起始再生过程。允许所得到的幼芽在生根培养基上生根，并且将所得到的植物转移至苗盆中并繁殖成转基因植物。

说明书中提及的所有出版物和专利申请表明本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请通过提及而合并入本文，其程度就好像具体且独个地指出每一独个出版物或专利申请通过提及而合并。

尽管为了清楚地理解，已通过举例说明和实施例相当详细地描述了上述发明，但显而易见的是，可以在所附权利要求书的范围内施行某些变化和修饰。

序列表

<110>Athenix Corporation

     Brian Vande Berg

     Cheryl Peters

     Brian Carr

     Daniel John Tomso

<120>赋予除草剂抗性的新型EPSP合酶基因

<130>45600/329201

<150>60/812,360

<151>2006-06-09

<160>38

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>1404

<212>DNA

<213>Arthrobacter arilaiti

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1404)

<400>1

<210>2

<211>467

<212>PRT

<213>Arthrobacter arilaiti

<400>2

<210>3

<211>1395

<212>DNA

<213>分枝节杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1395)

<400>3

<210>4

<211>464

<212>PRT

<213>分枝节杆菌

<400>4

<210>5

<211>1368

<212>DNA

<213>***

<220>

<221>misc_feature

<222>(0)...(0)

<223>Gram+细菌-菌株未知

<221>CDS

<222>(1)...(1368)

<400>5

<210>6

<211>455

<212>PRT

<213>***

<400>6

<210>7

<211>1386

<212>DNA

<213>产脲节杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1386)

<400>7

<210>8

<211>461

<212>PRT

<213>产脲节杆菌

<400>8

<210>9

<211>1296

<212>DNA

<213>饲料类芽孢杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1296)

<400>9

<210>10

<211>431

<212>PRT

<213>饲料类芽孢杆菌

<400>10

<210>11

<211>1296

<212>DNA

<213>饲料类芽孢杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1296)

<400>11

<210>12

<211>431

<212>PRT

<213>饲料类芽孢杆菌

<400>12

<210>13

<211>1251

<212>DNA

<213>多食/屎鞘氨醇杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1251)

<400>13

<210>14

<211>416

<212>PRT

<213>多食/屎鞘氨醇杆菌

<400>14

<210>15

<211>431

<212>PRT

<213>肠杆菌科物种(Enterobacteriaceae sp.)

<400>15

<210>16

<211>418

<212>PRT

<213>丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)菌株1448a

<400>16

<210>17

<211>418

<212>PRT

<213>丁香假单胞菌菌株DC3000

<400>17

<210>18

<211>418

<212>PRT

<213>丁香假单胞菌菌株B728

<400>18

<210>19

<211>419

<212>PRT

<213>泡囊短波单胞菌(Brevundomonas vesicularis)

<400>19

<210>20

<211>425

<212>PRT

<213>根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株C58

<400>20

<210>21

<211>428

<212>PRT

<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

<400>21

<210>22

<211>444

<212>PRT

<213>苍白杆菌属(Ochrobactrum)/布鲁氏菌属(Brucella)

<400>22

<210>23

<211>425

<212>PRT

<213>根瘤土壤杆菌菌株C58

<400>23

<210>24

<211>414

<212>PRT

<213>硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)

<400>24

<210>25

<211>424

<212>PRT

<213>具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)

<400>25

<210>26

<211>428

<212>PRT

<213>坎氏甲烷嗜热菌(Methanopyrus kandleri)

<400>26

<210>27

<211>436

<212>PRT

<213>球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)

<400>27

<210>28

<211>1251

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码GRG31的合成序列(syngrg31)

<400>28

<210>29

<211>1401

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码GRG25的合成序列(syngrg25)

<400>29

<210>30

<211>1392

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码GRG26的合成序列(syngrg26)

<400>30

<210>31

<211>1365

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码GRG27的合成序列(syngrg27)

<400>31

<210>32

<211>1383

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码GRG28的合成序列(syngrg28)

<400>32

<210>33

<211>1293

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码GRG29的合成序列(syngrg29)

<400>33

<210>34

<211>1293

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码GRG30的合成序列(syngrg30)

<400>34

<210>35

<211>431

<212>PRT

<213>肠杆菌科

<400>35

<210>36

<211>414

<212>PRT

<213>硫磺矿硫化叶菌

<400>36

<210>37

<211>409

<212>PRT

<213>恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)

<400>37

<210>38

<211>419

<212>PRT

<213>泡囊短波单胞菌

<400>38

Claims (31)

1.分离的核酸分子，其包含选自下列的核苷酸序列：

a)SEQ ID NO：13、1、3、5、7、9、11、28、29、30、31、32、33或34的核苷酸序列，或其互补物；

b)与SEQ ID NO：13、1、3、5、7、9、11、28、29、30、31、32、33或34的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，或其互补物；

c)以登记号NRRL B-30915、NRRL B-30911、NRRL B-30912、NRRLB-30913、NRRL B-30914N、NRRL B-30916N或NRRL B-30917N进行保藏的质粒的DNA***片段的除草剂抗性核苷酸序列，或其互补物；

d)编码包含SEQ ID NO：14、2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和

e)编码与SEQ ID NO：14、2、4、6、8、10或12的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列。

2.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述核苷酸序列是被设计用于在植物中表达的合成序列。

3.载体，其包含权利要求1的核酸分子。

4.权利要求3的载体，其进一步包含编码异源多肽的核酸分子。

5.宿主细胞，其包含权利要求3的载体。

6.权利要求5的宿主细胞，其是细菌宿主细胞。

7.权利要求5的宿主细胞，其是植物细胞。

8.转基因植物，其包含权利要求7的宿主细胞。

9.权利要求8的植物，其中所述植物选自玉蜀黍、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒属植物、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油籽油菜。

10.权利要求8的植物的经转化的种子。

11.分离的多肽，其选自：

a)包含SEQ ID NO：14、2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的多肽；

b)由SEQ ID NO：13、1、3、5、7、9、11、28、29、30、31、32、33或34的核苷酸序列编码的多肽；

c)包含与SEQ ID NO：14、2、4、6、8、10或12的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽具有除草剂抗性活性；

d)由与SEQ ID NO：13、1、3、5、7、9、11、28、29、30、31、32、33或34的核苷酸序列至少90％同一的核苷酸序列编码的多肽，其中所述多肽具有除草剂抗性活性；和

e)由以登记号NRRL B-30915、NRRL B-30911、NRRL B-30912、NRRL B-30913、NRRL B-30914 N、NRRL B-30916 N或NRRL B-30917 N进行保藏的质粒的DNA***片段的除草剂抗性核苷酸序列编码的多肽。

12.权利要求11的多肽，其进一步包含异源氨基酸序列。

13.用于产生具有除草剂抗性活性的多肽的方法，其包括在其中表达编码所述多肽的核酸分子的条件下培养权利要求5的宿主细胞，所述多肽选自：

a)包含SEQ ID NO：14、2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的多肽；

b)由SEQ ID NO：13、1、3、5、7、9、11、28、29、30、31、32、33或34的核酸序列编码的多肽；

c)包含与具有SEQ ID NO：14、2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的多肽具有至少90％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽具有除草剂抗性活性；

d)由包含与SEQ ID NO：13、1、3、5、7、9、11、28、29、30、31、32、33或34的核酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子编码的多肽，其中所述多肽具有除草剂抗性活性；和

e)由以登记号NRRL B-30915、NRRL B-30911、NRRL B-30912、NRRL B-30913、NRRL B-30914 N、NRRL B-30916 N或NRRL B-30917 N进行保藏的质粒的DNA***片段的除草剂抗性核苷酸序列编码的多肽。

14.用于在植物中赋予对于除草剂的抗性的方法，所述方法包括用DNA构建体转化所述植物，并再生出经转化的植物，所述构建体包含与核苷酸序列可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子，所述核苷酸序列选自：

a)SEQ ID NO：13、1、3、5、7、9、11、28、29、30、31、32、33或34的核苷酸序列，或其互补物；

b)与SEQ ID NO：13、1、3、5、7、9、11、28、29、30、31、32、33或34的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，或其互补物，其中所述核苷酸序列编码具有除草剂抗性活性的多肽；

c)以登记号NRRL B-30915、NRRL B-30911、NRRL B-30912、NRRLB-30913、NRRL B-30914 N、NRRL B-30916 N或NRRL B-30917 N进行保藏的质粒的DNA***片段的除草剂抗性核苷酸序列，或其互补物；

d)编码包含SEQ ID NO：14、2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；和

e)编码与SEQ ID NO：14、2、4、6、8、10或12的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有除草剂抗性活性。

15.权利要求14的方法，其中所述植物产生具有除草剂抗性活性的多肽。

16.权利要求14的方法，其中所述除草剂是草甘膦。

17.具有稳定整合到其基因组内的DNA构建体的植物，所述DNA构建体包含编码具有除草剂抗性活性的蛋白质的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列选自：

a)SEQ ID NO：13、1、3、5、7、9、11、28、29、30、31、32、33或34的核苷酸序列；

b)与SEQ ID NO：13、1、3、5、7、9、11、28、29、30、31、32、33或34的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码具有除草剂抗性活性的多肽；

c)编码包含SEQ ID NO：14、2、4、6、8、10或12的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；

d)编码与SEQ ID NO：14、2、4、6、8、10或12的氨基酸序列具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有除草剂抗性活性；和

e)以登记号NRRL B-30915、NRRL B-30911、NRRL B-30912、NRRLB-30913、NRRL B-30914 N、NRRL B-30916 N或NRRL B-30917 N进行保藏的质粒的DNA***片段的除草剂抗性核苷酸序列；

其中，所述核苷酸序列与在植物细胞中驱动编码序列表达的启动子可操作地连接。

18.权利要求17的植物，其中所述植物是植物细胞。

19.用于产生亲本grg25、grg26、grg27、grg28、grg29、grg30、grg31、syngrg25、syngrg26、syngrg27、syngrg28、syngrg29、syngrg30或syngrg31多核苷酸的多核苷酸变体的方法，其包括在致重组操作程序中使用SEQ ID NO：13、1、3、5、7、9、11、28、29、30、31、32、33或34的核苷酸序列或其片段，并就目的活性来测试由所得到的多核苷酸序列编码的多肽。

20.权利要求19的方法，其中所述目的活性是草甘膦抗性活性。

21.权利要求20的方法，其中由所得到的多核苷酸序列编码的所述多肽具有比由所述亲本多核苷酸编码的多肽更大的草甘膦抗性活性。

22.权利要求19的方法，其中所述致重组操作程序是DNA改组。

23.用于在植物中增加活力或产量的方法，其包括：

a)将编码除了SEQ ID NO：35、36或37之外的其他草甘膦耐受性EPSP合酶的核苷酸序列引入所述植物中，所述草甘膦耐受性EPSP合酶具有高于外界环境温度的最适温度；

b)使所述植物与有效浓度的草甘膦接触；和

c)在这样的条件下使所述植物生长，即温度高于外界环境温度至少2个连续的小时/天，共在与所述草甘膦接触后至少4天，其中在接触后的所述天在所述植物的生长季节内，

其中所述植物的活力或产量比表达不具有高于外界环境温度的最适温度的草甘膦耐受性EPSP合酶的植物的活力或产量高。

24.权利要求23的方法，其中所述EPSP合酶不是植物来源的EPSP合酶。

25.权利要求23的方法，其中所述EPSP合酶具有约35℃-约55℃的最适温度，和步骤(c)中的温度为约35℃-约55℃。

26.权利要求23的方法，其中所述EPSP合酶为SEQ ID NO：14中所示，和步骤(b)中的温度为约45℃-约55℃。

27.用于在植物中赋予对于草甘膦的抗性的方法，其包括：

a)将编码除了SEQ ID NO：35、36或37之外的其他草甘膦耐受性EPSP合酶的核苷酸序列引入所述植物中，所述草甘膦耐受性EPSP合酶在高于外界环境温度的温度下是热稳定的；

b)使所述植物与有效浓度的草甘膦接触；和

c)在这样的条件下使所述植物生长，即温度高于外界环境温度至少2个连续的小时/天，共在与所述草甘膦接触后至少4天，其中在接触后的所述天在所述植物的生长季节内。

28.权利要求27的方法，其中所述EPSP合酶不是植物来源的EPSP合酶。

29.权利要求27的方法，其中所述EPSP合酶在约32℃-约60℃的温度下具有热稳定性，和步骤(b)中的温度为约32℃-约60℃。

30.权利要求29的方法，其中所述EPSP合酶在约35℃-约45℃的温度下具有热稳定性，和步骤(b)中的温度为约35℃-约45℃。

31.权利要求27的方法，其中所述EPSP合酶为SEQ ID NO：14中所示，和步骤(b)中的温度为约37℃。

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