发明概述
本发明涉及例如表征眼的生理状态的方法,包括检测玻璃体液中一种或多种多肽或其片段的存在与否;表征眼的生理状态的方法,包括检测玻璃体液中一种或多种生物标志物吸引物相关多肽或其片段的存在与否;表征活***的生理状态的方法,包括检测玻璃体液中一种或多种多肽或其片段的存在与否;监测个体中的酪氨酸激酶抑制剂或其它药物的功效的方法,所述个体已被给予所述抑制剂或药物,包括测量从个体提取的玻璃体液样品中的所述抑制剂情况下的磷酸化多肽或所述药物情况下的多肽的存在,其中所述个体已经被给予酪氨酸激酶抑制剂、药物,或生物的、化学的、蛋白、抗体或其它治疗剂。
玻璃体积极参与病理状况的发展并含有可能与特殊视网膜病理学相关的蛋白。这些蛋白已经被牵连在血管生成、经由增加的同渗容摩的机械牵引和衰老中。保留在玻璃体中的蛋白提供眼组织状态的记录。
玻璃体液含有能够与诸如糖尿病视网膜病的特殊视网膜病理学相关的蛋白。糖尿病视网膜病(DR)是工作成年人中视觉损失的最普遍诱因。大多数1型糖尿病患者和超过60%的2型糖尿病患者最终发展成视网膜血管异常。这些患者的20%至30%发展至活性增殖性糖尿病视网膜病(PDR)和/或糖尿病性黄斑水肿。视网膜血管通透性(RVP)上升是糖尿病性黄斑水肿的主要诱因和PDR中的特征性发现。虽然激光凝固法手术和玻璃体切除术在减少视觉损失中非常有效,但是这些疾病的早期诊断和预防性治疗仍是主要的未被满足的临床需要。接下来讨论玻璃体蛋白组发现和玻璃体诊断测试的别的疾病应用。
湿性年龄相关黄斑变性(AMD)是年龄超过55岁的人群中失明的主要原因。在发展成该疾病的湿性形式的人群中出现最严重的视觉损失。湿性AMD的治疗和早期检测正在以空前的速度发展。这些新药的研究已经清楚地表明,维持功能性视力的最好时机取决于从干性到湿性AMD的转变的最早期的治疗。此外,干性AMD在发展至湿性形式之前持续的时间通常变化很大(数十年的范围)。目前仅可通过主观测试和血管造影术获得粗略指标。亟需检测和预测AMD的进展的方法,所述方法能够用于增加已经使用的主观和成像指标。
关于调节引起湿性AMD患者中严重视觉退化的渗出性过程的生化信号,人们知之甚少。某些数据表明VEGF(血管内皮生长因子)参与这种过程,但几乎没有关于其它可能的因子的数据。在玻璃体、视网膜和脉络膜中阻断VEGF的新药已经能够减缓该疾病的进程,但需要开发永久终止疾病进程并最终逆转其一些效果的方法。理解湿性AMD中的视网膜蛋白组会为较大地改进这种致盲性病症的治疗制造机会。
视网膜静脉阻塞是位于糖尿病视网膜病和黄斑变性之后的视觉损失的主要原因。这些疾病的自然历史显著地变化。唯一的预测性参数是视网膜血管灌注的粗糙测量。需要确定视网膜损伤的严重性阶段并寻求会预测视觉后果的参数。这些参数会为治疗医师提供改进的指导。另外,在开发目前仅有有限的治疗选择的疾病的新治疗方法时,这些测试会至关重要。
黄斑囊样水肿(CMD)是一类引起视网膜损伤并在广泛多种的眼睛症状中发生的黄斑水肿。执业医师和制药公司有强烈的兴趣开发CME治疗。理解CME患者的眼内液蛋白组谱会提供预防和治疗的新机会。
尽管仅在美国每年就有数百万人患上白内障,但人们对控制白内障发展的因子知之甚少。我们最近的发现显示,在玻璃体腔中发现了被称为晶体蛋白(crystallin)的晶状体蛋白。还知道典型的老年型白内障在去除玻璃体的凝胶部分(玻璃体液)后的数月之内形成。跟踪玻璃体凝胶和去除凝胶后集聚的残留液的蛋白组可以导致能够预防白内障形成的新因子的鉴定。这已经以多种方式成为眼科学的圣杯。
需要工具去跟踪直接或间接递送的眼内药物的药物动力学和跟踪玻璃体和血清之间的眼/全身药物分配。因此会极大地促进药物开发和改进,从而向开发视网膜症状的药物的快速成长的工业提供重要价值。
本发明提供对于这样的问题有价值的技术和方法。
能够根据本发明的方法分析任何眼内或与眼相关的液,包括例如玻璃体液、房水、诸如存在于脉络膜中的血液的视网膜血液和眼泪,包括自泪囊提取的眼泪。液能够常规提取,例如通过外科玻璃体切除术。在某些病例中,眼内液中反映出的具体疾病的状态能够通过荧光、磁或放射性核苷显像来测量。
本发明提供眼内液样品的蛋白组指纹,所述眼内液样品包含存在于样品中的至少一种多肽或其它分子。多肽(也称为“生物标志物”)能够用任何适合的技术分离。例如,生物标志物能够收获自低分子量片段,其中生物标志物吸引物与多肽或其它生物分子(“生物标志物”)相关。生物标志物吸引物相关生物分子的分离方法在WO05036180中进行了描述,其整体在此引入作为参考。
术语“生物标志物吸引物分子”或“BAM”是指生物液中的生物标志物粘附的分子或其它物质。在特别的实施例中,生物标志物以低结合亲和性粘附到BAM上(例如,低于10-3、10-4、10-5、10-6、10-7或10-8L/mol-min的结合亲和性)。抗体可以是达到它结合生物标志物程度的BAM,所述结合不是通过由刺激其产生的免疫反应引起的特异的抗原抗体相互作用。例如,生物标志物与抗体BAM的结合可以在互补决定区(CDR)以外或在可变区以外发生,例如通过与抗体的Fc部分结合。然而,在公开方法的某些实施方案中,BAM不是抗体。尽管特别的BAM可以选择性结合一类生物标志物,但是特定类中的生物标志物的结合亲和性的差异不如抗原与特定抗体相对与其它非识别分子的结合亲和性的差异那样显著。生物标志物结合的特异性较小的性质可以在BAM的某些实例中解释,在所述实例中超过一种的生物标志物与BAM结合,例如至少2、至少5、至少10、至少20、或甚至50或更多种生物标志物与BAM结合。
通常,BAM在特别的生物液(例如身体中)中的存在半衰期大于变得粘附于BAM的生物标志物的半衰期,从而浓缩生物液中的生物标志物。例如,BAM的半衰期能够大于约1天,如大于2、5、10、20或50天。在特定的实例中,BAM的大小和/或形状使得它基本上不被肾从血液中滤除。在其它特定的实例中,BAM的分子量大于25kDa,例如大于30、50、75、100、150、200或300kDa。在另外其它特定的实例中,BAM分子的分子量落入特定的范围,例如30至50kDa、50至75kDa、75至100kDa、100至150kDa、150至200kDa、200至300kDa,或30至300kDa的任一其它范围。生物标志物可以吸附在BAM表面或被吸附至BAM内部,或两者都有。
BAM的实例包括蛋白(包括天然和工程化蛋白,诸如嵌合蛋白、具有修饰的氨基酸成分的蛋白、翻译后修饰的蛋白、核酸修饰的分子、糖类修饰的分子和有机聚合物)、树枝状聚合物和颗粒(如微粒和纳米颗粒,包括二氧化硅、金属、陶瓷和糖类微粒和纳米颗粒)和纤维素微粒(见例如Diamant et al,Eur J Clin Invest.34:392-401,2004)。
可以产生BAM或将其衍生化以在它们的表面或内部提供离子基团(如羧酸酯、质子化的胺、季铵和硫酸酯基团)、氢键受体或氢键供体、电子供体或电子受体、极性基团(如氨基、羟基、酯基、巯基、腈基)、疏水基团(如烷基、烯基和炔基或具有特定分配系数的基团)、肽、蛋白、核酸、糖类、脂质和其任一组合。BAM是诸如天然存在的蛋白的蛋白时,还可以将它称为“载体蛋白”以反映其在从生物液中收集并浓缩LMM生物标志物中的作用。载体蛋白的实例包括白蛋白、铁结合蛋白(如转铁蛋白)、纤维蛋白原、α-2-巨球蛋白、免疫球蛋白(如IgA、IgE和IgG)、补体、结合珠蛋白、脂蛋白、前白蛋白、α-1-酸糖蛋白、纤连蛋白和血浆铜蓝蛋白,及它们的片段、组合和化学衍生物。
蛋白组指纹可以包括少至一种多肽,或可以包括一种以上的多肽(即多种)。可以使用分析眼内液含量的任何方法。例如,能够不限于纯化的目的地使用存在于眼内液中的生物标志物吸引物(也称为生物标志物吸引物分子或“BAM”),所述生物标志物吸引物包括白蛋白、蛋白多糖、葡糖胺聚糖和类肝素硫酸酯。多肽能够作为完整蛋白或片段存在。这样的片段能够是天然存在的,或能够通过无意或有意的蛋白水解(例如使样品与蛋白水解酶或化学裂解剂接触)在样品加工期间产生。
已经从眼内液中分离出的生物标志物的实例如表2至表13所示。获得这些是通过在SDS-PAGE凝胶上跑眼内液样品,然后用胰蛋白酶消化从高蛋白分子量至低蛋白分子量的整个凝胶道,以及接着进行MS/MS分析。
根据本发明检测的多肽组可以描述为“指纹”,因为它们是存在于眼内液中的多肽的特殊模式。指纹的制备可以使用上述BAM技术或使用其它技术或纯化方法,例如无BAM富集步骤地表征存在于眼内液中的多肽(这样的多肽的代表性实例见表2至表13)。
正如用指纹一样,能够将该多肽组用作独特的鉴定子来表征液以及个体的生理状态。能够将该眼内液指纹视为成分(例如多肽)的快照,所述成分与身体中发生的生理过程有关,或者是该过程的产物。能够根据本发明表征的生理状态的实例不限制地包括疾病状态(例如癌症、视网膜病、糖尿病、黄斑变性、静脉阻塞病、白内障或本文提及的其它症状);治疗性状态(例如,用于监测药物功效和不利事件);器官功能(例如,用来监测正常的器官功能,如脑、肾和肝功能);毒理学状态(例如用来检测毒素或由毒素引起的微扰(perturbation))等。因此,能够将眼内液指纹用于多种医学、诊断和治疗的目的,包括例如检测形成白内障的风险(见下文);监测血-眼衰弱;检测年龄相关黄斑变性;检测激酶抑制剂或其它药物的功效等。
例如能够用含有抑制多肽降解的试剂的全孔玻璃体切除术套管或切割器将眼内液从患者中移出,然后分析该液中生物标志物的存在。能够将这样的生物标志物用于确定白内障风险(例如在晶体蛋白增加时)、血眼屏障的完整性;和其它视网膜疾病状态和疾病。这在有患眼睛疾病风险的患者中特别有用,所述患者例如患糖尿病的个体、老年个体或已经被鉴定为与眼睛症状相关的基因缺陷的携带者的个体。
能够被常规地分析以评价个体生理状态的其它可行的候选多肽包括与某些生理状态在病理学上相关的蛋白。例如,已知维生素A结合蛋白(RBP4)通过阻断胰岛素的作用而促进糖尿病的发展。这种蛋白的眼检测可以引起对个体中糖尿病的起始和/或进展的重要洞察。这些候选多肽的其它实例包括但不限于富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)。已知受伤后SPARC被上调,并调节细胞粘附和增殖,并通过释放KGHK肽刺激血管生成。SPARC结合VEGF,抑制其与细胞外表面的相互作用,而且还抑制下游效应器(例如ERK1/2)的激活和VEGF诱导的DNA合成。据认为,SPARC不仅调节血管生成,而且,此外,SPARC水平的调节似乎是在黄斑变性中控制血管生成的关键。可以用作疾病状态(例如癌症)的诊断性标志物的蛋白的第三实例包括检测Akt的磷酸化状态。Akt被生长因子或细胞因子以PI3K-依赖的方式激活,其全部激活需要通过PDK1(T308)和PDK2(S473)将两残基磷酸化。当前方法包括在正常个体和患者中检测Akt的一种或多种氨基酸残基的磷酸化状态,并将该状态与例如患者中癌症的进展相比较。还可以常规地分析其它癌症生物标志物,例如VEGFR、EGFR、Bcr-Ab1、Her2-Neu(erbB2)、TGFR等。
因此,除了眼睛症状,通常能够用眼内液来监测个体的健康和生理状态。眼内液与其它身体腔隙相联系,因而可用于监测眼外腔隙,包括脑、肾、肝等。由于在发育上眼是脑的延伸,因此眼内液的分子组成状态能够提供关于脑中的疾病的信息。至于更远端的器官,来自这些器官的分子可以通过循环进入眼内液,或者眼内液标志物可以反映影响远端器官的全身范围的过程。
本发明还涉及监测个体生理状态的方法,其包括:测定从个体提取的玻璃体液样品中翻译后修饰的多肽(例如磷酸化)的存在。在某些权利要求中,可以监测信号通路。信号通路包括身体中参与发生调节细胞活性(例如,表明受体占有、位点定向的蛋白-蛋白结合和触发基因表达中达到极点的酶反应级联)的化学事件(例如磷酸化)的任何通路。例如,在参与细胞生长、细胞死亡、基因表达和细胞对刺激物的反应的许多生物通路中,磷酸化是关键的翻译后修饰事件。另外,异常的磷酸化模式可能与疾病相关,所述疾病例如癌症和其它过度增生症状。
进一步的实例包括,例如,G-蛋白受体介导的通路,所述受体特别是酪氨酸激酶的受体,如血管生长因子受体(例如VEGFR-1、VEGFR-2)、表皮生长因子受体(EGFR)、HER2、肾上腺素受体(例如α和β型);激素介导的受体等。受体的实例包括VEGFR-2(例如,包括磷酸化位点Y951、Y996、Y1054、Y1059、Y1175和Y1214),PDGFR-β(例如,包括磷酸化位点Y740、Y751和Y771)和EGFR(例如,包括磷酸化位点Y1173、Y1148、Y1068、Y845和Y992)。
能够使用这些方法来测量或监测药物的功效,所述药物特别是用于调节激酶如酪氨酸激酶的药物,或基于生物学的治疗剂,如自体血小板浓缩物。多种治疗剂正在被用于治疗与激酶活性异常和增加相关的疾病或症状,包括癌症和血管生成。靶包括但不限于,例如raf、PDGFR-α、PDGFR-β、EGFR、VEGFR、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、HER-2、KIT、FLT3、c-MET、FGFR、FGFR1、FGFR3、c-FMS、RET、ABL、ALK、ARG、NTRK1、NTRK3、JAK2、ROS等。其它信号靶包括例如ERK、AKT、PYK2等。
影响药物的激酶的实例包括但不限于例如阿瓦斯汀(avastin)(贝伐单抗(bevacizumab))、西妥昔单抗(cetuximab)、埃罗替尼(erlotinib)(它赛瓦(tarceva)或OSI774)、依维莫司(everolimus)(RAD0001)、法舒地尔(fasudil)、FK506、吉非替尼(gefitinib)(ZD1839)、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)(ST157或格列卫(Gleevec))、拉帕替尼(lapatinibditosylate)(GSK572016)、纳巴霉素、索拉菲尼(sorafinib)、西罗莫司(sirolimus)、舒尼替尼(sunitinib)(sutent)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(Herceptin)、serafanib和渥曼青霉素。
这样的药物疗法的一目标是减少靶多肽的磷酸化的量。例如,某些药物正在被用于通过阻止VEGFR-2的磷酸化来阻止血管生成。这样的药物的功效能够通过检测流入玻璃体液的脱落的磷酸化受体的外观来监测。如所附的实施例所示,用反相分析在玻璃体液中检测磷酸化VEGFR-2和PDGF-R多肽片段。
反相蛋白微阵列是通常用于高效准确地检测样品中的蛋白的技术。将自单个样品中提取的蛋白固定在基质上。用针对感兴趣的蛋白/多肽的第一抗体检测所俘获的分析物,并整合用于检测策略的第二标签的分子。阵列上的每一点对应于不同的样品。将不同样品的总裂解产物固定在阵列上并用一种抗体孵育。阵列上的每一点对应于不同的样品(高达每阵列640种裂解产物)。反相微阵列允许探查参与胞内信号的蛋白之间的网络和交谈。反相微阵列技术在例如微阵列指纹、蛋白检测和/或蛋白定量中的应用都与本发明的范围相当。
能够通过任何适当的技术进行多肽的检测。能够检测多肽骨架以及它的诸如糖基化和磷酸化的翻译后修饰。常规地能够使用抗体,所述抗体例如针对靶多肽的氨基酸表位而生成的抗体;磷酸化氨基酸等。能够用反相分析来检测眼多肽,其中所述分析由固定到如硝化纤维的基质上的眼内液组成,并且应用特异性结合感兴趣的靶的结合配对物(如抗体)。这些能够迅速被用于表征液的含量并产生疾病生物标志物,包括蛋白组指纹。参见例如Grubb et al.,Proteomics,3:2142-2146,2003。也能够使用质谱法和其它常规的蛋白组方法。
本发明提供了检测黄斑疾病、视网膜脱离、眼部炎症、糖尿病视网膜病变和许多其它疾病的方法,所述方法包括将健康个体中的脱落的受体或信号转导分子和/或它们的磷酸化形式的谱与患者的谱相比较,所述分子例如VEGFR、PDGFR、EGFR、RBP4。值得注意的是,已知这些受体蛋白是诸如格列卫、易瑞沙和阿瓦斯汀的现有药物的现有药物靶,证明这种信息能够用于为患者调整疗法。至于白内障,本发明涉及在已经做了视网膜脱离的玻璃体切除术的患者的玻璃体样品中鉴定一系列晶体蛋白。这样的患者事实上有立即发展成白内障的某种可能性。至于黄斑裂洞或黄斑脱离疗法和黄斑血管渗漏,疗法能够包括给予诸如血小板提取物的天然的自体蛋白。
有了本申请中描述的相关性,对于特定的患者,疾病的存在会通过例如从所述患者中提取玻璃体液,并用完全常规的方法确定感兴趣的特定多肽或片段的含量来测量,所述完全常规的方法诸如免疫学技术、抗体诊断、放射性免疫分析、质谱法、微阵列、Western印迹、凝胶电泳以及标记的或酶扩增的诊断性技术。
使用前述技术,本领域普通技术人员可以使用常规方法开发迎合或特异性针对特定疾病的检测及诊断的相关性。例如,该方法提供表征与特定的肽的水平或量相关的玻璃体液的特性和/或含量的手段,所述肽是疾病的指示。描述了疾病所特有的肽,其中任何量的这样的肽的存在会说明该疾病存在的可能性。本领域普通技术人员能够使用与特定疾病或生理状态相关的肽生物标志物的现有知识,并用本发明所描述的方法筛选所述肽。在某些情况下,背景以上的分子的存在与否可以诊断疾病,因为否则的话可能不会预期那种分子。实例是与湿性黄斑变性期间的血管渗漏相关的分子。在其它情况下,分子浓度水平或磷酸化分子(对一个或多个特定残基的磷酸化)的水平可以与疾病的严重性或由给予患者的药物产生的疾病抑制的量定量地相关。实例是检测VEGFR的磷酸化状态(可以与总受体蛋白的量没有相关性)的方法,所述VEGFR的磷酸化状态预示(a)需要血管生成抑制剂,和(b)血管生成抑制剂是否正在有效地抑制VEGF配体使其不触发其受体。如果所述受体有活性或与配体结合,那么随后也仅在随后它才会被磷酸化。
本发明涉及玻璃体液作为重要的生物学标志物储库的用途。如在表格中解释的那样,可以从活样本或尸体中分离样品。表格2至表格13提供了存在于眼的玻璃体液中的肽的代表性列表。
本发明还提供新的蛋白/肽的鉴定方法,所述蛋白/肽是个体中疾病和/或生理状态的潜在生物标志物。表格中(表5至表13)提供了与眼睛疾病(例如黄斑裂洞、视网膜变性或黄斑裂洞与视网膜变性的组合)有关的这样的肽的代表性实例。对于例如在与不同的疾病或对照样品相比时,与疾病特异相关的多肽,进行了突出显示或加了下划线。
另外,本发明涉及在眼的玻璃体液中检测蛋白的方法,所述方法包括蛋白的分离、酶水解(例如,使用胰蛋白酶)、HPLC分离、用质谱分析解析并在候选多肽数据库中检索所回收的片段。肽的常规HPLC分析方法在本领域中是已知的,并可以包括使用感兴趣的分离柱和/或缓冲液(例如改良C-18柱)。肽的质谱分析技术也是已知的,并可以包括例如纳喷雾/线性离子阱(nano-spray/linear Ion Trap)质谱分析。
本发明还提供了用于进行玻璃体切除术的改进的空心孔套管和切割器,其中所述改进包括所述套管和切割器中的储库,其包含至少一种化学制剂以保护多肽的完整性。能够包括在储库中的化学制剂包括例如蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等。具体实例包括丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。这些的实例包括AEBSF、抑肽酶、E-64、EDTA、亮抑酶肽、乌苯美司(bestatin)、O-邻二氮杂菲、组织蛋白酶等。
无需赘述,相信本领域技术人员用先前的描述能够最大程度地利用以下发明。因此,下列具体的优选权利要求应当仅解释为说明性的,而不是以任何方式对本公开内容其余部分的限制。
以上及以下引用的所有申请、专利和出版物的整体公开内容都在此引入作为参考。
下文中本发明将参照下列非限制性实施例而解释。
实施例
在之前和下列实施例中,所有的温度都以摄氏度(℃)未改正地列出,所有的分数和百分数都以重量计,除非另有说明。
实验程序
玻璃体取样:
睫状环玻璃体切除术
所有的玻璃体样品都在手术的玻璃体切除术部分之前获得。手术将已经完成,不考虑参与研究。以通常的无菌方式预备和覆布患者。在研究的玻璃体切除术部分之前,通过睫状环在无菌TB注射器中获得微小量玻璃体(大约0.1ml)。然后将玻璃体样品在-20℃或-80℃下冷冻,用于储藏和随后的玻璃体蛋白组分析。对于患者,除了单独由手术导致的风险之外没有另外的风险。
尸体解剖研究
在无限制的经过同意的尸体解剖中,通过在睑外侧裂中***附着于10ml结核菌素的22g针,提取2ml至8ml的清澈玻璃体凝胶。样品立即在-80℃下冷冻。
从每一眼中采集大约5cc至10cc的玻璃体。获得九份独立的尸体解剖样品。样品在-80℃下储存直至能够进行分析。
来自进行完全玻璃体勿除术的患者的样品
根据患者经受的具体病理学规定的麻醉/手术操作为患者作准备。用设计用来提供眼后部的清晰图像的手术显微镜和外部镜头进行玻璃体切除术。用巩膜刀在巩膜上制造出仅数毫米长的树状微小切口,然后视网膜外科医生***下列器械:1)纤维光学光源以照亮眼内;2)输注线以在手术期间维持眼的形状和紧张性和3)玻璃体切除刀(vitrectome)以切割并除去玻璃体。在手术期间,用玻璃体切除刀抽吸全部玻璃体并用保持在室温的林格(Ringer)-乳酸盐缓冲液稀释5至8次,这取决于手术程序的长度、是否需要另外的程序以及眼的整体健康状况。除去玻璃体后很快地,将含有稀释过的玻璃体的盒子置于4℃下,并在60分钟内轻轻抽吸,然后用冷林格-乳酸盐缓冲液1:1地稀释(4℃)。然后将该悬浮液小心地混合五次,然后使之通过具有狭窄尖端的无菌移液管(20通道)直至任何肉眼可见的物质都完全溶解。最后,将重新悬浮的物质分成小的等份试样(1ml),装入此前标记的塑料管,立即用液氮冷冻并在15分钟内置于-80℃下储存。还冷冻更小的等份试样以使用商业Bradford分析(Biorad)进行随后的蛋白定量。所有的程序用无菌塑料器具进行。
为了开发可重现的程序以分析眼组织中含有的蛋白,用得自当地屠宰场的牛眼球进行预备试验。将眼球维持在4℃直至玻璃体被提取,即动物死亡后的6至8小时。如(Facchiano et al,1996)所述,在异色边缘后3mm切割眼球并除去整个玻璃体和整个晶状体。然后,通过用冷的盐缓冲液机械解离所述物质将样品重新悬浮。通过SDS-PAGE分析和银染程序检查眼组织匀浆中的蛋白浓度和稳定性。
纳升级反相液相色谱串联质谱
用胰蛋白酶消化玻璃体样品,并将肽用Zip-tip(Waters)纯化。然后通过使用线性离子阱质谱仪(LTQ,ThermoElectron,San Jose,CA)的反相液相色谱纳喷雾串联质谱分析所述肽。在具有激光拉动尖端的100μm内径×10cm长的熔融石英毛细管(Polymicro Technologies,Phoenix,AZ)中用5μm、
孔尺寸的C
18树脂(Michrom BioResources,CA)内部浆体填充反相柱。进样后,用流动相A(0.1%甲酸)清洗柱子5分钟,并在250nl/min下,30分钟用0%流动相B(0.1%甲酸、80%乙腈)至50%流动相B的线性梯度,然后另外5分钟用0%至100%B的线性梯度洗脱肽。在数据依赖模式下操作LTQ质谱仪,在所述模式下每一全MS扫描后面接5次MS/MS扫描,其中动态选择五种丰度最高的分子离子并用35%的标准化碰撞能量通过碰撞诱导解离(CID)将其片段化。
生物信息分析
使用胰蛋白酶切割限制和碘乙酰胺的静态半胱氨酸烷化,通过Sequest Bioworks Browser(ThermoFinnigan)将串联质谱与Swiss-Prot人类数据库匹配。对于被认为正规地鉴定的肽,它必须达到的交叉相关性分数对[M+H]1+为1.5,对[M+2H]2+为2.0,对[M+3H]3+为2.5,ΔCn>0.1,并且被随机鉴定的最大可能性为0.01。
表1:玻璃体人口统计学信息(S:性别;PM:验尸)
玻璃体样品 | 年龄 | S | 死亡原因/诊断 | PM间隔 | 玻璃体颜色 | 玻璃体清澈度 |
2005-35 | 35 | M | 腹膜炎/肾病胱胺酸症 | 72h | 淡粉红色 | 清澈 |
2005-41 | 41 | M | 播散性曲霉菌病/GBM | 12h | 无色 | 清澈 |
2005-49 | 59 | M | 转移肾脏细胞癌 | 5h | 无色 | 清澈 |
2005-52 | 59 | F | 未确定/AML | 14h | 无色 | 清澈 |
2005-56 | 71 | M | 肺炎/多发性硬化 | 20.5h | 无色 | 清澈 |
2005-60 | 40 | F | 肺炎/ALL | 62h | 淡粉红色 | 清澈 |
2005-67 | 20 | M | 肺炎/亚历山大病 | 8h | 无色 | 清澈 |
2005-71 | 24 | M | CVA/慢性肉芽肿病 | 33h | 无色 | 清澈 |
2005-78 | 64 | M | 硬化/丙型肝炎 | 48h | 黄色 | 清澈 |
2004-34 | 16 | M | 神经弓形体病/脊髓发育不良 | 16h | 无色 | 清澈 |
2004-39 | 53 | M | CVA/毛细胞白血病 | 8.5h | 无色 | 清澈 |
2005-74 | 46 | F | dad/aml-m5 | 5h | 无色 | 清澈 |
表2
骨桥蛋白前体
白细胞介素前体
神经***钙粘着蛋白前体
PROSAAS前体(粒蛋白样神经内分泌肽前体)
感光细胞间类视黄醇结合蛋白前体
Dickkopf相关蛋白-3前体
TriadinMutS蛋白同系物4
Wnt抑制因子1前体
S-阻碍蛋白(arrestin)
浆液腺蛋白前体
旋光蛋白(opticin)
丝切蛋白(cofilin)
受体前体
TCP11b蛋白
肾特异性膜蛋白NX-17
视黄酸受体应答元件蛋白
视网膜母细胞瘤相关因子600
视网膜劈裂蛋白(Retinoschisin)
毒覃碱乙酰胆碱受体M5
磷脂酰乙醇胺结合蛋白
BAG-家族分子伴侣调节子-1
β-晶体蛋白B
通过用本发明的一般或具体描述的反应物和/或操作条件替换前述实施例所用的那些,能够类似成功地重复前述实施例。
从前述描述中,本领域技术人员能够轻易地弄清楚本发明的本质特征,并且能够对本发明作出多种改变和修饰以使其适应多种用途和条件而不偏离其精神和范围。
相信本领域技术人员使用前述信息和本领域可获得的信息,能够最大程度地利用本发明。对本领域普通技术人员应当明显的是,能够对本发明作出改变和修饰而不偏离如本文所阐明的本发明的精神或范围。以上和以下列出的主题标题用作能够在本申请中找到某些信息的指导,但不意味着是本申请中能够找到关于这样的主题的信息的唯一来源。以上引用的所有出版物和专利都在此引入作为参考。