CN101479379B - 含有非天然氨基酸的蛋白质的无细胞合成 - Google Patents

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    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Abstract

本发明提供使用细菌无细胞提取物合成在一个或多个特定残基上含有非天然氨基酸的多肽的方法。

Description

含有非天然氨基酸的蛋白质的无细胞合成
发明背景
蛋白质合成是一种基础生物过程、是开发多肽治疗、疫苗、诊断和工业酶的基础。随着重组DNA(rDNA)技术的出现、可以利用细胞的催化机器来产生所需的蛋白质。这可利用衍生自细胞的提取物在细胞环境内或体外实现。
无细胞蛋白质合成提供优于体内蛋白质表达方法的一些优点。无细胞***可使大多数(如果不是所有的)细胞代谢原料用于专门产生一种蛋白质。此外，在体外没有细胞壁也具有优点，因为这能控制合成环境。例如，可改变tRNA水平来反映待表达基因的密码子使用。由于无需考虑细胞的培养或存活，所以改变氧化还原电位、pH或离子强度也可能比体内更加易行。此外，可以容易地实现纯化的、适当折叠的蛋白质的直接回收。
认为体外翻译还能够掺入非天然的及同位素标记的氨基酸，和能够产生在体内不稳定、不溶或有细胞毒性的蛋白质。此外，无细胞蛋白质合成对改革蛋白质工程和蛋白质组筛选技术可能起作用。无细胞方法绕过克隆和转化细胞以在体内表达新基因产物所需的艰苦费力过程，从而成为该领域的技术平台。
相关文献
2006年5月16日批准的美国专利7,045,337，通过引用纳入本文作参考。
美国专利6,337,191B1；Swartz等，美国专利公开申请20040209321；Swartz等，国际公开申请WO 2004/016778；Swartz等，美国专利公开申请2005-0054032-A1；Swartz等，美国专利公开申请2005-0054044-A1；Swartz等，国际公开申请WO 2005/052117。Calhoun和Swartz(2005)Biotechnol Bioeng90(5)：606-13；Jewett和Swartz(2004)Biotechnol Bioeng 86(1)：19-26；Jewett等(2002)原核体外表达***(Prokaryotic Systems for In Vitro Expression)。刊于：Weiner M，Lu Q编辑的《基因克隆和表达技术》(Gene cloning and expressiontechnologies).Westborough，MA：伊顿出版社(Eaton Publishing).第391-411页；Lin等(2005)Biotechnol Bioeng 89(2)：148-56.(Wang等(2001)Science292(5516)：498-500；Wang等(2003)Proc Natl Acad Sci USA 100(1)：56-61；Chin等(2002)J Am Chem Soc 124(31)：9026-7；Farrell等(2005)Nat Methods，2005.2(5)：377-84；Liu等(2003)J Am Chem Soc 125(7)：1702-3。
发明概述
提供使用来自多核苷酸模板细菌细胞提取物进行高产量无细胞蛋白质合成的方法，其中对合成蛋白质进行修饰使其含有一个或多个位点特异性掺入的非天然氨基酸。蛋白质在包含至少一种非天然氨基酸氨酰化的正交tRNA的无细胞反应混合物中合成，其中正交tRNA碱基对携带的密码子通常不与氨基酸关联，如终止密码子、4bp密码子等。反应混合物还包含能够用非天然氨基酸氨酰化正交tRNA的tRNA合成酶。正交tRNA合成酶易于被细菌细胞提取物中的蛋白酶降解，通常外源性合成正交tRNA合成酶并在启动多肽合成前加入反应混合物。正交tRNA可在获取细胞提取物的细菌细胞中合成，可在多肽反应过程中从头合成，或可外源性加入反应混合物中。
本发明提供大量生产活性修饰蛋白质的方法。由此生产的蛋白质，包括含二硫键的蛋白质、分泌蛋白质、膜结合蛋白质和多聚蛋白质等具有生物学活性。在一些实施方式中，通过偶联的转录和翻译反应进行合成。
在一个实施方式中，合成反应条件能在体外激活氧化磷酸化。氧化磷酸化激活的证据是合成对电子传递链抑制剂的敏感。此类反应基本不用聚乙二醇。
所述无细胞蛋白质合成体系提供了用于表达含非天然氨基酸蛋白质的灵活的平台。在各种实施方式中，改进该体系以得到特定结果。根据期望的改进，来改变非天然氨基酸的数目和特性。正交tRNA和tRNA合成酶可来自数种来源，包含细菌、古细菌或哺乳动物。
在反应混合物中任选地加入影响非天然氨基酸***和蛋白质***或折叠的组分。此类组分包括浓度升高的翻译因子，以尽量减少释放因子1和2的影响并进一步优化正交组分浓度。可在反应混合物中加入侣伴蛋白(氧化还原酶和异构酶的Dsb***，GroES、GroEL、DNAJ、DNAK和Skp等)，或者在用于制备细胞提取物的来源细胞中过度表达上述侣伴蛋白。
附图简要说明
图1.利用非天然氨基酸掺入方案1在mGM-CSF中掺入邻甲基-酪氨酸(OMe-Tyr)的放射性自显影分析。在PANOx-SP无细胞反应中，加入纯化正交(o-)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)tRNA和邻甲基-酪氨酸合成酶的量不同。在10％Bis-Tris NuPAGE凝胶上分离样品并与Mark 12分子量标准品比较。条带1包含二聚化蛋白产物，条带2是掺入邻甲基酪氨酸的全长蛋白产物，条带3是截短蛋白产物(在75位残基上截短)。泳道2显示具有所有天然氨基酸的纯化mGM-CSF标准品。
图2.利用不同工艺方案在氯霉素乙酰基转移酶(CAT)中掺入邻甲基-酪氨酸的无细胞蛋白质合成产量。通过基于比色的活性实验测定活性CAT浓度[26]并在L-[U-14C]-亮氨酸掺入后通过闪烁计数进行验证。在MES缓冲液中利用10％Bis-Tris NuPAGE凝胶进行放射性自显影分析。该数据为n＝6次实验的平均值。
图3.含对-叠氮基-苯丙氨酸的CAT的放射性自显影分析(邻甲基-酪氨酸和对-乙酰基-苯丙氨酸结果类似)。用MES缓冲液中电泳的10％Bis-TrisNuPAGE凝胶进行放射性自显影，(A)在细胞提取物(例子来源于KC6细胞株的细胞提取物)中进行受控tRNA转录后，加入递增量的正交合成酶在30℃进行5小时无细胞反应后的修饰蛋白产量。(B，C)unAA-PANOx-SP***中无细胞蛋白合成期间放射性自显影时程和活性CAT产量。用约167μg/mL正交对-叠氮基-苯丙氨酸合成酶于30℃进行22小时无细胞反应。
图4.无细胞蛋白质合成反应中正交合成酶蓄积的放射性自显影分析。用MES缓冲液中电泳的10％Bis-Tris NuPAGE凝胶进行放射性自显影。对-叠氮基-苯丙氨酸tRNA合成酶被KC6细胞提取物中的蛋白酶严重降解。当使用ARG1、ARG2或MCJ29突变细胞株产生细胞提取物时，合成酶不被降解(因为所有结果均类似故只给出一个实例)。当ompT缺失或突变掺入KC6或KGK10细胞株时，新产生的合成酶是稳定的。
图5。采用反应方案I-IIIc反应的活性氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的产量显示了本发明提供的显著改进。发展I和II期包括掺入生理量的纯化tRNA和合成酶(与实施例1中所述那些产量类似)。发展方案IIIa包括体内表达正交合成酶和tRNA(KC6细胞提取物)。发展方案IIIb包括体内tRNA转录并加入少于167μg/mL活性纯化正交合成酶。通过改进unAA-PANOx-SP组分比例、反应环境、提取制备方法和tRNA表达得到发展方案IIIc。通过放射性自显影进行蛋白产物分析显示无细胞反应的大部分产物为含有非天然氨基酸的全长蛋白。这些结果在多于n＝6次实验中重现。
图6.包含二硫键的修饰蛋白质的产量。成功将对-叠氮基和对-乙酰基-苯丙氨酸非天然氨基酸掺入hGM-CSF和mGM-CSF(仅显示对-叠氮基-苯丙氨酸无细胞产量)。对-乙酰基-苯丙氨酸和对-叠氮基-苯丙氨酸掺入的放射性自显影确认，通过unAA-PANOx-SP无细胞体系合成全长的修饰产物。使用含有pK7tRNAmj质粒的KC6细胞株制备细胞提取物。对每一非天然氨基酸和蛋白质，在30℃进行三个单独的无细胞反应6小时。
图7.图6所述修饰蛋白的hGM-CSF和mGM-CSF的生物活性实验结果。几乎所有产生的全长产物(可溶部分)都能正确折叠并在细胞增殖实验中显示出生物活性。一式三份的检测样品(n＝3)。
图8.在34或182位残基掺入unAA(对-叠氮基-苯丙氨酸)的全长TetA膜蛋白的无细胞产量的放射性自显影分析。同时显示了蔗糖梯度悬浮实验分离的TetA蛋白产物的分布。在掺入14C亮氨酸后鉴定合成的TetA蛋白的放射性。小泡相连的浮于组分2之上，而聚集TetA保留在组分5-7梯度的底部。使用谷氨酸磷酸盐无细胞体系合成这些膜蛋白以保证活性氧化磷酸化通路。
图9.在残基34和182上用对-叠氮基-苯丙氨酸修饰的TetA的蛋白酶K消化的放射性自显影分析。实验中使用MES缓冲液中10％Bis-Tris NuPAGE凝胶。“内部”非天然氨基酸取代位于膜的周质侧(小泡内侧)，“外部”***的非天然氨基酸位于膜的胞质侧(小泡外侧)。
图10：利用pET24a_MS2cp_T15STOP表达载体进行的无细胞蛋白质合成的产量(30μl反应，n＝2)。
图11：利用天然氨基酸合成的MS2衣壳样品(+对照)以及15位上对-叠氮基-苯丙氨酸产生终止密码子抑制的MS2衣壳样品(非天然AA)，在10％-40％(2.5％步进)蔗糖密度梯度中的速率沉降特征。对掺入14C-亮氨酸闪烁计数测定放射性标记MS2外被蛋白的位置。
图12：通过图11所示的蔗糖密度梯度分离的非天然氨基酸样品组分12-15以及+对照样品的组分11-15(20μl组分，7.25μl NuPAGE LDS上样缓冲液-英杰公司，0.625mM DTT-英杰公司)在SDS-Page凝胶(10％Bis-Tris凝胶w/MES电泳缓冲液，英杰公司(Invitrogen)；电泳条件60mA 60分钟；SimplySafe Stain，英杰公司)上进行电泳。MS2外被蛋白单体分子量为13.7kDa。
图13：图12所示凝胶的放射性自显影图。
图14A-D：分离自15位合成有对-叠氮基-苯丙氨酸或酪氨酸的VLP的MS2外被蛋白的相关糜蛋白酶消化片段的质谱分析。分离对照和对-叠氮基-苯丙氨酸产物后，用糜蛋白酶消化。
实施方式详述
本发明的方法中，在包含至少一个非天然氨基酸氨酰化的正交tRNA的无细胞反应混合物中合成靶蛋白，其中正交tRNA碱基对携带的无义密码子通常不与氨基酸关联，如终止密码子、，4bp密码子等。该方法包括偶联的转录-翻译反应。本发明在无细胞蛋白合成中利用无义密码子抑制以产生大量包含非天然氨基酸的多肽。感兴趣的多肽包括但不限于含二硫键的蛋白、任何异源或同源的蛋白组合，包括融合蛋白、病毒外被蛋白和/或最初通过细胞膜分泌或位于膜内的蛋白。非天然氨基酸包括任一在自然界中一般无法找到的氨基酸类似物或类似实体，包括但不限于用于靶向翻译后修饰的那些分子。反应混合物包括细胞提取物，任选是氨基酸稳定化的、还原酶最小化的和/或蛋白酶突变的细胞提取物。
令人惊奇的发现，尽管正交tRNA可靠地由获得无细胞合成所用提取物的细菌细胞合成，但正交tRNA合成酶在细菌细胞提取物中易被降解。此种降解至少一个原因是细菌细胞中存在ompT蛋白酶。该蛋白酶通常不与细胞质内的多肽接触，因此不影响完整细胞中利用非天然氨基酸进行多肽合成的正交组分。在本发明的方法中，外源性合成tRNA合成酶并加入无细胞反应混合物中。或者，从ompT被灭活或本身处于失活状态的细菌细胞中制备反应混合物。
本发明方法能得到大量活性修饰蛋白，其产量大于体内表达***所能得到的产量。在本发明的一个实施方式中，活性修饰蛋白的产量为至少约50μg/ml反应混合物；至少约100μg/ml反应混合物；至少约250μg/ml反应混合物；或更多。大部分由此产生的靶多肽中非天然氨基酸含量通常为至少约50％、至少约75％、至少约85％、至少约95％、至少约99％、甚至更高。
本文所用修饰蛋白或靶蛋白在一个预定位点包含至少一个非天然氨基酸，并可包含或含有1、2、3、4、5或多个非天然氨基酸。在多肽两个或多个位点出现的非天然氨基酸可为相同或不同的。当非天然氨基酸不同时，对每一非天然氨基酸而言，都存在一种正交tRNA和关联tRNA合成酶。非天然氨基酸包括但不限于对-乙酰基-苯丙氨酸、对-乙炔基-苯丙氨酸、对-炔丙基氧基苯丙氨酸和对-叠氮基-苯丙氨酸。
本发明方法提供与天然蛋白具有相当生物学活性的包含非天然氨基酸的蛋白质。可通过功能性实验测定组合物中蛋白比活，通过非功能性实验，如免疫染色、ELISA、在考马斯或银染凝胶上定量测定存在的蛋白，并测定生物学活性蛋白占总蛋白的比例。通常，由此定义的比活为天然蛋白的至少约5％、10％，或约25％、50％、90％或更高。
本发明方法能大量获得自我组装的病毒外被蛋白。大部分蛋白质可组装成为稳定的病毒样颗粒(VLP)，通常至少约25％、至少约50％、至少约75％或更多，其中稳定VLP在生理条件下能在延长时间如至少约24小时、至少约1周、至少约1个月甚至更长时间中保持含有至少约60个多肽链的衣壳结构。一旦组装，VLP暴露于pH变化、热、冷冻和离子交换等条件时与天然病毒颗粒的稳定性相当。
本发明方法合成的多肽提供了能够通过非天然氨基酸之间的共价键将任何配体(包含或不包含二硫键)连接于多肽的优点。可使用接头连接两个相似或独特的非天然氨基酸，如在两条多肽链间连接。利用相似或不同配体在单一或多个位点进行位点特异性翻译后修饰可通过但不限于以下方法进行：温和[3+2]环加成反应或利用独特“酮柄”的配体特异性反应。或者，可将叠氮基团与炔相连，其中一个掺入了多肽表面，另一个则是接头或配体的一部分。
定义
应当理解本发明不受限于所述特定方法、实验方法、细胞系、动物种属和试剂，因为这些可变。也应理解本文所用术语仅为了描述特定实施方式，并无意限制本发明范围，仅有所附的权利要求书才能限制本发明范围。
本文所用单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数含义，除非上下文另有清楚地说明。因此，例如，提及“细胞”包括该细胞的复数形式，提及“培养物”包括提及一种或多种培养物及其本领域熟练技术人员所知等价物等等。除非另有说明，本文所用的技术和科学术语与本发明所属领域一般技术人员理解含义相同。
术语“所需蛋白”或“所选蛋白”可互换使用，通常指任何含多于5个氨基酸的肽或蛋白，其中包含至少一个非天然氨基酸，其中非天然氨基酸在编码该蛋白的多核苷酸的特定位点编码。所述多肽可与细菌(细菌无细胞提取物来源于该细菌)同源或外源(指异源的)，即外来的，如细菌无细胞提取物中产生的人蛋白、病毒蛋白、酵母蛋白等。
哺乳动物多肽的例子包括但不限于：分子如肾素；生长激素，包括人生长激素；牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；***；胰高血糖素；凝集因子如VIIIC因子、IX因子、组织因子和vonWillebrands因子；抗凝集因子，如蛋白C；心房钠元素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织类型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES和其它趋化因子；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；苗勒管抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；前松弛素(prorelaxin)；小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白，如β-内酰胺酶；DNA酶；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子受体；整联蛋白；蛋白A或D；类风湿性因子；神经营养因子如骨源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神经生长因子如NGF.-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如αFGF和βFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF.-β2、TGF.-β3、TGF.-β4或TGF-β5；***-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、***结合蛋白；CD蛋白如CD-3、CD-4、CD-8和CD-19；红细胞生成素；成骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，如IL-1至IL-18；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；促衰变因子；病毒抗原如AIDS包膜的一部分，转运蛋白、归巢受体、定居因子、调节蛋白、抗体和上述任何多肽的片段。
感兴趣的病毒外被蛋白包括任何已知病毒类型，如dsDNA病毒如天花(天花)；牛痘；疱疹病毒包括水痘带状疱疹；HSV1、HSV2、KSVH、CMV、EBV；腺病毒；乙型肝炎病毒；SV40；T偶数噬菌体如T4噬菌体、T2噬菌体；λ噬菌体；等。单链DNA病毒包括φX-174；腺伴随病毒等。负链RNA病毒包括麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)；副流感病毒(PIV)；肺炎后病毒；狂犬病病毒；艾波拉病毒；流感病毒等。正链RNA病毒包括脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、冠状病毒、风疹病毒、黄热病病毒、西尼罗河热病毒、登革热病毒、马脑炎病毒、甲型肝炎和丙型肝炎病毒、烟草花叶病毒(TMV)等。双链RNA病毒包括呼肠病毒等等。逆转录病毒包括劳氏肉瘤病毒；慢病毒如HIV-1和HIV-2等。
感兴趣的是细菌噬菌体，如MS2噬菌体。肌病毒科(有收缩性尾部的噬菌体)包括μ样病毒；P1-样病毒如P1；
Figure G2007800243459D00081
W39等；P2-样病毒；SPO-1-样病毒；T4-样病毒等。短尾噬菌体科(具有短尾部的噬菌体)包括N4-样病毒；P22-样病毒如P22；
Figure G2007800243459D00082
-29-样病毒如
Figure G2007800243459D00083
-29；T7-样病毒如T3、T7、W31等。长尾噬菌体科(具有长的非收缩性尾部的噬菌体)包括c2-样病毒；L5-样病毒；λ-样病毒如噬菌体λ、HK022；HK97等；N15-样病毒；
Figure G2007800243459D00084
C31-样病毒；ΨM1-样病毒；T1-样病毒如噬菌体T1等。微小病毒科(等长(isometric)ssDNA噬菌体)包括衣原体微小噬菌体病毒；微小病毒，如噬菌体α3、噬菌体WA13等；噬菌体G4；噬菌体
Figure G2007800243459D00085
X174和相关大肠杆菌噬菌体。本领域熟练技术人员所知的许多其它噬菌体尚未分类。许多外被蛋白的序列已公开可查。
非天然氨基酸。可用于本发明使用方法的非天然氨基酸的例子包括：酪氨酸的非天然同系物；谷胺酰胺的非天然同系物；苯丙氨酸的非天然同系物；丝氨酸的非天然同系物；苏氨酸的非天然同系物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、巯基、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸盐、硼酸酯(boronate)、磷酸基、膦酰基、膦、杂环、烯酮(enone)、亚胺、乙醛、羟胺、酮或氨基取代氨基酸或其任何组合；具有光敏型交联接头的氨基酸；自旋标记氨基酸；荧光氨基酸；具有新颖官能团的氨基酸；与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸；金属结合氨基酸；含金属的氨基酸；放射性氨基酸；光捕获(photocaged)和/或光异构化(photoisomerizable)氨基酸；含生物素或生物素类似物的氨基酸；糖基化的或糖修饰氨基酸；含酮氨基酸；含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；化学切割或光切割氨基酸；有延伸侧链的氨基酸；含毒性基团的氨基酸；糖取代的氨基酸，如糖取代的丝氨酸等；碳连接的含糖氨基酸；氧化还原活性氨基酸；含α-羟基的酸；含氨基硫代酸的氨基酸；α，α双取代氨基酸；β氨基酸；除脯氨酸外的环状氨基酸等。
感兴趣的非天然氨基酸包括但不限于为CLICK化学反应提供反应基团的氨基酸(参见《克里克化学：来自数个好反应的不同化学功能》(Click Chemistry：Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions)Hartmuth C.Kolb，M.G.Finn，K.Barry Sharpless Angewandte Chemie International Edition 40卷，2001，P.2004，特别通过引用纳入本文)。例如，感兴趣的是氨基酸对-乙酰基-L-苯丙氨酸和对-叠氮基-L-苯丙氨酸。
正交组分。本文所使用的正交组分包括具有非天然氨基酸的氨酰化的tRNA，其中正交tRNA碱基对具有通常与氨基酸无关的密码子，如终止密码子、4bp密码子等。反应混合物还可包含能氨酰化(用非天然氨基酸)关联的正交tRNA的tRNA合成酶。此类组分为本领域所知，参见例如2006年5月16日批准的美国专利7,045,337。正交tRNA识别可为无义密码子的选择密码子，如终止密码子，如琥珀、赭石和蛋白石密码子；四碱基或多碱基密码子；起源于天然或非天然碱基对的密码子等。正交tRNA的反密码子环能识别mRNA上的选择密码子并在多肽的该位点上***非天然氨基酸。
优选外源性合成正交tRNA合成酶，纯化并加入到本发明的反应混合物中，通常其含量确定，为至少约10μg/ml、至少约20μg/ml、至少约30μg/ml和不超过约200μg/ml。可在细菌或真核细胞中合成该蛋白并通过本领域熟知的计数如亲和色谱、PAGE、凝胶排阻色谱、反向色谱纯化该蛋白。
可在用于无细胞合成的提取物来源细胞中合成正交tRNA；正交tRNA可外源性合成、纯化并加入反应混合物，或从头合成，其中无细胞合成反应允许转录和翻译反应。当在用于无细胞合成的提取物来源细胞中合成正交tRNA时，可通过选择适当的启动子、培养基等控制表达。
本文所用体外合成，指在包含生物学提取物和/或确定试剂的反应混合物中无细胞合成多肽。反应混合物可包含用于产生大分子的模板，如DNA、mRNA等；用于大分子合成的单体，如氨基酸、核苷酸等和此类辅因子，酶和其它合成所必需的试剂，如核糖体、tRNA、聚合酶、转录因子等。此类合成反应体系为本领域所熟知并在文献中有记载。可以分批、连续流或半连续流等本领域所知形式进行无细胞合成。
在本发明的一些实施方式中，无细胞合成在氧化磷酸化激活的反应中进行，如CYTOMIMTM***。呼吸链和氧化磷酸化激活的证据是在O2存在时，多肽合成增加。在氧化磷酸化激活的反应中，与O2存在时相比，当存在特异性电子传递链抑制剂如HQNO或缺少O2时总多肽合成量至少降低约40％。反应化学在通过引用纳入本文的国际专利申请WO 2004/016778中有记载。
用于合成的CYTOMIMTM环境使用在含葡萄糖和磷酸盐的培养基中生长的细菌细胞的提取物，其中起始葡萄糖浓度至少约0.25％(重量/体积)，更常用的是至少约1％；常用的是不超过约4％，更常用的是不超过约2％。此类培养基的例子是2YTPG培养基，然而本领域技术人员可意识到许多培养基经改造均可用于此目的，其中许多公开培养基适用于细菌如大肠杆菌(E.coli)的生长，其中使用明确的和未明确的营养物来源(参见Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis.1989.Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第二版，冷泉港大学出版社，冷泉港，纽约(Cold Spring Harbor UniversityPress，Cold Spring Harbor，NY)，例如含葡萄糖的培养基)。或者，培养物可根据实验方案生长，该实验方案中葡萄糖根据需要连续添加于成分明确或复合的生长培养基中以保持高生长速率。
可在反应混合物加入小泡作为补充，如加入内膜小泡溶液。所提供小泡可占约0-约0.5体积，通常约0.1-约0.4体积。
在一些实施方式中，存在不超过痕量的PEG，例如少于0.1％并可少于0.01％。基本不含PEG的反应包含极少量PEG，例如PEG不抑制氧化磷酸化。亚精胺和腐胺分子可用于替代PEG。精胺或亚精胺的浓度为至少约0.5mM，通常至少约1mM，优选约1.5mM并且不超过约2.5mM。腐胺的浓度为至少约0.5mM，优选至少约1mM，优选约1.5mM并且不超过约2.5mM。亚精胺和/或腐胺可存在于最初细胞提取物中或另行加入。
反应混合物中的镁浓度影响总体合成。常常细胞提取物中存在镁，可再加入镁优化浓度。此方法中所用镁盐的来源为本领域所知。在本发明的一个实施方式中，镁的来源为谷氨酸镁。优选的镁浓度为至少约5mM，通常至少约10mM，优选至少约12mM；并且浓度不超过约25mM，通常不超过约20mM。其它可提高合成或降低成本的变化包括省略反应混合物中的HEPES缓冲液和磷酸烯醇式丙酮酸。
所述***可在好氧和厌氧条件下运行。尤其当反应大于15μl时可提供氧气以增加合成产量。反应室顶部空间可填充氧气；氧气可注入反应混合物中等。氧气可持续供给，或在更长反应时间进行蛋白表达的过程中在反应室顶部补充氧气。也可在制备细胞提取物中使用其它电子受体，如硝酸盐、硫酸盐或延胡索酸盐，以使细胞提取物中所需酶具有活性。
无需加入外源性辅因子激活氧化磷酸化。可使用化合物如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、NAD+或乙酰辅酶A补充蛋白合成产量，但这并非必须。加入草酸、磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(Pps)代谢抑制剂，可有利于增加蛋白产量，但这并非必须。
无细胞蛋白合成的模板可为mRNA或DNA，优选使用连续从具有可识别启动子的DNA模板中生成mRNA的联合体系。可在反应混合物中直接加入内源性RNA聚合酶或外源性噬菌体RNA聚合酶，通常为T7或SP6。或者，可通过在QB复制酶(一种RNA依赖性RNA聚合酶)模板中***信息以持续扩增mRNA。通常在加入反应混合物前利用化学修饰稳定纯化的mRNA。可从提取物中去除核酸酶以稳定mRNA水平。所述模板可编码任何感兴趣的具体基因。
可加入其它盐，尤其是生物学相关的盐，如锰盐。钾的浓度为至少约50mM，且不超过约250mM。铵的浓度通常不超过200mM，更通常不超过100mM。通常，反应保持在约pH 5-10，温度约20℃-50℃的范围内；更通常，在约pH 6-9和温度约25℃-40℃的范围内。这些范围可根据感兴趣的具体条件延伸。
可在反应混合物中加入对不良酶活性的代谢抑制剂。或者，可直接从提取物中移除引起不良活性的酶或因子，或者可使编码不良酶活性的基因失活或从染色体中缺失。
生物提取物。出于本发明的目的，生物提取物可为任何包含蛋白合成机器所需组分的制备物，通常为细菌细胞提取物，其中此类组分能表达编码所需蛋白的核酸。因此，细菌提取物包含能翻译编码所需蛋白的信使核糖核酸(mRNA)的组分，可选包括能够转录编码所需蛋白的DNA的组分。此类组分包括例如，DNA指导的RNA聚合酶(RNA聚合酶)、启动编码所需蛋白的DNA转录所需的任何转录激活物、转运核糖核酸(tRNA)、氨酰基-tRNA合成酶、70S核糖体、N10-甲酰基四氢叶酸、甲酰基甲硫氨酸-tRNAfMet合成酶、肽基转移酶、起始因子如IF-1、IF-2和IF-3，延伸因子如EF-Tu、EF-Ts和EF-G，释放因子如RF-1、RF-2和RF-3等。
在本发明的一个优选实施方式中，反应混合物包含来自细菌细胞的提取物，如大肠杆菌S30提取物，如本领域所知。在一些实施方式中，修饰菌株使其能够内源性表达正交tRNA。方便起见，用作提取物来源的有机体也称作来源有机体。生产活性提取物的方法为本领域所知，例如Pratt(1984)，原核无细胞体系中偶联的转录翻译(Coupled transcription-translation in prokaryote cell freesystems)，179-209，Hames，B.D.和Higgins，S.J.(编)，转录和翻译：实践方法(Transcription and Translation：A Practical Approach)，IRL出版社，纽约。Kudlicki等(1992)Anal Biochem 206(2)：389-93通过超速离心收集S30的核糖体组分，以修饰S30大肠杆菌无细胞细胞提取物。Zawada和Swartz BiotechnolBioeng，2006，94(4)：618-24和Liu等，2005，Biotechnol Progr 21：460教导了改进的提取物制备方法。
可根据本发明目的进一步修饰提取物来源菌株。在一个实施方式中，提取物来源于一种或多种蛋白有缺陷的大肠杆菌菌株，如菌株KC6(A19ΔtonAΔtnaAΔspeAΔendAΔsdaAΔsdaBΔgshA met+)、KGK10(A19ΔspeAΔtnaAΔtonAΔendAΔsdaAΔsdaBΔgshAΔgor met+，可包括TrxB-HA)、ARG1(A19ΔtonAΔtnaAΔspeAΔendAΔsdaAΔsdaBΔgshA met+OmpTD83A)、ARG2(A19ΔspeAΔtnaAΔtonAΔendAΔsdaAΔsdaBΔgshAΔgor met+OmpTD83A，可包括TrxB-HA)；MCJ29(A19ΔspeAΔtnaAΔompTΔptrCΔdegPΔtonAΔendAmet+)等。
本文所用折叠指形成多肽和蛋白三维结构的过程，其中氨基酸残基间的相互作用用于稳定该结构。非共价相互作用在决定结构时很重要，膜与蛋白接触效应对于正确结构有重要作用。对于天然产生的蛋白和多肽或其衍生物和变体，正确折叠的结果通常是产生最优生物学活性的排布，可方便地通过活性实验，如配体结合、酶活性实验等进行检测。
在一些例子中，如果所需产物是合成来源时，基于生物学活性的实验将意义不大。此类分子的正确折叠可通过物理性质、能量考量、建模研究等测定。
膜相关蛋白的合成后，可直接分离活性的膜相关形式，即不用进行再折叠或翻译后膜引入。分离过程可用本领域所知保持膜完整性的条件或使用任何本领域实践常用于分离膜蛋白的数种膜活性去污剂。
感兴趣的分离步骤包括亲和色谱。亲和色谱利用常出现于生物大分子上的高特异性结合位点，通过其与特定配体结合的能力分离分子。共价键以将配体公开呈现于蛋白样品的方式将该配体连接于不溶性的多孔支持介质，从而利用一种分子的天然生物特异性结合从混合物中区分并纯化第二种分子。亲和色谱中常使用抗体。优选将微球或基质作为亲和色谱的支持物。此类支持物是本领域了解的并可购得，包括能与接头分子偶联的活化支持物。例如，基于琼脂糖或聚丙烯酰胺的Affi-Gel支持物是适合用蠕动泵或重力流动洗脱的多数实验室规模纯化的低压凝胶。基于压力稳定型大孔径聚合物的Affi-Prep支持物适合制备和加工规模的应用。
也可通过离子交换色谱和/或浓缩、过滤、透析等本领域所知方法分离蛋白质。
合成方法
可使用大规模、小规模反应器或叠加同时进行数个合成反应来进行反应。连续反应使用给料机制来引入试剂流，并可作为工艺的一部分分离最终产物。同样感兴趣的是分批体系，其中可引入另外的试剂以延长活性合成的时间。反应器可以任何模式运行，如分批、延伸分批、半分批、半连续、分批及连续给料模式，根据应用目的选择具体模式。
在延长过程中在多肽链中引入至少一个非天然氨基酸的合成方案包括但不限于：(I)在无细胞反应中加入外源性纯化的正交合成酶、非天然氨基酸及正交tRNA，(II)在反应混合物中加入外源性纯化的正交合成酶和非天然氨基酸，但在无细胞反应中转录正交tRNA，(III)在反应混合物中加入外源性纯化的正交合成酶和非天然氨基酸，但通过细胞提取物来源有机体合成正交tRNA。尽管可使用其它方法如通过加入或特异性消化控制相关DNA水平来控制合成水平，但优选通过可调节启动子驱动正交组分来控制合成水平。
为了防止正交合成酶的降解，用于生产提取物的菌株可含缺失或突变的ompT(外膜蛋白T)。当ompT突变时，优选蛋白酶功能失活但侣伴蛋白功能保留的突变方式。此类提取物与没有突变或缺失的提取物相比，具有降低的合成酶降解水平。
可修饰反应混合物以保持氧化蛋白折叠环境，例如在反应混合物中补充浓度约为0.5mM-约10mM，通常约1mM-4mM的GSSG；补充浓度约0.5mM-约10mM，通常约1mM-约4mM的GSH。也可包含如100μg/mL DsbC或Skp等蛋白组分。任选地，用碘代乙酰胺(IAM)预处理细胞提取物。
反应混合物可为任意体积，可以是小规模，例如通常至少约1μl且不超过15μl，或是扩大规模，例如反应体积至少约15μl、通常至少约50μl、更通常至少约100μl，并可为500μl、1000μl或更大。大多数情况下，单个反应不超过约10ml，尽管可平行进行多重反应。然而，原则上，只要当需要时有充足的氧气(或其它电子受体)，反应可以任意规模进行。
除了上述组分，如无细胞提取物、遗传模板和氨基酸外，可在反应中加入蛋白合成所需特定材料。这些材料包括盐、亚叶酸、环AMP、蛋白质或核酸降解酶的抑制剂、氧化还原电位调节剂、非变性表面活性剂、缓冲液组分、精胺、亚精胺、腐胺等。
优选的盐包括钾、镁和铵盐(如乙酸或谷氨酸盐)。一种或多种此类盐可具有一个候选氨基酸作为抗衡阴离子。离子种类最佳浓度相互依赖。这些离子种类通常根据蛋白生产优化。当改变反应介质中某一特定组分的浓度时，可相应地改变其它组分的浓度。例如，根据其它组分浓度的改变，可同时调整数种组分如核苷酸和能源化合物的浓度。同样，反应器中组分的浓度可随时间改变。氧化还原电位调节剂可为二硫苏糖醇、抗坏血酸、谷胱甘肽和/或其氧化形式。
在半连续的操作模式中，膜的外侧或外表面与以预定次序循环改变的预定溶液接触。这些溶液包含底物如氨基酸和核苷酸。这时，以透析、分批渗滤或分批给料的模式操作反应器。通过同一膜或不同的注射单元为反应器提供给料溶液。合成蛋白在反应器中蓄积，在完成***操作后利用常用蛋白纯化方法分离和纯化蛋白。包含产物的小泡可以被连续分离，例如随着反应液体被泵送通过吸附介质时，从反应混合物中亲和吸附(原位或在循环回路中)。
当存在试剂流时，液流方向可为膜的垂线或切线方向。切向流能够有效回收ATP并防止膜堵塞，可附加于垂直流上。使用正压力泵或真空抽吸泵或利用本领域其它已知方法实加跨膜压力，能够引起或实现垂直于膜的流动。与膜外表面接触的溶液可循环更换，并且可为与膜相切的稳定切向流。通过合适的搅拌方法可从内部或外部搅动反应器。
在反应器蛋白合成的过程中，选择性分离所需蛋白的蛋白分离方法可包括包装有包被能吸附合成的所需蛋白的抗体分子或其它分子的颗粒的单元。蛋白分离方法优选包括两个柱子交替使用。
可用不同方式测定翻译反应中产生蛋白质的量。一种方法依赖于测定所翻译具体蛋白的活性的实验。测定蛋白质活性实验的一个例子是萤光素酶实验***，或氯霉素乙酰基转移酶实验***。这些实验检测产自翻译反应的功能性蛋白的量。活性实验不检测因为不正确的蛋白折叠或缺少其它蛋白活性所必需的翻译后修饰而失活的全长蛋白质。
另一检测偶联的体外转录和翻译反应所产生蛋白量的方法是利用已知量的放射性标记的氨基酸如35S-甲硫氨酸、3H-亮氨酸或14C-亮氨酸进行反应，然后检测掺入新翻译蛋白质的放射性氨基酸的量。掺入实验测定所有体外翻译反应中产生的蛋白质，包括截短的蛋白质产物中放射性标记氨基酸的量。放射性标记的蛋白质可进一步在蛋白凝胶上分离，并通过放射性自显影确认该产物大小正确并且未产生第二种蛋白质产物。
也提供了用于实施主题方法的试剂盒。此类试剂盒可包括用于蛋白质合成以及定点***非天然氨基酸的细菌提取物，如包含正交tRNA和/或tRNA合成酶或其编码多核苷酸、适用于氧化磷酸化被激活的反应的缓冲剂，以及小泡。试剂盒也可包括用于蛋白质合成的载体，包括表达SRP和SR蛋白的载体；其中载体可包含用于细菌提取物的启动子***。
提供以下实施例是为向本领域的普通技术人员完全公开并描述如何制造和使用本发明，而不是要限制本发明的范围。我们努力保证使用数值(例如，量、温度、浓度等)的精确性，但应该允许有一些实验失误和偏差。除非另有指出，份数是以重量计的份数，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
实验
作为例子的无细胞蛋白合成反应是谷氨酸磷酸盐/塞多米(GlutamatePhosphate/Cytomim)和PANOx-SP***。修饰这些***使之能有效将非天然氨基酸掺入蛋白。使用来自詹氏甲烷球菌的正交tRNATyr/酪氨酸-合成酶将非天然氨基酸邻甲基-L-酪氨酸、对-乙酰基-L-苯丙氨酸或对-叠氮基-L-苯丙氨酸位点特异性引入琥珀终止密码子的位置。非天然氨基酸市售可得，基因序列如科学文献所述(Wang等(2001)Science 292(5516)：498-500；Wang等(2003)Proc Natl Acad Sci U S A 100(1)：56-61；Chin等(2002)J Am Chem Soc124(31)：9026-7；Farrell等(2005)Nat Methods，2005。2(5)：377-84；Liu等(2003)J Am Chem Soc 125(7)：1702-3；通过引用纳入本文)。将这些非天然氨基酸掺入到可溶性细菌蛋白、包含二硫键的分泌型哺乳动物蛋白及膜蛋白中。通过改变用于制备提取物的细胞株、提取物制备方案、辅助蛋白浓度及无细胞反应条件来开发该无细胞蛋白合成平台。可通过合适的比色法、细胞增殖、免疫沉淀和转运实验来检验靶蛋白活性。
实施例1
使用无细胞蛋白合成法高产表达含非天然氨基酸的复合蛋白的方法
使用本发明方法合成细菌蛋白氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、二硫键连接的mGM-CSF和hGM-CSF蛋白以及膜蛋白TetA。为了高产合成靶蛋白，通过重叠PCR利用为大肠杆菌tRNA相关浓度优化的寡核苷酸(优选密码子)合成模板基因。此外，优化基因序列的N末端使其促进我们无细胞体系的翻译启动(使N末端富含A-T)。将优化的蛋白序列连接入pK7载体(参见所附序列)的NdeI和SalI限制性位点得到野生型质粒pK7CAT、pK7hGM-CSF、pK7hGM-CSFOPT(或进一步根据罕用密码子进行优化)、pK7mGM-CSF和pK7TetA。然后我们进行重叠PCR和/或QuikChange定位诱变将琥珀终止密码子(TAG)***到不会显著影响折叠或已知为天然糖基化位点的残基上。这样得到pK7CAT_Y109STOP(SEQ ID NO：1)、pK7hGM-CSF_N36STOP(SEQ IDNO：2)、pK7hGM-CSFOPT_N36STOP(SEQ ID NO：3)、pK7mGM-CSF_N75STOP(SEQ ID NO：4)、pK7TetA_D34STOP(SEQ ID NO：5)和pK7TetA_Q182STOP(SEQ ID NO：6)。{问题：该申请将包括这些序列吗？末尾好像这些序列被删除)这些基因在T7启动子和终止子的控制下。将这些质粒转化入XL1-Blue化学感受态细胞中进行制备，并利用凯杰公司(Qiagen)质粒大抽试剂盒(凯杰，巴伦西亚，加州)进行纯化。
用于掺入非天然氨基酸的谷氨酸磷酸盐/塞多米无细胞反应的组分包括13.3μg/mL模板质粒、1.2mM AMP、0.86mM CMP、0.86mM GMP、0.86mMUMP、34μg/mL亚叶酸、170.6μg/mL大肠杆菌tRNA混合物、20种天然氨基酸各2mM、非天然氨基酸0.5-10mM、1-200μg/mL氨酰基合成酶、0.33mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、0.27mM辅酶A(CoA)、1mM腐胺、1.5mM亚精胺、4mM草酸钠、1mM二硫苏糖醇、10mM谷氨酸铵、130mM谷氨酸钾、8mM谷氨酸镁、10mM磷酸钾pH 7.2、12μM L-[14C]-亮氨酸、0.1mg/mL T7RNA聚合酶、0.01-0.4体积大肠杆菌S30提取物和0-0.41体积内膜小泡溶液。
如Grodberg和Dunn J Bacteriol，1988.170(3)：1245-53所述的T7RNA聚合酶优选来自大肠杆菌菌株BL21(pAR1219)。可从下列任何菌株制备大肠杆菌S30提取物：菌株KC6(A19ΔtonAΔtnaAΔspeAΔendAΔsdaAΔsdaBΔgshAmet+)(Calhoun和Swartz Biotechnol Prog，2005.21(4)：1146-53)、KGK10(A19ΔspeAΔtnaAΔtonAΔendAΔsdaAΔsdaBΔgshAΔgor met+，可包括TrxB-HA)、ARG1(A19ΔtonAΔtnaAΔspeAΔendAΔsdaAΔsdaBΔgshA met+OmpTD83A)、ARG2(A19ΔspeAΔtnaAΔtonAΔendAΔsdaAΔsdaBΔgshAΔgor met+OmpTD83A，可包括TrxB-HA)(基因组修饰步骤如下所述)和MCJ29(A19ΔspeAΔtnaAΔompTΔptrCΔdegPΔtonAΔendA met+)，根据如下所述步骤进行培养(Zawada和Swartz，2006，Biotechnol和Bioeng 94：618并如Liu等，Biotechnol Prog.2005.21(2)：第460-5页所述制备)。对于本领域熟练技术人员来说，可构建任何其它细胞株用于产生此种无细胞体系所使用的细胞提取物。在细胞生长过程中表达的pK7tRNAmj质粒或合成酶质粒(pK7OMeTyr)产物也可用于产生提取物。构建这些质粒使其在组成型(lpp)或可控启动子(lac、ara等)与rrnC或T7终止子之间包含合适的基因序列(参见pK7tRNAmj)。
选择unAA-PANOx-SP***作为能量***。该反应包括170mM谷氨酸钾、10mM谷氨酸铵、0.6mM ATP，GTP、UTP和CTP各0.43mM、1.5mM亚精胺、1.0mM腐胺、17μg/mL亚叶酸、85.3μg/mL大肠杆菌tRNA混合物、20种氨基酸各2mM、0.5-10mM非天然氨基酸、0-200μg/mL氨酰基合成酶、10μM L-[U-14C]-亮氨酸、0.33mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、0.27mM辅酶A(CoA)、13.3μg/mL模板质粒、0.1mg/mL T7 RNA聚合酶和0.01-0.40体积大肠杆菌S30提取物。细胞提取物来源如上所述。unAA-PANOx-SP体系也包括16mM谷氨酸镁、33mM磷酸烯醇式丙酮酸，和2.7mM草酸钠。
合成鼠GM-CSF(mGM-CSF)和人GM-CSF(hGM-CSF)活性蛋白以展示修饰的二硫键连接蛋白的生产。通常这些反应为30μL总体积的unAA-PANOx-SP反应，其中补充1-16mM氧化谷胱甘肽缓冲剂(GSSG)、1-4mM还原谷胱甘肽缓冲剂(GSH)和约0-200μg/mL DsbC或Skp。此外，预先用0-2mM碘化乙酰胺(IAM)处理细胞提取物。所必需的DsbC和Skp在菌株BL21(DE3)中过表达并纯化(Yin和Swartz，2004，Biotechnol Bioeng，86：188-95)。在需要碘化乙酰胺(IAM)处理提取物的反应中，首先在反应容器中加入小体积的浓缩IAM。然后快速加入较大体积的S30细胞提取物并与小体积IAM充分混和。在用于无细胞反应前，将提取物在室温下与IAM孵育30分钟。
如注释所述，组合的转录-翻译反应在1.5mL Eppendorf试管或皮氏培养皿中于25-37℃下进行3-24小时。
掺入非天然(氨基)酸的方案包括但不限于：(I)在无细胞反应中加入纯化的正交合成酶和正交tRNA，(II)加入纯化的正交合成酶，但在无细胞反应中转录正交tRNA，(III)从表达正交合成酶和/或正交tRNA的细胞产生细胞提取物(若需要的话，在无细胞反应中加入细胞提取物中未表达的纯化因子)，以及(IV)开发顺序蛋白表达方法。
实施例2
无细胞反应中的纯化合成酶和纯化/受控的tRNA转录
该实施例描述掺入非天然氨基酸的方案I和II。方案I是在无细胞反应中加入纯化的正交合成酶和纯化的正交tRNA，方案II在无细胞反应混合物中加入纯化的正交合成酶，但在无细胞反应中转录正交tRNA。
对于方案I，从线性模板进行体外tRNA转录。1mL反应需要：200μL 5x转录缓冲液(200mM Tris-HCl pH 7.9、100mM DTT、125mM MgCl2)、80或160μL NTP(每种NTP 25mM)混合物、10μL 24μM的3H UTP、50μL约0.1mg/ml经PCR产生的纯化线性DNA模板(位于T7启动子后，利用QIA快速PCR纯化试剂盒纯化)、25μL 40U/ml RNA酶(out)、580或505μl水、10μL 1U/ml焦磷酸酶、20μL 100mM亚精胺和20μL 5mg/ml T7RNA聚合酶。在37℃孵育该反应混合物3-3.5小时。反应后加入5μL DNA酶并在室温下孵育10分钟降解DNA。酚/氯仿抽提法进行纯化。方案II中，将tRNA表达基因盒(包括lpp启动子和rrnC终止子)克隆入pK7载体(参见所附序列)的PstI位点。
在此实施例中，我们选择将邻甲基-L-酪氨酸掺入pK7mGM-CSF_N75STOP。为进行此项实验，还需表达和纯化起源于詹氏甲烷球菌的酪氨酸-合成酶突变体。将酪氨酸-合成酶基因克隆入pK7载体并将六组氨酸标签与C末端连接。同上所述，Wang等发表了关于产生邻甲基-酪氨酸取代所必需的合成酶突变。利用合成酶突变体质粒转化BL21DE3细胞，在LB培养基中生长，在0.6OD时用1mM IPTG诱导。3OD时收集细胞，7140xg离心30分钟。在S30缓冲液(10mM醋酸Tris pH8.2、14mM醋酸镁、60mM醋酸钾)中重悬并连续洗涤细胞3次。然后重悬细胞团块，通过单道匀浆(大于20,000Ψ)裂解细胞。裂解的细胞于20,000xg离心30分钟。将上清装载于1mLNi-NTA柱(安玛西亚生物科技公司)(Amersham Biosciences)，该柱用10mM咪唑、50mM磷酸缓冲液(pH 8.0)和300mMNaCl平衡。用30ml含25mM咪唑的同一缓冲液洗柱，用含250mM咪唑的同一缓冲液洗脱。用爱米康(Amicon)Ultra-15离心过滤单元(Centrifugal Filter Unit)(5,000MWCO)浓缩纯化的样品，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)重悬并重新浓缩。
本实施例使用能够保持氧化环境(为二硫键的形成和异构化所必需)的标准PANOx-SP***，包含如下组分：170mM谷氨酸钾、10mM谷氨酸铵、16mM谷氨酸镁、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、2.7mM草酸钠、0.6mM ATP、GTP、UTP和CTP各0.43mM、1.5mM亚精胺、1.0mM腐胺、17μg/mL亚叶酸、85.3μg/mL大肠杆菌tRNA混合物、20种天然氨基酸各2mM、10μM L-[U-14C]-亮氨酸、0.33mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、0.27mM辅酶A(CoA)、13.3μg/mL pK7mGM-CSF_N75STOP、0.1mg/mL T7RNA聚合酶、4mM氧化谷胱甘肽缓冲剂(GSSG)、1mM还原谷胱甘肽缓冲剂(GSH)、100μg/mL DsbC和用1mM碘化乙酰胺(IAM)预处理30分钟的0.24体积KC6大肠杆菌S30细胞提取物。如Zawada和Swartz Biotechnol Bioeng，2006.94(4)：618-24和Liu等(同上)所述制备细胞提取物。
利用上述PANOx-SP***37℃合成3小时后，利用液体闪烁计数仪(LS3801，贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter，Inc.))测量TCA-可沉淀的放射性并进行SDS-PAGE放射性自显影(10％Bis-TrisNuPAGE凝胶在MES缓冲液中电泳)，以便对合成的蛋白进行定量。使用方案I，n＝9次反应后最大活性无细胞合成的mGM-CSF(含邻甲基-酪氨酸)约为50ng/mL，如图1定量所示，这与闪烁计数结果一致。如图1所示，产生的修饰蛋白量处于这些实验的检测下限。方案II产量同样很低，n＝9次PANOx-SP无细胞反应产生20±5ng/mL。
实施例3
体内表达正交tRNA和合成酶
本实施例所使用的标准PANOx-SP无细胞表达环境包含如下组分：170mM谷氨酸钾、10mM谷氨酸铵、16mM谷氨酸镁、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、2.7mM草酸钠、0.6mM ATP，GTP、UTP和CTP各0.43mM，1.5mM亚精胺、1.0mM腐胺、17μg/mL亚叶酸、85.3μg/mL大肠杆菌tRNA混合物、20种天然氨基酸各2mM、10μM L-[U-14C]-亮氨酸、0.33mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、0.27mM辅酶A(CoA)、13.3μg/mL pK7CAT_Y109STOP、0.1mg/mL T7RNA聚合酶和0.24体积含体内表达正交rRNA和tRNA合成酶的KC6大肠杆菌S30细胞提取物。将正交tRNA和合成酶质粒(pDule质粒，如Wang等公开，同上)转化入化学感受态KC5细胞后，如Zawada和Swartz，同上，和Liu等，同上(如下述进行修饰)所述制备细胞提取物，并在3OD时收集。
方案III包括从同时表达正交合成酶和正交tRNA的修饰细胞株中产生细胞提取物。最初按照Zawada等，发酵生物技术(Fermentation Biotechnology)，S.B.编，2003，华盛顿特区(Washington，DC)：ACS出版社，142-156所述的步骤进行发酵。然而，大肠杆菌A19苯丙氨酸营养缺陷型菌株和KC6细胞株在成分确定的培养基上的生长速度为约0.5-0.6小时-1。这样得到的细胞提取物在我们的无细胞体系中生产CAT修饰蛋白的产量与方案I和II相比并未显著提高(如图2)。换成2x YTPG生长培养基使37℃生长速度增至0.7-0.9小时-1。在提高生长速度后，进行细胞提取物的分析鉴定。通过分析实验发现细胞提取物中总蛋白质浓度可接受(～42mg/mL，布来得福特实验测定(Bradford assay))，天然氨基酸浓度低(＜0.2mM，Dionex HPLC***测定)，并且小泡浓度不同(0.5-3.5mg/L，氯仿抽提后通过磷酸实验测定(Chen等，Anal.Chem.1956.28：第1756-1758页，Fiske和Subbarow，1925，J.Biol.Chem.，66：第374-389页。在***鉴定中发现升高小泡浓度有助于提高含非天然氨基酸的蛋白产量。如图2所示，经***开发后，含4mM邻甲基-酪氨酸的CAT无细胞蛋白合成产量增至约17μg/mL活性CAT。图2所示的放射性自显影图(来自MES缓冲液中电泳的10％Bis-Tris NuPAGE凝胶)表明包含非天然氨基酸的全长蛋白浓度增加，并且截短蛋白产物的浓度降低。
实施例4
体内表达tRNA并加入纯化合成酶
增加无细胞反应中正交合成酶和tRNA的浓度能增加无细胞产物的蓄积并减少琥珀终止密码子处的蛋白截短。可能的原因是更高的浓度克服了限制正交合成酶和tRNA浓度的蛋白酶或核酸酶，引起修饰的蛋白产物产量增加。
这个方法中，实现了升高的正交tRNA水平(利用修饰的去除tRNA合成酶基因的pDULE载体)，并在细胞提取物的生产中进行控制(使用确定培养基)。然而为了最大程度降低对细胞的应激，另外生产正交合成酶。对于该实验，生产并纯化易于掺入对-叠氮基-苯丙氨酸的詹氏甲烷球菌酪氨酸-合成酶。Chin等，同上公开了必要的突变。将该基因***至T7启动子后，C末端连接六组氨酸标签，所得质粒转化到BL21DE3pLys细胞株中。细胞生长于LB培养基并在0.6OD时用1mM IPTG诱导。在3OD时收集培养物，7140xg离心30分钟。在S30缓冲液(10mM醋酸Tris pH8.2、14mM醋酸镁、60mM醋酸钾)中重悬并连续离心细胞3次。重悬细胞团块，通过单道匀浆裂解细胞。裂解的细胞于20,000xg离心30分钟。收集上清，并在室温下与DNA酶一起培育30分钟。将上清装载于1mL或5ml Ni-NTA柱(安玛西亚生物科技公司)(Amersham Biosciences)，该柱用10mM咪唑、50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)和300mMNaCl平衡。用30ml含25mM咪唑的同一缓冲液洗柱，用含250mM咪唑的同一缓冲液洗脱。用爱米康(Amicon)Ultra-15离心过滤单元(CentrifugalFilter Unit)(5,000MWCO)浓缩纯化的样品，并用7,000MWCO透析管对磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析。
将含有pK7tRNAmi质粒的KC6细胞株(也可使用前述KGK10、MCJ29、ARG1和ARG2株)培养于装有确定培养基的4或10升发酵罐中。在3OD时收集发酵物，根据Liu等，同上所述简略步骤制备提取物。对该步骤进行如下修改：(1)匀浆离心后不进行S30缓冲液稀释，(2)进行一个透析步骤。在一些情况下，90分钟径流(runoff)反应后的最终离心步骤可略去，以保存更高的小泡浓度。检测小泡浓度的步骤可获自Chen等，同上和Fiske和Subbarow，同上。
本实施例中进行的unAA-PANOx-SP反应包括170mM谷氨酸钾、10mM谷氨酸铵、0.6mM ATP，GTP、UTP和CTP各0.6mM，1.5mM亚精胺、1.0mM腐胺、17μg/mL亚叶酸、85.3μg/mL大肠杆菌tRNA混合物、20种天然氨基酸各2mM、4mM非天然氨基酸、0-167μg/mL氨酰基合成酶、10μM L-[U-14C]-亮氨酸、0.33mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、0.27mM辅酶A(CoA)、13.3μg/mL pK7CAT_Y109STOP、0.1mg/mL T7RNA聚合酶和0.24体积大肠杆菌S30细胞提取物。细胞提取物的来源如上所述。unAA-PANOx-SP***也包括16mM谷氨酸镁、33mM磷酸烯醇式丙酮酸和2.7mM草酸钠。这些反应在30℃下进行所示时间长度。
方案IV中，细胞提取物制备中tRNA的受控表达(由缺少tRNA合成酶基因的修饰的pDule质粒表达)、修饰的细胞提取物制备实验方法以及将纯化的对-叠氮基-苯丙氨酸合成酶加入unAA-PANOx-SP无细胞反应中都引起修饰蛋白产量的提高。如图3A所示，与图2所示相比，提高合成酶浓度能使全长活性CAT产量提高约10倍(大于125μg/mL)。经过比色实验的测定，90-100％可溶性CAT浓度为正确折叠的活性蛋白。对细胞提取物制备实验方案的这些修改有助于提供更高的正交tRNA和小泡浓度，这些是将修饰蛋白合成时间延长8小时所必需的(参见图3B)。这保证了活性氧化磷酸化通路，其证据(参见图3C)是在蛋白合成的第一个小时最初消耗PEP后持续形成产物。
实施例5
改进用于掺入非天然氨基酸的细胞提取物
尽管在组合的转录/翻译***中产生了活性细菌和哺乳动物分泌蛋白，但我们追求更高的产量。我们发现其中一种限制性组分是正交合成酶的浓度。该组分限制的一个原因如图4第一泳道所示。这是正交对-叠氮基-苯丙氨酸tRNA合成酶蛋白产物，产生于37℃下3小时标准PANox-SP无细胞蛋白质合成反应。反应条件如实施例2所述(用L-[U-14C]-亮氨酸标记产物)。正交合成酶似乎受到了蛋白酶降解。在KC6细胞细胞提取物中加入多于500μg/mL L-[U-14C]-亮氨酸标记的正交合成酶进一步证实了这一点。37℃孵育6小时后，放射性自显影未检测到全长合成酶。通过控制合成酶降解，我们尝试增加修饰蛋白的产量。
使用Swartz实验室产生并证实能够将二硫键还原酶浓度降至最低并稳定氨基酸浓度的细胞株(KGK10和KC6)来构建新的细胞株。缺失或突变编码外膜蛋白T的ompT基因对细胞进行修饰，使基因产物缺失，或者虽然仍出现在我们的细胞提取物中，但无蛋白酶活性，而保留侣伴蛋白活性。
如Jewett在其博士论文中(化学工程系，2005，斯坦福大学：斯坦福，第240页)所述产生MCJ29突变株。利用pKO载体[28]构建用于等位基因交换的质粒，通过基因置换得到ARG1和ARG2突变体。利用引物ompTNo和ompTCo(基于获自G.M.Church网站的序列)从基因组DNA中PCR扩增侧接待置换基因ompT的约1kb片段。利用合适的限制性酶NotI和SalI，我们将PCR产物从野生型ompT克隆到pKOV载体中。然后将所需的D83A突变引入野生型ompT基因序列，使用的是QuikChange定位诱变试剂盒及引物ompTD83AmutF(SEQ ID NO：11)(GTGGCAATATGGTCGCTCAGGACTGGATGG)和mutR(SEQ ID NO：12)(GGTAGGTCAAGGACTCGCTGGTATAACGGTG)。将克隆入pKOV基因置换载体的突变等位基因电穿孔到KC6(最终生成ARG1)或KGK10(最终生成ARG2)中，30℃下细胞恢复1小时。将细胞铺于预热的氯霉素/LB平板并在42℃孵育。为检测整合频率，电穿孔细胞也铺于氯霉素/LB平板并在30℃孵育。从42℃平板上挑选1-5个集落到1mL LB肉汤中，连续稀释并立即铺于30℃5％w/v蔗糖平板上。在30℃氯霉素平板上筛选5％蔗糖平板上的集落以检测置换载体的丢失。总而言之，我们通过“集落挑选”寻找蔗糖耐受和氯霉素敏感的集落中的置换事件，并用引物ompT5’和ompTD83APCR确证我们的选择。结果是新细胞株ARG1和ARG2在ompT基因中包含失活的D83A突变。
图4显示在无细胞蛋白质合成反应中表达后正交合成酶蓄积的放射性自显影分析。用MES缓冲液中电泳的10％Bis-Tris NuPAGE凝胶进行放射性自显影。对-叠氮基-苯丙氨酸tRNA合成酶被KC6细胞提取物中的蛋白酶严重降解。当使用ARG1、ARG2或MCJ29突变细胞株生产细胞提取物时，合成酶不被降解(因为所有结果均类似故只给出一个实例)。当将ompT缺失或突变掺入KC6或KGK10细胞株中时，新产生的合成酶是稳定的。
，第二泳道，对制备细胞提取物所使用细胞进行的这些基因组修饰几乎可以消除标准PANOx-SP反应时产生的对-叠氮基-苯丙氨酸tRNA合成酶的降解作用。当对-乙酰基-苯丙氨酸合成酶与ARG1和MCJ29细胞提取物37℃共孵育6小时后，观察到相同的结果。
实施例6
在无细胞平台中高水平生产含非天然氨基酸的细菌蛋白
当使用上述任何备选能量***时，选择unAA-PANOx-SP举例说明包含非天然氨基酸的蛋白产量增加。具体说，在本实施例中无细胞反应包括170mM谷氨酸钾、10mM谷氨酸铵、0.6mM ATP，GTP、UTP和CTP各0.6mM，1.5mM亚精胺、1.0mM腐胺、17μg/mL亚叶酸、85.3μg/mL大肠杆菌tRNA混合物、20种天然氨基酸各2mM、2mM非天然氨基酸、150μg/mL氨酰基tRNA合成酶、10μM L-[U-14C]-亮氨酸、0.33mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、0.27mM辅酶A(CoA)、13.3μg/mL模板质粒、0.1mg/mL T7RNA聚合酶和0.29体积含正交詹氏甲烷球菌tRNA的S30提取物(使用专用细胞系之一制备)。细胞提取物的来源如上所述。unAA-PANOx-SP***也包括16mM谷氨酸镁、33mM磷酸烯醇式丙酮酸和2.7mM草酸。
图5显示含对-叠氮基或对-乙酰基-苯丙氨酸的CAT产量(与图2显示数据相比)有显著性增加。方案I和II与图1显示的mGM-CSF产量相似。类似的，方案IIIa证实了图2、实施例3中显示的提高的修饰蛋白产量。此外，方案IIIb证实了图3中显示的重复性和合成酶限制。最后，利用本实施例所列举的组合物，方案IIIc显示unAA-PANOx-SP组分比例(非天然氨基酸、正交合成酶和细胞提取物)的优化、反应条件的优化(30℃8小时)、使用突变细胞株制备细胞提取物(ARG1和ARG2)及其制造过程的修饰，将pK7tRNAmj质粒掺入新细胞株中，一种新型基于细菌的无细胞体系，其产生包含对-叠氮基或对-乙酰基-苯丙氨酸的修饰蛋白的产量增加2-3倍(多于300μg/mL)。其产量约为类似无细胞反应(不加入非天然氨基酸)中野生型CAT蛋白产量的75％。此外，如图5所示，通过放射性自显影分析方案IIIc中蛋白产物显示，无细胞反应的产物主要是包含非天然氨基酸的全长蛋白。
实施例7
合成具有生物活性的含非天然氨基酸的哺乳动物分泌蛋白
由于设计出一种新型基于细菌的无细胞体系并能增加CAT产量，因此可以开始将非天然氨基酸掺入到一些不同的复合蛋白中，而尚未生产出含有非天然氨基酸的此类蛋白。本文所示复合蛋白的例子为mGM-CSF、hGM-CSF和TetA膜蛋白。此类技术平台可延伸至本实施例未指出的大量复合蛋白，包括但不限于融合蛋白、单链可变区片段(scFv)、Fab抗体片段和全长抗体。
在进行类似于实施例6所述的unAA-PANOx-SP无细胞反应后，通过细胞增殖实验检测pK7mGM-CSF_N75STOP、pK7hGM-CSF_N36STOP或pK7hGM-CSFOPT_N36STOP产生的活性蛋白。为了保证折叠正确，通过补充4mM GSSG、1mM GSH和约100μg/mL DsbC到反应混合物中修饰实施例6所述unAA-PANOx-SP***，以保持氧化蛋白折叠环境。此外，使用1mM碘化乙酰胺(IAM)预处理细胞提取物。首先在反应容器中加入小体积的浓缩IAM。然后快速加入较大体积的S30提取物并与小体积IAM充分混和。在用于无细胞反应前，将提取物在室温下与IAM孵育30分钟。使用包含修饰的pDule质粒(缺少tRNA合成酶基因)的KC6细胞株制备细胞提取物并在30℃下进行无细胞反应6小时。
利用mGM-CSF或hGM-CSF依赖性细胞系、NFS-60或TF1(购自ATCC)检测鼠和人的GM-CSF生物学活性。将可溶性无细胞表达蛋白以及鼠和人GM-CSF的商品化标准品一式三分地进行连续稀释。将等体积的含10％FCS的RPMI培养液和对数期细胞培养物加入连续稀释的无细胞产物和GM-CSF标准品中以检测其刺激细胞增殖的能力。细胞以5000个细胞的浓度接种到96孔平底组织培养板中。37℃和5％CO2孵育NSF-60细胞16-20小时，孵育TF1细胞36-48小时，每孔加入50μL[3H]-胸苷使终浓度为6.7μCi/mL，通过[3H]-胸苷掺入检测增殖。37℃和5％CO2中孵育细胞8-10小时后，将细胞收集到玻璃纤维过滤垫上并洗涤。利用瓦拉赫(Wallach)1450微β闪烁计数器(珀金埃尔默公司生命科学部(Perkin Elmer Life Sciences))测定[3H]-胸苷的掺入。
图6显示unAA-PANOx-SP无细胞蛋白合成体系产生修饰二硫键连接蛋白的产量。此外，如图7的生物学活性数据(采用前述方法)所示，所产生的蛋白折叠正确并具有生物学活性。这些结果表明新型无细胞体系产生包含非天然氨基酸的活性二硫键连接蛋白具有GM-CSF活性，与体内***产生的蛋白活性相当。那些不包含正交tRNA、合成酶、非天然氨基的无细胞反应不产生任何刺激细胞增殖的蛋白。这些数据也表明在N或C末端含GM-CSF或类似免疫刺激物的融合蛋白构建物可掺入非天然氨基酸，并可通过此种新型无细胞蛋白合成平台生产。
实施例8
将非天然氨基酸掺入膜蛋白
使用谷氨酸磷酸盐无细胞体系产生正确折叠膜蛋白的独特性在于它也需要使用由Muller和Blobel Proc Natl Acad Sci USA，1984，81(24)：7737-41和Osborn等，J Biol Chem 1972.247(12)：3962-72改造的方法制备小泡溶液。重悬KC6细胞并用20mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA洗涤。最终细胞团块重悬于同样缓冲液(每克细胞使用1mL缓冲液)并在冰上与0.2mg/mL鸡蛋白溶菌酶共同孵育15分钟。孵育后，细胞溶液通过20,000Ψ匀浆器三次。30,000xg 20分钟离心两次去除未破碎的细胞和碎片。超速离心(154,000xg，1.5小时)收集小泡，并用0.5mL/g细胞含250mM蔗糖的缓冲液H(20mM HEPES-KOH pH7.5，1mM DTT、5mM EDTA)以231,000xg离心1小时重新得到团块。将这些粗纯化的小泡重悬于20％(w/w)蔗糖中，并装载于含50％、45％、40％、35％、30％和25％(w/w)蔗糖层的步进梯度的顶部。114000xg超速离心24小时后，收集含内膜小泡的组分。小泡形成团块后以高浓度(1-2mg/mL)重悬于20mMHEPES-KOH pH 7.2、60mM KCl、1mM DTT中。
生成无细胞组分后，我们使用组合谷氨酸磷酸盐转录/翻译体系合成含非天然氨基酸(对-叠氮基-苯丙氨酸)的膜蛋白TetA，并评估它是否能够正确折叠到小泡膜中。用于掺入非天然氨基酸的谷氨酸磷酸盐无细胞反应的组分包括13.3μg/mL pK7TetA_D34STOP或pK7TetA_Q182STOP(参见所附序列)、1.2mM AMP、0.86mM CMP、0.86mM GMP、0.86mM UMP、34μg/mL亚叶酸、170.6μg/mL大肠杆菌tRNA混合物、20种天然氨基酸各2mM、4mM非天然氨基酸、75μg/mL氨基酰基合成酶、0.33mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、0.27mM辅酶A(CoA)、1mM腐胺、1.5mM亚精胺、4mM草酸钠、1mM二硫苏糖醇、10mM谷氨酸铵、130mM谷氨酸钾、8mM谷氨酸镁、10mM磷酸钾pH 7.2、12μM[14C]-亮氨酸、0.1mg/mL T7RNA聚合酶、0.29体积大肠杆菌S30细胞提取物和0.21体积内膜小泡溶液。
图8A的放射性自显影中清楚表明，我们能生产含非天然氨基酸的TetA膜蛋白(42.5kDa)。这是在37℃无细胞蛋白质合成6小时的结果。使用液体闪烁计数器测量TCA-可沉淀放射性，能定量测定合成的总蛋白质。质粒pK7TetA_D34STOP和pK7TetAQ182STOP产生的TetA突变蛋白为226和349μg/mL。在进一步分析前，相对500-1000体积的10mM Tris-HCl pH 8.0、100mMKCl缓冲液在100kDa MWCO透析袋中透析三次，每次透析3小时，透析后更换缓冲液，从而粗纯化该反应。
为了测定***大肠杆菌小泡的蛋白量，我们将透析的无细胞反应产物进行蔗糖浮选实验。将透析的无细胞反应产物与浓蔗糖溶液混和，并装载于三步蔗糖梯度的底部。选择层密度，以便在超速离心(16小时，237,000xg)后，错误折叠的蛋白聚集体(密度ρ～1.3g/mL)停留于底层，而较轻小泡(ρ～1.13-1.25g/mL，取决于被***蛋白的量)漂浮于第二层之上的交界面上。图8显示了蔗糖浮选分析后放射性标记的TetA的分布。在整个梯度中加入6M尿素以减少合成蛋白与膜的非特异性结合。当反应中出现小泡时，我们发现大多数合成TetA与小泡结合(组分2)。当蛋白合成反应中不加入小泡时不发生这种结合，正如聚集TetA保留在较低组分中(组分6-8)所揭示的那样。不包含另外小泡的反应未出现大量膜结合或聚集的蛋白产物。这强调了包含非天然氨基酸的蛋白质的生产过程中氧化磷酸化的重要性。当不另外加入小泡时此通路不激活。如图8B所示将要***小泡的TetA的量对应于每mL无细胞反应产生大于100μg***TetA的总体产量。既然Q182STOP反应的主要产物是截短且与小泡连接的，因此显然也***了截短的182氨基酸TetA(参见图8A)。
为了保证我们的膜蛋白正确***小泡，我们将透析的反应混合物暴露于2μg/μL非特异性蛋白酶-蛋白酶K。与膜内片段或小泡内部的片段相比，未包埋入膜的膜蛋白部分-如胞质结构域或跨膜片段间的大环-被蛋白酶更快速降解。因此，通过观察随时间推移蛋白酶K消化产生的蛋白片段，我们可以验证蛋白是否具有对应于正确折叠的所需拓扑结构。
图9显示了与蛋白酶K 25℃孵育后的带型。甚至在孵育60分钟后，小泡中仍然出现了显著比例的全长TetA。然而，当用LDS去污剂溶解膜后，TetA不再受到保护避免消化。因此，TetA被掺入小泡膜中。
这些数据表明利用无细胞表达***合成大量修饰膜蛋白质；并进一步显示合成蛋白被***小泡中并正确折叠。
实施例9
合成优化的MS2基因
材料和方法
质粒构建利用DNAworks根据大肠杆菌tRNA相关浓度(优选密码子)和从寡核苷酸合成对MS2外被蛋白基因进行优化。利用两步PCR，将基于DNAworks推荐序列的寡核苷酸(平均长度60bp，欧普龙技术公司，美国)(OperonTechnologies，USA)组装到优化的MS2外被蛋白基因核苷酸序列中。将优化的MS2外被蛋白序列连接(T4 DNA连接酶，NEB公司，美国)入pET-24a(+)载体(诺瓦基公司，美国)(Novagen，USA)的Nde I和Sal I限制性位点中，产生pET24a-MS2cp。用pET24a-MS2cp转化DH5α细胞(One Shot MAXXEfficiency DH5α-T1R感受态细胞，英杰公司(Invitrogen))，并用凯杰质粒大抽试剂盒(凯杰公司，巴伦西亚，加州)纯化质粒。利用两步PCR和定制寡核苷酸(欧普龙技术公司，美国)，将T15STOP(琥珀终止密码子)取代突变入MS2cp序列。将突变序列连接入pET24a(+)载体(诺瓦基公司，美国)的Nde I和Sal I限制性位点中，命名为pET24a_MS2cp_T15STOP。用载体转化DH5α细胞(One ShotMAXX Efficiency DH5α-T1R感受态细胞，英杰公司)，并用凯杰质粒大抽试剂盒(凯杰公司，巴伦西亚，加州)纯化用于无细胞蛋白合成反应的质粒。优化的外被蛋白序列提供为SEQ ID NO：9。
实施例10
表达含非天然氨基酸的MS2外被蛋白
材料和方法
PANOx-SP无细胞表达***。本实施例进行的PANOx-SP无细胞反应6为30μL体系，在1.5mlEppendorf试管中30℃孵育8小时。该反应包括如下组分：1.2mM ATP，GTP、UTP和CTP各0.85mM，34μg/mL亚叶酸、170.6μg/mL大肠杆菌tRNA混合物、24nM pET24aMS2_T15STOP质粒、100μg/mL T7RNA聚合酶、5μM 1-[U-14C]-亮氨酸、20种未标记的氨基酸各2mM、4mM对-叠氮基-苯丙氨酸、～150μg/mL纯詹氏甲烷球菌突变的酪氨酸合成酶、0.33mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、0.27mM辅酶A(CoA)、30mM磷酸烯丙醇丙酮酸、1.5mM亚精胺、1mM腐胺、170mM谷氨酸钾、10mM谷氨酸铵、20mM谷氨酸镁、2.7mM草酸钠和28％v/v KC6_tRNA S30细胞提取物，如下所述进行制备。如Grodberg和Dunn所述从大肠杆菌菌株BL21(pAR1219)中制备T7RNA聚合酶。
纯化詹氏甲烷球菌正交酪氨酸合成酶。在本实验中生产并纯化易于掺入对-叠氮基-苯丙氨酸的詹氏甲烷球菌酪氨酸-合成酶突变体。Chin等，同上公开了必要的突变。将该基因***到T7启动子后，六组氨酸标签连接于C末端，将所得质粒转化到BL21DE3pLys细胞株中。该细胞生长于LB培养基中并在0.6OD时用1mM IPTG诱导。在3OD时收集细胞并以7140xg离心30分钟。重悬细胞并用S30缓冲液(10mM醋酸Tris pH 8.2，14mM醋酸镁、60mM醋酸钾)连续洗涤三次。重悬细胞团块，通过单道匀浆裂解细胞。裂解的细胞于20,000xg离心30分钟。收集上清并在室温下与DNA酶孵育30分钟。将上清装载于1mL或5ml Ni-NTA柱(安玛西亚生物科技公司)(Amersham Biosciences)，该柱用10mM咪唑、50mM磷酸盐缓冲液(pH 8.0)和300mMNaCl平衡。用30ml含25mM咪唑的同一缓冲液洗柱，用含250mM咪唑的同一缓冲液洗脱。用爱米康(Amicon)Ultra-15离心过滤单元(Centrifugal Filter Unit)(5,000MWCO)浓缩纯化的产物，并用7,000MWCO透析管对磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析。
生产含有高浓度正交tRNA的S30细胞提取物。该方法中，得到升高的正交tRNA水平(利用tRNAmj基因，SEQ ID NO：10，***pK7载体)，并在细胞提取物生产中加以控制。用细胞株KC6(A19ΔtonAΔtnaAΔspeAΔendAΔsdaAΔsdaBΔgshA met+)生长中表达的pK7tRNAmj质粒产生细胞提取物。包含pK7tRNAmj质粒(称作KC6_tRNA)的KC6细胞株(也可使用KGK10、MCJ29、ARG1和ARG2)培养于含确定培养基的4-升发酵罐中(18)。在3OD时收集发酵物，并用Liu等所述简略步骤制备细胞提取物。对该步骤进行如下修改：(1)匀浆离心后不进行S30缓冲液稀释，(2)进行一次透析步骤。。
检测蛋白产量利用液体闪烁计数仪(LS3801，贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter，Inc.))测量TCA-沉淀和放射性，以检测蛋白合成总量。样品在25℃和15,000RCF离心15分钟后，对上清进行TCA沉淀和闪烁计数，以测定可溶性蛋白的产量。
结果
进行使用pET24a_MS2cp_T15STOP的30μL的PANOx SP***无细胞反应，经测定总蛋白和可溶性蛋白的产量分别为77μg/ml(±6.6μg/ml)和63μg/ml(±3.2μg/ml)，如图10所示。
实施例11
展示掺入对-叠氮基-苯丙氨酸的MS2VLP的组装体
材料和方法：
SDS-PAGE和放射性自显影15,000xg离心15分钟将可溶性蛋白与不溶性组分分离。将样品与Mark12MW分子量标准品(英杰公司)施加于MES缓冲液中的NuPAGE 10％Bis Tris凝胶(英杰公司，加利福尼亚州拉霍亚)中电泳。利用考马斯亮蓝染料(伯乐公司(BioRad))对凝胶进行染色，并在干胶仪(型号583)(伯乐公司，里士满，加州)上干燥，然后在柯达科学成像胶片(罗彻斯特，纽约州)上曝光。
透析为了移除未掺入的L-[U-14C]-亮氨酸，在6-8000MWCO Specra/ProMolecularporous膜管(光谱实验室公司)(Spectrum Labs)中对300mL TSM缓冲液(10mM Tris-HCl、100mM氯化钠、1mM氯化镁，pH 7.0)透析无细胞产物过夜，期间缓冲液更换两次。
蔗糖步进梯度速率沉降对透析的无细胞rxn产物进行蔗糖非连续梯度离心。多聚阿洛糖16x102mm离心管(贝克曼公司，加利福尼亚州帕洛阿尔托)中依次充满1mL蔗糖溶液，这些溶液是用TSM缓冲液和15mM EDTA配制的，其中蔗糖浓度以2.5％w/v的步长逐步降低(40％、37.5％、35％、32.5％、30％、27.5％、25％、22.5％、20％、17.5％、15％、12.5％、10％w/v)。透析的无细胞反应产物位于试管顶部，并在安装贝克曼库尔特公司的SW-32摆臂吊桶转头(加利福尼亚州富勒敦)的贝克曼L8-M超速离心机中以4℃31,000rpm离心3.5小时，并采用“缓慢”加速(程序9)和“无刹车”减速。利用Teledyne Isco FoxyJr.密度梯度分级***(新英格兰州林肯)收集0.5mL组分，并用TCA-沉淀和液体闪烁计数器(LS3801，贝克曼库尔特公司)放射性测定来检测每一组分中MS2外被蛋白的浓度。
蔗糖梯度组分放射性标记的MS2外被蛋白产量的测定将各组分50μL点样在不同色谱纸(沃特曼公司，美国)上，干燥后通过检测放射性从而测定每一蔗糖梯度组分中MS2外被蛋白产量。将色谱纸浸没于5mL贝克曼Readysafe闪烁混合物中，在液体闪烁计数器(LS3801，贝克曼库尔特公司)上计算放射性。根据MS2外被蛋白分子量及MS2外被蛋白中可掺入放射性标记的亮氨酸的亮氨酸数目，将放射性计数转化为产量。
VLP浓缩用梯度组分和TSM缓冲液填充艾米康(Amicon)Ultra-4 100,000MWCO离心过滤装置至4ml，以便浓缩含VLP的蔗糖梯度组分。在配备Fiberlite F13-14x15cy转头(派拉蒙技术公司(Piramoon Tech.))和Fiberlight 15mL适配器(派拉蒙公司)的索福(Sorvall)RC5B离心机中，将该单元4℃ 5,500rpm离心15分钟。立即取出浓缩样品并储存于4℃。
结果
平行进行阳性、阴性对照，以证实在使用pET24a_MS2cp_T15STOP载体的PANOx-SP修饰的无细胞反应中产生的所有蛋白质均包含对-叠氮基-苯丙氨酸非天然氨基酸。在相同条件、但不存在正交合成酶的情况下进行阴性对照。在PANOx-SP修饰的无细胞反应中，利用pET24a_MS2cp载体进行阳性对照实验。在方法部分描述的基于原核细胞的无细胞反应中pET24a_MS2cp_T15STOP载体表达的，经过蔗糖梯度速率沉降和放射性计数测定的掺入对-叠氮基-苯丙氨酸的MS2外被蛋白的组装体产量为22μg/mL(+/-0.6μg/mL，n＝2)，如图11所示。
实施例12
通过赛默菲尼根(ThermoFinnigan)LCQ Deca XP+离子阱LC-MS检验含有 180个可及对-叠氮基-苯丙氨酸的MS2 VLP的组装体
材料和方法
质谱实验方法利用艾米康-ultra4膜滤器浓缩非天然氨基酸掺入的MS2衣壳和对照野生型MS2衣壳。这些样品获自组装的MS2VLP，组装的MS2VLP来自与图11所示类似的蔗糖密度梯度样品。将这些样品施加于SDS-PAGENuPAGE 10％Bis Tris凝胶(英杰公司，加利福尼亚州拉霍亚)。在MES电泳缓冲液(英杰公司)中60mA条件下将样品与Mark12MW分子量标准品(英杰公司)电泳60分钟，并用SimplySafe染料(英杰公司)进行染色。以少量水冲洗凝胶过夜使其脱色。将13.7kD条带从湿的凝胶上切下，尽可能避免周围空白胶。
在切出的凝胶片段中加入10mL 45mM二硫苏糖醇(DTT，西格玛公司)和100mL 100mM Tris pH 7.8，55℃孵育样品30分钟，之后弃去溶液相。接下来在凝胶片段中加入10mL 100mM丙烯酰胺(ICN)和100mL 100mM TrispH 7.8并将混合物室温下孵育30分钟。再一次弃去溶液相。用500mL 50mMTris pH 7.8/50％乙腈(ICN)洗涤凝胶片段30分钟，弃去溶液相。然后在SpeedVac旋转蒸发装置中将凝胶片段完全干燥。最后，将25mM Tris pH 7.8配制的5pmol糜蛋白酶加入到凝胶片段中，溶胀后，加入足量的25mM Tris pH 7.8刚好淹没凝胶片段。37℃孵育片段过夜。去除溶液相，不作进一步处理，直接注入赛默菲尼根LCQ Deca XP+离子阱LC-MS并进行分析。
结果
图13A显示包含T15氨基酸的MS2野生型衣壳单体的糜蛋白酶消化片段的HPLC图(881.6m/z)。消化后，含T15片段的序列为(SEQ ID NO：13)VLVDNGGTGDVTVAPSNF，MW＝1761.91，m/z＝882。图13B显示MS2野生型单体样品，并显示我们预计若包含非天然氨基酸，则会出现如图13A所示同一片段的HPLC图区域(912m/z)。预计包含T15对-叠氮基-苯丙氨酸的片段的序列为(SEQ ID NO：13)VLVDNGGXGDVTVAPSNF，其预计分子量和质荷比为MW＝1821，m/z＝912。不出所料，野生型MS2对照样品不包含非天然氨基酸，因为糜蛋白酶解后未发现对应预计非天然氨基酸掺入片段洗脱的峰。
图13C显示T15位被对-叠氮基-苯丙氨酸取代的MS2衣壳的色谱图。如前所述，若非天然氨基酸未被掺入，该位置出现我们期望的片段。显然并非如此。最后，图13D显示了含T15对-叠氮基-苯丙氨酸取代的MS2单体样品的HPLC图和测定的荷质比。在预期处洗脱出峰，且该峰具有掺入非天然氨基酸的肽片段的预期质荷比。这些结果允许我们得出结论：我们成功将对-叠氮基-苯丙氨酸掺入到MS2病毒衣壳的外部表位上。
应当被理解的是本发明不局限于所述具体方法、实验方法、细胞系、动物种属、构建物或诸如此类。同样应被理解的是本文所用术语仅仅用于描述具体实施方式，而非限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。
除非另有说明，所有本文使用的技术和科学术语具有本发明所属领域一般熟练技术人员通常理解的含义。尽管与本文所述相似或相等同的任意方法、设备和材料均可用于实践或检测本发明，但本文仍叙述了优选的方法、设备和材料。
所有本文提及的公开物通过引用纳入本文，用以描述和公开，例如，公开物中所述的细胞系、构建物和方法，它们可用于本发明。提供如上所述和遍及全文的公开物仅因为其公开日早于本申请的提交日。本文不承认本发明人没有资格根据现有发明而提前公开本申请。
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Claims (19)

1.一种在无细胞体外反应中合成多肽的方法，该多肽包含至少一个位点特定的非天然氨基酸，所述方法包括：
在无细胞体外翻译反应混合物中合成所述多肽，所述反应混合物包含与无义密码子形成碱基配对的正交tRNA、细菌细胞提取物、多肽和/或mRNA合成机器组分；所述多肽的转录模板；合成所述多肽的单体；翻译所需的辅因子、酶和其它试剂；
其中所述反应混合物包含浓度至少10μg/ml外源性合成的正交tRNA合成酶，所述正交tRNA合成酶能用非天然氨基酸氨酰化正交密码子；其中合成所述多肽使其含有至少一个位点特定的非天然氨基酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，加入所述反应混合物的所述外源性合成的正交tRNA合成酶的浓度为至少30μg/ml。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正交tRNA由作为所述细菌细胞提取物来源的细菌内源性合成。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应混合物产生至少约50μg/ml含至少一个位点特定的非天然氨基酸的蛋白质。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述含至少一个位点特定的非天然氨基酸的蛋白质中至少50％具有生物学活性。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含至少一个位点特定的非天然氨基酸的蛋白质由偶联的转录翻译反应合成。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述正交tRNA与终止密码子形成碱基配对。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述无细胞体外翻译反应中，氧化磷酸化是激活的。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述无细胞体外翻译反应中加入外源性膜小泡。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含至少一个位点特定的非天然氨基酸的蛋白质为膜结合蛋白。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含至少一个位点特定的非天然氨基酸的蛋白质为分泌蛋白。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含至少一个位点特定的非天然氨基酸的蛋白质含有至少一个二硫键。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽为病毒外被蛋白。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，合成两种或更多种外被蛋白。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述病毒外被蛋白是噬菌体外被蛋白。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述噬菌体是MS2。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非天然氨基酸是修饰的苯丙氨酸或酪氨酸。
18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非天然氨基酸选自对-乙酰基-苯丙氨酸、对-乙炔基-苯丙氨酸、对-炔丙基氧基苯丙氨酸或对-叠氮基-苯丙氨酸。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无细胞体外翻译反应包含衍生自ompT-突变细菌菌株的细菌提取物。
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