JP3896460B2 - 非天然蛋白質の製造方法、固定化方法及びキット - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、生物が普遍的に利用する２０種類のＬ−α−アミノ酸に存在しない側鎖を持つ非天然アミノ酸が部位特異的に組込まれた非天然蛋白質を製造する非天然蛋白質の製造方法、及びその非天然蛋白質を固定化する非天然蛋白質の固定化方法、及びその非天然蛋白質の製造用キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、この種の非天然蛋白質の製造方法としては、例えば、非天然型アミノ酸組込み蛋白質とその製造法及び試薬キットが知られている（特許文献１参照）。この製造法は、無細胞蛋白質合成系下で、特定のアミノ酸に対応するアイソアクセプティングｔＲＮＡのうち、一部のもののみを非天然型アミノ酸と結合させたものと、蛋白質構成アミノ酸とを用いて蛋白質合成を行って、非天然型アミノ酸を特定のコドングループに組込むものである。また、前記非天然型アミノ酸は、ａ．天然型アミノ酸中の原子を安定同位体で置換したもの、ｂ．天然型アミノ酸中の原子を放射性同位体で置換したもの、ｃ．天然型アミノ酸の側鎖の光学異性体、ｄ．天然型アミノ酸の側鎖に置換基を導入したもの、ｅ．天然型アミノ酸の側鎖を置換して疎水性、反応性、蛍光性、荷電状態、分子の大きさ、水素結合能を変化させたもの、等が挙げられる。
【０００３】
一方、従来より、蛋白質のＸ線結晶構造解析には、例えば非特許文献１に開示されている方法により製造されたセレノメチオニン置換タンパク質が用いられている。このセレノメチオニン置換タンパク質を製造する際には、まず、大腸菌のメチオニン要求株と目的タンパク質の遺伝子が挿入されているプラスミドを準備して形質転換を行った後、抗生物質を含むアガロースゲルプレートを用いて目的タンパク質を発現する単一コロニーを単離する。次に、単離された形質転換体をメチオニンの代わりにセレノメチオニンを含む培地中で培養することにより目的タンパク質を発現させて精製する。
【０００４】
【特許文献１】
特許第３３１７９８３号公報
【非特許文献１】
清水敏之、岡田健吾、箱嶋敏雄、第１７章 Ｘ線結晶構造解析 セレノメチオニン置換タンパク質の発現と調製、「基礎生化学実験法３ タンパク質Ｉ．検出・構造解析法」、株式会社東京化学同人、第１版第１刷 ２００１年２月１５日、ｐ．１８９−１９０。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、前記従来の非天然型アミノ酸組込み蛋白質の製造法では、前記ｄ及びｅの置換基の種類、性質、大きさ等が十分に厳選されていなかったことから、それら非天然型アミノ酸の組込み効率に著しい差異が生じやすく、実用的ではなかった。さらに、この製造法では、リボソームとの結合において立体障害となるような巨大な置換基が導入された非天然型アミノ酸の組込みは事実上不可能であった。
【０００６】
一方、前記従来のセレノメチオニン置換タンパク質を製造する際には、前記目的タンパク質のメチオニンが取り込まれるべき全ての位置にセレノメチオニンが取り込まれて置換されることから部位特異的な置換を行うことができなかった。このため、この製造方法にて製造されたタンパク質では、セレノメチオニンの置換数が多すぎる場合には溶解度が著しく低下することから精製や結晶化が困難になり、逆に目的タンパク質中の構成アミノ酸としてメチオニンを含まない場合にはそのままの状態では適用できないといった様々な不都合が生じていた。
【０００７】
この発明は、上記のような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、生理活性の低下を抑えつつ、蛋白質構成アミノ酸として非天然アミノ酸を高効率で部位特異的に組込むことが容易な非天然蛋白質の製造方法を提供することにある。別の目的とするところは、蛋白質構成アミノ酸として非天然アミノ酸が部位特異的に組込まれているうえ、生理活性の低下を抑えることが容易な非天然蛋白質を提供することにある。その他の目的とするところは、生理活性の低下を抑えつつ、部位特異的に非天然蛋白質を固定化することが容易な非天然蛋白質の固定化方法を提供することにある。一方、この発明のそれ以外の目的とするところは、Ｘ線構造解析に容易に利用することができる非天然蛋白質、その製造方法及び製造用のキットを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明の非天然蛋白質の製造方法は、非天然アミノ酸が部位特異的に組込まれた非天然蛋白質を製造する方法であって、チロシンアナログと、サプレッサーｔＲＮＡと、前記チロシンアナログをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とを含有する蛋白質合成系に、鋳型を加えて蛋白質合成させる蛋白質合成工程及び該蛋白質合成工程後の後修飾工程を含み、前記チロシンアナログはアジドチロシン、アセチルチロシン、アミノチロシン又はドーパであり、前記鋳型は前記サプレッサーｔＲＮＡが認識する終止コドンを翻訳領域に配したポリヌクレオチドであり、前記後修飾工程は、前記チロシンアナログの側鎖のアジド基、アセチル基、アミノ基又は水酸基を修飾して蛍光物質を含む修飾物を結合させることにより前記チロシンアナログを蛍光性チロシンアナログ修飾体にする工程であることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項２に記載の発明の非天然蛋白質の製造方法は、請求項１に記載の発明において、前記チロシンアナログはアジドチロシンであり、前記修飾物は蛍光物質と該蛍光物質に結合されたトリアリールホスフィン誘導体であって、蛍光物質とトリアリールホスフィン誘導体とを結合させ、その結合された修飾物を前記アジド基に結合させることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項３に記載の発明の非天然蛋白質の製造方法は、請求項１又は請求項２に記載の発明において、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体を酵母（Saccharomyces cerevisiae）のチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とするとともに、前記サプレッサーｔＲＮＡを酵母（Saccharomyces cerevisiae）のナンセンスサプレッサーｔＲＮＡTyrとしたことを特徴とするものである。
【００１１】
請求項４に記載の発明の非天然蛋白質の固定化方法は、非天然アミノ酸が部位特異的に組み込まれた非天然蛋白質を製造する方法であって且つチロシンアナログと、サプレッサーｔＲＮＡと、前記チロシンアナログをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とを含有する蛋白質合成系に、鋳型を加えて蛋白質合成させる蛋白質合成工程を含み、前記チロシンアナログはアジドチロシン、アセチルチロシン、アミノチロシン又はドーパであり、前記鋳型は前記サプレッサーｔＲＮＡが認識する終止コドンを翻訳領域に配したポリヌクレオチドであることを特徴とする非天然蛋白質の製造方法により製造された非天然蛋白質を、支持体とその支持体に結合した反応基とを備えた固定化担体に固定化する方法であって、前記チロシンアナログの側鎖のアジド基、アセチル基、アミノ基又は水酸基を前記反応基に対して結合させることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項５に記載の発明のキットは、請求項１に記載の非天然蛋白質の製造方法に用いられる非天然蛋白質の製造用のキットであって、前記チロシンアナログと、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体と、前記蛍光物質を含む修飾物とを備えていることを特徴とするものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
（第一実施形態）
以下、この発明を具体化した第一実施形態を詳細に説明する。
【００１６】
第一実施形態の非天然蛋白質は、非天然アミノ酸が部位特異的に組込まれたポリペプチドである。前記非天然アミノ酸は、生物が普遍的に利用する２０種類の標準型アミノ酸（Ｌ−α−アミノ酸）に存在しない側鎖を持つアミノ酸であり、チロシンアナログ（Ｙアナログ）又はその修飾体（チロシンアナログ修飾体、Ｙアナログ修飾体）が挙げられる。この非天然蛋白質は、前記Ｙアナログが組込まれた第１の非天然蛋白質、又は前記Ｙアナログ修飾体が組込まれた第２の非天然蛋白質の２種類に分類される。
【００１７】
Ｙアナログとしては、アジドチロシン（azido tyrosine）、アセチルチロシン（acetyl tyrosine）、アミノチロシン（amino tyrosine）又はドーパ（DOPA；3,4-dihydroxyphenylalanine）が用いられる。これらのＹアナログは、下記化１又は化２に示される構造を有している。
【００１８】
【化１】
但し、Ｒ１はアジド基、アセチル基、アミノ基又は水酸基。
【００１９】
【化２】
但し、Ｒ２はアジド基、アセチル基又はアミノ基。
【００２０】
即ち、化１に示されるＹアナログは、チロシンの側鎖を構成するフェノール性芳香族環の３（メタ）位に置換基Ｒ１としてアジド基（−Ｎ3）、アセチル基（−ＣＯＣＨ3）、アミノ基（−ＮＨ2）又は水酸基（−ＯＨ）を有している。化２に示されるＹアナログは、チロシンの側鎖を構成するフェノール性芳香族環の２（オルト）位に置換基Ｒ２としてアジド基、アセチル基又はアミノ基を有している。なお、これらのＹアナログの置換基は、メタ位又はオルト位のいずれに結合されていても構わないが、側鎖の端部側に位置しＹアナログ修飾体にする反応が進行しやすいことからメタ位に結合されているのが好ましい。また、これらのＹアナログは、Ｌ型又はＤ型のいずれの光学異性体であっても構わないが、蛋白質合成効率が高いことからＬ型であるのが好ましい。
【００２１】
Ｙアナログ修飾体は、前記Ｙアナログの側鎖（フェノール性芳香族環の２位又は３位）に修飾物が結合した有機化合物である。前記修飾物は、修飾基と、その修飾基に結合した反応基とを備えている。前記反応基としては、オルトアルコキシカルボニルアリールジアリールホスフィン（トリアリールホスフィン（triarylphosphine）誘導体）、ヒドラジン（hydrazine）、コハク酸イミドエステル（succimidyl ester）、イソチオシアン酸（isothiocyanate）塩、塩化スルホニル（sulfonyl chloride）、アルデヒド（aldehyde）、又はカルボン酸や酸ハライド若しくはその酸無水物が挙げられる。前記修飾基は、特に限定されないが、実用的な用途拡大が容易であることから、蛍光物質、疎水性の巨大分子、親水性物質、電荷を有する物質、水素結合能を有する物質、化学反応性を有する物質、生理活性物質（酵素等）、生体構成物質（蛋白質、糖鎖、ポリヌクレオチド、脂肪酸等）、ビオチン（Biotin）、抗体又はその一部等が好適に用いられる。また、修飾基として、ポリエチレングリコール等のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に用いられる機能性担体を用いてもよい。
【００２２】
このＹアナログ修飾体は、Ｙアナログの置換基と、前記修飾物の反応基とを化学的又は生物化学的に結合（共有結合）させることにより得られる。
前記置換基と反応基との組合わせとしては、置換基がアジド基の場合には反応基としてはトリアリールホスフィン誘導体となり、図１に模式的に示されるような反応（Staudinger ligation反応）が行われる。また、置換基がアセチル基の場合には反応基がヒドラジンとなり、置換基がアミノ基の場合には反応基がコハク酸イミドエステル、イソチオシアン酸塩、塩化スルホニル、アルデヒド、又はカルボン酸や酸ハライド若しくはその酸無水物となる。これら置換基と反応基との反応は化学的反応である。また、前記Ｙアナログがドーパの場合には、そのフェノール性芳香族環の３位及び４位の水酸基をドーパオキシダーゼ（DOPA oxidase）による酵素反応を利用しつつ反応基としてのアミノ基と結合（生物化学的反応）させることにより、修飾物が結合してＹアナログ修飾体となる。これらのＹアナログの置換基を修飾する反応は、生理的条件下（例えば大腸菌や酵母等の一般細菌又は単細胞生物が生存可能な条件下）で行うことが可能となっている。
【００２３】
実施形態の第１の非天然蛋白質の製造方法は、Ｙアナログと、サプレッサーｔＲＮＡと、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とを含有する蛋白質合成系に、鋳型を加えて蛋白質合成させる蛋白質合成工程を行うものである。前記サプレッサーｔＲＮＡは、ｍＲＮＡ上の終止コドン（アンバー、オーカー又はオパール）をあるアミノ酸に対応するコドンとして読むナンセンスサプレッサーｔＲＮＡ又はミスセンスサプレッサーｔＲＮＡである。
【００２４】
前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体は、前記Ｙアナログを前記サプレッサーｔＲＮＡに特異的に結合させる酵素である。このアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体としては、前記Ｙアナログを基質とするものであれば特に限定されないが、標準型アミノ酸に対する基質特異性が低くなりやすく有用であることから野生型のチロシルｔＲＮＡ合成酵素を改変したチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（TyrＲＳ変異体）が最も好適に用いられる。前記野生型のチロシルｔＲＮＡ合成酵素としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる酵母（Saccharomyces cerevisiae）チロシルｔＲＮＡ合成酵素が挙げられる。
【００２５】
この酵母チロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体、即ち酵母TyrＲＳ変異体としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列の４３番目のＴｙｒがＧｌｙに置換されたＹ４３ＧチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（Y43G TyrＲＳ）、配列番号１で表されるアミノ酸配列の８１番目のＨｉｓがＶａｌに置換されたＨ８１ＶチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（H81V TyrＲＳ）、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１８６番目のＧｌｎがＶａｌに置換されたＱ１８６ＶチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（Q186V TyrＲＳ）、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１８６番目のＧｌｎがＴｈｒに置換されたＱ１８６ＴチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（Q186T TyrＲＳ）、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列の１８６番目のＧｌｎがＩｌｅに置換されたＱ１８６ＩチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（Q186I TyrＲＳ）が挙げられる。また、前記Y43G TyrＲＳ、H81V TyrＲＳ、Q186V TyrＲＳ、Q186T TyrＲＳ若しくはQ186I TyrＲＳの１〜３６４番目のアミノ酸配列からなる変異体も同様の酵素活性があることから用いられる。
【００２６】
さらに、このTyrＲＳ変異体としては、精製が容易であること等から、前記各TyrＲＳ変異体のＣ末端にヒスチジンタグ等のタグ（tag）が結合したものを用いるとよい。なお、前記Y43G TyrＲＳについては、S.Ohno et.al., Changing the Amino Acid Specificity of Yeast Tyrosyl-tRNA Synthetase by Genetic Engineering, J.Biochem.130,417-423(2001)に開示されている。また、前記各酵母TyrＲＳ変異体はいずれも、酵母ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡTyr（ｔＲＮＡTyr）（アンバー、オーカー又はオパール）を基質とする。
【００２７】
前記鋳型は、前記サプレッサーｔＲＮＡが認識する終止コドンを、部位特異的突然変異（site-directed mutagenesis）等により人為的に翻訳領域に配したポリヌクレオチドであり、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの形態で用いられる。前記ＤＮＡとしては、転写に必須な配列を含む二本鎖ＤＮＡが挙げられ、種々のベクターやプラスミド等に導入して利用するのが最も簡便である。なお、前記翻訳領域の３’末端に位置する終止コドンは、前記サプレッサーｔＲＮＡが認識する終止コドンとは異なる塩基配列のコドンが配される。
【００２８】
前記蛋白質合成系は、前記鋳型がコードする蛋白質を合成させるためのシステムであり、インビトロ（in vitro）蛋白質合成系又はインビボ（in vivo）蛋白質合成系が挙げられる。なお、この蛋白質合成系に含有されるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体及びその変異体の基質としてのサプレッサーｔＲＮＡは、同蛋白質合成系の翻訳過程に関与する成分とは異なる種の生物に由来するものであるのが好ましく、一方が真核細胞由来で他方が原核細胞由来であるのがより一層好ましい。このとき、第１の非天然蛋白質にＹアナログを適切かつ部位特異的に組込むことがより一層容易となる。
【００２９】
インビトロ蛋白質合成系としては、鋳型としてのｍＲＮＡからの翻訳を行わせるインビトロ翻訳系、又は鋳型としてのＤＮＡから転写及び翻訳を行わせるインビトロ転写翻訳系が挙げられる。これらインビトロ蛋白質合成系としては、転写、若しくは転写及び翻訳に必要な成分を人工的に混合することにより構築されたもの、細胞抽出物からなる無細胞蛋白質合成系、又は両者を混合することにより構築されたものが用いられる。前記無細胞蛋白質合成系は、大腸菌等の原核細胞、酵母等の真核細胞、プロトプラスト等の植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の細胞を主として脱核することにより得られ、転写及び翻訳に必要な各種成分が高含有されている。このインビトロ蛋白質合成系としては、広く有用性が認められていることから、大腸菌Ｓ３０抽出物又は小麦胚芽抽出物を含有するもの、ウサギ網状赤血球の溶血系、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、バキュロウィルスベクター蛋白質発現系、アフリカツメガエル卵母細胞等が好適に用いられる。また、非天然アミノ酸の導入に負に働く因子（例えば核酸分解酵素、蛋白質分解酵素、解離因子、酸化・還元酵素等）を破壊（欠損）、又は免疫沈降等により取り除いた大腸菌の細胞抽出液も好適に用いられる。
【００３０】
このインビトロ蛋白質合成系中に含まれるＹアナログは、同蛋白質合成系中の各標準型アミノ酸の含有量よりも多いのが好ましく、より好ましくは前記含有量の１〜１００倍量、さらに好ましくは５〜１０倍量であるとよい。Ｙアナログが前記含有量の１倍量未満の場合にはＹアナログを非天然蛋白質に高い効率で組込ませることができず、逆に１００倍量を越える場合には蛋白質合成系の秩序が乱されて破綻しやすくなる。また、インビトロ蛋白質合成系中に含まれるサプレッサーｔＲＮＡは、同蛋白質合成系中の各ｔＲＮＡの含有量と同程度であるのが好ましく、より好ましくは前記含有量の０．０１〜１０倍量、さらに好ましくは０．５〜２倍量であるとよい。サプレッサーｔＲＮＡが前記含有量の０．０１倍量未満の場合にはＹアナログを非天然蛋白質に高い効率で組込ませることができず、逆に１０倍量を越える場合には蛋白質合成系の秩序が乱されて破綻しやすくなる。また、インビトロ蛋白質合成系中に含まれるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体は、同蛋白質合成系中の各アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（野生型）の含有量よりも多いのが好ましく、より好ましくは前記含有量の０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌであるとよい。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体が前記含有量の０．０５ｍｇ／ｍｌ未満の場合にはＹアナログを非天然蛋白質に高い効率で組込ませることができず、逆に０．５ｍｇ／ｍｌを越える場合には蛋白質合成系の秩序が乱されて破綻しやすくなる。
【００３１】
インビボ蛋白質合成系としては、外来遺伝子としての前記鋳型及びアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体が発現可能となるように形質転換された細胞（形質転換細胞）、又は該細胞を含む生物個体が用いられる。前記形質転換細胞としては、脱核されていない生細胞が用いられ、大腸菌等の原核細胞、酵母等の真核細胞、植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞等が好適に用いられる。なお、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体の基質としてのサプレッサーｔＲＮＡが前記形質転換細胞中に内在されていない場合には、該サプレッサーｔＲＮＡも外来遺伝子として同細胞中に形質転換される必要がある。このインビボ蛋白質合成系では、Ｙアナログを食餌として摂取させることにより、前記外来遺伝子が発現された形質転換細胞中の蛋白質合成系が非天然蛋白質を継続的かつ大量に生産する。
【００３２】
一方、この第１の非天然蛋白質の製造方法に用いられるＹアナログとしては、蛋白質合成系に通常含有されていない置換基を有していることから、アジドチロシン又はドーパが好適に用いられる。また、特異性の高い酵素反応を利用して第２の非天然蛋白質を製造することが可能であることから、ドーパが特に好適に用いられる。
【００３３】
実施形態の第２の非天然蛋白質の製造方法は、前記第１の非天然蛋白質の製造方法における蛋白質合成工程を行った後、さらに後修飾工程を行うものである。この後修飾工程は、前記Ｙアナログの側鎖のアジド基、アセチル基、アミノ基又は水酸基を修飾してＹアナログ修飾体にする工程であり、上記Ｙアナログ修飾体における化学的反応又は生物化学的反応が行われる。なお、この第２の非天然蛋白質の製造方法において、前記蛋白質合成工程と後修飾工程との間に、蛋白質合成に関与しなかった未反応のＹアナログを取り除く操作を行うのが好ましい。
【００３４】
実施形態の非天然蛋白質の固定化方法は、前記第１の非天然蛋白質を固定化担体に対して固定化するものである。前記固定化担体は、水又は有機溶媒に不溶な固体からなる支持体と、その支持体に結合した反応基とを備えている。前記反応基は、上記Ｙアナログ修飾体の置換基と反応するもの（上記反応基と同じもの）が用いられる。そして、この固定化方法では、上記Ｙアナログ修飾体における化学的反応又は生物化学的反応と同じ反応を行うことにより、固定化担体に第１の非天然蛋白質を固定化させる。この非天然蛋白質が固定化された固定化担体は、例えばアフィニティクロマトグラフィー、プロテインチップ、バイオリアクター等に利用することができる。また、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、エラスチン、ヒアルロン酸等の細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、免疫グロブリンスーパーファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリー、リンク蛋白質ファミリー、シアロムチンファミリー等の細胞接着分子を固定化させたインプラント材や再生医療用人工素材にも利用することができる。
【００３５】
上記第一実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ 第一実施形態の第１の非天然蛋白質は、蛋白質構成アミノ酸としてＹアナログが部位特異的に組込まれたものである。第一実施形態の第２の非天然蛋白質は、蛋白質構成アミノ酸としてＹアナログ修飾体が部位特異的に組込まれたものでる。即ち、これら非天然蛋白質は、蛋白質構成アミノ酸として非天然アミノ酸が部位特異的に組込まれていることから、天然蛋白質とは異なる性質を人為的に付与されたものである。
【００３６】
このため、これらの非天然蛋白質は、天然蛋白質とは分子構造が明確に区別されていることから、その生体内での局在や挙動を調べるのが容易である。特に、第１の非天然蛋白質では、Ｙアナログのサイズが標準型アミノ酸とほとんど相違しないことから、生きた生物体に対する悪影響が極めて少ないうえ、該生物体に対して後修飾工程を行ってインサイチュ（in situ）による可視化を行うことが極めて容易である。また、電気泳動後に標識化（可視化）することも容易である。また、これらの非天然蛋白質は、非天然アミノ酸が部位特異的に組込まれていることから、天然蛋白質の生理活性に関与する蛋白質構成アミノ酸を特定したり、蛋白質の立体構造解析（structurome）に利用したり、情報処理解析技術の開発に利用することができる。また、アフィニティクロマトグラフィー担体、プロテインチップやその解析機器、バイオリアクター、ナノテクノロジー、電子機器、情報解析、精密計測機器等の研究又は工業的な応用が容易である。また、ゲノム情報を活用した画期的な医薬品素材やバイオマーカーの開発等の医療関連分野にも応用することが可能である。特に、第１の非天然蛋白質は蛋白質合成系による生物学的な製造方法により得られ、第２の非天然蛋白質は置換基と反応基との化学反応等が生理的な条件下で行われていることから、その生理活性の変化や立体構造の変化を極めて寡少に止めることが容易であるうえ、人為的に変化させることも容易である。
【００３７】
・ 第一実施形態の第１の非天然蛋白質の製造方法では、Ｙアナログが用いられている。これらのＹアナログのアジド基、アセチル基、アミノ基又は水酸基は、いずれも標準型アミノ酸に対する分子構造の差を明確化しているうえ、いずれも立体障害をほとんど生じない小さいサイズのものである。このため、これらのＹアナログはいずれも、リボソーム上でアミノアシルｔＲＮＡがアミノアシルｔＲＮＡ結合部位（Ａ部位）に結合する反応を行う際の立体障害とはならないサイズであることから、蛋白質合成工程が天然蛋白質の場合とほぼ同様に迅速に進行する。さらに、これらのＹアナログはいずれも、セントラルドグマに従った蛋白質合成系を用いた生理的な反応により非天然蛋白質に組込まれることから、該蛋白質の生理活性の低下が著しく効果的に抑えられている。また、トリプレットからなる遺伝コードを利用していることから、公知の天然蛋白質をコードするポリヌクレオチドの翻訳フレームを部位特異的突然変異等により大幅に改変する必要がなく、極めて手軽に製造することが可能である。
【００３８】
・ 第一実施形態の第２の非天然蛋白質の製造方法は、蛋白質合成工程を行って第１の非天然蛋白質を製造した後、該蛋白質と修飾物とを混合して生理的条件下で反応（化学反応や酵素反応等）させる後修飾工程を行うことにより、同蛋白質に修飾物を結合させるものである。この製造方法では、蛋白質合成工程及び後修飾工程ともに生理的条件下で行われることから、第２の非天然蛋白質の生理活性の低下を極めて効果的に抑えることができる。さらに、前記後修飾工程における置換基と反応基との反応は、著しく迅速かつ効率的に進行する反応である。一方、実施形態の非天然蛋白質の固定化方法は、前記後修飾工程とほぼ同様な反応を利用していることから、全く同様な効果が奏され得る。
【００３９】
（第二実施形態）
以下、この発明の第二実施形態を上記第一実施形態を参照しつつ説明する。
第二実施形態の非天然蛋白質は、Ｙアナログとしてのブロモチロシン（bromo tyrosine）が部位特異的に組込まれたポリペプチドである。この非天然蛋白質は、Ｘ線を好適に散乱させる性質を有するブロモ基（−Ｂｒ）が部位特異的に組込まれていることから、その非天然蛋白質のＸ線結晶構造解析に好適に利用される。さらに、この非天然蛋白質は、前記ブロモ基が極めて立体障害の少ない置換基であることから、該非天然蛋白質の立体構造（三次構造、四次構造）と天然蛋白質のそれとの間に相違が生じにくく、極めて好適な構造解析を行うことができる。
【００４０】
前記ブロモチロシンは、チロシンの側鎖を構成するフェノール性芳香族環の３（メタ）位又は２（オルト）位に置換基としてのブロモ基を備えたＹアナログであり、上記化１に示されるＹアナログの置換基Ｒ１をブロモ基としたもの又は上記化２に示されるＹアナログの置換基Ｒ２をブロモ基としたものが挙げられる。なお、このブロモチロシンのブロモ基は、メタ位又はオルト位のいずれに結合されていても構わない。また、このブロモチロシンとしては、Ｌ型又はＤ型のいずれの光学異性体であっても構わないが、蛋白質合成効率が高いことからＬ型であるのが好ましい。
【００４１】
第二実施形態の非天然蛋白質の製造方法は、上記第一実施形態の第１の非天然蛋白質の製造方法と全く同様に行われる。
第二実施形態のキットとしての非天然蛋白質の製造用キットは、少なくともブロモチロシン及び該ブロモチロシンをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体が含有されており、さらにサプレッサーｔＲＮＡが含有されているのがより好ましい。また、この製造用キット中には、さらに蛋白質合成系が含有されているのが好ましい。なおこのとき、前記サプレッサーｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体は、該蛋白質合成系の翻訳過程に関与する成分とは異なる種の生物に由来するものであるのが好ましく、一方が真核細胞由来で他方が原核細胞由来であるのがより一層好ましい。また、この製造用キット中に、部位特異的突然変異を行うための遺伝子キットが含有されていてもよい。
【００４２】
上記第二実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ 第二実施形態の非天然蛋白質は、蛋白質構成アミノ酸としてブロモチロシンが部位特異的に組込まれたものである。このため、この非天然蛋白質は、ブロモチロシンのサイズが標準型アミノ酸とほとんど相違しないことから、非天然蛋白質の三次構造が天然蛋白質のフォールディング様式とほとんど相違することはない。従って、Ｘ線結晶構造解析において立体構造を調べるために好適に用いられるうえ、その際にはＸ線の散乱特性に非常に優れていて好ましい。さらに、ブロモチロシンが部位特異的に組込まれていることから、前記従来のセレノメチオニン置換タンパク質の場合のような種々の不具合の発生がほとんどない。
【００４３】
・ 第二実施形態の非天然蛋白質の製造方法では、Ｙアナログとしてブロモチロシンが用いられている。このＹアナログのブロモ基は、立体障害をほとんど生じない小さいサイズのものであることから、上記第一実施形態の第１の非天然蛋白質の製造方法と全く同様の効果を奏する。
【００４４】
【実施例】
以下、前記実施形態を具体化した実施例及び比較例について説明する。
＜インビトロ蛋白質合成系（大腸菌Ｓ３０抽出物）の調製＞
ＬＢ（Luria-Bertani）プレートに生やした大腸菌Ｑ１３株（国立遺伝学研究所より分譲）の単一コロニーをＬＢ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で一晩振盪培養（プレ培養）した。次に、前記プレ培養後の培養液を１００倍量の２×ＹＴ（Trypton Pepton,Yeast Extract）培地（DIFCO社製）に加え、６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ600）が０．３〜０．４になるまで３７℃で振盪培養（本培養）した。続いて、前記本培養後の培養液を氷冷し、すぐに遠心分離して集菌した後、その菌体を、ヘペス緩衝液（Hepes-KOH(pH7.5) 20mM）、酢酸マグネシウム（10mM）、酢酸アンモニウム（20mM）、2-メルカプトエタノール（10mM）を含む溶液４０ｍｌに懸濁して菌体懸濁液を得た。前記菌体懸濁液にLysozyme（生化学工業社製）を２ｍｇ／ｍｌになるように加え、氷上に約１０分間静置した。続いて、前記菌体懸濁液を遠心分離して沈澱を得た後、その沈澱（菌体）の重量を量り、その重量と同量のＳ３０緩衝液（菌体１ｇに対し１ｍｌのＳ３０緩衝液）で懸濁してＳ３０懸濁液を得た。そのＳ３０懸濁液を細胞破砕した後、遠心分離することにより上清を得た。この上清は、インビトロ蛋白質合成系としての大腸菌Ｓ３０抽出物であり、小分けして液体窒素で長期間保存することが可能である。
【００４５】
＜非天然蛋白質の製造＞
ヘペス緩衝液（Hepes-KOH(pH7.6) 50mM）、酢酸マグネシウム（7.7mM）、酢酸アンモニウム（27.5mM）、ジチオスレイトール（DTT 1.7mM）、ヌクレオチド三リン酸（ATP 1.25mM,GTP 0.83mM,UTP 0.83mM,CTP 0.83mM）、クレアチンリン酸（80mM）、クレアチンキナーゼ（0.21mg/ml）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（本発明者らが単離0.1mg/ml）、大腸菌Ｑ１３株ｔＲＮＡミックス（本発明者らが単離 3.4A260unit/ml）、Ｌ−チロシン（80μM）、Ｌ−チロシン以外の標準型アミノ酸１９種（each 160μM）、ホリン酸（50μM）、酢酸カリウム（200mM）、ポリエチレングリコール（wt.8000 4%）、３−アジド−Ｌ−チロシン（本発明者らが合成 500μM）、酵母Y43G TyrＲＳ（本発明者らが作製 0.17mg/ml）、酵母サプレッサーｔＲＮＡTyr(CUA)（本発明者らが単離 0.1A260unit/ml）、鋳型ＤＮＡ（20μg/ml）、前記大腸菌Ｓ３０抽出物（30%(v/v)）及び脱イオン水を、括弧内に記載された終濃度となるように試験管内に入れて混合した後、３０℃で１時間インキュベートした。
【００４６】
比較例１は、鋳型ＤＮＡとして、野生型の大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素（dihydrofolate reductase［EC:1.5.1.3］；ＤＨＦＲ）遺伝子、即ち配列番号２で表される塩基配列からなる二本鎖ＤＮＡが組込まれたプラスミドベクターpET 21-a(+)（NOVAGEN社製）を使用した。比較例２は、鋳型ＤＮＡとして、前記プラスミドベクターpET 21-a(+)を使用した。実施例１は、鋳型ＤＮＡとして、大腸菌ＤＨＦＲの３７位のＡｓｎに対応するコドンを部位特異的突然変異によりアンバーコドンに改変した遺伝子、即ち配列番号２で表される塩基配列の１０９〜１１１番目をtagに改変した二本鎖ＤＮＡが組込まれたプラスミドベクターpET 21-a(+)を使用した。また、実施例２は、鋳型ＤＮＡとして、大腸菌ＤＨＦＲの１２８位のＴｙｒに対応するコドンを部位特異的突然変異によりアンバーコドンに改変した遺伝子、即ち配列番号２で表される塩基配列の３８２〜３８４番目をtagに改変した二本鎖ＤＮＡが組込まれたプラスミドベクターpET 21-a(+)を使用した。
【００４７】
次に、前記インキュベート後の反応液をＮｉ−ＮＴＡスピンカラム（Qiagen社製、溶出液はｐＨ７．４のリン酸緩衝液）により蛋白質合成に関与しなかった３−アジド−Ｌ−チロシンを除去しつつ精製した後、蛍光標識された修飾物を終濃度２５０μＭとなるように添加して３７℃で１時間インキュベートした。続いて、これら実施例１，２、比較例１，２及び予め単離された野生型の大腸菌ＤＨＦＲをＳＤＳゲル電気泳動した後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色及び蛍光染色を行った。なお、前記修飾物は、本発明者らが合成したトリアリールホスフィン誘導体であり、図１に示されるような構造を有している。
【００４８】
その結果、比較例１，２では蛍光が検出されなかったが、改変した鋳型ＤＮＡを用いて製造された実施例１，２では、いずれも野生型の大腸菌ＤＨＦＲと同じ分子量のＣＢＢ染色バンドの位置に蛍光バンドが検出された。また、データは示さないが、実施例１，２の非天然蛋白質ではいずれも、野生型の大腸菌ＤＨＦＲとほぼ同程度のＤＨＦＲ活性が確認された。
【００４９】
＜非天然蛋白質の固定化＞
アミノコーティングプレート（住友ベークライト社製）の各穴（ウェル）に、トリアリルフォスフィン誘導体（5mg/ml ジメチルスルホキシド溶液）を分注し、３７℃で２時間インキュベートして吸着させた。各ウェルをリン酸緩衝液(pH7.4)で洗浄した後、前記実施例１，２、比較例１，２及びリン酸緩衝液（コントロール）を各ウェルに分注し、３７℃で６時間インキュベートした。次に、各ウェルをリン酸緩衝液(pH7.4)で洗浄した後、テキサスレッドで標識したメトトレキセートを各ウェルに分注し、３７℃で２時間インキュベートした。最後に、各ウェルをリン酸緩衝液(pH7.4)で洗浄した後、イメージングアナライザー（アマシャムファルマシア・バイオテク社製）で解析したところ、実施例１，２を分注したウェルでは底面及び内壁面にテキサスレッドの色が明確に確認された。一方、比較例１，２及びリン酸緩衝液を分注したウェルでは確認されなかった。
【００５０】
＜アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体の基質特異性の調査＞
Y43G TyrＲＳ、H81V TyrＲＳ、Q186V TyrＲＳ、Q186T TyrＲＳ及びQ186I TyrＲＳの５種類の酵母TyrＲＳ変異体について、各種Ｙアナログに対する基質特異性を酸性条件下ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。なお、前記電気泳動は、Nucleic Acids Symposium Series No.35, 285-286(1996) (Oxford University Press, ISSN 0261 3166)の方法に従って行われた。結果を表１に示す。なお、表１において、酵母TyrＲＳがＹアナログを認識したことを実際に確認した場合には◎と表記した。また、酵母TyrＲＳがＹアナログを認識したことを直接確認してはいないが、野生型の酵母チロシルｔＲＮＡ合成酵素（酵母TyrＲＳ）等の試験結果から、認識する可能性が極めて高い場合には○、認識する可能性が十分にある場合には△、認識する可能性が極めて低い又は認識しない場合には×、認識するか否か全く不明の場合にはＮＤと表記した。
【００５１】
【表１】
その結果、これら５種類の酵母TyrＲＳ変異体については、全ての確認が取れていない状況ではあるが、基質特異性に多少の相違は見られるが概ね上記各実施形態の非天然蛋白質の製造に使用できることが確認された。さらには、これら５種類の酵母TyrＲＳ変異体は、メタ位（３位）に置換基を有するものは表１の通りであるが、野生型の酵母TyrＲＳがオルト位（２位）に置換基を有するものを基質として認識するという事実から同様に認識する可能性が高い。一方、Y43G TyrＲＳ及びH81V TyrＲＳについては、Ｄ−チロシンを認識しないことからＤ型のＹアナログを認識する可能性は著しく低いが、Ｄ−ドーパは認識する可能性は高い。Q186V TyrＲＳ、Q186T TyrＲＳ及びQ186I TyrＲＳについては、Ｄ−チロシンを基質として認識する可能性が高いが、Ｄ−ドーパは基質とはなる可能性は極めて低い。
【００５２】
なお、上記実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・ 第一実施形態の第１の非天然蛋白質の製造方法において、まず、Ｙアナログと、サプレッサーｔＲＮＡと、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とを予め酵素反応させることにより、Ｙアナログがアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡ（アミノアシルｔＲＮＡ）を調製すること。その後、前記調製されたアミノアシルｔＲＮＡを蛋白質合成系に添加して蛋白質合成を行うこと。なおこのとき、前記蛋白質合成系にアミノアシルｔＲＮＡに加えて、さらにＹアナログと、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とを加えてもよい。また、第二実施形態の非天然蛋白質の製造方法も全く同様に製造され得る。
【００５３】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・ 非天然蛋白質の製造方法により製造された非天然蛋白質であって、蛋白質構成アミノ酸としてチロシンアナログを備えていることを特徴とする非天然蛋白質。請求項２に記載の非天然蛋白質の製造方法により製造された非天然蛋白質であって、蛋白質構成アミノ酸としてチロシンアナログ修飾体を備えていることを特徴とする非天然蛋白質。
【００５４】
・ 非天然蛋白質の製造方法に用いられる非天然蛋白質の製造用のキットであって、チロシンアナログと、そのチロシンアナログをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とを備えていることを特徴とするキット。このように構成した場合、生理活性の低下を抑えつつ、蛋白質構成アミノ酸として非天然アミノ酸を高効率で部位特異的に組込むことが容易である。
【００５５】
・ 非天然蛋白質の固定化方法に用いられる非天然蛋白質の固定化用のキットであって、チロシンアナログと、そのチロシンアナログをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体と、固定化担体とを備えていることを特徴とするキット。このように構成した場合、生理活性の低下を抑えつつ、部位特異的に非天然蛋白質を固定化することが容易である。
【００５６】
【発明の効果】
以上詳述したように、この発明によれば、次のような効果を奏する。
請求項１から請求項３に記載の発明の非天然蛋白質の製造方法によれば、生理活性の低下を抑えつつ、蛋白質構成アミノ酸として非天然アミノ酸を高効率で部位特異的に組込むことが容易である。請求項４に記載の発明の非天然蛋白質の固定化方法によれば、生理活性の低下を抑えつつ、部位特異的に非天然蛋白質を固定化することが容易である。
【００５８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 第一実施形態の後修飾工程における反応の一例を示す模式図。
【発明の属する技術分野】
この発明は、生物が普遍的に利用する２０種類のＬ−α−アミノ酸に存在しない側鎖を持つ非天然アミノ酸が部位特異的に組込まれた非天然蛋白質を製造する非天然蛋白質の製造方法、及びその非天然蛋白質を固定化する非天然蛋白質の固定化方法、及びその非天然蛋白質の製造用キットに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、この種の非天然蛋白質の製造方法としては、例えば、非天然型アミノ酸組込み蛋白質とその製造法及び試薬キットが知られている（特許文献１参照）。この製造法は、無細胞蛋白質合成系下で、特定のアミノ酸に対応するアイソアクセプティングｔＲＮＡのうち、一部のもののみを非天然型アミノ酸と結合させたものと、蛋白質構成アミノ酸とを用いて蛋白質合成を行って、非天然型アミノ酸を特定のコドングループに組込むものである。また、前記非天然型アミノ酸は、ａ．天然型アミノ酸中の原子を安定同位体で置換したもの、ｂ．天然型アミノ酸中の原子を放射性同位体で置換したもの、ｃ．天然型アミノ酸の側鎖の光学異性体、ｄ．天然型アミノ酸の側鎖に置換基を導入したもの、ｅ．天然型アミノ酸の側鎖を置換して疎水性、反応性、蛍光性、荷電状態、分子の大きさ、水素結合能を変化させたもの、等が挙げられる。
【０００３】
一方、従来より、蛋白質のＸ線結晶構造解析には、例えば非特許文献１に開示されている方法により製造されたセレノメチオニン置換タンパク質が用いられている。このセレノメチオニン置換タンパク質を製造する際には、まず、大腸菌のメチオニン要求株と目的タンパク質の遺伝子が挿入されているプラスミドを準備して形質転換を行った後、抗生物質を含むアガロースゲルプレートを用いて目的タンパク質を発現する単一コロニーを単離する。次に、単離された形質転換体をメチオニンの代わりにセレノメチオニンを含む培地中で培養することにより目的タンパク質を発現させて精製する。
【０００４】
【特許文献１】
特許第３３１７９８３号公報
【非特許文献１】
清水敏之、岡田健吾、箱嶋敏雄、第１７章 Ｘ線結晶構造解析 セレノメチオニン置換タンパク質の発現と調製、「基礎生化学実験法３ タンパク質Ｉ．検出・構造解析法」、株式会社東京化学同人、第１版第１刷 ２００１年２月１５日、ｐ．１８９−１９０。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、前記従来の非天然型アミノ酸組込み蛋白質の製造法では、前記ｄ及びｅの置換基の種類、性質、大きさ等が十分に厳選されていなかったことから、それら非天然型アミノ酸の組込み効率に著しい差異が生じやすく、実用的ではなかった。さらに、この製造法では、リボソームとの結合において立体障害となるような巨大な置換基が導入された非天然型アミノ酸の組込みは事実上不可能であった。
【０００６】
一方、前記従来のセレノメチオニン置換タンパク質を製造する際には、前記目的タンパク質のメチオニンが取り込まれるべき全ての位置にセレノメチオニンが取り込まれて置換されることから部位特異的な置換を行うことができなかった。このため、この製造方法にて製造されたタンパク質では、セレノメチオニンの置換数が多すぎる場合には溶解度が著しく低下することから精製や結晶化が困難になり、逆に目的タンパク質中の構成アミノ酸としてメチオニンを含まない場合にはそのままの状態では適用できないといった様々な不都合が生じていた。
【０００７】
この発明は、上記のような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、生理活性の低下を抑えつつ、蛋白質構成アミノ酸として非天然アミノ酸を高効率で部位特異的に組込むことが容易な非天然蛋白質の製造方法を提供することにある。別の目的とするところは、蛋白質構成アミノ酸として非天然アミノ酸が部位特異的に組込まれているうえ、生理活性の低下を抑えることが容易な非天然蛋白質を提供することにある。その他の目的とするところは、生理活性の低下を抑えつつ、部位特異的に非天然蛋白質を固定化することが容易な非天然蛋白質の固定化方法を提供することにある。一方、この発明のそれ以外の目的とするところは、Ｘ線構造解析に容易に利用することができる非天然蛋白質、その製造方法及び製造用のキットを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明の非天然蛋白質の製造方法は、非天然アミノ酸が部位特異的に組込まれた非天然蛋白質を製造する方法であって、チロシンアナログと、サプレッサーｔＲＮＡと、前記チロシンアナログをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とを含有する蛋白質合成系に、鋳型を加えて蛋白質合成させる蛋白質合成工程及び該蛋白質合成工程後の後修飾工程を含み、前記チロシンアナログはアジドチロシン、アセチルチロシン、アミノチロシン又はドーパであり、前記鋳型は前記サプレッサーｔＲＮＡが認識する終止コドンを翻訳領域に配したポリヌクレオチドであり、前記後修飾工程は、前記チロシンアナログの側鎖のアジド基、アセチル基、アミノ基又は水酸基を修飾して蛍光物質を含む修飾物を結合させることにより前記チロシンアナログを蛍光性チロシンアナログ修飾体にする工程であることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項２に記載の発明の非天然蛋白質の製造方法は、請求項１に記載の発明において、前記チロシンアナログはアジドチロシンであり、前記修飾物は蛍光物質と該蛍光物質に結合されたトリアリールホスフィン誘導体であって、蛍光物質とトリアリールホスフィン誘導体とを結合させ、その結合された修飾物を前記アジド基に結合させることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項３に記載の発明の非天然蛋白質の製造方法は、請求項１又は請求項２に記載の発明において、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体を酵母（Saccharomyces cerevisiae）のチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とするとともに、前記サプレッサーｔＲＮＡを酵母（Saccharomyces cerevisiae）のナンセンスサプレッサーｔＲＮＡTyrとしたことを特徴とするものである。
【００１１】
請求項４に記載の発明の非天然蛋白質の固定化方法は、非天然アミノ酸が部位特異的に組み込まれた非天然蛋白質を製造する方法であって且つチロシンアナログと、サプレッサーｔＲＮＡと、前記チロシンアナログをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とを含有する蛋白質合成系に、鋳型を加えて蛋白質合成させる蛋白質合成工程を含み、前記チロシンアナログはアジドチロシン、アセチルチロシン、アミノチロシン又はドーパであり、前記鋳型は前記サプレッサーｔＲＮＡが認識する終止コドンを翻訳領域に配したポリヌクレオチドであることを特徴とする非天然蛋白質の製造方法により製造された非天然蛋白質を、支持体とその支持体に結合した反応基とを備えた固定化担体に固定化する方法であって、前記チロシンアナログの側鎖のアジド基、アセチル基、アミノ基又は水酸基を前記反応基に対して結合させることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項５に記載の発明のキットは、請求項１に記載の非天然蛋白質の製造方法に用いられる非天然蛋白質の製造用のキットであって、前記チロシンアナログと、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体と、前記蛍光物質を含む修飾物とを備えていることを特徴とするものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】
（第一実施形態）
以下、この発明を具体化した第一実施形態を詳細に説明する。
【００１６】
第一実施形態の非天然蛋白質は、非天然アミノ酸が部位特異的に組込まれたポリペプチドである。前記非天然アミノ酸は、生物が普遍的に利用する２０種類の標準型アミノ酸（Ｌ−α−アミノ酸）に存在しない側鎖を持つアミノ酸であり、チロシンアナログ（Ｙアナログ）又はその修飾体（チロシンアナログ修飾体、Ｙアナログ修飾体）が挙げられる。この非天然蛋白質は、前記Ｙアナログが組込まれた第１の非天然蛋白質、又は前記Ｙアナログ修飾体が組込まれた第２の非天然蛋白質の２種類に分類される。
【００１７】
Ｙアナログとしては、アジドチロシン（azido tyrosine）、アセチルチロシン（acetyl tyrosine）、アミノチロシン（amino tyrosine）又はドーパ（DOPA；3,4-dihydroxyphenylalanine）が用いられる。これらのＹアナログは、下記化１又は化２に示される構造を有している。
【００１８】
【化１】
【００１９】
【化２】
【００２０】
即ち、化１に示されるＹアナログは、チロシンの側鎖を構成するフェノール性芳香族環の３（メタ）位に置換基Ｒ１としてアジド基（−Ｎ3）、アセチル基（−ＣＯＣＨ3）、アミノ基（−ＮＨ2）又は水酸基（−ＯＨ）を有している。化２に示されるＹアナログは、チロシンの側鎖を構成するフェノール性芳香族環の２（オルト）位に置換基Ｒ２としてアジド基、アセチル基又はアミノ基を有している。なお、これらのＹアナログの置換基は、メタ位又はオルト位のいずれに結合されていても構わないが、側鎖の端部側に位置しＹアナログ修飾体にする反応が進行しやすいことからメタ位に結合されているのが好ましい。また、これらのＹアナログは、Ｌ型又はＤ型のいずれの光学異性体であっても構わないが、蛋白質合成効率が高いことからＬ型であるのが好ましい。
【００２１】
Ｙアナログ修飾体は、前記Ｙアナログの側鎖（フェノール性芳香族環の２位又は３位）に修飾物が結合した有機化合物である。前記修飾物は、修飾基と、その修飾基に結合した反応基とを備えている。前記反応基としては、オルトアルコキシカルボニルアリールジアリールホスフィン（トリアリールホスフィン（triarylphosphine）誘導体）、ヒドラジン（hydrazine）、コハク酸イミドエステル（succimidyl ester）、イソチオシアン酸（isothiocyanate）塩、塩化スルホニル（sulfonyl chloride）、アルデヒド（aldehyde）、又はカルボン酸や酸ハライド若しくはその酸無水物が挙げられる。前記修飾基は、特に限定されないが、実用的な用途拡大が容易であることから、蛍光物質、疎水性の巨大分子、親水性物質、電荷を有する物質、水素結合能を有する物質、化学反応性を有する物質、生理活性物質（酵素等）、生体構成物質（蛋白質、糖鎖、ポリヌクレオチド、脂肪酸等）、ビオチン（Biotin）、抗体又はその一部等が好適に用いられる。また、修飾基として、ポリエチレングリコール等のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に用いられる機能性担体を用いてもよい。
【００２２】
このＹアナログ修飾体は、Ｙアナログの置換基と、前記修飾物の反応基とを化学的又は生物化学的に結合（共有結合）させることにより得られる。
前記置換基と反応基との組合わせとしては、置換基がアジド基の場合には反応基としてはトリアリールホスフィン誘導体となり、図１に模式的に示されるような反応（Staudinger ligation反応）が行われる。また、置換基がアセチル基の場合には反応基がヒドラジンとなり、置換基がアミノ基の場合には反応基がコハク酸イミドエステル、イソチオシアン酸塩、塩化スルホニル、アルデヒド、又はカルボン酸や酸ハライド若しくはその酸無水物となる。これら置換基と反応基との反応は化学的反応である。また、前記Ｙアナログがドーパの場合には、そのフェノール性芳香族環の３位及び４位の水酸基をドーパオキシダーゼ（DOPA oxidase）による酵素反応を利用しつつ反応基としてのアミノ基と結合（生物化学的反応）させることにより、修飾物が結合してＹアナログ修飾体となる。これらのＹアナログの置換基を修飾する反応は、生理的条件下（例えば大腸菌や酵母等の一般細菌又は単細胞生物が生存可能な条件下）で行うことが可能となっている。
【００２３】
実施形態の第１の非天然蛋白質の製造方法は、Ｙアナログと、サプレッサーｔＲＮＡと、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とを含有する蛋白質合成系に、鋳型を加えて蛋白質合成させる蛋白質合成工程を行うものである。前記サプレッサーｔＲＮＡは、ｍＲＮＡ上の終止コドン（アンバー、オーカー又はオパール）をあるアミノ酸に対応するコドンとして読むナンセンスサプレッサーｔＲＮＡ又はミスセンスサプレッサーｔＲＮＡである。
【００２４】
前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体は、前記Ｙアナログを前記サプレッサーｔＲＮＡに特異的に結合させる酵素である。このアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体としては、前記Ｙアナログを基質とするものであれば特に限定されないが、標準型アミノ酸に対する基質特異性が低くなりやすく有用であることから野生型のチロシルｔＲＮＡ合成酵素を改変したチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（TyrＲＳ変異体）が最も好適に用いられる。前記野生型のチロシルｔＲＮＡ合成酵素としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる酵母（Saccharomyces cerevisiae）チロシルｔＲＮＡ合成酵素が挙げられる。
【００２５】
この酵母チロシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体、即ち酵母TyrＲＳ変異体としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列の４３番目のＴｙｒがＧｌｙに置換されたＹ４３ＧチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（Y43G TyrＲＳ）、配列番号１で表されるアミノ酸配列の８１番目のＨｉｓがＶａｌに置換されたＨ８１ＶチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（H81V TyrＲＳ）、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１８６番目のＧｌｎがＶａｌに置換されたＱ１８６ＶチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（Q186V TyrＲＳ）、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１８６番目のＧｌｎがＴｈｒに置換されたＱ１８６ＴチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（Q186T TyrＲＳ）、又は配列番号１で表されるアミノ酸配列の１８６番目のＧｌｎがＩｌｅに置換されたＱ１８６ＩチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体（Q186I TyrＲＳ）が挙げられる。また、前記Y43G TyrＲＳ、H81V TyrＲＳ、Q186V TyrＲＳ、Q186T TyrＲＳ若しくはQ186I TyrＲＳの１〜３６４番目のアミノ酸配列からなる変異体も同様の酵素活性があることから用いられる。
【００２６】
さらに、このTyrＲＳ変異体としては、精製が容易であること等から、前記各TyrＲＳ変異体のＣ末端にヒスチジンタグ等のタグ（tag）が結合したものを用いるとよい。なお、前記Y43G TyrＲＳについては、S.Ohno et.al., Changing the Amino Acid Specificity of Yeast Tyrosyl-tRNA Synthetase by Genetic Engineering, J.Biochem.130,417-423(2001)に開示されている。また、前記各酵母TyrＲＳ変異体はいずれも、酵母ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡTyr（ｔＲＮＡTyr）（アンバー、オーカー又はオパール）を基質とする。
【００２７】
前記鋳型は、前記サプレッサーｔＲＮＡが認識する終止コドンを、部位特異的突然変異（site-directed mutagenesis）等により人為的に翻訳領域に配したポリヌクレオチドであり、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの形態で用いられる。前記ＤＮＡとしては、転写に必須な配列を含む二本鎖ＤＮＡが挙げられ、種々のベクターやプラスミド等に導入して利用するのが最も簡便である。なお、前記翻訳領域の３’末端に位置する終止コドンは、前記サプレッサーｔＲＮＡが認識する終止コドンとは異なる塩基配列のコドンが配される。
【００２８】
前記蛋白質合成系は、前記鋳型がコードする蛋白質を合成させるためのシステムであり、インビトロ（in vitro）蛋白質合成系又はインビボ（in vivo）蛋白質合成系が挙げられる。なお、この蛋白質合成系に含有されるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体及びその変異体の基質としてのサプレッサーｔＲＮＡは、同蛋白質合成系の翻訳過程に関与する成分とは異なる種の生物に由来するものであるのが好ましく、一方が真核細胞由来で他方が原核細胞由来であるのがより一層好ましい。このとき、第１の非天然蛋白質にＹアナログを適切かつ部位特異的に組込むことがより一層容易となる。
【００２９】
インビトロ蛋白質合成系としては、鋳型としてのｍＲＮＡからの翻訳を行わせるインビトロ翻訳系、又は鋳型としてのＤＮＡから転写及び翻訳を行わせるインビトロ転写翻訳系が挙げられる。これらインビトロ蛋白質合成系としては、転写、若しくは転写及び翻訳に必要な成分を人工的に混合することにより構築されたもの、細胞抽出物からなる無細胞蛋白質合成系、又は両者を混合することにより構築されたものが用いられる。前記無細胞蛋白質合成系は、大腸菌等の原核細胞、酵母等の真核細胞、プロトプラスト等の植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の細胞を主として脱核することにより得られ、転写及び翻訳に必要な各種成分が高含有されている。このインビトロ蛋白質合成系としては、広く有用性が認められていることから、大腸菌Ｓ３０抽出物又は小麦胚芽抽出物を含有するもの、ウサギ網状赤血球の溶血系、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、バキュロウィルスベクター蛋白質発現系、アフリカツメガエル卵母細胞等が好適に用いられる。また、非天然アミノ酸の導入に負に働く因子（例えば核酸分解酵素、蛋白質分解酵素、解離因子、酸化・還元酵素等）を破壊（欠損）、又は免疫沈降等により取り除いた大腸菌の細胞抽出液も好適に用いられる。
【００３０】
このインビトロ蛋白質合成系中に含まれるＹアナログは、同蛋白質合成系中の各標準型アミノ酸の含有量よりも多いのが好ましく、より好ましくは前記含有量の１〜１００倍量、さらに好ましくは５〜１０倍量であるとよい。Ｙアナログが前記含有量の１倍量未満の場合にはＹアナログを非天然蛋白質に高い効率で組込ませることができず、逆に１００倍量を越える場合には蛋白質合成系の秩序が乱されて破綻しやすくなる。また、インビトロ蛋白質合成系中に含まれるサプレッサーｔＲＮＡは、同蛋白質合成系中の各ｔＲＮＡの含有量と同程度であるのが好ましく、より好ましくは前記含有量の０．０１〜１０倍量、さらに好ましくは０．５〜２倍量であるとよい。サプレッサーｔＲＮＡが前記含有量の０．０１倍量未満の場合にはＹアナログを非天然蛋白質に高い効率で組込ませることができず、逆に１０倍量を越える場合には蛋白質合成系の秩序が乱されて破綻しやすくなる。また、インビトロ蛋白質合成系中に含まれるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体は、同蛋白質合成系中の各アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（野生型）の含有量よりも多いのが好ましく、より好ましくは前記含有量の０．０５〜０．５ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌであるとよい。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体が前記含有量の０．０５ｍｇ／ｍｌ未満の場合にはＹアナログを非天然蛋白質に高い効率で組込ませることができず、逆に０．５ｍｇ／ｍｌを越える場合には蛋白質合成系の秩序が乱されて破綻しやすくなる。
【００３１】
インビボ蛋白質合成系としては、外来遺伝子としての前記鋳型及びアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体が発現可能となるように形質転換された細胞（形質転換細胞）、又は該細胞を含む生物個体が用いられる。前記形質転換細胞としては、脱核されていない生細胞が用いられ、大腸菌等の原核細胞、酵母等の真核細胞、植物細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞等が好適に用いられる。なお、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体の基質としてのサプレッサーｔＲＮＡが前記形質転換細胞中に内在されていない場合には、該サプレッサーｔＲＮＡも外来遺伝子として同細胞中に形質転換される必要がある。このインビボ蛋白質合成系では、Ｙアナログを食餌として摂取させることにより、前記外来遺伝子が発現された形質転換細胞中の蛋白質合成系が非天然蛋白質を継続的かつ大量に生産する。
【００３２】
一方、この第１の非天然蛋白質の製造方法に用いられるＹアナログとしては、蛋白質合成系に通常含有されていない置換基を有していることから、アジドチロシン又はドーパが好適に用いられる。また、特異性の高い酵素反応を利用して第２の非天然蛋白質を製造することが可能であることから、ドーパが特に好適に用いられる。
【００３３】
実施形態の第２の非天然蛋白質の製造方法は、前記第１の非天然蛋白質の製造方法における蛋白質合成工程を行った後、さらに後修飾工程を行うものである。この後修飾工程は、前記Ｙアナログの側鎖のアジド基、アセチル基、アミノ基又は水酸基を修飾してＹアナログ修飾体にする工程であり、上記Ｙアナログ修飾体における化学的反応又は生物化学的反応が行われる。なお、この第２の非天然蛋白質の製造方法において、前記蛋白質合成工程と後修飾工程との間に、蛋白質合成に関与しなかった未反応のＹアナログを取り除く操作を行うのが好ましい。
【００３４】
実施形態の非天然蛋白質の固定化方法は、前記第１の非天然蛋白質を固定化担体に対して固定化するものである。前記固定化担体は、水又は有機溶媒に不溶な固体からなる支持体と、その支持体に結合した反応基とを備えている。前記反応基は、上記Ｙアナログ修飾体の置換基と反応するもの（上記反応基と同じもの）が用いられる。そして、この固定化方法では、上記Ｙアナログ修飾体における化学的反応又は生物化学的反応と同じ反応を行うことにより、固定化担体に第１の非天然蛋白質を固定化させる。この非天然蛋白質が固定化された固定化担体は、例えばアフィニティクロマトグラフィー、プロテインチップ、バイオリアクター等に利用することができる。また、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、エラスチン、ヒアルロン酸等の細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、免疫グロブリンスーパーファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリー、リンク蛋白質ファミリー、シアロムチンファミリー等の細胞接着分子を固定化させたインプラント材や再生医療用人工素材にも利用することができる。
【００３５】
上記第一実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ 第一実施形態の第１の非天然蛋白質は、蛋白質構成アミノ酸としてＹアナログが部位特異的に組込まれたものである。第一実施形態の第２の非天然蛋白質は、蛋白質構成アミノ酸としてＹアナログ修飾体が部位特異的に組込まれたものでる。即ち、これら非天然蛋白質は、蛋白質構成アミノ酸として非天然アミノ酸が部位特異的に組込まれていることから、天然蛋白質とは異なる性質を人為的に付与されたものである。
【００３６】
このため、これらの非天然蛋白質は、天然蛋白質とは分子構造が明確に区別されていることから、その生体内での局在や挙動を調べるのが容易である。特に、第１の非天然蛋白質では、Ｙアナログのサイズが標準型アミノ酸とほとんど相違しないことから、生きた生物体に対する悪影響が極めて少ないうえ、該生物体に対して後修飾工程を行ってインサイチュ（in situ）による可視化を行うことが極めて容易である。また、電気泳動後に標識化（可視化）することも容易である。また、これらの非天然蛋白質は、非天然アミノ酸が部位特異的に組込まれていることから、天然蛋白質の生理活性に関与する蛋白質構成アミノ酸を特定したり、蛋白質の立体構造解析（structurome）に利用したり、情報処理解析技術の開発に利用することができる。また、アフィニティクロマトグラフィー担体、プロテインチップやその解析機器、バイオリアクター、ナノテクノロジー、電子機器、情報解析、精密計測機器等の研究又は工業的な応用が容易である。また、ゲノム情報を活用した画期的な医薬品素材やバイオマーカーの開発等の医療関連分野にも応用することが可能である。特に、第１の非天然蛋白質は蛋白質合成系による生物学的な製造方法により得られ、第２の非天然蛋白質は置換基と反応基との化学反応等が生理的な条件下で行われていることから、その生理活性の変化や立体構造の変化を極めて寡少に止めることが容易であるうえ、人為的に変化させることも容易である。
【００３７】
・ 第一実施形態の第１の非天然蛋白質の製造方法では、Ｙアナログが用いられている。これらのＹアナログのアジド基、アセチル基、アミノ基又は水酸基は、いずれも標準型アミノ酸に対する分子構造の差を明確化しているうえ、いずれも立体障害をほとんど生じない小さいサイズのものである。このため、これらのＹアナログはいずれも、リボソーム上でアミノアシルｔＲＮＡがアミノアシルｔＲＮＡ結合部位（Ａ部位）に結合する反応を行う際の立体障害とはならないサイズであることから、蛋白質合成工程が天然蛋白質の場合とほぼ同様に迅速に進行する。さらに、これらのＹアナログはいずれも、セントラルドグマに従った蛋白質合成系を用いた生理的な反応により非天然蛋白質に組込まれることから、該蛋白質の生理活性の低下が著しく効果的に抑えられている。また、トリプレットからなる遺伝コードを利用していることから、公知の天然蛋白質をコードするポリヌクレオチドの翻訳フレームを部位特異的突然変異等により大幅に改変する必要がなく、極めて手軽に製造することが可能である。
【００３８】
・ 第一実施形態の第２の非天然蛋白質の製造方法は、蛋白質合成工程を行って第１の非天然蛋白質を製造した後、該蛋白質と修飾物とを混合して生理的条件下で反応（化学反応や酵素反応等）させる後修飾工程を行うことにより、同蛋白質に修飾物を結合させるものである。この製造方法では、蛋白質合成工程及び後修飾工程ともに生理的条件下で行われることから、第２の非天然蛋白質の生理活性の低下を極めて効果的に抑えることができる。さらに、前記後修飾工程における置換基と反応基との反応は、著しく迅速かつ効率的に進行する反応である。一方、実施形態の非天然蛋白質の固定化方法は、前記後修飾工程とほぼ同様な反応を利用していることから、全く同様な効果が奏され得る。
【００３９】
（第二実施形態）
以下、この発明の第二実施形態を上記第一実施形態を参照しつつ説明する。
第二実施形態の非天然蛋白質は、Ｙアナログとしてのブロモチロシン（bromo tyrosine）が部位特異的に組込まれたポリペプチドである。この非天然蛋白質は、Ｘ線を好適に散乱させる性質を有するブロモ基（−Ｂｒ）が部位特異的に組込まれていることから、その非天然蛋白質のＸ線結晶構造解析に好適に利用される。さらに、この非天然蛋白質は、前記ブロモ基が極めて立体障害の少ない置換基であることから、該非天然蛋白質の立体構造（三次構造、四次構造）と天然蛋白質のそれとの間に相違が生じにくく、極めて好適な構造解析を行うことができる。
【００４０】
前記ブロモチロシンは、チロシンの側鎖を構成するフェノール性芳香族環の３（メタ）位又は２（オルト）位に置換基としてのブロモ基を備えたＹアナログであり、上記化１に示されるＹアナログの置換基Ｒ１をブロモ基としたもの又は上記化２に示されるＹアナログの置換基Ｒ２をブロモ基としたものが挙げられる。なお、このブロモチロシンのブロモ基は、メタ位又はオルト位のいずれに結合されていても構わない。また、このブロモチロシンとしては、Ｌ型又はＤ型のいずれの光学異性体であっても構わないが、蛋白質合成効率が高いことからＬ型であるのが好ましい。
【００４１】
第二実施形態の非天然蛋白質の製造方法は、上記第一実施形態の第１の非天然蛋白質の製造方法と全く同様に行われる。
第二実施形態のキットとしての非天然蛋白質の製造用キットは、少なくともブロモチロシン及び該ブロモチロシンをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体が含有されており、さらにサプレッサーｔＲＮＡが含有されているのがより好ましい。また、この製造用キット中には、さらに蛋白質合成系が含有されているのが好ましい。なおこのとき、前記サプレッサーｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体は、該蛋白質合成系の翻訳過程に関与する成分とは異なる種の生物に由来するものであるのが好ましく、一方が真核細胞由来で他方が原核細胞由来であるのがより一層好ましい。また、この製造用キット中に、部位特異的突然変異を行うための遺伝子キットが含有されていてもよい。
【００４２】
上記第二実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ 第二実施形態の非天然蛋白質は、蛋白質構成アミノ酸としてブロモチロシンが部位特異的に組込まれたものである。このため、この非天然蛋白質は、ブロモチロシンのサイズが標準型アミノ酸とほとんど相違しないことから、非天然蛋白質の三次構造が天然蛋白質のフォールディング様式とほとんど相違することはない。従って、Ｘ線結晶構造解析において立体構造を調べるために好適に用いられるうえ、その際にはＸ線の散乱特性に非常に優れていて好ましい。さらに、ブロモチロシンが部位特異的に組込まれていることから、前記従来のセレノメチオニン置換タンパク質の場合のような種々の不具合の発生がほとんどない。
【００４３】
・ 第二実施形態の非天然蛋白質の製造方法では、Ｙアナログとしてブロモチロシンが用いられている。このＹアナログのブロモ基は、立体障害をほとんど生じない小さいサイズのものであることから、上記第一実施形態の第１の非天然蛋白質の製造方法と全く同様の効果を奏する。
【００４４】
【実施例】
以下、前記実施形態を具体化した実施例及び比較例について説明する。
＜インビトロ蛋白質合成系（大腸菌Ｓ３０抽出物）の調製＞
ＬＢ（Luria-Bertani）プレートに生やした大腸菌Ｑ１３株（国立遺伝学研究所より分譲）の単一コロニーをＬＢ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で一晩振盪培養（プレ培養）した。次に、前記プレ培養後の培養液を１００倍量の２×ＹＴ（Trypton Pepton,Yeast Extract）培地（DIFCO社製）に加え、６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ600）が０．３〜０．４になるまで３７℃で振盪培養（本培養）した。続いて、前記本培養後の培養液を氷冷し、すぐに遠心分離して集菌した後、その菌体を、ヘペス緩衝液（Hepes-KOH(pH7.5) 20mM）、酢酸マグネシウム（10mM）、酢酸アンモニウム（20mM）、2-メルカプトエタノール（10mM）を含む溶液４０ｍｌに懸濁して菌体懸濁液を得た。前記菌体懸濁液にLysozyme（生化学工業社製）を２ｍｇ／ｍｌになるように加え、氷上に約１０分間静置した。続いて、前記菌体懸濁液を遠心分離して沈澱を得た後、その沈澱（菌体）の重量を量り、その重量と同量のＳ３０緩衝液（菌体１ｇに対し１ｍｌのＳ３０緩衝液）で懸濁してＳ３０懸濁液を得た。そのＳ３０懸濁液を細胞破砕した後、遠心分離することにより上清を得た。この上清は、インビトロ蛋白質合成系としての大腸菌Ｓ３０抽出物であり、小分けして液体窒素で長期間保存することが可能である。
【００４５】
＜非天然蛋白質の製造＞
ヘペス緩衝液（Hepes-KOH(pH7.6) 50mM）、酢酸マグネシウム（7.7mM）、酢酸アンモニウム（27.5mM）、ジチオスレイトール（DTT 1.7mM）、ヌクレオチド三リン酸（ATP 1.25mM,GTP 0.83mM,UTP 0.83mM,CTP 0.83mM）、クレアチンリン酸（80mM）、クレアチンキナーゼ（0.21mg/ml）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（本発明者らが単離0.1mg/ml）、大腸菌Ｑ１３株ｔＲＮＡミックス（本発明者らが単離 3.4A260unit/ml）、Ｌ−チロシン（80μM）、Ｌ−チロシン以外の標準型アミノ酸１９種（each 160μM）、ホリン酸（50μM）、酢酸カリウム（200mM）、ポリエチレングリコール（wt.8000 4%）、３−アジド−Ｌ−チロシン（本発明者らが合成 500μM）、酵母Y43G TyrＲＳ（本発明者らが作製 0.17mg/ml）、酵母サプレッサーｔＲＮＡTyr(CUA)（本発明者らが単離 0.1A260unit/ml）、鋳型ＤＮＡ（20μg/ml）、前記大腸菌Ｓ３０抽出物（30%(v/v)）及び脱イオン水を、括弧内に記載された終濃度となるように試験管内に入れて混合した後、３０℃で１時間インキュベートした。
【００４６】
比較例１は、鋳型ＤＮＡとして、野生型の大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素（dihydrofolate reductase［EC:1.5.1.3］；ＤＨＦＲ）遺伝子、即ち配列番号２で表される塩基配列からなる二本鎖ＤＮＡが組込まれたプラスミドベクターpET 21-a(+)（NOVAGEN社製）を使用した。比較例２は、鋳型ＤＮＡとして、前記プラスミドベクターpET 21-a(+)を使用した。実施例１は、鋳型ＤＮＡとして、大腸菌ＤＨＦＲの３７位のＡｓｎに対応するコドンを部位特異的突然変異によりアンバーコドンに改変した遺伝子、即ち配列番号２で表される塩基配列の１０９〜１１１番目をtagに改変した二本鎖ＤＮＡが組込まれたプラスミドベクターpET 21-a(+)を使用した。また、実施例２は、鋳型ＤＮＡとして、大腸菌ＤＨＦＲの１２８位のＴｙｒに対応するコドンを部位特異的突然変異によりアンバーコドンに改変した遺伝子、即ち配列番号２で表される塩基配列の３８２〜３８４番目をtagに改変した二本鎖ＤＮＡが組込まれたプラスミドベクターpET 21-a(+)を使用した。
【００４７】
次に、前記インキュベート後の反応液をＮｉ−ＮＴＡスピンカラム（Qiagen社製、溶出液はｐＨ７．４のリン酸緩衝液）により蛋白質合成に関与しなかった３−アジド−Ｌ−チロシンを除去しつつ精製した後、蛍光標識された修飾物を終濃度２５０μＭとなるように添加して３７℃で１時間インキュベートした。続いて、これら実施例１，２、比較例１，２及び予め単離された野生型の大腸菌ＤＨＦＲをＳＤＳゲル電気泳動した後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色及び蛍光染色を行った。なお、前記修飾物は、本発明者らが合成したトリアリールホスフィン誘導体であり、図１に示されるような構造を有している。
【００４８】
その結果、比較例１，２では蛍光が検出されなかったが、改変した鋳型ＤＮＡを用いて製造された実施例１，２では、いずれも野生型の大腸菌ＤＨＦＲと同じ分子量のＣＢＢ染色バンドの位置に蛍光バンドが検出された。また、データは示さないが、実施例１，２の非天然蛋白質ではいずれも、野生型の大腸菌ＤＨＦＲとほぼ同程度のＤＨＦＲ活性が確認された。
【００４９】
＜非天然蛋白質の固定化＞
アミノコーティングプレート（住友ベークライト社製）の各穴（ウェル）に、トリアリルフォスフィン誘導体（5mg/ml ジメチルスルホキシド溶液）を分注し、３７℃で２時間インキュベートして吸着させた。各ウェルをリン酸緩衝液(pH7.4)で洗浄した後、前記実施例１，２、比較例１，２及びリン酸緩衝液（コントロール）を各ウェルに分注し、３７℃で６時間インキュベートした。次に、各ウェルをリン酸緩衝液(pH7.4)で洗浄した後、テキサスレッドで標識したメトトレキセートを各ウェルに分注し、３７℃で２時間インキュベートした。最後に、各ウェルをリン酸緩衝液(pH7.4)で洗浄した後、イメージングアナライザー（アマシャムファルマシア・バイオテク社製）で解析したところ、実施例１，２を分注したウェルでは底面及び内壁面にテキサスレッドの色が明確に確認された。一方、比較例１，２及びリン酸緩衝液を分注したウェルでは確認されなかった。
【００５０】
＜アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体の基質特異性の調査＞
Y43G TyrＲＳ、H81V TyrＲＳ、Q186V TyrＲＳ、Q186T TyrＲＳ及びQ186I TyrＲＳの５種類の酵母TyrＲＳ変異体について、各種Ｙアナログに対する基質特異性を酸性条件下ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。なお、前記電気泳動は、Nucleic Acids Symposium Series No.35, 285-286(1996) (Oxford University Press, ISSN 0261 3166)の方法に従って行われた。結果を表１に示す。なお、表１において、酵母TyrＲＳがＹアナログを認識したことを実際に確認した場合には◎と表記した。また、酵母TyrＲＳがＹアナログを認識したことを直接確認してはいないが、野生型の酵母チロシルｔＲＮＡ合成酵素（酵母TyrＲＳ）等の試験結果から、認識する可能性が極めて高い場合には○、認識する可能性が十分にある場合には△、認識する可能性が極めて低い又は認識しない場合には×、認識するか否か全く不明の場合にはＮＤと表記した。
【００５１】
【表１】
【００５２】
なお、上記実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・ 第一実施形態の第１の非天然蛋白質の製造方法において、まず、Ｙアナログと、サプレッサーｔＲＮＡと、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とを予め酵素反応させることにより、Ｙアナログがアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡ（アミノアシルｔＲＮＡ）を調製すること。その後、前記調製されたアミノアシルｔＲＮＡを蛋白質合成系に添加して蛋白質合成を行うこと。なおこのとき、前記蛋白質合成系にアミノアシルｔＲＮＡに加えて、さらにＹアナログと、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とを加えてもよい。また、第二実施形態の非天然蛋白質の製造方法も全く同様に製造され得る。
【００５３】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・ 非天然蛋白質の製造方法により製造された非天然蛋白質であって、蛋白質構成アミノ酸としてチロシンアナログを備えていることを特徴とする非天然蛋白質。請求項２に記載の非天然蛋白質の製造方法により製造された非天然蛋白質であって、蛋白質構成アミノ酸としてチロシンアナログ修飾体を備えていることを特徴とする非天然蛋白質。
【００５４】
・ 非天然蛋白質の製造方法に用いられる非天然蛋白質の製造用のキットであって、チロシンアナログと、そのチロシンアナログをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とを備えていることを特徴とするキット。このように構成した場合、生理活性の低下を抑えつつ、蛋白質構成アミノ酸として非天然アミノ酸を高効率で部位特異的に組込むことが容易である。
【００５５】
・ 非天然蛋白質の固定化方法に用いられる非天然蛋白質の固定化用のキットであって、チロシンアナログと、そのチロシンアナログをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体と、固定化担体とを備えていることを特徴とするキット。このように構成した場合、生理活性の低下を抑えつつ、部位特異的に非天然蛋白質を固定化することが容易である。
【００５６】
【発明の効果】
以上詳述したように、この発明によれば、次のような効果を奏する。
請求項１から請求項３に記載の発明の非天然蛋白質の製造方法によれば、生理活性の低下を抑えつつ、蛋白質構成アミノ酸として非天然アミノ酸を高効率で部位特異的に組込むことが容易である。請求項４に記載の発明の非天然蛋白質の固定化方法によれば、生理活性の低下を抑えつつ、部位特異的に非天然蛋白質を固定化することが容易である。
【００５８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 第一実施形態の後修飾工程における反応の一例を示す模式図。
Claims (5)
- 非天然アミノ酸が部位特異的に組込まれた非天然蛋白質を製造する方法であって、
チロシンアナログと、サプレッサーｔＲＮＡと、前記チロシンアナログをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とを含有する蛋白質合成系に、鋳型を加えて蛋白質合成させる蛋白質合成工程及び該蛋白質合成工程後の後修飾工程を含み、
前記チロシンアナログはアジドチロシン、アセチルチロシン、アミノチロシン又はドーパであり、
前記鋳型は前記サプレッサーｔＲＮＡが認識する終止コドンを翻訳領域に配したポリヌクレオチドであり、
前記後修飾工程は、前記チロシンアナログの側鎖のアジド基、アセチル基、アミノ基又は水酸基を修飾して蛍光物質を含む修飾物を結合させることにより前記チロシンアナログを蛍光性チロシンアナログ修飾体にする工程であることを特徴とする非天然蛋白質の製造方法。 - 前記チロシンアナログはアジドチロシンであり、前記修飾物は蛍光物質と該蛍光物質に結合されたトリアリールホスフィン誘導体であって、蛍光物質とトリアリールホスフィン誘導体とを結合させ、その結合された修飾物を前記アジド基に結合させることを特徴とする請求項１に記載の非天然蛋白質の製造方法。
- 前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体を酵母（Saccharomyces cerevisiae）のチロシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とするとともに、 前記サプレッサーｔＲＮＡを酵母（Saccharomyces cerevisiae）のナンセンスサプレッサーｔＲＮＡTyrとしたことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の非天然蛋白質の製造方法。
- 非天然アミノ酸が部位特異的に組み込まれた非天然蛋白質を製造する方法であって且つチロシンアナログと、サプレッサーｔＲＮＡと、前記チロシンアナログをサプレッサーｔＲＮＡに結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体とを含有する蛋白質合成系に、鋳型を加えて蛋白質合成させる蛋白質合成工程を含み、前記チロシンアナログはアジドチロシン、アセチルチロシン、アミノチロシン又はドーパであり、前記鋳型は前記サプレッサーｔＲＮＡが認識する終止コドンを翻訳領域に配したポリヌクレオチドであることを特徴とする非天然蛋白質の製造方法により製造された非天然蛋白質を、支持体とその支持体に結合した反応基とを備えた固定化担体に固定化する方法であって、
前記チロシンアナログの側鎖のアジド基、アセチル基、アミノ基又は水酸基を前記反応基に対して結合させることを特徴とする非天然蛋白質の固定化方法。 - 請求項１に記載の非天然蛋白質の製造方法に用いられる非天然蛋白質の製造用のキットであって、
前記チロシンアナログと、前記アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素変異体と、前記蛍光物質を含む修飾物とを備えていることを特徴とするキット。
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